SECUENCIAMIENTO

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INTRODUCCION

El término “secuencia” designa la composición de nucleótidos en un trozo de ADN.

Ese trozo de ADN puede corresponder a un gen, un genoma, o una parte de ellos.

Secuenciar permite determinar el tipo y orden de sus nucleótidos.

Para obtener el genoma basta secuenciar una sola copia del ADN.

En el humano se secuencian

aprox. 3.400 millones de pb.

¿QUÉ ES Y EN QUE CONSISTE LA SECUENCIACIÓN DE ADN?

Es una técnica en la que se hace un análisis más detallado de la estructura del ADN y consiste en un conjunto de técnicas y métodos bioquímicos que nos permiten averiguar la secuencia de los nucleótidos (A, C, G, T) en el ADN.

PRINCIPIOS EN QUE SE BASA LA SECUENCIACION

Las técnicas de secuenciación empleadas actualmente de forma rutinaria están basadas en metodologías publicadas en 1977:

El método de Sanger y el de Maxam–Gilbert, siendo el primero el más popular.

Ambos se basan en la generación de una población de moléculas marcadas radiactivamente, que representan todos los tamaños y combinaciones posibles.

HISTORIA

1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollan un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas.

1975, Sanger presenta un método de secuenciación enzimática.

1980, Sanger y Gilbert reciben el premio Nobel de Química.

EL MÉTODO DE DEGRADACIÓN QUÍMICA (MAXAM AND GILBERT, 1977)

Se usa P radioactivo para marcar el ADN.

Se fracciona con reacciones específicas para cada base.

4 alícuotas de la misma muestras se tratan en condiciones diferentes (DMS (G), ácido fórmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C) ).

Tratamiento con piperidina rompe en la base modificada.

Los productos se separan en gel por electroforesis según su tamaño.

Las reacciones químicas que se utilizan para fragmentar la molécula de ADN son:

1. Corte de las purinas.

2. Corte de adeninas.

3. Corte de pirimidinas.

4. Corte de citosina.

MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

El método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos.

Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose.

Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.

Se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar.

Se emplea una sola hebra para la secuenciación.

Se utiliza un “primer” que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa para comenzar a elongar.

Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.

A cada tubo se le añade dideoxinucleótido trifosfato; ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP.

En cada tubo se producen cadenas de DNA de distintas longitudes.

Los productos de las 4 reacciones, son cargados en un gel y sometidos a electroforesis.

Así, obtendremos un patrón de bandas en orden, del que deducir la secuencia del ADN introducido.

Existen algunas modificaciones en la metodología.

Se pueden usar cebadores marcados por fluorencencia o ddNTPs marcados.

Facilitan la detección de los nucleótidos.

Permite realizar una sola reacción.

SECUENCIACIÓN POR TERMINADOR FLUORESCENTE:

La mayor ventaja de este método es que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro reacciones como en el método del cebador marcado:

Se marcan cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda.

Este método es atractivo por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el método de referencia en la secuenciación automatizada con analizadores de secuencia controlados por computadora.

SECUENCIACIÓN ALELO-ESPECÍFICA POR BISULFITO:

Es una variante de la secuenciación Sanger utilizada para el mapeo de metilaciones alelo-específicas en los sitios CpG.

PIROSECUENCIACIÓN

Método de secuenciación de ADN en tiempo real.

Basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs.

No requiere correr en un gel los fragmentos de ADN generados.

A medida que la reacción transcurra, se obtiene una serie de picos de señal en el pirograma

PIROSECUENCIACIÓN

Tres pasos:

Adición de uno de los 4 dNTPs , si es el complementario a la base de la hebra molde que toca copiar, será procesado, liberando un PPi.

PPi es convertido a ATP al reaccionar con adenosina 5’- fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa.

Emisión de radiación como consecuencia de la oxidación de la luciferina a oxiluciferina catalizada por la luciferasa de consumiendo el ATP

PIROSECUENCIACIÓN

La altura de los picks se correlaciona con la cantidad de nucleótidos agregados.

A mayor altura mayor número de nucleótido agregados de forma consecutiva.

AUTOMATIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Los instrumentos modernos automáticos de secuenciación del ADN (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar más de 384 muestras marcadas por fluorescencia de una sola vez y llevar a cabo 24 ciclos de secuenciación al día. No obstante, los secuenciadores automáticos de ADN llevan a cabo solamente separación del ADN basada en el tamaño (por electroforesis capilar), detección y registro de la coloración fluorescente, y los datos resultantes se dan como cromatogramas que registran los picos de fluorescencia. Se efectúan por separado las reacciones de secuenciación mediante una termocicladora, lavado y resuspensión en una solución tamponada antes de pasar las muestras al secuenciador.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO AUTOMÁTICO DE SECUENCIACIÓN

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje.

En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.

La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

NUEVOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN

La elevada demanda de secuenciación de bajo coste ha dado lugar a las distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Se pretende que las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento disminuyan los costes de secuenciación de las bibliotecas de ADN más allá de lo que se puede hacer con el método corriente del terminador marcado basado en la separación del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos métodos de alto rendimiento usan métodos que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias a la vez.

AMPLIFICACIÓN CLONAL IN VITRO:

La mayoría de los métodos utilizan un paso con clonación in vitro para generar muchas copias de cada molécula individual. Uno de los métodos es la PCR de emulsión, en la que se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa.

ILLUMINA (SOLEXA):

En este método, se usan polimerasas diseñadas por la empresa y nucleótidos fluorescentes y de terminador reversibles. Las hebras de ADN y los primers se pegan a un portaobjetos, y se lleva a cabo una amplificación por la polimerasa, de forma que se crean colonias locales de ADN o "clusters de ADN".