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Seminarios en Biotecnología y Bioseguridad de OGMs

1

Martha Guerrero Olazarán [email protected]

BIOPROCESOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

24 de agosto de 2017

mailto:[email protected]

2

Todos los seres vivos contienen miles de proteínas

con estructura y funciones muy diferentes.

Son macromoléculas conformadas largas cadenas de aminoácidos

¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS?

Hormona del crecimiento humano

https://es.123rf.com/photo_14568680_estructura-quimica-de-la-hormona-de-crecimiento-humana-hgh--una-hormona-natural-que-se-utiliza-como-.html

3

Las proteínas determinan la forma y la estructura de las

células y dirigen casi todos los procesos vitales.

• ESTRUCTURAL: tejidos de sostén, confieren elasticidad y

resistencia a órganos y tejidos.

• DEFENSA: Anticuerpos, toxinas, venenos

• REGULADORA: Hormonas, enzimas

• MOTILIDAD: miosina y actina, facilitan la contracción muscular

• TRANSPORTE : hemoglobina y la mioglobina, transportadoras del O2

• RESERVA ENERGÉTICA: lactoalbúmina de la leche o a ovoalbúmina

de la clara de huevo, la hordeina de la cebada y la gliadina del

grano de trigo

• ENZIMÁTICA: catalizadores

• RECONOCIMIENTO DE SEÑALES: receptores

FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS

¿CUÁLES SON LAS FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS?



4

¿CÓMO SE APLICAN LAS PROTEÍNAS?

APLICACIÓN

•Biomedicina

•Alimentos

•Química de la

Transformación

•Reactivo químico

•Medio ambiente

•Agente terapéutico

•Vacunas

•Diagnóstico

•Procesos industriales•Aditivos•Nutracéuticos

•Suplemento alimenticio

•Industria del papel

•Industria textil y del cuero

•Industria farmacéutica

•Industria química

•Reactivo analítico

•Energía y combustibles

•Tratamiento de residuos

•Humanos

•Animales

•Plantas

•Catálisis enzimática

•Síntesis

estereoselectiva



5

¿CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS?

DNA RNAm PROTEÍNA

Tanscripción(RNA polimerasa)

Traducción(Ribosomas)

Modificaciones Postraduccionales

(RE-AG)



6

¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

Proteína producida en un

organismo foráneo o no

nativo o cuya secuencia

génica codificante ha sido

manipulada



7

EJEMPLOS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Protein Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015 Martha Guerrero Olazarán [email protected]


8

EJEMPLOS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Protein Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015

http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/

Todas ellas consideradas como biológicos o biofármacos




Combina in vitro material

genético distintas fuentes y

transfiere a un organismo

receptor para crear

organismos genéticamente

modificados (OGM u OVM)

que adquieren un genotipo y

fenotipo alterado.

9

¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

POR INGENIERÍA GENÉTICA (TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE)

Vector oplásmido

Gen de interés

Plásmidorecombinante

Célula Modificada(OGM)

Genoma nativo

Célula procariota

Célula eucariota



10


SE EMPLEAN SISTEMAS DE EXPRESIÓN

Hospedero: Organismo receptor que es

modificado para producir la proteínarecombinante

Vector de expresiónMolécula de DNA que transporta lasecuencia codificante de la proteína ysecuencias que regulan su expresión.

Técnicas • Transformación (Transferencia de DNA)• Selección de transformantes• Regulación de la expresión génica

OGM

Proteína recombinante

SISTEMAS DE EXPRESIÓN


Enzimas de Restricción

Transformación

Bacteria

Vector

Propagación

CLONACIÓN MOLECULAR

DNA ligasa

12

¿ POR QUÉ PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

11 toneladas de páncreas

100,000 cerdos

Extracción y

purificación

Hoechts

Insulina de cerdo

o de vaca

50 páncreas de

cerdo para

tratamiento anual

Alergias

Costo elevado

Contaminación

Producción de

Insulina en gran

cantidadExtracción y

purificación

Insulina

humana



13

¿ POR QUÉ PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

• Producción de proteínas específicas y auténticas

• Incrementar los niveles de producción

• Facilitar su purificación

• Mejorar o modificar las propiedades biológicas de las proteínas

por Ingeniería de proteínas

• Concentraciones muy bajas

• Contaminación con toxinas

u otras moléculas traza

• Altos costos

• No idénticas

Aislamiento

purificación

FUENTES NATURALES

VENTAJAS



14


Sistemas

microbianosSistemas de Expresión

Eucariota

Células de mamífero

Células de plantas

Células de insectos

Animales y plantas transgénicas

Algas

Protozoarios

Hongos

Levaduras

Procariota Bacterias

LOS HOSPEDEROS DE LOS

SISTEMAS DE EXPRESIÓN Características de la

proteína

Aplicación de la

Proteína

Tipo de Bioproceso• Cultivo• Propagación

Martha Guerrero Olazarán

[email protected]


ORIGEN DE LA PROTEINA• Procariota

• Eucariota

•Secuencia nucleotídica •Uso de codones

preferenciales

•Tamaño

•pI

•Modificaciones

postraduccionales

•Proteólisis

•pH

•Temperatura

•Extracelular

•Intracelular

PROPIEDADES DE

LA PROTEINA

•Propiedades químicas

•Estabilidad

•Toxicidad

•Destino celular

•Grado de pureza

FACTORES DETERMINANTES EN LA SELECCIÓN DE UN SISTEMA

DE EXPRESIÓN



16

FACTORES DETERMINANTES EN LA SELECCIÓN DE UN SISTEMA

DE EXPRESIÓN

APLICACIÓN

•Biomedicina

•Alimentos

•Química de la

Transformación

•Reactivo químico

•Medio ambiente

•Agente terapéutico

•Vacunas

•Diagnóstico

•Procesos industriales•Aditivos•Nutracéuticos

•Suplemento alimenticio

•Industria del papel

•Industria textil y del cuero

•Industria farmacéutica

•Industria química

•Reactivo analítico

•Energía y combustibles

•Tratamiento de residuos

•Humanos

•Animales

•Plantas

•Catálisis enzimática

•Síntesis

estereoselectiva



DISTRIBUCIÓN DE USO DE HOSPEDEROS PARA LA PRODUCCIÓN

DE PROTEÍNAS RECOMBINANTE

Martha Guerrero Olazarán [email protected] Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015


18


VECTORES DE EXPRESIÓN: ELEMENTOS GÉNICOS QUE LO CONFORMAN

Gen de interés

INTEGRATIVOS EXTRACROMOSOMALES

ESPECÍFICOS PARA

CADA HOSPEDERO



19


ELEMENTOS GÉNICOS IMPORTANTES EN UN

VECTOR DE EXPRESIÓN



¿ CUÁLES SON LOS RETOS EN LA PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

CALIDAD DEL PRODUCTO

RENDIMIENTOS

PRODUCTIVIDAD DEL PROCESO

COSTOS

Yp/s Yp/x

Yx/s

Máxi

ma

Pro

ducc

ión

Proteína Recombinante

Hospedero Cepas recombinante Selección Bioproceso



¿ CUÁLES SON LOS RETOS EN PRODUCCIÓN DE

PROTEÍNAS RECOMBINANTES?

REDISEÑO

GÉNICO

CONDICIONES DE

CULTIVO

• Secuencia génica

• Regiones ricas en AT/TTT

• Estructuras secundarias en 5’

• Dósis génica

Transcripción

• Codones preferenciales

• Modificaciones postraduccionales

Traducción

• Características de la proteína • Carga metabólica • Procesamiento y Secreción

Procesamiento

FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Productividad volumétrica

Rendimiento específico Martha Guerrero Olazarán [email protected]


FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESION DE GENES,PRODUCCION Y

CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES

REGULACION DE LA TRANSCRIPCION

EFICIENCIA DE LA TRADUCCION

•SEÑALES DE RECONOCIMIENTO DE INICIO DE LA TRADUCCION (RBS)

•USO DE CODONES PREFERNCIALES

•MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

•PROMOTOR reconocible por la RNA polimerasa

•REPRESORES INDUCTORES

•SEÑALES DE TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCION

CARACTERISTICAS DEL HOSPEDERO

DESTINO CELULAR DE LA PROTEINA

ESTABILIDAD Y TOXICIDAD DE LA PROTEINA

CONDICIONES DE CULTIVO



ETAPAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS

PROTEINAS RECOMBINANTES


[email protected]

Aplicación

CaracterísticasDemanda

¿Cuánto?

Proteína

de interésSelección

+

Ho

sped

ero

Vec

tor

Sistema de

Expresión

Diseño del genSíntesis

del gen

Organismo

Recombinante

1

2

3

4

Tamizaje de

cepas

5


ETAPAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS

PROTEINAS RECOMBINANTES


[email protected]

Diseño del

bioproceso

Caracterización

de la cepa

6

Caracterización

Proteína

7Purificación

8

Bioproceso

controlado

Downstream

CLARIFICACIÓN

PURIFICACIÓN

FORMULACIÓN

PRODUCTO

9


Biomasa

celular

(g/L)

Producto

(mg/L)

Fase I Fase II

SUSTRATO

100

0

0 12 24

50

100

0

Tiempo (horas)

50

Bioproceso en lote + lote alimentado

(batch + fed-batch)

Fase II

MeOH

50

0 48 64240

50

100

100

0

Tiempo (horas)

Bioproceso en lote alimentado

(fed-batch)

CONTROL DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES

Fase

de g

enera

ció

n d

e b

iom

asa

Fase

de i

nducció

n d

e g

en

Pro

ducció

n d

e la p

rote

ína


SEMILLA XX L

XX LDownstream

FASE IVol: XX L batchGlicerol XX g/L

Tiempo: XX h pH XXAeración: XX L/minTemp: XX °CDCF: XX g/LAgitación XXX

FASE IIIVolumen total: 30 L Fuente de carbono X g/L Flujos de XX mL/minTiempo: XX h pH XMezcla aire/O2, XX L/minTemp: XX °CDCF: XX g/LAgitación XX

GENERACIÓN DE BIOMASAPRODUCCIÓN

FASE IIVolumen total: XX L FUENTE DE Carbono X g/L Flujos de XX mL/minTiempo: XX h pH XXMezcla aire/O2, XX L/minTemp: XX°CDCF: XX g/LAgitación XX

REACTOR DE 40 L /30 L VOLUMEN DE TRABAJO

SUPERVISIÓN DE INFRAESTRUCTURA

VERIFICACIÓN, ADECUACIÓNY PREPARACIÓN DE INFRAESTRUCTURA

Selección de proteína

• Ingredientes vegetales• Decrecer PO4• Peletizado• Contaminación

Optimación

• Niveles de producción • Termoestabilidad• Actividad específica

Optimación

Efectividad

• Optimación del proceso.

• Bio-ensayos in vitro • Bio-ensayos in vivo• Fisiología del proceso

Termoestable

Activa pH 6-8

MejoraGenética

Rediseño de proteína

Niveles de producción

Efectividad

Fisiología comprometida

• Bases de datos • Adq. Cepa• Clonación

Expresión • Caracterización

• Codones preferenciales

• Ing. de Proteínas

• Gen sintético

Cepa

FTEII

• Diseño multifactorial

• Análisis Transcripcional

Proceso

31

EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS

PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Desarrollo de un Sistema de Expresión

• Universidades

• Centros de Investigación

• Pequeñas empresas que surgen como “spin-off” de los primeros

PROTECCIÓN

POR PATENTES

PRODUCCIÓN DE MÚLTIPLES

PROTEÍNAS DE INTERÉS

• COMERCIAL

• INVESTIGACIÓN

GENERAN ACTIVOS

TECNOLÓGICOS

SUSCEPTIBLE A LICENCIARSE

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

DE ALTO VALOR COMERCIAL

Proceso de investigación

32EL

SEG

MEN

TO

IN

DU

STRIA

L EN

TO

RN

O A

LA T

ECN

OLO

GÍA

DE L

AS P

RO

TEÍN

AS R

ECO

MBIN

AN

TES



33



LA INDUSTRIA DE SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y

PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

EMPRESAS GRANDES:

Agilent Technologies, Inc. (EE.UU.)

Life Technologies Corporation (EE.UU.)

Lonza

Clontech

Meck-Millipore

Research Corporation Technologies

Promega Coporation (EE.UU.)

QIAGEN (Países Bajos)

Sigma-Aldrich Corporation (EE.UU.)

Takara Bio, Inc. (Japón)

Thermo Fisher Scientific, Inc. (EE.UU.)

BIOLÓGICOS TERAPÉUTICOS

EMPRESAS PEQUEÑAS:

Dyadic International

Greenovation

Geneva Biotech

iBio

Jena Bioscience

New England Biolabs, Inc.

Oxford Expression

Technologies

Pfenex

Scarab Genomics

(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015

34



EL MERCADO DE LA INDUSTRIA DE SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y

PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES


USUARIOS FINALES

Investigación académica

Organizaciones de investigación por contrato

Compañías farmacéuticas y biotecnológicas

Crecimiento del mercado global entre 2013 y 2018 se estima con un

CAGR (tasa de crecimiento anual compuesto) de 8.83%.

Valor del mercado global se estima en 1,396.68 millones de USD para el 2018

Las organizaciones de

investigación por contrato (proporcionan recursos y

conocimientos relativamente

menos costosos (CAGR )

Las empresas farmacéuticas y biotecnológicas

dominan la mayor parte del mercado mundial

35



OPORTUNIDAD, DEMANDA E IMPORTANCIA DE LOS SISTEMAS DE

EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015World Enzymes Industry Study with Forecasts for 2015 & 2020”,

BIOLÓGICOS TERAPÉUTICOS ≈900 productos biológicos terapéuticos en varios estados de desarrollo. ≈ 150 productos biológicos terapéuticos en el mercado. El valor del mercado de productos biológicos terapéuticos se estima en 200,000

millones de USD. Segmento de biosimilares con más de 550 productos en desarrollo.

SEGMENTOS LUCRATIVOS Y ASOCIADOS

BIOLÓGICOS NO TERAPÉUTICOS

El mercado global de las enzimas industriales se estima en un valor de $6.3 mil

millones de USD para el 2022.

Las enzimas industriales son usadas para la producción de biocombustibles, como

aditivos en alimentos para la nutrición animal, en la industria del cuero, textil,

de detergentes y procesado de alimentos y bebidas

36



BIOFARMA-CMO: EMPRESAS DE MANOFACTURA POR CONTRATO


DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

37





DISTRIBUCIÓN POR ESCALA DE OPERACIÓN

38





DISTRIBUCIÓN POR TIPO DE BIOLÓGICO

39





DISTRIBUCIÓN POR TIPO SISTEMA DE EXPRESIÓN

•Biotecnología moderna:

•Se entiende la aplicación de técnicas in vitro de ácido nucleico,

incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN y ARN) recombinante

•la inyección directa de ácido nucleico en células u organelos, o

•la fusión de células más allá de la familia taxonómica, que supera

las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la

recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y

selección tradicional,

•que se aplican para dar origen a organismos genéticamente

modificadosMartha Guerrero Olazarán [email protected]

Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM)

BIOTECNOLOGÍA MODERNA

40



BIOSEGURIDAD Y TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Las primeras directrices en cuestiones de seguridad en materia de la

Tecnología del ADN Recombinante se proponen en una conferencia

científica celebrada en Asilomar (California, EE.UU.) en 1975 .

Lineamientos para la Investigación que Involucra Moléculas de ADN

Recombinante y ADN sintético (NIH Guidelines for Research Involving

Recombinant or Synthetic Nucleic Acid Molecules ) del Instituto Nacional

de Salud de los Estados Unidos (NIH).

El documento especifica los procedimientos de confinamiento físico y contención

a través de barreras biológicas, necesarios para trabajar con OGMs.

Dichos procedimientos pueden de considerar como los estándares mínimos.

41


Define la práctica segura y los procedimientos de contención para la

investigación básica y clínica que involucran el uso de moléculas de

ácidos nucleicos recombinantes o sintéticos, incluyendo la creación y

utilización de los organismos y los virus que contienen ácido nucleico

recombinante o sintético.

Directrices del NIH para la investigación con moléculas

de ácidos nucleicos recombinantes o sintéticas

ADN recombinante y ADN sintético según las directrices de NIH

(i) moléculas que a) se construyen por la unión de moléculas de ácido

nucleico y b) que puede replicarse en una célula viva (ADN recombinante)

(ii) moléculas de ácido nucleicos sintetizados químicamente o por otros

medios o amplificados, incluyendo aquellos que son químicamente o de

otro modo modificadas, pero puede tener pares de bases de origen

natural con moléculas de ácido nucleico (ADN sintéticos),

(iii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en (i) o (ii)

anterior

42



La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados

(LBOGMS)

Regula la utilización confinada de estos organismos

Utilización Confinada:

Cualquier actividad por la que se modifique el material genético de

un organismo o por la que éste, así modificado, se cultive, almacene,

emplee, procese, transporte, comercialice, destruya o elimine,

siempre que en la realización de tales actividades se utilicen barreras

físicas o una combinación de éstas con barreras químicas o biológicas,

con el fin de limitar de manera efectiva su contacto con la

población y con el medio ambiente.

BIOSEGURIDAD DE OGMs EN MÉXICO

43



Evaluación del riesgo

Determinar el tipo de OGM y

actividad

Determinar el tipo de

contención y control

Garantizar que la exposición de losseres humanos y el medio ambiente alos OGMs resulte al nivel más bajo quesea razonablemente posible

Determinar la contención mínima para la actividad específica con el OGM

44



EVALUACIÓN DEL RIESGO

DETERMINAR EL TIPO DE OGM Y ACTIVIDAD

45



CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD

EVALUACIÓN DE RIESGO: es un proceso subjetivo

GRUPO DE RIESGO: Basado en el grupo de riesgo (GR) de un agente

CLASIFICACIÓN DE GRUPOS DE RIESGO: Los agentes se clasifican en

4 grupos de riesgo (RGS) en función de su patogenicidad a seres humanos

adultos sanos .

GRUPOS DE RIESGO (RG)

PATOGENICIDAD

Grupo 1 Agentes no asociados a enfermedades en adultos sanos.Grupo 2 Agentes asociados con enfermedades en humanos, que rara vez

es grave y para los que las intervenciones preventivas o terapéuticas a menudo están disponibles.

Grupo 3 Agentes asociados con enfermedades en humanos grave o letal para el que las intervenciones preventivas o terapéuticas pueden estar disponibles.

Grupo 4 Agentes pueden causar enfermedades humanas graves o letales para los que las intervenciones preventivas o terapéuticas generalmente no están disponibles.

DIRECTRICES DEL NIH: DEFINICIÓN DE GRUPOS DE RIESGO

46



EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS

•Características de los organismos donantes y de los genes donados.

Estimación del nivel de expresión necesario para conseguir actividad biológica o

farmacológica

Toxinas, Citoquinas, Hormonas, Alergenos

Resistencia a antibióticos

Reguladores de la expresión génica

Secuencias oncogénicas

Riesgos derivados directamente del

gen insertado (organismo

donante)

Producto del gen insertado tenga una actividad biológica o farmacológica que

pueda resultar dañina

47


•Características organismos receptores/hospederos

Susceptibilidad del hospedero

Patogenicidad de la cepa huésped, incluida

la virulencia, la inefectividad y la

producción de toxinas

Estado inmunitario del receptor

Modificación de la gama de huéspedes

Riesgos asociados al receptor/hospedero

48




Riesgos derivados de la alteración de rasgos patogénicos existentes

• ¿Hay un aumento de la infectividad o la patogenicidad?

• ¿Podría superarse cualquier mutación incapacitante en el receptor de resultado de la inserción del gen foráneo?

Muchas modificaciones no utilizan genes cuyos

productos sean intrínsecamente

nocivos

• ¿Codifica el gen foráneo un determinante de patogenicidad de otro organismo?

• Si el ADN foráneo incluye un determinante de patogenicidad, ¿cabe prever que ese gen pudiera contribuir a la patogenicidad del OGM?

pero pueden producirse efectos adversos de resultas

de la alteración de

características patogénicas o no patogénicas existente

• ¿Se dispone de tratamiento?

• ¿Se verá afectada la susceptibilidad del OGM a los antibióticos u otra forma de tratamiento a consecuencia de la modificación genética?

• ¿Podría conseguirse la erradicación del OGM?

La modificación de genes normales puede alterar la

patogenicidad

49



Evaluación Integral de Riesgos

Como decidir sobre la contención apropiado para un experimento

•Determinar el riesgo del agente de acuerdo al grupo de riesgo

•Considerar la manipulación del agente

Virulencia,

Patogenicidad

Dosis infecciosa

Estabilidad del medio ambiente

Vía de propagación

Comunicabilidad, operaciones, y cantidad,

Disponibilidad de la vacuna o el tratamiento

Efectos del producto del gen tales como toxicidad,

actividad fisiológica, y la alergenicidad

50


EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMs


•Combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio.

•Equipos de seguridad e instalaciones adecuadas para las operaciones realizadas.

•Se basan en los riesgos potenciales impuestos por los agentes utilizados para la

función y la actividades de laboratorio.

•Nivel de Bioseguridad 1 es el menos estricto.

•Nivel de Bioseguridad 4 proporciona las condiciones más estrictas de contención.

•Limitación de la infectividad de un vector o vehículo (plásmido o virus) para

hospedero específicos.

•Limitación para su diseminación y la supervivencia en el medio ambiente.

•Vectores, pueden ser genéticamente diseñado para disminuir, en muchos

órdenes de magnitud, la probabilidad de diseminación de la molécula de ácido

nucleico recombinante o sintético fuera del laboratorio.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

BARRERAS BIOLÓGICAS

51



Consideraciones de bioseguridad en relación con los sistemas

de expresión biológica


E. coli K12/pUC18

pUC18 carece de los genes necesarios para la expresión en otras bacterias

E. coli K12 es una

cepa no patógena

que no puede

colonizar

permanentemente el

intestino del

ser humano ni de los

animales sanos.

52



Cuando la expresión de secuencias de ADN derivadas de organismos patógenos pueda aumentar la virulencia del OGM.

Cuando las secuencias de ADN insertadas no estén bien caracterizadas, por ejemplo durante la preparación de genotecas de ADN genómico de microorganismos patogénicos.

Cuando los productos génicos puedan tener actividad farmacológica.

Cuando los productos génicos sean toxinas.

Consideraciones de bioseguridad en relación con los vectores de expresión

Puede ser necesario trabajar en niveles de bioseguridad más altos en los siguientes casos:


53



Los vectores víricos, por ejemplo los de adenovirus, se utilizan para transferir genes a otras células.

Esos vectores carecen de ciertos genes necesarios para la replicación vírica y son propagados en líneas celulares que complementan el defecto.

Las poblaciones de esos vectores pueden contaminarse con virus que tienen intacta la capacidad de replicación, generados por sucesos poco frecuentes de recombinación espontánea en las líneas celulares de propagación, o procedentes de una purificación insuficiente.

Esos vectores deben manipularse al mismo nivel de bioseguridad que el adenovirus del que proceden.


Consideraciones de bioseguridad en relación con vectoresvíricos para la transferencia de genes

54



Los animales que llevan información genética incorporada (animales transgénicos) deben manipularse en niveles de contención apropiados para las características de los productos de los genes foráneos incorporados.Los animales en los que se han suprimido de forma selectiva ciertos genes (knock-out) no suelen entrañar riesgos biológicos particulares.


Consideraciones de bioseguridad en relación con Animalestransgénicos y con genes inactivados (knock-out)

Los animales transgéncos que expresan receptores de virus normalmente sonincapaces de infectar a esa especie.Si esos animales salieran del laboratorio y transmitieran el transgén a lapoblación animal salvaje, en teoría podría generarse un reservorio animal de esosvirus en particular.Es preciso efectuar estudios para determinar vías de infección, el tamaño del inóculo y el grado de excreción de virus por parte de los animales infectados necesario para que se diseminar una infección.

55



SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Clonación de toxinas con una DL50 100 ng/kg de peso corporal

SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: ADN proviene de RG-1 y hospedero patógenoADN –VECTORES HOSPEDERO-

GRUPO DE RIESGONIVEL DE CONTENCIÓN

Sin riesgo RG-2 BL2Sin riesgo RG-3 BL3Sin riesgo RG-4 ¿No definido?SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO:ADN proviene de un grupo de riesgo y hospedero

no-patógeno procariote o eucariote inferior y el DNA proviene de un grupo de riesgo

ADN –VECTORES HOSPEDERO-GRUPO DE RIESGO

NIVEL DE CONTENCIÓN

RG-2 o RG-3 No patógeno BL2RG-4 No patógeno BL4/ BL2SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: ADN o ARN A viral o ADN o ARN A viral alterado

en presencia de un virus “helper” en sistemas de cultivo de tejido ADN –VECTORES HOSPEDERO-

GRUPO DE RIESGONIVEL DE CONTENCIÓN

Virus -RG-2 Infeccioso/alterado/PHV

cultivo de tejido BL2.

Virus -RG-3/Priones/ PHV cultivo de tejido BL3

Virus –RG-4 Infeccioso/alterado/PHV

cultivo de tejido BL4

DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE CONTENCIÓN

56


SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Cultivos de más 10 L

ADN –VECTORES HOSPEDERO-GRUPO DE

RIESGO

NIVEL DE CONTENCIÓN

No tóxicos No patógeno GLSP/GMP

Requiere BL1 a escala de lab Requiere BL1 a escala de lab

BL1-LS


BL2-LS


BL3-LS

CULTIVOS DE MÁS DE 10 L DE OGMs

57




SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Usados a escala Laboratorio y de producción

SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO:

HOSPEDERO-GRUPO DE

RIESGO

VECTOR NIVEL DE CONTENCIÓ

NSistema de

Escherichia coli K-12 (EK1)

Escherichia coli K-12 derivados

No conjugativos

pSC101, Co1E1Bacteriófago

BL1/ BL1-LS

Sistema deSaccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

BL1/ BL1-LS

SistemaKluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis

BL1/ BL1-LS

Sistema Bacillus subtilis

Bacillus subtilis BL1/ BL1-LS

Sistema Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis

No forma esporas

BL1/ BL1-LS

58

DE

TE

RM

INA

CIÓ

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DE

CO

NT

EN

CIÓ

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IVO

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10

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s

59

CAPÍTULO II DE LOS AVISOS En el caso específico de la utilización confinada de OGMs con fines deenseñanza, de investigación científica y tecnológica, industriales ocomerciales, la LBOGM establece la figura del “Aviso” para quieneslleven a cabo estas actividades. Específicamente, el Art. 74 de laLBOGM dice a la letra: Quienes realicen actividades de utilizaciónconfinada sujetas al requisito de presentación de aviso en los términos de estaLey, deberán cumplir con lo siguiente:

I. Llevar un libro de registro de las actividades de utilización confinada querealicen, el cual se deberá proporcionar a las Secretarías correspondientes cuandoéstas lo soliciten;II. Aplicar las medidas de confinamiento cuya ejecución deberá adaptarse a losconocimientos científicos y técnicos más modernos y avanzados en materia de manejode riesgos y de tratamiento, disposición final y eliminación de residuos de OGMsgenerados en la realización de la actividad yIII. En el caso de la utilización confinada con fines de enseñanza o de investigacióncientífica y tecnológica, integrar una comisión interna de bioseguridad yaplicar los principios de las buenas prácticas de la investigación científica, así como lasreglas de bioseguridad que defina la comisión interna de bioseguridad. Dicha comisióninterna estará encargada de la seguridad en las instalaciones y de las buenas prácticasy la seguridad en el manejo de OGMs utilizados en la actividad señalada.

La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGMS)

60

La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGMS)

Ante que secretaría se debe presentar el AVISO

61

62


!GRACIAS¡


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