selección y evaluación de microorganismos nativos del
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
TESIS
Selección y evaluación de microorganismos nativos del norte de Sinaloa como biofertilizantes para el cultivo de garbanzo (Cicer arietinum L.)
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS
NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
ROSARIO ALICIA FIERRO CORONADO
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO. DICIEMBREDE 2012.
II
III
IV
V
Este trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola
del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional
(CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente
trabajo fue apoyado económicamente a través del proyecto vinculado con
Productores Unidos del Río Petatlán S.A. de C.V (con número de registro
CV10092). La alumna Fierro Coronado Rosario Alicia, fue apoyada con una beca
CONACYT con clave 366504. Un agradecimiento a Coecyt Sinaloa por su apoyo
económico para la impresión y empastado de esta tesis.
VI
DEDICATORIA
A la persona que más me apoya y que amo:
“Rey David Ruelas Ayala”
a mi madre y mi hijo David
y a Dios
VII
AGRADECIMIENTOS
Al CIIDIR-Sinaloa, por darme la oportunidad de realizar mis estudios de
Maestría.
A Productores Unidos del Río Petatlán S.A. de C.V por el financiamiento
para mi trabajo de tesis (2010-2012).
A CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología), por la beca
proporcionada durante el período de Agosto2010-Julio2012.
Al Dr. Ignacio E. Maldonado Mendoza, por la formación y orientación
académica, por todo el apoyo brindado durante toda mi estancia en su
grupo y por la confianza depositada en mi persona. Gracias Dr. Ignacio por
permitirme ser parte de su grupo de investigación.
A mi comité tutorial: Dr. Ignacio E. Maldonado Mendoza, Dr. Adolfo D.
Armenta Bojórquez, Dra. Melina López Meyer, Dra. Claudia Castro
Martínez y M.C. Andrés Góngora Gómez, por su incondicional ayuda y
disposición a las consultas para mejorar el trabajo científico, por sus
sugerencias y por la información prestada para le realización de la tesis.
Al Dr. Francisco Roberto Quiroz Figueroa y a la M.C. Luz María García
Pérez, por su apoyo y tan acertadas sugerencias en la realización de mis
bioensayos con mis aislados productores de auxinas.
A los Licenciados Roberto Urías (Don Robert) y Dorín Ortiz, por su apoyo
en todos los trámites académicos y de solicitud de becas.
A Jesús Quiroz, por apoyarme con sus protocolos y material para
bioensayos en Arabidopsis.
A mis compañeros, por su valiosa amistad, por compartir alegrías, tristezas
y logros personales y aguantar mí forma de ser. Espero seguir contando
con todos ustedes: Alejandra Hernández, Juan Carlos Martínez, Karla
Leyva, Glenda Sánchez, Daniel Torres, Raquel López, Lucy Sotomayor,
Isela López, Odet López, Alejandro Figueroa, Damián Cordero y Nadia
Douriet.
VIII
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS XI
ÍNDICE DE CUADROS XII
GLOSARIO XIII
RESUMEN XVII
ABSTRACT XVIII
1.INTRODUCCIÓN 1
2.ANTECEDENTES 3
2.1. El Garbanzo 3
2.1.1. Características generales 3
2.1.2. Producción 4
2.2. Biofertilizantes 6
2.2.1. Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (BPCV) 6
2.2.2. Fijación Biológica de Nitrógeno 7
2.2.3. Rhizobium 8
2.2.3.1. Proceso de nodulación 10
2.2.4. Micorrizas arbusculares 11
2.2.4.1. Colonización por hongos micorrízicos arbusculares
(HMA)
13
2.3. Antecedentes en el grupo de trabajo 15
3.JUSTIFICACIÓN 16
4.HIPÓTESIS 17
5.OBJETIVOS 17
5.1. Objetivo general 17
5.2. Objetivos específicos 17
6.METODOLOGÍA 6.1. Esquema general de trabajo
18
18
6.2. Muestreo 19
6.3. Selección de bacterias productoras de auxinas a partir del banco de
la rizósfera de garbanzo
19
6.4. Caracterización de las bacterias productoras de auxinas 21
6.4.1. Caracterización morfológica y pruebas de hemólisis de los
aislados productores de AIA
21
IX
6.4.2. Espectrofotometría de luz visible 22
6.4.3. Evaluación de la funcionalidad biológica del AIA producido
por los aislados bacterianos en Arabidopsis thaliana
pDR5::GFP
23
6.4.3.1. Cultivo de Arabidopsis thalina en cajas petri con
Murashige y Skoog (MS)
23
6.4.4. Respuesta del AIA en arquitectura radical en Arabidopsis
thaliana
24
6.4.5. Evaluación de solubilización de fosfatos 25
6.4.6. Evaluación de los aislados en garbanzo con antecedente de
promover el crecimiento vegetal
26
6.5. Selección de una comunidad de HMA 28
6.5.1. Cultivos trampa con pasto (Brachiaria brizantha) 28
6.5.1.1. Determinación del porcentaje de micorrización 29
6.5.2. Evaluación del potencial infectivo 29
6.5.3. Evaluación de las comunidades micorrízicas en garbanzo 31
6.6. Obtención de aislados de Rhizobium 31
6.7. Identificación molecular de los aislados bacterianos productores de
auxinas y aislados de nódulos de garbanzo (Rhizobium)
32
6.7.1. Extracción de ADN genómico 32
6.7.2. Cuantificación de ADN 32
6.7.3. Reacción en cadena de la polimerasa 33
6.7.4. Visualización de los productos de PCR 33
6.7.5. Purificación de los productos de PCR, cuantificación y
secuenciación del ADN
33
6.7.6. Análisis de las secuencias 34
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35
7.1. Muestreos 35
7.2. Selección de bacterias productoras de auxinas a partir del banco de
la rizósfera de garbanzo
36
7.3. Caracterización de las bacterias productoras de auxinas 38
7.3.1. Caracterización morfológica y pruebas de hemólisis de los
aislados productores de AIA
38
X
7.3.2. Espectrofotometría de luz visible 38
7.3.3. El AIA proveniente de aislados bacterianos produce una
respuesta fisiológica en Arabidopsis thaliana pDR5::GFP
39
7.3.4. Respuesta del AIA en arquitectura radical en Arabidopsis
thaliana
42
7.3.5. Evaluación de solubilización de fosfatos 44
7.3.6. Evaluación de los aislados con antecedentes de promover
el crecimiento vegetal
45
7.3.7. Identificación molecular de los aislados productores de AIA 47
7.4. Selección de una comunidad de HMA 50
7.4.1. Cultivos trampa de HMA con pasto (Brachiaria brizantha) 50
7.4.2. Evaluación del potencial infectivo 52
7.4.3. Evaluación de las comunidades micorrízicas en garbanzo 53
7.5. Obtención de aislados de Rhizobium en garbanzo 55
8. CONCLUSIONES 9. PERSPECTIVAS
57
58
10. REFERENCIAS 59
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de trabajo. 18
Figura 2.Banco de microorganismos aislados de nódulos de garbanzo y
de la rizósfera de garbanzo.
20
Figura 3. Pruebas con Salkowski. 36
Figura 4. Especificidad de la reacción de Salkowski para el AIA. 39
Figura 5. Inducción de fluorescencia por el AIA producido por el aislado
476 en Arabidopsisthaliana pDR5::GFP en estomas de las hojas
del lado adaxial.
40
Figura 6. Inducción de fluorescencia por el AIA producido por el aislado
476 en Arabidopsisthaliana pDR5::GFP en el sistema vascular
de las hojas del lado abaxial.
41
Figura 7. Arquitectura radicular de Arabidopsis thaliana en placas con
medio MS modificado.
43
Figura 8. Densidad y longitud de las raíces laterales de A. thaliana. 43
Figura 9. Inducción de pelos absorbentes en A. thaliana por AIA, vista en
microscopio confocal.
44
Figura 10. Árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16s ADNr
de los aislados productores de AIA asociados a garbanzo.
49
Figura 11. Cultivos trampa con pasto Brachiaria brizantha en condiciones
de invernadero.
50
Figura 12. Raíces micorrízadas de pasto B. brizantha. 51
XII
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Solución Long Ashton. 27
Cuadro 2.Lista de los lotes muestreados para la toma de suelo y/o raíces
para obtener BPCV, Rhizobium y HMA.
35
Cuadro 3. Índice de solubilización de fosfato (IS). 45
Cuadro 4. Peso seco (PS) de raíz y follaje en plantas de garbanzo con 30
días post-inoculación de bacterias productoras de AIA.
47
Cuadro 5. Porcentajes de identidad de especies homólogas a los aislados
de la rizósfera de garbanzo productores de AIA.
48
Cuadro 6. Porcentajes de micorrización en los cultivos trampa con pasto
(Brachiaria brizantha).
51
Cuadro 7. Número más probable de propágulos viables 53
Cuadro 8. Biomasa y porcentaje de micorrización en garbanzo. 55
XIII
GLOSARIO
Abaxial. En botánica se considera que la cara abaxial de la hoja es el envés (cara inferior de la hoja).
Abiótico. Término que se utiliza en el ámbito de la biología para hacer mención al medio que, por sus características, no puede albergar ninguna forma de vida.
Aclimatación. Es el proceso por el cual un organismo se adapta fisiológicamente a los cambios en su medio ambiente.
Adaxial. En botánica, lado que está haciael ejeo línea central, por lo general en la parte superiorlateral. Su antónimo es abaxial.
ADN. Ácido desoxirribonucleico. Portador de la información genética en las células, compuesto por dos cadenas complementarias de nucleótidos enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de dirigir la síntesis de RNA.
Apoplasto. Espacio extracelular periférico al plasmalema de las células vegetales por el que fluyen agua y otras sustancias.
Apresorio. Estructura adhesiva, achatada, a partir de la cual se origina una hifa afilada que rompe la cutícula de una célula epidérmica del huésped por punción permitiendo la penetración del micelio para establecer la infección de un hongo.
Árbol filogenético. Diagrama en forma de árbol que ilustra con sus ramificaciones descendencias y grupos emparentados.
Arquebacterias. [Gr. arjaía: las antiguas, singular: arqueon, arqueonte o arqueota]: son un grupo demicroorganismosunicelulares pertenecientes aldominioArchaea.
Brasinólidos. Sonuna especie de reguladores del crecimiento vegetal que promueven el crecimiento y aumenta el rendimiento.
Cepa. En microbiología, una variante fenotípica de una especie o, incluso, de un taxón inferior.
Clorofila. [Gr. chloros, verde + phyllon, hoja]: pigmentos verdes que actúan como receptores de la energía lumínica en la fotosíntesis.
Criopreservación. Proceso en el cual células, tejidos, órganos o individuos completos son congelados a muy bajas temperaturas para disminuir sus funciones y poder mantenerlo en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo.
Cultivos trampa. Permiten el desarrollo de esporas saludables y raíces micorrizadas, con las que se pueden llevar a cabo estudios morfológicos y
XIV
moleculares de diversidad de especies de HMA presentes en una muestra de suelo.
Decantación. Método mecánico de separación de mezclas heterogéneas, estas pueden estar formadas por un líquido y un sólido, o por dos líquidos.
Desnaturalización. Pérdida de la configuración nativa de una macromolécula que resulta, por ejemplo, del tratamiento con calor, de cambios extremos de pH, del tratamiento químico u otros agentes desnaturalizadores. Habitualmente está acompañada por pérdida de la actividad biológica.
Diploide. [Gr. di, doble, dos + ploion, nave, barca]: doble dotación cromosómica (2n) en la cual los cromosomas se encuentran en pares.
Electroforesis. Método de separaración de moléculas, consiste en someter la mezcla a un campo eléctrico de manera que las moléculas migrarán más o menos según su tamaño y su carga eléctrica. Puede ser una técnica preparativa para purificar o separar moléculas (proteínas, fragmentos de ARN óADN).
Encalado de suelos. Consiste en incorporar al suelo calcio y magnesio para neutralizar la acidez del mismo, es decir para que el pH alcance un nivel ideal para el desarrollo normal de los cultivos y al mismo tiempo reduzca el contenido del aluminio y manganeso tóxico.
Endocitosis. [Gr. Endon, dentro + kytos, célula]: proceso celular en el cual una porción de la membrana plasmática se repliega y genera una pequeña depresión en su lado externo que rodea a la sustancia que va a ingresar en la célula junto con una porción del material del medio extracelular. Luego, se produce un estrangulamiento de la membrana y se forma una vesícula intracelular o vacuola dentro de la cual está el material internalizado.
Endosimbionte. Organismo que habita en el interior de otro organismo.
Espectrofotometría de luz visible. Seocupa de las medidas de las cantidades relativas de la luz que se absorbe para una muestra particular, siempre en función de una longitud de onda.
Estrés. (Del inglés stress, ‘tensión’) es una reacción fisiológica del organismo en el que entran en juego diversos mecanismos de defensa para afrontar una situación que se percibe como amenazante o de demanda incrementada.
Germinación. [Lat. germinare, gemar]: inicio del crecimiento de una semilla o espora hasta que se generan los órganos básicos.
Hemólisis. (Eritrocateresis) es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes).
XV
Hifa. [Gr. hyphe, red]: un solo filamento tubular de un hongo o de un oomiceto; el conjunto de hifas constituye el micelio, el “cuerpo” con aspecto de maraña de un hongo.
Hospedero. En biología, se llama hospedador, hospedante y hospedero a aquel organismo que alberga a otro en su interior o lo porta sobre sí, ya sea en una simbiosis de parásito, un comensal o un mutualista.
Humedad relativa. La cantidad de vapor de agua contenida en el aire, en cualquier momento determinado, normalmente es menor que el necesario para saturar el aire. La humedad relativa es el porcentaje de la humedad de saturación, que se calcula normalmente en relación con la densidad de vapor de saturación.
Micotroficoo micótrofo. Que desarrolla micorrizas; puede ser micótrofo obligado si necesitan la micorriza para vivir, o micótrofo facultativo cuando puede prescindir de la micorriza.
Nativo. Relativo al lugar donde se ha nacido.
Nitrogenasa. Enzima utilizada por las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico para romper el nitrógeno molecular (N2) y combinarlo con hidrógeno para formar amoníaco (NH3). Es un complejo catalítico que consiste de dos unidades proteicas diferentes conocidas como dinitrogenasa y reductasa de dinitrogenasa.
Oligonucleótido. Secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50 nucleótidos. Tienen distintas funciones: se utilizan como cebadores en reacciones deamplificación, como sondas dehibridacióny enbloqueos específicosdeARN mensajero.
Patógeno. Esaquel elemento o medio capaz de producir algún tipo de enfermedad.
PCR. Reacción en cadena de la polimerasa. Técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de DNA, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una DNA polimerasa termorresistente. Reacción en cadena de la polimerasa.
Promotorde un gen. Esla región de ADN que controla la iniciación de la transcripción de dicho gen a ARN. Dicha región (el promotor) está compuesta por una secuencia específica de ADN localizado justo donde se encuentra el punto de inicio de la transcripción y contiene la información necesaria para activar o desactivar el gen que regula.
Propágulo. En biología es cualquier gérmen, parte o estructura de un organismo (planta, hongo o bacteria), producido sexual o asexualmente, capaz de desarrollarse separada para dar lugar a un nuevo organismo idéntico al que le formó.
XVI
Rizósfera. Es una parte del suelo que esta en contacto directocon las raíces donde tiene lugar una interacción dinámica con los microorganismos.
Sideróforos. [Gr.: transportador de hierro]: es un compuesto quelante de hierro secretado por microorganismos.
Simbiosis. Interacción entre dos o más organismos de especies diferentes, llamados simbiontes, en la que todos resultan beneficiados.
XVII
RESUMEN
Sinaloa ocupa el primer lugar como productor y exportador de garbanzo (Cicer
arietinum L.) en México, y produce un grano con alta calidad. Para lograrlo,
generalmente se emplean productos agrológicos sintéticos. Sin embargo, su
empleo degrada los suelos y los costos de producción se incrementan. En este
trabajose realizóla selección y evaluación de biofertilizantes nativos a base de
bacterias promotoras de crecimiento vegetal, bacterias fijadoras de nitrógeno y
hongos micorrízicos arbusculares (HMA). Para ello, se tomaron muestras de suelo
y raíces con nódulos de 11 campos de garbanzo generandouna colección de 864
aislados bacterianos de la rizósfera de garbanzo (RG), una colección de 96
aislados de nódulos de garbanzo (NG) y seis comunidades de HMA. Se
seleccionaron diez aislados productores de AIA (5-76 µM) de la RG, de los cuales
cincofueron capaces de solubilizar fosfato. El AIA producido por el aislado 476
indujo en plantas de Arabidopsis thaliana pDR5::GFP la expresión del gen GFP
con un promotor inducible específicamente por AIA y modificó su arquitectura
radical induciendo mayor número de pelos absorbentes. Los diez aislados
productores de AIA de la RGfueron identificados como bacterias del género
Enterobacter y Serratia, los cuales tienen antecedentes de promover el
crecimiento vegetal. En el bioensayo en maceta, la mejor respuesta en peso seco
en raíz fue la delos aislados 476 y 759. Se obtuvieroncuatro comunidades de
HMA a partir de suelo asociado a garbanzo mediante cultivos trampa con pasto
Brachiaria brizantha, presentando altos porcentajes de micorrización (41-98%). Se
determinó el numero más probable de propágulos infectivos de cada comunidad
(112-259 propágulos/100 g de suelo) y posteriormente se realizó la evaluación en
maceta con garbanzo sin presentar diferencias estadísticas significativas con
respecto al control en cuanto a productividad de biomasa. Los porcentajes de
micorrización fueron bajos (21.8-49.21%), sin embargo, una de las muestras de
suelofue capaz de nodular garbanzo, sugiriendo la presencia mixta de HMAs y
Mesorhizobium. Se cuenta con siete aislados de nódulosque fueron capaces de
sobrevivir a la criopreservaciíon, identificados como Bulkholderia y siete aislados
más por identificar y evaluar en trabajos posteriores.
XVIII
ABSTRACT
Sinaloa ranks first in Mexico as a producer and exporter of chickpea (Cicer
arietinum L.) producing high quality grain. To achieve such production, it is
required the use of synthetic products. However, its use causes soil degradation
and the increasein production costs. In this work, selection and evaluation of
biofertilizers was done based on native plant growth promoting bacteria, nitrogen-
fixing bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). Samples of soil and
nodulated roots fromeleven chickpea fields were taken to create a collection of
864 bacterial isolates from chickpea rhizosphere (CR), a collection of 96 isolates
from nodules of chickpea (NC) and six communities of arbuscular mycorrhizal
fungi (AMF). Ten isolates from the CR produced indol-acetic acid (IAA) and were
selected (5-76 µM).Five ofthem were able to solubilize phosphate. Isolate 476
produced IAA that showed to be biologically active in Arabidopsis thaliana
pDR5:GFP inducing GFP gene expression (pDR5 promoter is specifically
inducible by IAA), and it also modified root architecture in Arabidopsis
thalianainducing the formation of root hairs.Ten IAA producing isolates were
identified as CR bacteria of the genus Enterobacter and Serratia, which have been
reported to cause plant growth promotion.In pot bioassays, the best response in
root dry matter was observed with isolates 476 and 759. Four communities of AMF
were propagated from soil associated to chickpea with trap culturesin Brachiaria
brizantha. AMF showed high percentages of colonization in the trap cultures (41-
98%). We determined the most probable number of infective propagules for each
community (112-259 propagules/100 g). Then, the evaluation was conducted with
chickpea without showing statistical differences in biomass production with respect
to the control.Mycorrhization percentages were low (21.8-49.21%), however, one
AMF community was able to nodulate chickpea, suggesting the presence of a
mixed population of AMF and Mesorhizobium. Seven isolates from chickpea
noduleswere obtaines, and they were viable after cryopreservation, and identified
as Bulkholderia. Seven more isolateswill require to be identified and evaluated in
subsequent work.
1
1. INTRODUCCIÓN
En México, la producción de garbanzo del 2007 al 2009 fue de 389 mil
toneladas, situándolo en el tercer lugar a nivel mundial, sólo por debajo de la India
y Turquía. A nivel nacional, el estado de Sinaloa es el productor y exportador más
importante. Sin embargo, su consumo local es muy pobre, pero a nivel mundial el
garbanzo sinaloense es reconocido por su calidad (Fundación Produce Sinaloa,
2010).
Debido a que el garbanzo producido en Sinaloa está destinado al mercado
de exportación, es necesario producir un grano de alta calidad, y para lograrlo el
productor debe invertir en una serie de medidas que traen como consecuencia un
incremento en los costos de producción (Agronet, 2010). Una parte de estos
costos son destinados para la fertilización sintética, la cual es indispensable en
nuestros suelos ya que la disponibilidad de algunos nutrientes esenciales para las
plantas es muy pobre. Sin embargo, debido al exceso de fertilizantes sintéticos
empleados, su uso, lejos de mejorar nuestros suelos, los degrada (Armenta-
Bojórquez et al., 2010).
Una buena alternativa para disminuir los costos de producción, evitar la
contaminación del suelo y darle un valor agregado a la producción, es el uso de
biofertilizantes. Estos son microorganismos que, asociados a las raíces de las
plantas, mejoran, estimulan, protegen y facilitan el desarrollo de las mismas,
disminuyendo las dosis de fertilizante nitrogenado, fosforado u otros insumos
necesarios para un rendimiento rentable y de calidad (Bashan, 1998).
Un ejemplo de estos biofertilizantes son las bacterias promotoras de
crecimiento vegetal, las cuales inoculadas a la siembra inducen la germinación de
la semilla para luego colonizar la raíz, en donde transforman los exudados
radicales en sustancias promotoras del crecimiento vegetal (Gutiérrez-Manero et
al., 2001; Patten y Glick, 2002); tales como los microorganismos como Rhizobium,
que son bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas principalmente a leguminosas.
Otro tipo de biofertilizantes son los producidos por los hongos micorrízicos
arbusculares (HMA). Éstos forman un componente esencial en el sistema suelo-
2
planta optimizando el crecimiento y productividad de los cultivos (Kapoor et al.,
2004), mejoran la absorción de fósforo (P), nitrógeno (N) y micronutrientes
(Kapoor et al., 2007; Javaid, 2009). Además de jugar un papel importante en la
disminución de enfermedades y al estrés abiótico (Akthar y Siddiqui, 2008). Sin
embargo, es importante mencionar que los biofertilizantes son más eficientes si
provienen de microorganismos nativos, ya que la mayoría de los productos
comerciales no se aclimatan a las condiciones en donde son aplicados,
reduciendo su eficiencia y desarrollo. El presente trabajo tiene como objetivo
principal desarrollar inoculantes microbianos a partir demicroorganismos nativos
para el cultivo de garbanzo en Sinaloa.
3
2. ANTECEDENTES
2.1. El Garbanzo 2.1.1. Características generales
El garbanzo (Cicer arietinum), pertenece a la familia de las Fabaceas, es
una planta anual diploide cuya reproducción es por autogamia. Fue una de las
primeras leguminosas cultivadas en el viejo continente (van der Maesen, 1972).
El origen de este cultivo es del Suroeste de Turquía, y desde allí se extendió
hacia Europa principalmente en la región mediterránea, más tarde a África
fundamentalmente a Etiopía y en América a países como Canadá, México,
Argentina y Chile (Infoagro, 2002).
El garbanzo es una importante fuente de alimento rico en proteínas,
hidratos de carbono, fibra y minerales siendo un alimento muy balanceado. El
cultivo se adapta a un rango amplio de temperaturas, es resistente a heladas, no
así la flor y el grano tierno, y las temperaturas superiores a 25°C no son
favorables durante la floración y llenado de vainas. Es una planta que se
caracteriza por ser tolerante al déficit hídrico, en contrastea los demás cultivos
convencionales de la región de Sinaloa, sin embargo el déficit hídrico durante los
periodos de germinación, floración y llenado de vaina tiene consecuencias
negativas en el rendimiento. Este cultivo prefiere suelos francos, suavemente
inclinados, bien drenados, no tolera el encostramiento ni excesos de humedad
(García-Medina, 2002).
La planta puede alcanzar una altura de 60 cm, presenta un tallo principal
erecto, piloso, con colénquima muy desarrollado y cutícula gruesa, y de éste se
originan ramas primarias con ramificaciones abundantes. Sus foliolos presentan el
borde dentado, presentan abundante pilosidad, la cual es una característica muy
importante ya que los pelos presentan una secreción acuosa compuesta
principalmente por ácido málico (90-96%) y oxálico (4-9%) que ayudan a colectar
la humedad ambiental, lo cualayuda de manera significativa a que las plantas
mantengan su contenido hídrico y soporten los déficits de humedad (Fenalce,
2005). Las flores son papilionáceas, pequeñas y se ubican sobre pedúnculos muy
4
cortos (6-13 mm), éstos nacen en las axilas de las hojas ubicadas en los nudos
reproductivos, los cuales son considerados como losnudos de la mitad superior de
las plantas. Los frutos se presentanen vaina bivalva que miden aproximadamente
1 cm de ancho por 2.5-3 cm de largo de color verde, con una o dos semillas en su
interior que suelen ser algo arrugadas y su color puede ser blanco, crema,
amarillento, café, rojizo o negro pudiendo encontrarse distintas tonalidades dentro
de cada color (Infoagro, 2011). Sus raíces son profundas, normalmente alcanza
entre 40 y 50 cm de profundidad con un máximo de un metro bajo condiciones
óptimas. El sistema radical presenta cuatro filas de raíces laterales las cuales no
son muy numerosas, pero tienen una estructura firme y varias capas de corteza
secundaria que ayudan a la planta a tolerar la sequía (Saxena et al., 1996).
Por su baja demanda de agua de riego, el garbanzo es más competitivo
que otros cultivos que requieren mayor cantidad de agua como el maíz y las
hortalizas (INIFAP-CIRNO, 2003). Su cultivo es fácil y el período de crecimiento
es corto. Todos estos factores hacen que seaun cultivo muy importante que
pueda incorporarse al sistema de rotación con los cereales (Şahin et al., 2010).
Existen tres tipos de garbanzo de acuerdo al tamaño, forma y coloración de
las semillas. 1) Tipo Kabuli, grano de tamaño de medio a grande, redondeado y
arrugado, color claro con flores no pigmentadas. Su cultivo se localiza en la
región mediterránea, América Central y América del Sur. 2) Tipo Desi, grano
pequeño, forma angular y de color amarillo o negro. Flores y tallos pigmentados.
Se cultivan principalmente en la India. 3) Tipo Gulabi, grano de tamaño medio a
pequeño, liso, redondeado y color claro (Naghavi y Jahansouz, 2005).
2.1.2. Producción
Su producción abarca áreas de los subtrópicos áridos hasta zonas
tropicales (Ustimenko, 1982). Es una de las principales leguminosas cultivadas en
el mundo. Actualmente los principales productores son: India, Turquía, México,
Canadá, Estados Unidos, Australia, España y Argentina (Fundación Produce
Sinaloa, 2010).
5
Existen dos tipos de garbanzos en el mercado de acuerdo a su manejo: el
grano de color blanco o cremoso para consumo humano, y el grano café o
forrajero, el cual tiene una gran demanda como alimento molido (planta y grano)
para ganado por su alto contenido de proteína, y además, su uso permite reducir
la compra de alimentos balanceados de alto costo (Soltero-Díaz et al., 2008).
Sinaloa es el principal exportador a nivel nacional, seguido por Sonora y
Baja California. En el ciclo otoño-invierno 2010-2011 la producción en el estado
de Sinaloa fue de 52,680 toneladas (SIAP, 2010), con un rendimiento promedio
de 2 ton/ha, superior al promedio internacional de 1 ton/ha. El 90% de la
producción es para exportación hacia los países de España, Argentina y Asia
principalmente, buscando su expansión a nuevos mercados (Asiáticos, Europeos,
Medio Oriente y Africanos) (Fundación Produce Sinaloa, 2010).
Para una buena producción el cultivo de garbanzo necesita materia
orgánica, y lo mejor sería que las tierras dedicadas a este cultivo estuvieran bien
dotadas de este elemento (Carrera-Morales y Mateo-Box, 2005). Sin embargo, los
suelos de nuestra región se caracterizan por tener bajo contenido de materia
orgánica, este componente del suelo evita que los nutrientes se pierdan,
reteniéndolos y poniéndolos a disposición de las plantas (Baver et al., 1973).
Asimismo, el manejo tradicional de los ecosistemas agrícolas ha involucrado la
fertilización química, el uso de maquinaria para acondicionamiento del suelo y el
establecimiento de monocultivos, esto ha llevado a un desgaste y erosión de los
suelos (Toro et al., 2008). Estas medidas afectan al medio ambiente en general y
a los productores, desde el punto de vista económico (Şahin et al., 2010). En
consecuencia, se ha producido un creciente interés por una agricultura sostenible
y sistemas de agricultura orgánica.
Una alternativa para mejorar el estado nutricional de nuestros suelos es el
uso de fertilización biológica que permitan establecer su fertilidad, sin perturbar
y/o empeorar su condición (Dodd et al., 1990), y a su vez, incrementar los
rendimientos y dar un valor agregado al producto.
6
2.2. Biofertilizantes
Los biofertilizantes son preparados a partir de microorganismos y son
aplicados al suelo y/o planta con el fin de sustituir parcial o totalmente la
fertilización sintética, así como disminuir la contaminación generada por los
agroquímicos (Armenta-Bojórquez et al., 2010). La interacción directa o indirecta
con las plantas, o con el sistema radical favorece el aumento del desarrollo
vegetal y reproductivo de las plantas.
Para que el manejo de los biofertilizantes sea más eficiente, es importante
utilizar microorganismos nativos, debido a que la supervivencia de los
microorganismos introducidos puede serdifícil debido alas condiciones
ambientales de nuestro clima semiárido, como las sequías frecuentes, la falta de
suficiente irrigación, alta salinidad y erosión del suelo pueden disminuir
rápidamente la población de cualquier especie introducida en el suelo (Armenta-
Bojórquez et al., 2010).
2.2.1. Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (BPCV)
Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal a base de
bacterias (BPCV), son llamadas rizobacterias y generalmente provienen de un
cultivo puro del microorganismo aislado de la raíz de alguna planta de interés.
Estas bacterias se han aplicado a semillas, tubérculos o raíces, y son capaces de
colonizar las raíces de las plantas y estimular el crecimiento y rendimiento de
cultivos (Chanway et al., 1989). Algunos ejemplos de estas bacterias son:
Azotobacter, Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus,
Metanobacterium y Clostridium (Reis et al., 2000).
Los mecanismos del efecto de BPCV tienen un amplio rango de
posibilidades que incluyen efectos que consisten en síntesis de fitohormonas
(auxinas, giberelinas, citocininas y etileno), aumento en la movilización de los
nutrientes solubles y mejora de su absorción por las plantas (Kloepper, 1993; Glick, 1995), aumento en la fijación de N2 aumentando el número de nódulos de la
raíz y la actividad nitrogenasa (Zhang et al.,1996), y la producción de metabolitos,
7
como los antibióticos, sideróforos, enzimas, o fungicidas que disminuyen el
crecimiento de fitopatógenos (Glick, 1995).
Gholami et al. (2009) evaluaron el efecto como BPCV de seis cepas
(Pseudomonasputida cepa R-168, P. fluorescens cepa R-93, P. fluorescens
DSM50090, P. putida DSM291, Azospirillum lipoferum DSM1691, A. brasilense
DSM1690 de manera independiente en el cultivo de maíz. El experimento reveló
que la inoculación de las semillas con todas las bacterias resultó en un aumento
de altura de la planta, el área foliar y número de granos en mazorca.
Kloepper y Beauchamp (1992) demostraron que el rendimiento del trigo
aumentó hasta un 30% con inoculación de Azotobacter y hasta el 43% con la
inoculación de Bacillus. Rokhzadi et al. (2008) demuestran que la inoculación
combinada de BPCV (Azospirillum, Azotobacter, Mesorhizobium y Pseudomonas)
como biofertilizante mejora en un 80% el rendimiento y en un 50%la biomasa del
garbanzo en condiciones de campo.
Yadav et al. (2010) evaluó el efecto de BPCV sobre el crecimiento de la
planta de garbanzo de cinco cepas de BPCV designadas como Pseudomonas
aeruginosa BHUPSB02, P. putida BHUPSB04, Bacillus subtilis BHUPSB13,
Paenibacillus polymyxa BHUPSB17 y B. boronophilus BHUPSB19. La mayoría de
los aislados produjo un incremento significativo en la longitud del tallo (24-64%),
de la raíz (50-38%) y en la producción de materia seca de tallo (hasta un 43%) y
raíz (hasta un 63%) de las plántulas de garbanzo.
2.2.2. Fijación Biológica de Nitrógeno
La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción
de N2a NH4+por la enzima nitrogenasa es, después de la fotosíntesis, la ruta
metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biósfera.
Curiosamente, este proceso crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos
grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent y Sprent, 1990).
8
Se considera que la fijación biológica del nitrógeno es una de las
alternativas más viables para recuperar nitrógeno en el ecosistema (Kimball,
1980), y contribuye con180 millones de toneladas métricas de nitrógeno fijado por
año a nivel mundial, de los cuales las asociaciones simbióticas produce el 80%.
Esta capacidad de reducir y obtener tales cantidades de nitrógeno de la atmósfera
y enriquecer la tierra se limita a las bacterias y arqueobacterias (Graham, 1988;
Young, 1992).
2.2.3. Rhizobium
Lasbacterias que tienen la capacidad de formar nódulos en las raices de
leguminosas son del género Rhizobiuim. Cuando los rizobios colonizan las raíces
de las plantas no leguminosas en una relación no específica, las cepas de este
género se comportan como BPCV (Saharan y Nehra, 2011).
El garbanzo en simbiosis con una cepa eficiente de Rhizobium constituye
una asociación que puede llegar a suministrar entre 80 y 120 kg N/ha al suelo
(Küçük y Kivanç, 2008).
La taxonomía actual de los rizobios se basa en un enfoque
multidisciplinario que incluye morfología, bioquímica, fisiología, genética y
filogenia. Hasta la fecha se han propuesto 36 especies distribuidas en siete
géneros: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium,
Methylobacterium, Rhizobium y Sinorhizobium (Sahgal y Johri, 2003).
Las especies de rizobios que nodulan en garbanzo (Cicer arietinum L.) son
muy específicas (Gaur y Sen, 1979). Nour et al. (1994a, 1994b, 1995)
describieron a estas especies como: Rhizobium ciceri y R. mediterraneum. Dos
años más tarde, estas especies fueron retiradas del género Rhizobium y se
incluyeron en el nuevo género, Mesorhizobium (Jarvis et al., 1997). Sin embargo,
en los años 2001 y 2002 han sido aisladas en Túnez y Marruecos cepas de
garbanzo que probablemente pertenezcan a las especies Sinorhizobium medicae
y S. meliloti (Aouani et al., 2001; Maâtallah et al., 2002). Y, recientemente varias
9
cepas que nodulan garbanzo en España y Portugal han sido identificadas como
Mesorhizobium tianshanense y M. loti (Laranjo et al., 2004; Rivas et al., 2004).
En el cultivo de garbanzo los nódulos deben aparecer en la planta
aproximadamente a los 20 días después de la siembra e inoculación y las plantas
pueden ser infectadas en condiciones naturales si la temperatura interna del suelo
es mantenida por debajo de los 30ºC (Rupela y Dart, 1989).
Dibut et al. (2005), evaluaron la biofertilización con Mesorhizobium ciceri en
garbanzo cultivado sobre suelo ferralítico rojo. Ellos encontraron un alto índice de
colonización, número, peso y contenido de nitrógeno en nódulos cuando se
aplicaron dosis reducidas de hasta 70% de fertilizante nitrogenado. Los
rendimientos fueron de 1.2 ton/ha y no afectaron la calidad del grano. Qureshi et
al. (2009), evaluaron en campo el potencial de la inoculación de M. ciceri y
Azotobacter chroococcum sobre el rendimiento de garbanzo, obteniendo una
mayor producción de biomasa y granos, número y masa nodular y porcentaje de
nitrógeno y fósforoen la co-inoculación de estos microorganismos.
Se ha demostrado que la inoculación de bacterias solubilizadoras de
fosfatosmejoran la capacidad competitiva y la efectividad simbiótica de inoculados
de Rhizobium sp., por lo que tienen un gran potencial de ser formulados y
utilizados como biofertilizantes (Cakmakc et al., 2007; Kumar y Chandra, 2008;
Akthar and Siddiqui, 2009). Santillana et al. (2005) obtuvieron dos cepas de
Rhizobium en las que observaron un efecto significativo en la germinación y
crecimiento de plantas de tomate. Estos resultados se atribuyen a la producción
de hormonas como el ácido indol acético, ácido giberélico y citoquininas, y
sustancias reguladoras del crecimiento de las plantas, y no por la fijación de
nitrógeno (Dey et al., 2004; Yanni et al., 2001).
Sin embargo, cepas de Rhizobium que, aunque competitivas, provengan de
nódulos o suelos ajenos al sitio en cuestión corren el riesgo de verse afectadas
por la población de Rhizobium autóctono, el cual compite con las cepas
introducidas, dando lugar a un menor rendimiento (Al-Falih, 2002; Thies et al.,
1991). Esto sugiere que puede ser ventajoso utilizar los rizobios nativos aislados
10
de una zona específica como biofertilizantes abriendo una posible alternativa para
el enriquecimiento de los suelos con finesagrícolas (Cuadrado et al., 2009). Por
otra parte, Uribe y Acuña (1987) y Uribe et al. (1990), determinaron que la
producción de frijol no aumenta significativamente, cuando se inocula con rizobios
introducidos de otros países.
2.2.3.1. Proceso de nodulación
El proceso inicia cuando las raíces de las plantas secretan a la rizósfera
ciertos compuestos del tipoflavonoides, que sirven de señal y median la
especificidad de las leguminosas con los rizobios. En respuesta a estos
compuestos los rizobios activan una serie de genes implicados en la nodulación,
los cuales se conocen como genes NOD y producen los factores NOD, que son
glucosaminas unidas aun ácido araquidónico. Posteriormente al reconocimiento
ocurre la adherencia de la bacteria a la planta hospedera mediante una proteína
de anclaje (ricadesina) presente en la superficie de las células del Rizobium, ésta
se une al calcio presente en los extremos de los pelos radicales de la planta. Los
factores NOD inducen la deformación del pelo radical, enroscándose 360°, y
formando una estructura a la que se llama “cayado de pastor”. Entonces, la
bacteria penetra en el pelo radical e induce la formación, por parte de la planta, de
un tubo conocido como canal de infección; este canal es un tubo vacío en el que
se multiplican los rizobios. Cuando la infección alcanza a las células de la raíz
adyacente a los pelos radicales, los factores NOD estimulan la división de las
células vegetales corticales, dando origen al nódulo (Martin, 1977; Martínez y
Martínez, 1998; Strugaard, 2000; Hirsch et al., 2001).
Los rizobios son liberados desde el canal de infección al citoplasma de las
células corticales por un mecanismo similar a la endocitosis, quedando alojadas
en "vesículas" llamadas membranas peribacteroidal (MPB) derivadas de la
membrana citoplasmática de la célula de la planta. Ésta funciona de intermediario
de señales y nutrientes entre la bacteria y la planta (Redondo-Nieto et al., 2011).
La formación de la MPB es inducida por los factores NOD, por parte de
Rhizobium, y por fitohormonas como la auxina que funcionan como mensajeros
para sensibilizar las células vegetales. Cuando la división celular culmina, las
11
bacterias cambian de forma a unas estructuras hinchadas y deformes
denominadas bacteroides, que pueden llegar a ser hasta cuarenta veces más
grandes que los bacilos a partir de los que se desarrollaron. El sistema vascular
de la planta se extiende dentro del nódulo y transporta nutrientes hacia y desde el
nódulo. Los bacteroides inician el proceso de fijación de nitrógeno (Martin, 1977;
Martínez y Martínez, 1998; Strugaard, 2000; Hirsch et al., 2001).
La forma de los nódulos son determinados principalmente por la planta
hospedera, puede ser esférica, cilíndrica o circular. Los nódulos que se
encuentran activos son de mayor tamaño y presentan una coloración rojiza, que
se atribuye a la presencia de la proteína leghemoglobina. Esta proteína se ha
estudiado ampliamente, por su relación con la simbiosis. Actualmente se conoce
que el grupo hemo proviene de los bacteroides y la globina de la planta, su
principal función consiste en facilitar la difusión del oxígeno y regular sus niveles
dentro del nódulo. El oxígeno es requerido como transportador de electrones
dentro de la fijación de nitrógeno pero un exceso en sus niveles inhibe la actividad
de la nitrogenasa (Quispel, 1974; Martin, 1977).
2.2.4. Micorrizas arbusculares
Las micorrizas arbusculares son asociaciones ecológicamente mutualistas
que se establecen entre un selecto grupo de hongos (Glomeromycota) y la gran
mayoría de las plantas. Esta simbiosis no es tan específica como aquella
responsable de la fijación de nitrógeno atmosférico, debido a que la raíz de una
planta puede ser colonizada por varios hongos micorrízicos de diferentes
especies, inclusive a una misma vez, y con ello, establecer la simbiosis (Coyne,
2000).
Se estima que aproximadamente un 80% de las familias de plantas
existentes pueden formar dicha asociación (Trappe, 1987). En esta simbiosis el
hongo micorrízico arbuscular (HMA) forma diversas estructuras en el interior de la
raíz de la planta, específicamente en las células de la corteza. Entre estas están
las hifas y los arbúsculos, que son las estructuras donde se realiza el intercambio
de nutrientesentre el hongo y la planta (Smith y Read, 1997). Algunos hongos
12
micorrízicos arbusculares (HMA) forman vesículas en el micelio interno, las cuales
son estructuras de reserva de carbono del hongo. La mayoría de las especies de
HMAs forman estructuras de reproducción conocidas como esporas en la parte
externa del micelio y solo en algunos casos, desarrolla esporas de manera
interna. Entre el micelio externo se encuentran hifas especializadas, semejantes
en estructura a los arbúsculos conocidas como estructuras de absorción que
toman agua y nutrientes del suelo y los translocan al interior de la raíz a través de
las estructuras miceliares internas.
Los HMA forman un componente esencial en el sistema suelo-planta
optimizando el crecimiento y productividad de los cultivos, mejorando la absorción
de agua y de elementos poco móviles como P, Cu y Zn vía micelio externo e
interno (Smith y Read, 1997), y estimulando la fijación del nitrógeno en las plantas
asociadas a bacterias fijadoras de nitrógeno (Mortimer et al., 2008).
Además, aumentan la tolerancia a las enfermedades en las plantas
mejorando su nutrición y compitiendo con microorganismos patógenos por el
espacio en las raíces de las plantas (Gardezi et al., 2001; Rivera et al., 2002;
Elsen et al., 2003), inmovilizan algunos metales pesados y fertilizantes químicos
(Vogel-Mikuš et al., 2005; Huang et al., 2007). También presentan una mayor
tolerancia frente a muchos factores de estrés (sequía, desequilibrios en el pH,
altos contenidos de sales, exceso de viento, entre otros). Esto se debe a que
facilita una adecuada evapo-transpiración de la planta y un mejor funcionamiento
fisiológico de éstas en sentido general (Marulanda et al., 2003; Al-Karaki et al.,
2004). El empleo de las micorrizas en la agricultura significa un ahorro de insumos
y una mejor protección del medio ambiente (Cuenca et al., 2007). Por otra parte,
las plantas micorrizadas son capaces de hacer un mejor uso de los fertilizantes
orgánicos, debido a la producción de fosfatasas (Dodd et al., 1987; Joner y
Johansen, 2000), por aumentar el área de exploración en el suelo por las raíces
con las hifas de los hongos, y gracias a la asociación existente entre las hifas del
HMA y los microorganismos que participan en la mineralización de la materia
orgánica (Azcón-Aguilar y Barea, 1992).
13
En plantas de chile pre-colonizadas con Glomus intrarradices se obtuvo
una modificación de la arquitectura radical, un aumento de la actividad de las
enzimas peroxidasa y catalasa asociadas a respuestas de estrés, una menor
severidad de la enfermedad causada por Phytophthora capsici y el 100% de
supervivencia de las plántulas de chile (Espinosa-Victoria et al., 2004).
Por su parte, Manjarrez-Martínez et al. (2005), evaluaron en condiciones de
invernadero, el efecto de la fertilización foliar de fórmulas comerciales y la
inoculación con HMA en plántulas de chirimoya (Annona cherimola Mill). La tasa
fotosintética fue mayor en plantas inoculadas con el consorcio Glomus Zac-19; a
pesar de que no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Sin
embargo, el mayor contenido de clorofila, biomasa y contenido de nitrógeno foliar
se presentó en los tratamientos con Glomus Zac-19.
Se ha comprobado que la aplicación de diversas combinaciones de
microorganismos, hongos y bacterias en diferentes plantas, tienen efecto
sinérgico en la nutrición de la planta huésped y su correspondiente beneficio en el
desarrollo vegetativo y reproductivo; por ejemplo, Akthar y Siddiqui (2008),
observaron que la inoculación conGlomus intraradices, Pseudomonas straita y
Rhizobium sp. en garbanzo provocó un aumento significativo en el crecimiento de
la planta, número de vainas, clorofila, nitrógeno, fósforo y el contenido de potasio
en presencia del nemátodo Meloidogyne incognita y del hongo Macrophomina
phaseolina.
Tovar-Franco (2006) realizó una inoculación dual en alfalfa (Medicago
sativa L.) con Sinorhizobium meliloti, y con el hongo MA Archaeospora leptoticha,
demostrando la eficacia de la fertilización biológica, al incrementar los efectos del
encalado y fertilización química, aumentando el rendimiento y al mejorar en el
follaje el contenido de nitrógeno y fósforo.
2.2.4.1. Colonización de los Hongos Micorrizicos arbusculares
La colonización de una raíz por parte de un hongo micorrizógeno es un
proceso que involucra una secuencia de etapas reguladas en una precisa
14
interacción entre endosimbionte y hospedero. La pre-infección está asociada a la
actividad de los propágulos infectivos presentes en el suelo que circundan la raíz.
Dichos propágulos pueden ser esporas o micelios fúngicos. Este último,
generalmente se encuentra vinculado a raicillas de plantas vivas o segmentos de
raíz infectada. La penetración se inicia con la formación de un “punto de entrada”
que se caracteriza por el desarrollo de un abultamiento o apresorio en el punto de
contacto sobre la superficie de la raíz. Cada espora genera un solo punto de
entrada, mientras que un segmento de raíz puede eventualmente generar más de
uno. No es del todo claro si el mecanismo de penetración está mediado por un
evento enzimático, por un evento mecánico o por una combinación de ambos.
Una vez que el hongo ha penetrado, se asegura un proceso proliferativo
que conduce al establecimiento de una unidad de colonización que se puede
extender hasta un centímetro de distancia a partir del punto de penetración
(Dávila Rocha et al., 2009). El avance de la infección está restringido a la
epidermis y el parénquima cortical. La unidad de colonización avanza mediante el
crecimiento de hifas aseptadas que se extienden entre las células corticales y que
generan estructuras características como los arbúsculos y las vesículas.
Algunas semanas después de iniciada la infección, el hongo está en
condiciones de reproducirse asexualmente a través de la esporulación, la cual
está mediada por las condiciones ambientales del suelo, en particular, la
humedad parece ser un factor regulador de importancia, ya que se ha visto que el
estrés hídrico en el suelo dispara la esporulación (Guerrero et al., 1996). Las hifas
externas están en capacidad de re-infectar el mismo sistema de raíz del cual se
origina. Algunas de estas hifas generan “puntos de entrada” que provocan nuevas
unidades de colonización, lo cual supone que la infección avanza a lo largo de la
raíz a través de unidades de colonización discontinuas. Este proceso de
proliferación se puede trasladar a otros sistemas de raíz vecinos de la misma o
diferente especie de planta (Dávila-Rocha et al., 2009).
15
2.3. Antecedentes en el grupo de trabajo
Productores Unidos del Río Petatlán S.A. de C.V. (PURP) es una empresa
comercializadora de granos. Una de las principales actividades de PURP es la
producción y comercialización de garbanzo para consumo y semilla. El mercado
del grano de garbanzo es muy competitivo y la empresa comienza a reconocer la
producción de grano orgánico como un nicho con posibilidades de penetración en
el mercado internacional cada vez más demandante de este tipo de producto. En
asociación con PURP, INIFAP y nuestro grupo de trabajo hemos venido
realizando una serie de evaluaciones a nivel de campo, donde en el ciclo 2008-
2009 se realizó la inoculación de microorganismos comerciales no nativos
(Rhizobium, Azospirillum y micorrizas arbusculares) en parcelas en el campo
experimental INIFAP-JJR con tratamientos fertilizados y no fertilizados. Y en el
ciclo 2009-2010, se realizó la evaluación de microorganismos del suelo en
parcelas fertilizadas y no fertilizadas de la PURP. Los resultados más importantes
obtenidos en los dos ciclos mostraron que no existen diferencias estadísticas en
la producción y colonización de los microorganismos en el cultivo de garbanzo ya
sea al inocularse con productos comerciales o respecto a la adición de
fertilizantes químicos. Por lo que se propone que el utilizar aislados nativos de
microorganismos, pudiera incrementarla posibilidad de obtener mayores
rendimientos que los tratamientos sin fertilizar.
16
3. JUSTIFICACIÓN
El garbanzo (Cicer arietinum L.) es una de las principales leguminosas
cultivadas en el mundo, y Sinaloa es el productor y exportador más importante de
México conuna producción de 52,680 toneladas en el ciclo 2009-2010, lo cual
representa el 40% del total nacional. Debido a que este cultivo está destinado al
mercado de exportación, es necesario producir un grano de alta calidad y mayor
producción. Para lograr una buena producción se emplean variedades mejoradas
en México, y generalmente se emplean de manera inadecuada productos
agrológicos sintéticos. Sin embargo, con el empleo de estos productos los suelos
se degradan y los costos de producción incrementan.
Con el fin de disminuir estos efectos, se propone la búsqueda y empleo de
inoculantes microbianos nativos a base de bacterias promotoras de crecimiento
vegetal (BPCV), bacterias fijadoras de nitrógeno (Rhizobium) y de hongos
micorrízicos arbusculares (HMA) como un primer esfuerzo para disminuir las
cantidades de agroquímicos empleados para la producción de garbanzo y dirigirse
hacia la producción orgánica del mismo. Se recomienda que los inoculantes
microbianos a emplear sean cepas nativas debido a que estos presentan mayor
posibilidad de efectividad en el campo, por estar pre-adaptados a las condiciones
del suelo de cada región y evitar los riesgos que representa la introducción de
especies exóticas.
17
4. HIPÓTESIS
Al menos un tipo de microorganismo (BPCV, Rhizobium ó HMA) es capaz de
incrementar significativamente el crecimiento de garbanzo.
5. OBJETIVOS 5.1. Objetivo general: Seleccionar y evaluar microorganismos nativos del norte de Sinaloa enel cultivo
de garbanzo (Cicer arietinum L.).
5.2. Objetivos específicos:
1. Seleccionar, caracterizar y evaluar bacterias productoras de auxinas como
promotoras de crecimiento en garbanzo.
2. Seleccionar y evaluar comunidades de HMA en garbanzo.
3. Obtener aislados de Rhizobium en garbanzo.
18
Muestreos en campo de suelo asociado a garbanzo y raíces de garbanzo con nódulos
Creación de un banco de bacterias de la rizósfera de
garbanzo
Creación de un banco de bacterias a partir de nódulos
de garbanzo
Obtención de comunidades de HMA asociados a garbanzo mediante cultivos trampa
Selección de diez aislados productores de AIA por el
método de Salkowski
Caracterización de los aislados prod. de AIA
Evaluación de los aislados prod. AIA en maceta con garbanzo
Morfología y hemólisis
Funcionalidad biológica en A.
thaliana pDR5::GFP
Respuesta en arquitectura radical
en A. thaliana
Solubilizaciónde fosfatos
Identificación molecular
Determinación del NMP de propágulos
Evaluación de las comunidades de HMA
en maceta con garbanzo
Identificación molecular
6. METODOLOGÍA
6.1. Esquema general de trabajo
Figura 1. Esquema de trabajo
19
6.2. Muestreo
En el mes de enero del 2011, se realizaron muestreos en el municipio de
Guasave, Sinaloa en seis diferentes lotes de productores de PURP (Cuadro2) con
cultivo de garbanzo en etapa de floración y/o llenado de vaina. Encada lote se
tomaron cinco plantas con sistema radical (con nódulos) y suelo (para cultivos
trampa de HMA). Las muestras se depositaron en una bolsa de plástico
etiquetada con la siguiente información: nombre del lote, número de planta,
coordenadas de ubicación geográfica, tipo de fertilización y cultivo anterior) para
posteriormente ser transportado al laboratorio de Ecología Molecular de la
Rizósfera en el Departamento de Biotecnología Agrícola del CIIDIR IPN-Unidad
Sinaloa.
En febrero del 2011 se realizaron cinco muestreos más (cuadro 2): dos
lotes delcampo experimental Miguel Leyson, Guasave; dos lotes del campo
experimental INIFAP de Juan José Ríos, Guasave; y uno en la zona de
preservación ecológica de centro de población “La Uva” en Guasave, Sinaloa.Los
muestreos se realizaron bajo las mismas condiciones que los muestreos
mencionados anteriormente.
En el muestreo realizado en “La Uva” se tomaron muestras del suelo
asociado a diferentes especies de leguminosas, no a garbanzo. La finalidad de
este último muestreo fue para considerar las poblaciones microbianas que se
encuentran en un área conservada con una gran diversidad de bacterias rizobios
nativas del sistema de selva baja caducifolia prevalente en nuestro municipio que
pudieran interaccionar con garbanzo y que también pudieran presentar beneficios
para el desarrollo del cultivo de garbanzo.
6.3. Selección de bacterias productoras de auxinas a partir del banco de la rizósfera de garbanzo
Se obtuvo un banco de la rizósfera de garbanzo a partir de las
muestrasmencionadas en la sección anterior y siguiendo la metodología de
Cordero-Ramírez et al. (2012a y 2012b). El banco consta de 864 aislados
bacterianos, los cuales fueron criopreservados a -70°C en glicerol al 15%
20
enmedio LB (Figura 2), y distribuidos en nueve placas de 96 cavidades con un
volumen de 250 µl para su mantenimiento. Se realizaron tres copias de este
banco.
Figura 2. Banco de microorganismos aislados de nódulos de garbanzo y de la rizósfera de garbanzo. Microorganismos criopreservados a -70°C en glicerol al 15% en medio LB (Foto: Fierro-coronado, 2011).
El banco de la rizósfera de garbanzo fueevaluado para determinar el
potencial de la biosíntesis de ácido indolacético (IAA) en ausencia de triptófano
(precursor de la biosíntesis del AIA) por el método de Salkowski de acuerdo a
Glickmann y Dessaux (1995). Este es un método colorimétrico basado en la
oxidación que produce el ácido sulfúrico a las moléculas de indol, tal oxidación se
observa en el cambio de color de las muestras a tonos rosados, evidenciando la
presencia de moléculas presumibles como compuestos auxínicos (Glickmann y
Dessaux, 1995).
Los aislados se reanimaron sembrándolos en placas de 96 cavidades con 1
ml de medio LB, se incubaron en un agitador rotatorio a 200 rpm, a 25 °C
durante48horas, posteriormente cada placa se centrifugó por 25 min a 5,900 rpm
en una centrifuga Beckman Coulter (modelo Avanti J-30I, rotor tipo JS-5.9),
enseguidase tomaron 100 µl del sobrenadante bacteriano y se adicionaron100 µl
del reactivo Salkowski (20 g de FeCl3.6H2O por litro de H2SO47.9 M), la reacción
se incubó durante 30 minutos en oscuridad, a temperatura ambiente (Pilet y
Chollet, 1970). Se seleccionaron de manera visual los diez aislados que
presentaron la coloración rosada más intensa.
21
Finalmente, a los aislados seleccionados, se les realizó de nuevo esta
prueba, en esta ocasión, se cuantificó la producción de AIA. Una vez crecida la
bacteria en medio líquido se resembraron en placas de LB agar para observar la
pureza de las colonias. Las colonias puras se crecieron nuevamente en medio
líquido LB, se incubaron en un agitador rotatorio a 200 rpm, a 25°C durante 48
horas, y posteriormente se igualó la densidad óptica de los aislados y se continuó
con la metodología descrita para el método de Salkowski descrita arriba.
La reacción de Salkowski con los sobrenadantes bacterianos se realizó por
triplicado y se cuantificó espectrofotométricamente a 530 nm. Una curva estándar
fue creada usando LB con concentraciones conocidas de AIA (SIGMA No.
Cat.12886) por triplicado para determinar las concentraciones de AIA equivalente
de los aislados.
6.4. Caracterización de las bacterias productoras de auxinas
6.4.1. Caracterización morfológica y pruebas de hemólisis de los aislados
productores de AIA
La morfología colonial fue descrita a partir de colonias crecidas por 48
horas en placas de LB agar, registrando color, textura y forma de la colonia.
Además se realizó la tinción de Gram tomando una asada de una colonia y
homogenizándola en una gota de agua destilada sobre un cubre objetos. El frotis
se dejó secar a temperatura ambiente y posteriormente éste fue fijado concalor
suave sobre la flama de un mechero evitando el calor excesivo para que no
alterar la morfología bacteriana. Posteriormente, se cubrió el frotis por un minuto
con safranina, se lavó con agua destilada para eliminar el excedente de colorante
y se agregó lugol durante un minuto, se repitió el lavado con agua, y se tiñó
finalmente por un minuto con safranina haciendo un último lavado con agua
destilada. Se dejó secar a temperatura ambiente para su posterior observación al
microscopio.
22
Para conocer la capacidad hemolítica de los aislados microbianos, éstos
fueron crecidos en medio líquido LB en un agitador rotatorio a 200rpm, a 25°C
durante 48 horas. Posteriormente, se centrifugaron por 20 minutos a una
velocidad de 12,000 rpm, se recuperó el sobrenadante y se pasó a tubos nuevos
estériles. Se realizó una segunda centrifugación con el fin de eliminar todas las
células bacterianas. De este segundo sobrenadante se tomaron 100 µl y se
colocaron en un pozo de un cm de diámetro de placas con agar sangre, se dejó
secar la placa en campana de flujo laminar la placa hasta absorberse
completamente el sobrenadante. En uno de los pozos de la placa se agregaron
100 µl de medio LB estéril como control negativo de la hemólisis y/o
contaminación. Finalmente, las placas se incubaron a 37°C por 48 horas,
registrando cada 24 horas la actividad hemolítica.
6.4.2. Espectrofotometría de luz visible
El método de Salkowski no es específico para AIA, sino que también es
capaz de producir color en presencia de otras iso-formas de auxinas o moléculas
precursoras (Glickmann y Dessaux, 1995). Por lo anterior, se realizó una
espectrofotometría de barrido de 400 a 700 nm a la reacción de Salkowski con los
sobrenadantes de los diez aislados seleccionados visualmente a la par con AIA
(SIGMA) a concentraciones diferentes para comparar los picos de absorción (λmax)
y observar si los metabolitos producidos en los aislados son químicamente
similares al AIA y por lo tanto, presentan un espectro de absorción semejante a
esta molécula.
Una segunda espectrofotometría de barrido fue realizada a la reacción de
Salkowski adicionando diferentes tipos de controles tales como: ácido
indolacético, ácido indolbutírico, ácido naftalen-acético, y, de forma independiente,
a los elementos que participan en la reacción de Salkowski (sólo Salkowski, solo
AIA, NaOH, etc.).
23
6.4.3. Evaluación de la funcionalidad biológica del AIA producido por los aislados bacterianos en Arabidopsis thaliana pDR5::GFP
Con el fin de demostrar que los aislados seleccionados en la sección
anterior son activos a nivel fisiológico, se realizó un bioensayo con A. thaliana
transgénica (pDR5::GFP), la cual tiene una construcción con un promotor
inducible con AIA, acoplado a un gen reportero de proteína verde fluorescente, el
cual es inducido exclusivamente con altas concentraciones de AIA. Para este
bioensayo se eligió únicamente uno de los diez aislados que presentaron la mayor
producción de AIA equivalente.
Plántulas de A. thaliana pDR5::GFP de siete días y de crecimiento
homogéneo fueron sumergidas en 500 µl del sobrenadante bacteriano libre de
bacterias. Plántulas sumergidas en AIA (Sigma), medio LB y agua destilada estéril
fueron utilizadas como controles en esta prueba. Las concentraciones del
sobrenadante bacteriano y del AIA fueron calculadas y llevadas a la misma
concentración. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado a pH 7 y las
suspensiones fueron filtradas con un filtro de 0.45 µm previamente en campana al
momento de su aplicación.
Las plantas se incubaron por 14 horas sumergidas en los tratamientos a
temperatura ambiente y en condiciones de oscuridad. Posteriormente se tomaron
las hojas de A. thaliana y se colocaron en un porta objetos. Se colocó un
cubreobjetos encima de la hoja suavemente evitando la formación de burbujas y
se llevó al microscopio confocal (LEICA TCS SP5X) para observar la inducción de
fluorescencia en tejido foliar en ambos lados de la hoja (adaxial y abaxial). Se
tomaron fotografías bajo las mismas condiciones a todos los tratamientos para
que estos pudieranser comparados.
6.4.3.1. Cultivo de Arabidopsis thaliana en cajas petri con medio Murashige y Skoog (MS)
Las semillas de Arabidopsis thaliana pDR5::GFP se esterilizaron
superficialmente por inmersión con agitación, durante cuatro minutos, en una
24
dilución de 500 µl de hipoclorito de sodio al 1.2% con 0.5 µl de detergente Tritón
X-100. A continuación se realizaron tres lavados sucesivos con agua estéril. Las
semillas recién desinfectadas se mantuvieron a 4°C en ausencia de luz durante
tres días suspendidas en medio de agua-agar al 0.1% con el fin de sincronizar la
germinación de las semillas. Después, se realizó la siembra de las semillas en
placas petri con medio MS 0.5X con ayuda de una micropipeta. Por cada litro de
medio MS 0.5X se agregó: MS 2.16 g, sacarosa 5 g, agar 9 g, a pH 5.8, todo lo
anterior se realizó en condiciones asépticas.
Una vez hecha la siembra, las placas petri fueron selladas con papel
parafilm con el fin de impedir el intercambio de gases con el exterior, y fueron
incubadas en posición vertical a 20 ± 2°C y 60 % de humedad relativa, con ocho
horas luz/16 horas oscuridad en cámaras de crecimiento (marca Binder, Modelo
KBW 400) hasta el momento de su evaluación.
6.4.4. Respuesta del AIA en arquitectura radical en Arabidopsis thaliana
Además de evaluar la producción de AIA y la respuesta a nivel
transcripcional, se realizaron otras pruebas con el fin de obtener más información
que sugiera la capacidad de promover el crecimiento vegetal de estos aislados tal
como:
1. La respuesta del AIA del sobrenadante bacteriano en la arquitectura
radical en A. thalianay
2. La capacidad de los aislados para solubilizar fosfato tricálcico en placa
(descrita en la siguiente sección).
Una de las respuestas de las auxinas en las plantas es la reducción
longitudinal de la raíz principal e inducción de la producción de raíces laterales.
En base a esta información, se realizó lo siguiente: se prepararon cajas petri con
medio MS 0.5X modificado con los siguientes tratamientos: MS; MS+LB; MS+AIA
SIGMA (50 nM); MS+AIA bacteriano equivalente a 50 nM.
Se utilizaron tres plantas de A. thalianade tres días de crecimiento
homogéneo por placa, por triplicado. Las placas petri se mantuvieron en posición
25
vertical durante cinco días, a 25°C con 8 h luz/16 h oscuridad en cámaras de
crecimiento. Cada 24 horas se registró el crecimiento de la raíz principal y se
eliminó el exceso de humedad de la caja petri para evitar problemas de
contaminación. A los 5 días se midió y cuantificó el número de raíces laterales.
Adicionalmente, las raíces fueron sumergidas por 30 min en yoduro de propidio
(Sigma, No. Cat. P4170) a una concentración de 1 µg/ml en condiciones de
oscuridad. El yoduro de propidio es un colorante (agente intercalante del ADN)
que permite visualizar pared vegetal y núcleo en plantas (Copyring, 1999).
Posteriormente todo el sistema radical se colocó en un portaobjetos, y a
continuación se les colocó un cubreobjetos suavemente para evitar la formación
de burbujas y se llevó al microscopio confocal (LEICA TCS SP5X) para observar
los pelos absorbentes en raíz principal y raíces laterales. Se tomaron fotografías
bajo las mismas condiciones a todos los tratamientos para que estos puedan ser
comparados.
6.4.5. Evaluación de solubilización de fosfatos
Para esta prueba se empleo el medio agar de Pikovskaya (Pikovskaya,
1948), el cual contiene fosfato tricálcico insoluble 2.5 g, glucosa 13 g, (NH4)2
SO40.5 g, NaCl 0.2 g, MgSO4.7H2O 0.1 g, KCl 0.2 g, extracto de levadura 0.5 g,
agar 15 g, a pH 7.2 y se disolvió en 1000 ml de agua destilada.
Cien microlitros de cada cultivo conservado en agua destilada estéril
(dilución 10-6del cultivo bacteriano) se sembró en placas Pikovskaya y se
incubaron durante siete días. Posteriormente el índice de solubilización fue
calculado utilizando la siguiente fórmula de Edi-Premono et al. (1996):
IS = diámetro de la colonia + diámetro del halo
diámetro de la colonia
26
6.4.6. Evaluación de los aislados en garbanzo con antecedente de promover el crecimiento vegetal Los diez aislados con mayor producción de AIA equivalente del banco de la
rizósfera de garbanzo se evaluaron bajo condiciones de invernadero en garbanzo.
El sustrato empleado fue arena con vermiculita estéril (doble esterilización por una
hora a 121°C a 15 lb/pulg2 de presión) con una relación 1:1 (v/v) con pH 6.8 y
conductividad eléctrica (CE) de 0.14. Se utilizaron macetas de un kilogramo de
capacidad. Las semillas de garbanzo empleadas fueron variedad Costa 2004.
Esta variedad fue seleccionada debido a que presentó un mayor porcentaje de
germinación y pureza que la variedad Blanco Sinaloa bajo nuestras condiciones
de laboratorio. Las semillas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 5% por 10
minutos seguido de cinco lavados con agua destilada estéril.
Los aislados a evaluar fueron resembrados en tubos de ensaye con rosca
con 5 ml de medio LB estéril, partiendo de una colonia en placa, se incubaron a
25°C, 200 rpm durante 20 h. De este cultivo se tomaron 50 µl y se adicionaron
a50 ml de medio LB en matraz Elenmeyer de 125 ml incubándose a 25°C, 200rpm
durante 20 h. Posteriormente, se centrifugaron a 6,000 rpm por 10 min para
eliminar el medio de cultivo. Las bacterias se re-suspendieron en agua destilada
estéril y fueron llevadas a la misma densidad óptica y se tomó una alícuota de la
suspensión bacteriana de cada aislado para determinar el número de UFC/ml
presentes en cada inóculo. La inoculación se realizó en raíces de plántulas de
garbanzo de una semana después de ser sembradas. Las plántulas control fueron
inoculadas con agua destilada estéril.
El diseño fue completamente al azar, empleando 10 tratamientos y un
control inoculado con agua, con seis repeticiones por tratamiento. La fertilización
se realizó una vez a la semana con la solución nutritiva Long Ashton (Hewitt,
1966), los riegos se hicieron cada tercer día con agua estéril. Cuarenta días
después de la inoculación se evaluó peso seco de la parte aérea, y peso seco de
la raíz. Para el análisis estadístico se realizó un análisis no paramétrico y una
comparación de medias (Tukey, 0.05%).
27
Cuadro 1. Solución Long Ashton (Hewitt, 1966) modificada por Hernández-Ortega
(2011).
Solución “stock”
Cantidad de reactivo en peso (g L-1)
Cantidad de solución stock para preparar 1L
(mL)
KNO3 80.8 5.0 MgSO4.7H2O 73.6 5.0 Ca(NO3)2.4H2O 188.8 5.0 NaH2PO4.H2O 36.8 1.25 (0.33 mM de P)
2.50 (0.66 mM de P) 5.00 (1.33 mM de P)
Elementos traza 1.0 Solución de citratos (Adicionar antes de la fertilización)
5.0
Solución “stock” elementos traza ( Aforar a 1000 mL con agua destilada)
MnSO4.H2O 1.69 CuSO4.5H2O 0.25 ZnSO4.7H2O 0.29 H3BO3 3.10 NaCl 5.90 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.088
Solución“stock” de citratos: (Aforar a 1000 mL con agua desionizada destilada, agitar por unos minutos y llevar a autoclave para completar la disolución, almacenar en refrigeración)
Citrato férrico (FeC6H5O7)
4.9
Ácido cítrico (H3C6H5O7.H2O)
4.9
28
6.5. Selección de una comunidad de HMA
A partir del suelo obtenido en los muestreos se establecieroncultivos
trampa con garbanzo con el fin de obtener comunidades de HMA asociados a
este cultivo, sin embargo las plantas se enfermaron con hongos patógenos
presentes en los suelos empleados ya que éstos no pueden ser esterilizados. Por
lo tanto, se realizaron de nuevo los cultivos trampa empleando como “planta
trampa” al pasto Brachiaria brizantha.
6.5.1. Cultivos trampa con pasto (Brachiaria brizantha)
Para estos cultivos trampa se emplearon los lotes: L4, L7, L8, L9, L10 y
L11 en macetas de 1 kg, se adicionó arena estéril (doble esterilizaciónpor una
hora a 121°C a 15 lb/pulg2 de presión) y la muestra de suelo en capas,
quedando la muestra entre la arena estéril a una profundidad de 5 cm (Hamel,
1996). Las semillas de pasto se esterilizaron con etanol al 70% por 5 minutos,
hipoclorito de sodio al 1.2% por 10 minutos y cinco lavados con agua destilada.
Ya que el porcentaje de germinación de las semillas era bajo (50%) se sembraron
10 semillas por maceta para asegurar la germinación de dos plántulas por
maceta. Se montaron 4 macetaspor lote de suelo, con una distribución
completamente al azar en condiciones de invernadero (Figura 2). La fertilización
se realizó con solución nutritiva Long Ashton con baja concentración de fosfato
(0.33 mM, ver cuadro 1) dos veces/semana.
Después de dos meses de montados los cultivos trampa se tomó una
porción de raíces de una repetición de cada lote para medir el porcentaje de
colonización por HMA y una porción de sustrato de los cultivos trampa también
fue tomada para cuantificar número de esporas por gramo de suelo por el método
del tamizado y decantación húmeda seguido por centrifugación en gradiente de
sacarosa (Sieverding, 1991). Posteriormente se homogenizaron las cuatro
macetas de cada lote, incluyendo todo el sistema radical cortado en trocitos, estos
sustratos se almacenaron en bolsas de plástico bien etiquetadas en un cuarto frio
a 4°C para sus posteriores evaluaciones.
29
6.5.1.1. Determinación del porcentaje de micorrización
La cuantificación del porcentaje de micorrización se realizó según el
método de tinción con azul de Tripano de Phillips y Hayman, 1970: las raíces de
cada tratamiento se lavaron por separado con agua corriente para retirar todo
residuo de suelo y se preservaron en etanol al 50%, posteriormente las raíces
fueron cortadas en segmentos de 2 cm aproximadamente, se colocaron en
hidróxido de potasio (KOH) al 10% por 24 horas para clarificar las raíces. A
continuación se enjuagaron con agua corriente y se acidificaron con ácido
clorhídrico (HCl) al 1% por 10 min, pasado este tiempo se escurrió el exceso de
ácido sin lavar las raíces y se procedió a la tinción con azul de tripano en
lactoglicerol 0.05% durante toda la noche. Enseguida,se decantó el colorante y se
filtró para re-utilizarlo, las raíces teñidas se conservaron en lactoglicerina para su
posterior observación al microscopio para determinar el porcentaje de
micorrización.
El porcentaje de micorrización se determinó por el método del intercepto:
los segmentos de las raíces ya teñidas se arreglaron en portaobjetos. Luego se le
colocó un cubre objeto suavemente para evitar la formación de burbujas, y se
llevó al microscopio. El campo óptico del microscopio se movió a través de la
lámina, se utilizó el indicador de ocular como línea de intersección. En cada
intersección se registró la presencia o ausencia de alguna estructura del HMA. Se
examinaron al menos 100 intersecciones para cada muestra de raíz (Newman,
1966).
6.5.2. Evaluación del potencial infectivo
Esta evaluación se realizó con el fin de conocer la cantidad de propágulos
infectivos de HMA por cada 100 gramos de suelo en cada lote. Se eligieron los
cuatro lotes con mayor porcentaje de micorrización en los cultivos trampa con
pasto B. brizantha que pertenecieran a cuatro sitios diferentes. El potencial
infectivo se determinó utilizando el método modificado del número más probable
(NMP) de propágulos infectivos de Porter (1979) descrito por Bagyaraj y Stürmer
(2008).
30
Inicialmente se homogenizaron las cuatro repeticiones por lote, incluyendo
todo el sistema radical en trocitos. A partir de estas muestras de suelo y raíces, se
realizaron diluciones seriadas con arena estéril, con un factor de dilución de 10
(proporción 1:9), teniendo diluciones de 100 (muestra pura) hasta 10-4. Para
conseguir la dilución 10-1 se pesó 100 g de muestra y se colocaron en una bolsa
de plástico en la que se agregó 900 g de arena estéril, posteriormente se agitó
hasta homogenizar perfectamente. A continuación se utilizó esta dilución de 10-1
como sustrato inicial para conseguir la dilución 10-2 con el mismo procedimiento y
así sucesivamente hasta la dilución 10-4.
El suelo de cada dilución se colocó en rizoconos de plástico de 150 g de
capacidad en los que se trasplantaron plántulas de 3 cm de altura de B. brizantha
esterilizadas y pre-germinadas previamente en cámaras húmedas (charolas con
papel húmedo estéril y tapa). Se realizaron cinco repeticiones por dilución, dando
un total de 25 plantas por lote. Los rizoconos se distribuyeron en un diseño
completamente al azar dentro de una cámara de crecimiento (Binder KBW 400) a
25±2°C y 60% de humedad relativa, con 12 horas luz/12 horas oscuridad. Al
concluir las seis semanas del ensayo las raíces fueron teñidas con azul de tripano
(Phillips y Hayman, 1970) y la infección micorrízica se examinó en unmicroscopio
estereoscópico y la presencia o ausencia de infección se registró en cada una de
las réplicas.
El NMP de propágulos de HMA presentes en cada lote se calcula mediante
la fórmula: Log de Ω = (x) (log a) – K, con un intervalo de confianza del 95%
(Fisher y Yates, 1970).
Donde:
Ω= Número Más Probable de propágulos infectivos de HMA
x= Número total de réplicas con infección/número de réplicas por dilución
a= Factor de dilución (en este caso 10)
K = Valor obtenido de la Tabla VIII de Fisher y Yates (1970)
31
6.5.3. Evaluación de las comunidades micorrízicas en garbanzo Una vez que se determinó el número de propágulos micorrízicos de cada
uno de los lotes, se realizó el bioensayo en garbanzo para evaluar las
comunidades de HMA obtenidos en los cultivos trampa. Se utilizaron macetas de
un kilogramo, usando como sustrato arena y vermiculita estéril (doble
esterilización por una hora a 121°C a 15 lb/pulg2 de presión) con una relación1:1
(v/v), empleando como inóculo500 propágulos infectivos de HMA por maceta.
Cuatro tratamientos más un control (sin inóculo) y cinco repeticiones de cada uno
fueron utilizados. Se sembraron dos semillas de garbanzo en cada maceta,
después de una semana se realizó el aclareo, dejando una planta por maceta. La
fertilización se realizó cada tercer día con solución nutritiva Long Ashton bajo en
fosfato (0.33 mM), los riegos se hicieron cada tercer día con agua estéril.
Después de seis semanas se realizaron las siguientes evaluaciones: peso
de la materia seca de la raíz y parte aérea, y porcentaje de micorrización. Para
evaluar las comunidades de HMA se realizó un ANOVA y una prueba de
comparación de medias (Tukey, 0.05%).
6.6. Obtención de aislados de Rhizobium
Las raíces obtenidas en los muestreos de campo fueron lavadas
cuidadosamente con agua de la llave para eliminar restos de suelo, los nódulos se
cortaron de las raíces con ayuda de unas tijeras estériles. Posteriormente, los
nódulos fueron esterilizados superficialmente con lavados de etanol al 70% por
dos minutos; hipoclorito de sodio al 0.5% por diez minutos; finalmente se
realizaron cinco lavados con agua estéril. En cajas petri estériles se realizó la
molienda de los nódulos por separado. Del macerado resultante se tomó una
asada y se sembró por estría en placas con medio de extracto de levadura-
manitol con rojo congo (ELMARC), que contiene: manitol 12 g, K2HPO40.5 g,
MgSO4·7H2O 0.2 g, NaCl 0.1 g, extracto de levadura 15 g y agar 18 g y
sediluyóen un litro de agua destilada y ajustóa pH 6.8. Se autoclaveópor 15 min a
121 libras de presión, y antes de vaciar se adicionaron 10 ml del colorante rojo
congo (dilución 1:400 p/v).
32
Las placas se incubaron de 48 a 72 h a 28°C, las colonias resultantes con
morfología característica del género Rhizobium (color crema, textura mucosa y de
forma circular) fueron resembradasen medio ELMARC (Somasegaran y Hoben,
1994). Todos los aislados fueron criopreservados a -70°C en glicerol al 15% en
medio ELMA para sus posteriores análisis (Figura 1) en trabajos posteriores a
este trabajo de tesis.
6.7. Identificación molecular de los aislados bacterianos productores de auxinas y aislados de nódulos de garbanzo (Rhizobium)
6.7.1. Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN se realizó siguiendo el método de DNAzol
(Invitrogen, No. Cat. 10503-027). Los aislados evaluados en los bioensayos se
crecieron en medio LB para las bacterias productoras de auxinas y en medio
ELMARC para los aislados de nódulos, y se incubaron por 48 h a 28°C.
Posteriormente se tomó una asada de cada aislado y se pasó a un tubo Ependorff
con 100 µl de DNAzol. Se agitó vigorosamente y centrifugó por 10 minutos a
10,000 rpm, se recuperó la fase acuosa (sobrenadante) y se transfirió a un tubo
nuevo Ependorff. Se agregó 200 µl de etanol al 100%, se agitó por inversión de 3
a 4 veces y se incubó por 10 minutos a -20°C. Posteriormente, se centrifugó por
dos min a 8,000 rpm y se decantó cuidadosamente sin perder la pastilla. Se
agregó a la pastilla 500 µl de etanol al 75%, se mezcló por inversión de 3 a 4
veces y se centrifugó por 5 minutos a 6,000 rpm. Se decantó el sobrenadante
cuidadosamente, y se repitió el paso anterior. Finalmente, se dejó secar la pastilla
a temperatura ambiente y se resuspendió en 20 µl de agua destilada estéril ultra
pura.
6.7.2. Cuantificación de ADN
La cuantificación del ADN se realizó en el equipo Nanodrop (ND-8000), el
equipo fue calibrado con 1.5 µl de agua ultra pura. Se utilizó 1.5 µl de la muestra,
entre cada medición para limpiar la celda del Nanodrop. Se registraron las
lecturas en ng/µl.
33
6.7.3. Reacción en cadena de la polimerasa
Para la amplificación por PCR del ADN ribosomal de los aislados se
utilizaron los oligonucleótidos F2C (5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’) y C (5’-
ACGGGCGGTGTGTAC-3’) los cuales amplifican una región de aproximadamente
1.6 Kb. Se realizó la siguiente mezcla de reacción en un volumen de 25 µl: 17.25
µl agua ultrapura; 0.75 µl de MgCl2 50 µM, 1 µl de los oligonucleótidos 1 y 2 (10
µM), 1.25 µl de dNTPs 10 µM, 0.25 µl Taq DNA polimerasa (5 U/µL) y 1 ó 10 ng
de ADN templado. Las condiciones del programa de PCR para amplificar el ADNr
son las siguientes: desnaturalización por 4 min a 95ºC, 1 min a 95ºC; anillamiento
1 min a 60ºC; elongación 2 min a 72ºC, esto repetido por 32 ciclos; y un paso final
de elongación de 5 min a 72ºC.
6.7.4. Visualización de los productos de PCR
La visualización de los productos de PCR se realizó por electroforesis en
geles de agarosa al 1%, utilizando el marcador de peso molecular 1 Kb plus DNA
Ladder (Invitrogen No. Cat. 10787-018). Se usó bromuro de etidio adicionado a la
agarosa para poder visualizar las bandas bajoluz ultravioleta, y los resultados se
documentaron en un fotodocumentador (Chemidoc Universal Hood II de Biorad,
CA, EUA).
6.7.5. Purificación de los productos de PCR, cuantificación y secuenciación del ADN
Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit Qiaquick PCR
Purification Kit (Qiagen, EUA, Cat. No. 28106). El ADN se cuantificó empleando el
Nanodrop (ND 8000).Cuatrocientos ng de las muestras de ADN amplificado se
secaron en un horno a 50°C durante toda la noche y se enviaron a secuenciar de
manera bidireccional a CINVESTAV-Unidad Irapuato, empleando un equipo ABI
Prism 3100.
34
6.7.6. Análisis de las secuencias
Las secuencias obtenidas se compararon en la base de datos del National
Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.gov/)
empleando el software BLAST-N. Se determinó la similitud de las secuencias
obtenidas con organismos que mostraran más del 90% de identidad como criterio
de identificación. El árbol filogenético se realizó con el software MEGA 5 Beta
(Tamura et al., 2011). Las secuencias se alinearon usando el software de
alineamiento de secuencias múltiple clustal W (Larkin et al., 2007) implementado
en MEGA 5. El árbol filogenético se construyó con el método de neighbour-joining
(NJ) (Saitou y Nei, 1987) y el modelo de sustitución de Kimura de dos parámetros.
La tasa de variación fue modelada por una distribución gamma, con cinco
categorías. La solidez de la topología de NJ se evaluó mediante la prueba de
bootstrap usando 1 000 réplicas. Para generar el árbol filogenético se incluyeron
las secuencias de los diez aislados del banco de la rizósfera de garbanzo
productoras de AIA y cepas de referencia de los géneros más cercanos. Como
grupos externos se utilizó a Pectobacterium carotovorum y Proteus vulgaris.
35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Muestreos En total se realizaron 11 muestreos en el municipio de Guasave (Cuadro
2), uno de los cuatro municipios de mayor producción de garbanzo en el estado
de Sinaloa, los otros tres municipios en orden consecutivo en cuanto a la
producción de garbanzo en Sinaloa son: Guamúchil, Culiacán y Los Mochis
(SIAP, 2010). Ocho de los lotes de garbanzo eran de la variedad Blanco Sinaloa y
dos lotes de la variedad Costa 2004.
Cuadro 2. Lista de los lotes muestreados para la toma de suelo y/o raíces para obtener BPCV, Rhizobium y HMA.
Código Nombre del lote Coordenadas Variedad del cultivo N W
L1 Pedro Herrera/ PURP 25°33.023´ 108°23.124´ Blanco Sinaloa
L2 Álamo/ PURP 25°31.975´ 108°22.422´ Blanco Sinaloa
L3 Los chiles/ PURP 25°31.412´ 108°22.152´ Blanco Sinaloa
L4 Chamony/ PURP 25°28.964´ 108°21.177´ Costa 2004
L5 Mussot/ PURP 25°27.206´ 108°19.303´ Blanco Sinaloa
L6 El águila/ PURP 25°27.155´ 108°19.109´ Blanco Sinaloa
L7 Miguel Leyson 25°30.512´ 108°22.640´ Blanco Sinaloa
L8 Miguel Leyson 25°30.502´ 108°22.677´ Costa 2004
L9 INIFAP-JJR 25°46.409´ 108°48.224´ Blanco Sinaloa
L10 INIFAP-JJR 25°46.408´ 108°48.226´ Costa 2004
L11 La Uva 25°46.400´ 108°48.208´ Suelo asociado a leguminosas
36
7.2. Selección de bacterias productoras de auxinas a partir del banco de la rizósfera de garbanzo
Para la selección de BPCV se buscaron aquellas bacterias productoras de
auxinas. Las auxinas son hormonas vegetales y el ácido indol acético (AIA) es el
más importante de ellos en cuanto a cantidad y actividad. El AIA es una auxina
natural con importantesefectos fisiológicos, que juega un papel relevanteen el
crecimiento y desarrollo de las plantas.
Una de las técnicas más utilizadas para la detección de bacterias
productoras de AIA es mediante el uso del reactivo de Salkowski. Esta es una
técnica simple, rápida y económica que permite el análisis de numerosos
sobrenadantes bacterianos. En nuestro análisis con la reacción de Salkowski, de
un total de 864 aislados del banco de la rizósfera de garbanzo, 74 aislados dieron
algún tipo de coloración rosada, de estos últimos se eligieron los siguientes diez
aislados con mayor intensidad: 417, 464, 476, 715, 727, 741, 758, 759, 859 y 860
(Figura 3).
Figura 3. Pruebas con Salkowski. A) Reacción de Salkowski de los 10 aislados seleccionados del banco de la rizósfera de garbanzo (tres filas debajo de la línea) y curva de calibración (tres filas sobre la línea). B) Concentraciones de AIA producidas por los aislados ajustados a una misma densidad óptica para homogenizarlos. Letras iguales son similares estadísticamente (Tukey 0.05%).
37
El intervalo de concentración de AIA producido por los aislados fue de 5.35
a 76.41 µM. Arshad y Frankenberger (1998) y Zahir et al., (2000) reportan que la
adición de triptófano (Trp) como un precursor de auxina aumenta sustancialmente
la producción de auxinas. En este trabajo no se empleó este precursor, sin
embargo, las concentraciones son comparables con aquellos aislados que fueron
crecidos con Trp.
Asghar et al., 2002 cuantificaron en diferentes rizobacterias productoras de
AIA, concentraciones que van de 65.47–140.41 µM. Khakipour et al. (2008)
evaluaron cincuenta aislados de Pseudomonas fluorescens y P. putida donde las
concentraciones fueron de 0-180.37 µM y de 0-137.45 µM respectivamente.
Resultados similares encontró Yadav (2010) con aislados de P. putida, P.
aeruginosa, Bacillus subtilis, P. polymyxa y B. boronophillus con una producción
de 146.12, 121.86, 92.64, 90.13 y 62.78 µM de AIA respectivamente, empleando
100 mg/ml de triptófano en todos los casos anteriores.
Sin embargo, es importante mencionar que en los microorganismos existen
al menos tres vías metabólicas para la biosíntesis del AIA a partir del Trp (Patten
y Glick, 1996), denominadas vía del indol 3-pirúvico (AIP), ácido 3-acetamida
(AIM) y de la triptamina (Tam), y adicionalmente se ha descrito una vía que no
requiere de este precursor para la biosíntesis del AIA y que es denominada vía
independiente del Trp, principalmente en plantas(Aguilar-Piedras et al. 2008), por
lo que nuestros aislados no necesariamente producirían mayor AIA al adicionar el
aminoácido Trp. Sin embargo, en la mayoría de las bacterias se ha comprobado
que la biosíntesis para el AIA es dependiente del aminoácido.
38
7.3. Caracterización de las bacterias productoras de auxinas
7.3.1. Caracterización morfológica y pruebas de hemólisis de los aislados productores de AIA Los diez aislados bacterianos formaron colonias circulares de ~4 mm de
diámetro, de color crema, borde irregular y elevación convexa con textura suave
al ser crecidas por 48 horas a 25 °C en placas de LB agar.
Todos los aisaldos fueron bacilos Gram negativos. Esta morfología
microscópica es característica de la mayoría de las rizobacterias que han sido
objeto de estudio con potencial para ser evaluadas en la promoción de
crecimiento vegetal, por ejemplo de los géneros Azotobacter, Azospirillum,
Bacillus, Burkholderia, Enterobacter y Pseudomonas.
A dichos aislados se les analizó su capacidad hemolítica la cual reveló,
entodos los casos, una hemólisis parcialmuy limitada, esto sugiere que su posible
patogenicidad al humano es baja, comparada a los aislados que son β-
hemolíticos o con hemólisis total.
7.3.2. Espectrofotometría de luz visible
Empleando espectrofotometría de luz visible haciendo un barrido de 450 a
600 nm se logró demostrar que los picos máximos de absorción de los
sobrenadantes de los aislados son similares al AIA, a excepción del aislado 741 y
417, los cuales presentaron un comportamiento diferente (Figura 4A). En el caso
del aislado 741 el espectro de absorción no presentó un pico máximo de
absorbancia en el barrido, esto se le puede atribuir a la baja concentración de AIA
que produce el aislado. Mientras que para el aislado 417 su pico máximo no es
similar al del AIA, esto puede serdebido a que el aislado esté produciendo un
compuesto precursor para la síntesis del AIA, o un compuesto cercano al AIA, el
cual da reacción colorida en el ensayo de Salkowski. Glickmann y Dessaux (1995)
demostraron con tres versiones diferentes de esta técnica, que no solo se detecta
39
AIA en la reacción, sino también ácido indol-pirúvico e indolacetamida, ambos
precursores en la ruta de la biosíntesis del AIA.
En un segundo barrido se incluyó ácido indol-butírico IBA (un tipo de auxina
que tiene un anillo indol y un diferente grupo radical al AIA) y al ácido
naftalenacético ó NAA (el cual presenta un mismo grupo radical que el AIA pero
carece de anillo indol). En este análisis se demuestra que la reacción es
específica para aquellas moléculas que contengan el anillo indol y un grupo
radical similar al AIA (Figura 4B). Además se encontró que los elementos del
reactivo no interfieren en la reacción cuando se encuentran en forma
independiente, al no observar picos de absorción (Figura 4B).
Figura 4. Especificidad de la reacción de Salkowski para el AIA. A) picos máximos de absorción del AIA (0, 125 y 200 µM, en rojo) y de los aislados seleccionados presentando el mismo comportamiento que el AIA a excepción del 417. B) comparación del AIA y del aislado representativo 476 con Salkowski (S), un control con un anillo indólico y diferente grupo R (IBA + S), un control sin anillo indólico pero con el mismo grupo R (NAA + S) y otros controles que incluyen los reactivos empleados en la reacción de Salkowski.
7.3.3. El AIA proveniente de aislados bacterianos produce una respuesta fisiológica en Arabidopsis thaliana pDR5::GFP
La suspensión bacteriana del aislado 476 logró inducir la expresión de la
proteína verde fluorescente en A. thaliana pDR5::GFP demostrando que el AIA
sintetizado por este aislado es funcional a nivel fisiológico (Figura 5 y 6).Esta
respuesta fue observada en estomas del lado adaxial de las hojas (Figura 5) y en
BAAb
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)Longitud de onda (nm)
Abso
rban
cia
40
el sistema vascular visto en el lado abaxial de las mismas (Figura 6). Las plantas
control que fueron expuestas a medio LB únicamente mostraron autofluorescencia
en respuesta al AIA que se produce naturalmente en las raíces. Sin embargo,
exhiben una fluorescencia muy débil comparándolas con las plantas que se
expusieron a AIA sintético y AIA bacteriano, donde la fluorescencia fue más
brillante. Nakamura et al. (2003) realizaron un ensayo similar en Arabidobsis, pero
en este caso la inducción específica fue para DR5::GUS empleando AIA sintético
y brasinólidos de manera independiente.
Figura 5. Inducción de fluorescencia por el AIA producido por el aislado 476 en Arabidopsis thaliana pDR5::GFP en estomas de las hojas del lado adaxial. En la columna de la izquierda se observa en color rojo la clorofila (640-700 nm), en el centro de color verde (496-540 nm) los estomas y en la columna derecha la sobreposición de las dos imágenes anteriores. La fila de arriba muestra el tratamiento testigo con LB, donde la fluorescencia de los estomas es
41
muy débil, mientras que en los tratamientos con AIA (fila del medio) y medio de la bacteria 476 (fila de abajo) presentan mayor brillo en la fluorescencia. La toma de todas las imágenes se llevaron a cabo exactamente con los mismos ajustes en el confocal para asegurar que los datos puedan ser comparables.
Figura 6. Inducción de fluorescencia por el AIA producido por el aislado 476 en Arabidopsisthaliana pDR5::GFP en el sistema vascular de las hojas del lado abaxial. En la columna de la izquierda se observa en color rojo la clorofila (640-700 nm), en el centro de color verde (496-540 nm) el sistema vascular y en la columna derecha la sobreposición de las dos imágenes anteriores. La fila de arriba muestra el tratamiento testigo con LB, donde la fluorescencia de los estomas es muy débil, mientras que en los tratamientos con AIA (fila del medio y abajo) presentan mayor brillo en la fluorescencia. La toma de todas las imágenes se llevaron a cabo exactamente con los mismos ajustes para asegurar que los datos puedan ser comparables.
42
7.3.4. Respuesta del AIA en la arquitectura radical en Arabidopsis thaliana
La síntesis de fitohormonas como las auxinas, particularmente el ácido
indolacético, promueven el crecimiento de las raíces y la proliferación de pelos
radicales, mejorando la absorción de agua y minerales del suelo y con ello un
mayor desarrollo en biomasa de la planta (Sarabia-Ochoa et al., 2010).
Dado que la planta de Arabidopsis nos permite obtener resultados en un
período corto de tiempo se evaluó la respuesta de la fitohormona producida por el
aislado 476 en la arquitectura radical de esta planta.
En los controles MS, es decir la condición en donde las plántulas de
Arabidopsis fueron colocadas solo en medio MS, y MS + LB, el desarrollo de la
raíz principal fuemayor con respecto a los tratamientos con AIA (Figura 7).
Mientras que la respuesta en la producción de raíces laterales fue la opuesta, ya
que la longitud de la raíz fuemenor en los controles y mayor en los tratamientos
con AIA. En esta misma evaluación se observó un número similar de raíces
laterales en todos los tratamientos. Las fotografías presentadas en la figura 7 son
de una placa representativa de cada tratamiento de un experimento que incluyó
tres placas por tratamiento. Los experimentos se desarrollaron por triplicado con
resultados similares. Sin embargo, al calcular la densidad de raíces laterales,
dividiendo el número de raíces laterales entre la longitud de la raíz principal, la
densidad fue claramente mayor en presencia del AIA sintético y/o AIA producido
por el aislado 476 y estadísticamente diferente a los controles (MS, MS + LB)
(Figura 8). Además, en el microscopio confocal se observó que en presencia de
AIA, los pelos absorbentes son abundantes y largos, mientras que en ausencia de
AIA, éstos son cortos y escasos (Figura 9). Estos resultados indican que la
producción de auxinas por los aislados bacterianos tienenun efecto fisiológico de
promoción del sistema radical de la planta medido como inducción de raíces
laterales en cuanto a su longitud y zona de absorción de nutrientes, lo que podría
traducirse en una planta con mejor crecimiento y desarrollo.
43
Figura 7. Arquitectura radicalde Arabidopsis thaliana en placas con medio MS modificado.A) Plantas crecidas en medio base MS; B) MS + LB (tipo de medio empleado para crecer los aislados; C) MS + AIA sintético (50 nM); D) MS + AIA bacteriano equivalente a 50 nM. E) En el gráfico se representa cuantitativamente el crecimiento de la raíz principal de los tratamientos a través del tiempo por cinco días. SB indica sobrenadante bacteriano. (Foto: Fierro-Coronado, 2012).
Late
ral R
ootD
ensi
ty(L
R n
umbe
r/ pr
imar
yRoo
tLen
ght)
MS MS MS MS+LB +IAA +BLBS
MS MS MS MS+LB +IAA +BLBS
Late
ral R
ootL
engh
t(m
m)
B
B
A A
Long
itud
de ra
íces
late
rale
s (m
m)
Den
sida
d de
raíc
es la
tera
les
B B
AA
MS+SBMS+AIAMS+LBMSTratamientos
MS+AIAMS+LBMS MS+SBTratamientos
A B
Figura 8. Densidad y longitud de las raíces laterales de A. thaliana. A) Densidad de las raíces laterales. B) Longitud de las raíces laterales. Datos obtenidos a partir del bioensayo de la figura 6. Letras iguales no presentan diferencias estadísticas (Tukey 0.05%).SB indica sobrenadante bacteriano.
44
Figura 9. Inducción de pelos absorbentes en A. thaliana por AIA, vista en microscopio confocal. A, B y C: Raíz principal desarrollada en MS + LB, MS + AIA (50 nM) y MS + SB (50 nM AIA equivalente) respectivamente. D y E: Raíz lateral en medio MS + AIA (50 nM) y MS + SB (50 nM AIA equivalente) respectivamente. 7.3.5. Evaluación de solubilización de fosfatos
De los diez aislados productores de AIA, cinco fueron capaces de
solubilizar fosfato (Cuadro 3). Los resultados obtenidos en cuanto al índice de
solubilización (IS) de fosfato de nuestros aislados van desde 1.36 hasta
1.77.Índices reportados en otras especies son similares a los encontrados en este
trabajo; por ejemplo, Alam et al. (2002) analizaron la capacidad de solubilizar
fosfato de diez aislados obtenidos de la rizósfera de maíz, de los cuales los IS
fueron de 1.63-3.29. Por su parte, Hariprasad y Niranjana (2009) encontraron un
IS de fosfato de 1.1 hasta 3.1 en rizobacterias del cultivo de tomate. Mientras que
Madhan-Chakkaravarthy et al., 2010 encontraron que la cepa PB08 (Bacillus sp.)
tiene un alto IS que varióde 2-4.8.
La capacidad de solubilización de fosfato por un aislado bacteriano puede
ser un indicador del potencial a ser empleado como biofertilizante. Por lo tanto, el
45
uso de estos microorganismos en la agricultura no solo compensa los altos costos
de los fertilizantes sintéticos, sino que también ayuda a la movilización del fósforo
insoluble en los fertilizantes y suelos a los que se aplican (Rodríguez y Fraga,
1999; Chang y Yang, 2009).
Cuadro 3. Índice de solubilización de fosfato (IS). Cinco de los diez aislados fueron capaces de solubilizar fosfato tricálcico.
AISLADOS IS
417 1.4
464 1.45
476 1.51
715 --
727 1.77
741 --
758 --
759 --
859 1.36
860 --
7.3.6. Evaluación de los aislados con antecedentes de promover el crecimiento vegetal
Se inoculó un promedio de ~3 x109 UFC por plántula de cada uno de los 10
aislados seleccionados a plántulasde siete días. Treinta días post-inoculación se
realizó la cosecha de los tratamientos. En el peso seco de la parte aérea no se
observaron diferencias estadísticas, aunque existe una tendencia de un aumento
de biomasa en los tratamientos 476, 758 y 859 (Cuadro 4). El motivo de que no
exista ningún efecto significativo en follaje es, posiblemente, poreltiempo que duró
el experimento, debido a que éste no fue suficiente para observar el efecto de las
bacterias en follaje. Esta respuesta tiene relación con los resultados obtenidos en
Arabidopsis en donde observamos un efecto en la proliferación de raíces laterales
y pelos absorbentes, debido a que en la literatura se reportaque en etapas
tempranas la respuesta de las plantas a BPCV es observada en la raíz.Por
46
ejemplo, Pereira et al. (1988) y Kloepper et al. (1991) reportan que las bacterias
promotoras de crecimiento como P. fluorescens, se caracterizan por incrementar
el desarrollo radical, lo que repercute directamente en el rendimiento del cultivo.
Sin embargo, en el peso seco de la raíz sí se obtuvieron diferencias
estadísticas (Cuadro 4). Los aislados 476 y 759 son los que mostraron una mejor
respuesta de promoción de crecimiento en el sistema radical de garbanzo,
seguido por los aislados 715, 758, 859 y 860, mientras que los demás aislados no
mostraron diferencias con respecto al control.
El mejor tratamiento en peso seco fue con el aislado 476, el cual fue el
mayor productor de AIA y es capaz de solubilizar fosfato tricálcico. Sin embargo,
el aislado 759, que fue estadísticamente igual al 476 en cuanto a su respuesta de
promoción de crecimiento radical (Cuadro 4), produce bajas concentraciones de
AIA y no solubiliza fosfato. La respuesta favorable de este aislado se le pudiera
adjudicar a que las raíces de la planta podría haber liberado L-triptófanoa través
de losexudados de la raíz lo que pudiera resultar en una mayor producción de
auxinas en la rizósfera (Asghar et al., 2002). Otra posibilidad es que el aislado 759
estéproduciendo otros tipos de fitohormonasque no fueron analizados en este
trabajo yque pudieran causar un efecto positivo en biomasa radical (Lifshitz et al.,
1987; Frankenberger y Arshad, 1995).
En contraste, el aislado 727, a pesar de que produce altas concentraciones
de AIA y es capaz de solubilizar fosfatos, no fue capaz de promover el aumento
de peso seco de raíz. Estos resultadospueden ser atribuidos a que la población
de bacterias establecidas en laraízno fue suficiente para ver un efecto positivo en
biomasa debida aestosmetabolitos. Si bien, en condiciones in vitro esta bacteria
puede producir AIA y solubizar fosfatos, no necesarimente estas capacidades se
van a expresar in vivo (Kamilova et al., 2007; Nimnoi y Pongsilp, 2009; Cordero-
Ramírez et al., 2012a), ya que los ambientes son muy diferentes (Barea y Azcón-
Aguilar, 1982).
Los resultados observados en el bioensayo en maceta del aislado 476
complementan los obtenidos en A. thaliana, ya que el AIA producido en buena
47
cantidad por este aislado fue capaz de aumentar la densidad de raíces laterales,
aumentar los pelos radicales responsables de la absorción de nutrientes en A.
thaliana y aumentar la biomasa radical en garbanzo.
Cuadro 4.Peso seco (PS) de raíz y follaje en plantas de garbanzo con 30 días post-inoculación de bacterias productoras de AIA.
Tratamientos PS Raíz (mg)* PS Follaje (mg)*
Control 131.3 ± 42.1c 561 ± 106.6a
417 147.2 ± 9.4c 609.5 ± 92a
464 161.8 ± 6.9bc 538.5 ± 90.4a
476 228.5 ± 34.8a 711.5 ± 102.3a
715 183.5 ± 23.3ab 589.8 ± 139.7a
727 139.8 ± 7.0c 690.3 ± 60.0a
741 158.3 ± 27.7bc 658.5 ± 130.9a
758 188.3 ± 20.5ab 747.8 ± 103.6a
759 225.3 ± 55.3a 642 ± 109a
859 201.3 ± 61.0ab 705.5 ± 208.2a
860 185.5 ±30.5ab 654.3 ± 103.6a
Biomasa ± desviación estándar. Medias con la misma letra dentro de la misma columna son estadísticamente iguales (Tukey 0.05%). *n = 3. 7.3.7. Identificación molecular de los aislados productores de AIA
Los diez aislados productores de AIA fueron identificados molecularmente. El
análisis de las secuencias obtenidas del ADN ribosomal (región del genoma
bacteriano empleda como huella genética) mostró una identidad del 98 al 99% a
especies del género Enterobacter y Serratia (Cuadro 5). Se realizó un árbol
filogenético con las secuencias obtenidas e incluyendo secuencias de referencia
de estos géneros. El grupo I contiene nueve de los diez aislados, los cuales
fueron identificados como Enterobacter sp.yel grupo II contiene únicamente al
aislado 741, identificado como Serratia sp. (Figura 10).
48
Ambos géneros pertenecen a la misma familia: Enterobacteriaceae. Estas
bacterias son habitantes comunes del suelo y han sido reportadas como
organismos endofíticos vegetales. Esta última característica es muy importante en
un organismo con potencial a ser empleado como agente de promoción de
crecimiento ya que los organismos son capaces de crecer de manera interna en
los tejidos vegetales y de manera inter-celular (entre célula y célula) en el
apoplasto de la planta. Los organismos que crecen de esta manera son ideales
agentes de control del crecimiento porque crecen en estrecha relación con la
planta y sin factores externos que pudieran evitar su establecimiento. Además,
existen diversos reportes para ambos géneros acerca de su capacidad de
promover el crecimiento vegetal, comportarse como antagonistas, producir AIA, y
solubilizar fosfato, entre otras (Lavania et al., 2006; Koo y Cho, 2009; Shoebitz et
al., 2009; Ahemad y Khan, 2010; George et al., 2012).
Cuadro 5. Porcentajes de identidad de especies homólogas a los aislados de la rizósfera de garbanzo productores de AIA
Aislados Especie Porcentaje de identidad
417 Enterobacter ludwigii 98%
464 Enterobacter cloacae 98%
476 Enterobacter cloacae 99%
715 Enterobacter cancerogenus 98%
727 Enterobacter cloacae 99%
741 Serratia marcescens 99%
758 Enterobacter cancerogenus 99%
759 Enterobacter cancerogenus 98%
859 Enterobacter cloacae 99%
860 Enterobacter cloacae 99%
49
Figura 10. Árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16S del ADNr de los aislados productores de AIA asociados a garbanzo. Los números indican el porcentaje de veces que el alineamiento se mantiene en el árbol. La barra indica el número de sustituciones como distancia genética en el árbol.
Pantoea sp. HE716892
Enterobacter cloacae JQ993364
Enterobacter ludwigii NR_042349
Pantoea endophytica AF130902
Enterobacter cancerogenus Z96078
Enterobacter sp. (417)
Enterobacter hormaechei GQ900611
Enterobacter sp. (715) Enterobacter sp. (759)
Citrobacter freundii NR_028894
Enterobacter sp. (464)
Enterobacter sp. (727)
Enterobacter sp. (859)
Enterobacter sp. (476)
Enterobacter sp. (860)
Enterobacter cloacae subsp. Dissolvens NR_044978
Enterobacter dissolvens Z96079
Enterobacter sp. AM231085
Enterobacter cloacae EU797674
Serratia sp. (741)
Serratia marcescens subsp. marcescens NR_041980
Serratia marcescens subsp. sakuensis NR_036886
Serratia nematodiphila NR_044385
Pectobacterium carotovorum NR_044980
Proteus vulgaris NR_025336
50.7%
64.5%
64.2%81.8%
84.9%61.9%
72.1%
99.9%
100%
85.2%
89.9%
88.2%
75.3%
0.004
Gru
po I
Gru
po II
50
7.4. Selección de una comunidad de HMA
7.4.1. Cultivos trampa de HMA con pasto (Brachiaria brizantha) De los 11 puntos muestreados, sólo se evaluaron seis lotes para los
cultivos trampa en pasto, el resto de los lotes se perdieron por contaminación con
hongos patógenos. El problema principal en este primer ensayo fue que se usó
garbanzo como planta trampa, y ya que en este proceso se empleó suelo
directamente de campo, el cual contiene microorganismos patógenos de
garbanzo, las plantas trampa se infectaron.
Los criterios para la selección de una planta trampa son que sea
micotrófica (que desarrolla micorrizas), de buen crecimiento, compatible a un
amplio rango de HMA, de fácil manejo y poda, que sea perenne, y tolerante a
plagas y enfermedades (Salas y Blanco, 2000). Además, es recomendable el uso
de plantas monocotiledóneas (Ferguson y Woodhead, 1982), debido a sus hábitos
vigorosos de crecimiento y desarrollo fibroso radicalrápido. Por lo anterior, se
decidió usar al pasto Brachiaria brizantha (Figura 11). Esta gramínea presenta
una elevada capacidad de asociación micorrízica y no es susceptible a los
patógenos que se asocian al garbanzo.
Figura 11. Cultivos trampa con pasto Brachiaria brizantha en condiciones de invernadero (Foto: Fierro-Coronado, 2011).
Después de un período de dos meses de crecimiento de B. brizantha se
tomó una réplica de cada uno de los lotes para medir el porcentaje de
micorrización, los resultados indican altos porcentajes de micorrización, que van
51
desde el 41% hasta el 98% (Cuadro 6). En las raíces micorrizadas se observaron
las estructuras características de los HMA: esporas, vesículas, micelio aseptado y
arbúsculos (Figura 12). Para inducir la formación de un mayor número de
esporas, las plantas de B. brizanthase sometieron a una condición de estrés por
sequíadurante una semana, para posteriormente muestrear y homogenizar las
raíces de las plantasde cada lote sin repetir la medición de esporas ni
colonización.
Cuadro 6. Porcentajes de micorrización en los cultivos trampa con pasto (Brachiaria brizantha). La letra y número e el nombre de la muestra corresponde al número del lote, y el número después del guión se refiere a la repetición analizada.
NOMBRE SITIO % COLONIZACIÓN # ESPORASN W RAÍZ SUELO
L4-2 PURP 25° 28.964' 108° 21.177' 84.16 *L7-4 Miguel Leyson 25° 30.512' 108° 22.640' 41.13 *L8-1 Miguel Leyson 25° 30.502' 108° 22.677' 98.14 *L9-3 INIFAP 25° 46.409' 108° 48.224' 98.74 *
L10-2 INIFAP 25° 46.408' 108° 48.226' 96.15 *L11-1 La UVA 25° 46.400' 108° 48.208' 67.92 *
COORDENADAS
* Plantas de pasto con pobre producción de esporas de HMAs en suelo sin la condición de estrés por sequía.
F
100X 400X 400X
400X 400X 400X
Hifa Vesícula Espora Hifa
Hifa
Espora Esporas Arbúsculos
Figura 12. Raíces micorrizadas de pasto B. brizantha.
52
7.4.2. Evaluación del potencial infectivo
Para la realización de esta evaluación se eligieron cuatro de los seis lotes
utilizados en los cultivos trampa debido a los bajos porcentajes de germinación
(menos de 20%) y a la presencia de hongos patógenos en las semillas de pasto
B. brizantha. Fue necesario esterilizar más de mil semillas para completar las
diluciones para los cuatro lotes a evaluar eligiéndose los lotes con mayor
porcentaje de micorrización y tomando en cuenta los cuatro sitios empleados en
los cultivos trampa: PURP, Miguel Leyson, INIFAP y la Uva. Una vez cosechadas
las diluciones se determinó el número de propágulos viables los cuales se
muestran en elCuadro 7.
Estos resultados no pueden ser comparados con la literatura ya que en los
trabajos reportados no se ha realizado la secuencia que se siguió en este trabajo:
masificar y purificar el inóculo de campo mediante cultivos trampa y
posteriormente determinar el NMP de propágulos viables, para finalmente realizar
la evaluación de las comunidades de HMA obtenidas. Lo que se reporta
generalmente es la obtención de esporas de suelo de campo únicamente y éstas
son usadas como inóculo directamente, o bien se determina el NMP a partir de
muestras de campo sin el empleo de cultivos trampa.
El lote de PURP (L4) e INIFAP (L9) fueron los que presentaron el mayor
número de propágulos con 250 propágulos viables por cada 100 g de suelo para
ambos lotes, mientras que el de La uva (L11) presentó el menor número de
propágulos: 112 por cada 100 g (Cuadro 7). Estos resultados muestran que los
lotes que presentan perturbación agrícola (L4 y L9) presentan más HMA que en la
zona no perturbada (L11) lo cual no concuerda con Bethlenfalvay (1992) quien
reporta que las prácticas intensivas de manejo agrícola afectan negativamente a
la asociación micorrízica. Sin embargo, nuestros resultados pueden haber variado
a lo reportado en la literatura debido a las condiciones prevalecientes en los
cultivos trampa (toma de muestra, tipo de planta trampa, factores abióticos,
etcétera).
53
Cuadro 7. Número más probable de propágulos viables presentes en los lotes empleados en el bioensayo y cantidad de inóculo necesario para emplear 500 propágulos por réplica de cada tratamiento.
Lote NMP/100 g suelo Cant. de inóculo (g)
PURP (L4) 250 200
M. Leyson (L8) 175 285
INIFAP(L9) 250 200
La Uva (L11) 112 480
7.4.3. Evaluación de las comunidades micorrízicas en garbanzo
En la evaluación de las comunidades de HMA en maceta no se observaron
diferencias significativas entre los tratamientos en las variables de peso fresco y
peso seco en follaje y raíz (Cuadro 8). Sin embargo, el tratamiento L8, presentó
los valores más altos en todas las variables de biomasa con respecto a los otros
tratamientos, además, en todas las réplicas del L8 se observó nodulación,
mientras que en los lotes L9 y L4 se observaron pequeños nódulos en formación.
En los controles y en el L11 no se observó esta simbiosis. Resulta interesante ver
que los rizobios hayan sobrevivido a las condiciones de almacenamiento y hayan
sido capaces de nodular a garbanzo después de que el sustrato se mantuvo a
4°C por un período de un año ya que esto nos permitiría almacenar el inóculo de
rizobios en suelo y refrigeración puesto que se observó que los rizobios asociados
a garbanzo no soportan el tratamiento de criopreservación (ver siguiente sección)
y ésta pudiera ser una manera alternativa de preservar a las rizobacterias por
períodos largos de tiempo.
Los porcentajes de micorrización fueron bajos en el bioensayo: de 21.8 a
49.2%, siendo los lotes L4 y L8 los que presentaron mejor colonización con 49.2 y
45.56% de micorrización respectivamente.
Los resultados obtenidos en biomasa pudieran haber sido afectados por las
condiciones de volumen de la macetay el tiempo de desarrollo de la planta, ya
54
que la planta de garbanzo es muy robusta y la maceta que se utilizó era de tan
solo 1 L de volumen, y el tiempo del experimento, probablemente no fue suficiente
para ver un efecto de la simbiosis. Además, de que la respuesta de la planta
puede variar en función del grado de dependencia entre los simbiontes endófitos y
la planta hospedante, así como del grado de colonización.
La actividad fúngica representa un costo para la planta, la cual aporta la
fuente carbonada requerida para el desarrollo del hongo (Sylvia et al., 1993;
Ferrera-Cerrato y Alarcón, 2008). Nogueira et al. (2004), señalan que durante el
establecimiento de la simbiosis, la demanda del hongo por carbono de la planta
es mayor que su aporte nutricional, y por lo tanto esta demanda se traduce en una
depresión transitoria del crecimiento en las plantas durante las primeras etapas
después de la inoculación.
Sin embargo, es importante mencionar que a pesar de que no se
observaron resultados positivos en cuanto al aumento de la biomasa en el
garbanzo existen otras ventajas importantes para este cultivo, tales como
protección al estrés hídrico, al pH ácido del suelo y contra patógenos, evita la
degradación de los suelos y contribuye a la regeneración del mismo favoreciendo
indirectamente el desarrollo del cultivo (Cuenca et al., 2007). Además, los HMA se
caracterizan por ser capaces de asociarse con los microorganismos que
participan en la mineralización del suelo (Azcón-Aguilar y Barea, 1992) y por ser
capaces de producir fosfatasas (Dodd et al., 1987; Joner y Johansen, 2000).
Todas estas ventajas hacen que las plantas micorrizadas sean capaces de hacer
un mejor uso de los fertilizantes sintéticos u orgánicos.
55
Cuadro 8. Biomasa y porcentaje de micorrización en garbanzo.
Tratamientos PF follaje PS follaje PF raíz PS raíz % myc
Control 7.9 ± 1.91 a 1.21 ± 0.32 a 9.25 ± 1.71 a 0.57 ± 0.17 a 00.00
L4 6.9 ± 1.28 a 1.14 ± 0.18 a 7.13 ± 1.84 a 0.50 ± 0.10 a 49.21
L8 8.5 ± 0.61 a 1.35 ± 0.10 a 8.33 ± 1.37 a 0.59 ± 0.15 a 45.56
L9 7.6 ± 1.25 a 1.23 ± 0.25 a 8.05 ± 2.37 a 0.50 ± 0.08 a 27.00
L11 7.6 ± 1.05 a 1.26 ± 0.17 a 8.09 ± 2.34 a 0.55 ± 0.15 a 21.80
Biomasa en gramos ± desviación estándar. Medias con la misma letra dentro de la misma columna son estadísticamente iguales (Tukey 0.05), n = 5. 7.5. Obtención de aislados de Rhizobium en garbanzo
Se creó un banco de 96 aislados obtenidos de nódulos de garbanzo
muestreados en campo. Durante la criopreservación perdieron viabilidad cerca del
90% de los aislados, por lo que esta estrategia no es la más adecuada para la
conservación de este tipo de microorganismos. Esto ha sido también reportado en
otros trabajos (Linscott y Boack 1960; Coghlan 1967) Sin embargo, existen
microorganismos, en que esta estrategia ha sido muy efectiva (Cordero-Ramírez
et al., 2012a).
Siete aislados se lograron reanimar y fueron identificados molecularmente.
La identificación molecular arrojó como resultado que todas estas bacterias
pertenecían al género Burkholderia ypresentaron una identidad del 98-99% con
Burkholderia terricola. Las especies de este género son microorganismos que
poseen la capacidad de crecer dentro de las plantas de manera endofítica. Ésta
característica las hace particularmente muy difíciles de cultivar y estudiar. Sin
embargo, poseen una gran ventaja desde un punto de vista biotecnológico, ya
que pueden ser introducidas de manera muy efectiva a una planta al crecer
intercelularmente dentro de las raíces de la misma.
Especies de este género se caracterizan por ser fijadoras de nitrógeno y
presentan actividad de la enzima ACC desaminasa (implicada en disminuir los
niveles nocivos de etileno en plantas estresadas o en desarrollo y promover su
crecimiento). Poseen capacidad de solubilizar fosfatos e inhibir el crecimiento de
hongos fitopatógenos (Caballero-Mellado et al., 2006). Por este motivo, se
56
propone que estos siete aislados del género Burkholderia sean evaluados como
potenciales promotores de crecimiento vegetal en trabajos futuros.
Es interesante el hecho de que estos organismos hayan sido aislados de
nódulos de garbanzo, pudiendo sugerir una interacción con las rizobacterias del
género Rhizobium presentes en los nódulos. Aunque recientemente se acepta, en
general, que las leguminosas no son noduladas exclusivamente por miembros de
la familia Rhizobiaceae (α-proteobacteria) si no que también pueden ser
noduladas por especies del grupo de las β-proteobacterias, en donde se ubicael
géneroBurkholderia (Moulin et al., 2001). Por ejemplo, en Taiwán y Sudamérica
se han aislado varias cepas de Burkholderia a partir de nódulos de Mimosa sp.
(Chenet al., 2005, 2006; Sheu et al., 2011)
Además, se reporta que este tipo de bacterias son capaces de crecer de
manera endosimbiótica en esporas de HMA (Bianciottoet al., 1996,2000), por lo
que incluir este tipo de bacterias en un cocktail para combinar diferentes
organismos como biofertilizantes pudiera ser algo muy novedoso y quizás ofrezca
alguna ventaja en cuanto a la productividad del cultivo y/o captación de nutrientes
por la planta de garbanzo.
Por otra parte, se realizó un nuevo muestreo y se colectaron nódulos de los
cuales se obtuvieron siete nuevos aislados los cuales se conservan en placas de
agar en refrigeración en lugar de congelación. Estos aislados serán identificados
molecularmente y en caso de resultar rizobacterias, se emplearán para realizar
pruebas de nodulación en garbanzo en trabajos posteriores.
57
8. CONCLUSIONES Se probó la hipótesis de este trabajo de tesis, ya que al menos un tipo de
microorganismo fue capaz de inducir el crecimiento de garbanzo en cuanto a biomasa en raíz.
Objetivo 1.
Los diez aislados de bacterias del banco de la rizosfera de garbanzo se caracterizaron como productores de auxinas (5-76 µM) y algunos (cinco aislados) como solubilizadores de fósforo.
Los mejores aislados (476 y 759) en promover el crecimiento en planta de garbanzo evaluado al inicio de floración presentaron una respuesta significativa aumentando el peso seco de raíz por tener el AIA un efecto directo sobre ésta.
Los aislados de bacterias promotores de crecimiento fueron evaluados solamente en producción de AIA y solubilización de fosfatos. Sin embargo, los resultados sugieren que producen otros metabolitos que promueven el crecimiento.
Objetivo 2.
Los consorcios de HMA presentaron diferencias en su capaciad de infectar las raíces de garbanzo variando lo porcentajes de infección de 21.8 a 49.21%.
Objetivo 3.
De los aislados obtenidos de nódulos de garbanzo se obtuvieron bacterias contaminantes identificadas como Burkholderia, género reportado como de bacterias fijadoras de nitrógeno, con capacidad de solubilizar fosfatos e inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos.
Siete aislados más fueron obtenidos con características de Rhizobium en un segundo muestreo, los cuales serán identificados y evaluados en trabajos posteriores.
58
9. PERSPECTIVAS
Se propone medir nutrientes en tejido foliar almacenado a -70°C de los ensayos con las bacterias productoras de AIA y comunidades de HMA para complementar los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis.
Se recomienda repetir la evaluación en maceta de los mejores aislados productores de AIA y de las cuatro comunidades de HMA mejorando las condiciones del bioensayo. Se sugiere modificar el fotoperíodo a períodos de días cortos y calidad de luz. Esto en base a experimentos recientes con otro tipo de lámparas de mayor espectro de luz visible/UV y de modificaciones en el fotoperíodo. Éste es un factor muy importante ya que si la planta se encuentra en mejores condiciones de iluminación y produce fotosintatos de una manera más adecuada, el aporte de carbono que pueda hacerle al HMA y el efecto de la interacción planta-hongo puede resultar beneficiada.
También se sugiere revisar factores como temperatura, humedad, tamaño de maceta y cantidad de inóculo, los cualespueden ser optimizados con la finalidad de obtener resultados contundentes sobre el efecto de las comunidades en el crecimiento de la planta de garbanzo. Es necesario seguir masificando mediante cultivos trampa en gramíneas a las comunidades de HMA para que éstas no se agoten y puedan seguir evaluándose.
Se sugiere hacer cultivos trampa con garbanzo para la obtención de rizobios presentes en los consorcios de HMA de los lotes L8, L9 y L4. Los cuales mostraron capacidad de nodular garbanzo bajo las condiciones empleadas en el bioensayo de las comunidades de HMAs.
Los aislados de Burkholderia deben ser evaluados en maceta con garbanzo como promotoras de crecimiento ya que existen antecedentes que sugieren pudieran tener esta capacidad.
Hace falta realizar más pruebas de caracterización de todos los aislados bacterianos seleccionados en este trabajo con el fin de obtener mayor información de cada uno de ellos, y se sugiere realizar pruebas a nivel invernadero y posteriormente pruebas en campo para validar el efecto promotor de crecimiento de los aislados bacterianos.
En el futuro, sería interesante poder evaluar la combinación de los tres tipos de biofertilizantes y poder llegar a pruebas en campo con estos microorganismos.
59
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