scichro v1n2 corrigidoa cromatografia líquido-sólido (cls), isto é, a realização de uma...

Scientia ChromatographicaRevista Trimestral do Instituto Internacional

de Cromatografia

2009 | Volume 1 | Número 2

ISSN 1984-4433

PILARES DA CROMATOGRAFIA

II. Químicos redescobrem a Cromatografia Líquido-Sólido...........7Carol H. Collins

PREPARO DE AMOSTRAS

Microextração em sase sólida no capilar (in-tube SPME) paraautomação das análises de fármacos em fluidos biológicos ............13

Maria Eugênia C. Queiroz

CROMATOGRAFIA GASOSA (GC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

¿Cuántos componentes hay en una mezcla?Respuesta cromatográfica...........................................................23

Elena E. Stashenko*, Jairo René Martínez

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (LC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”? .....................351. Fundamentos do Acoplamento LC/MS

Fernando M. Lanças

QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI) / PONTO DE VISTA

Impurezas de Degradação ..........................................................63Flávio Leite

CROMATOGRAFIA MULTIDIMENSIONAL

Cromatografia Líquida Bidimensional........................................73Rosângela Assis Jacques*, Elina Bastos Caramão*

TROUBLESHOOTING (TS)

Uma visão técnica para a compreensão e resolução de problemas em sistemas de cromatografia líquida ..........................83

Álvaro José dos Santos Neto

Calendário Geral .......................................................................97

Instituto Internacional de Cromatografia..................................100

Bookstore ................................................................................102

Sumário

O surgimento de um novo periódico científico sempre é motivo de júbilo, umavez que novas informações serão disponibilizadas por especialistas em suas áreas deatuação, contribuindo com a formação de novos pesquisadores e usuários das técnicas.

Atualmente, as técnicas cromatográficas estão dentre as principais técnicas deanálise química; basta consultar os livros mais relevantes sobre análise instrumental,os quais têm contribuído com a formação de gerações de pesquisadores e analistas, everificar o destaque que elas possuem. Além disso, quando associadas outras técnicas– tanto de preparo de amostras (ex. SPME-LC, SBSE-GC e outras) quanto deidentificação (LC-MS, GC-MS, CEC-MS, LC-MS/MS etc.) – poderosas ferramentasanalíticas tornam-se disponíveis ao analista.

O objetivo do Scientia Chromatographica é não apenas cobrir a área decromatografia (que por si só já é bastante ampla), como, também, abordar as técnicasempregadas antes e depois do processo cromatográfico, sejam elas acopladas(“on-line”) ou não (“off-line”). Para conseguir tal abrangência, pesquisadores dasdiferentes áreas, com diferentes formações e até mesmo distintos enfoques analíticos,foram convidados a contribuírem como coeditores do periódico, trazendo experiênciacomo contribuição maior. Gostaria de dedicar a eles este número do Scientia, com oprofundo agradecimento pela presteza, absoluto desprendimento e dedicação com aqual aceitaram mais esta carga em seus afazerem diários. A colaboração dos coeditores foi uma das peças mais importantes no estabelecimento do padrão de qualidade doperiódico.

É com satisfação que faço chegar às suas mãos, após o trabalho de um númerogrande de colaboradores envolvidos no seu preparo, o volume 1, número 2 doperiódico Scientia Chromatographica, único periódico na América Latina dedicadoexclusivamente às técnicas cromatográficas e relacionadas. Opiniões, sugestões,críticas e correções serão muito bem recebidas, pois a constante melhora do nossoperiódico é a razão maior do grupo que se dedica à sua produção.

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S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a

Editorial

Fernando M. LançasEditor

A cromatografia líquido-sólido (CLS), isto é, arealização de uma separação pela passagem de umasolução contendo alguns compostos, usualmente nãoionizados, por um sólido (fase estacionária) contido em um tubo, iniciada pela colocação da solução no topo dacoluna, seguida pela passagem de um ou maissolventes puros (fase móvel), é muito aplicada para aseparação, a identificação e a quantificação dos

diferentes componentes de diversos extratos de origemvegetal ou animal. O primeiro pesquisador a descreveresta aplicação da CLS foi o botânico Michael S.Tswett1, que publicou vários trabalhos aplicando estatécnica, começando com os trabalhos publicados em1906 que a denominou cromatografia 2,3. Tswettidentificou as substâncias separadas pelas suasposições na coluna cromatográfica e, após remover a(s)

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II. Químicos redescobrem a Cromatografia Líquido-Sólido

Carol H. Collins

Universidade Estadual de CampinasInstituto de Química13083-970 – Campinas (SP)[email protected]

ResumoEste capítulo sobre os "Pilares de Cromatografia" descreve os

avanços importantes feitos na área de Química de Produtos Naturais

depois da redescoberta, em 1930, da técnica de Michael Tswett por

Prof. Richard Kuhn e seu pós-doutorando Edgar Lederer. Em menos de

dez anos, a cromatografia líquido-sólido se tornou o método preferido

para a separação de produtos naturais e foi essencial na descoberta de

alguns vitaminas.

AbstractThis chapter of "Pillars of Chromatography" describes the great

advances made in Natural Products Chemistry following the

"rediscovery" of Michael Tswett's separation technique by Prof.

Richard Kuhn and his post-docotoral fellow, Edgar Lederer, in 1930. In

less than 10 years liquid-solid chromatography became the method of

choice for separation of natural products and was essential for the

discovery of several vitamins.

Palavras-chave

História de cromatografia,

Cromatografia líquido-sólido,

Química de produtos naturais,

Carotenóides

Keywords

History of chromatography,

Liquid-solid chromatography,

Natural products chemistry,

Carotenoids

Carol H. CollinsEditora

PILARES DA CROMATOGRAFIA

banda(s) da coluna, o(s) composto(s) foi(foram)extraído(s) de cada banda e seus espectros de absorçãono UV-vis obtidos. Os compostos não foram eluídos da coluna, como é comum hoje.

Nos anos após estes primeiros trabalhos deTswett, outros pesquisadores, especialmente botânicos,aplicaram o método de Tswett com sucesso. Entretanto,os químicos da época ou não tiveram sucesso ou,simplesmente, não aceitaram o conceito. Mais de vinteanos depois de os trabalhos iniciais de Tswett, o Prof.F.M. Schertz, um químico norte-americano sumarizou,em 1929, as opiniões de muitos de seus colegas,indicando que “é evidente que Tswett (e, porimplicação, seu compatriota Leroy Palmer) nunca, emqualquer momento, trabalhou com pigmentos puros,uma vez que nunca cristalizou as substâncias”4.

Tudo mudou em 1930. Para o primeiro projetode seu pós-doutorado no laboratório de Prof. RichardKuhn na Universidade de Heidelberg, o Dr. EdgarLederer (figura 1) recebeu a tarefa de esclarecer umacontrovérsia na área de carotenoides, descrita a seguir.

Quando o Prof. Richard Willstätter e seuscolaboradores, da Universidade de Münich e, maistarde, do Instituto Kaiser-Wilhem, em Berlim,investigaram os carotenoides de certas plantas, elesidentificaram, utilizando o método de cristalização, umhidrocarboneto (caroteno, C40H56) e um compostosimilar contendo dois oxigênios (xantofila, C40H56O2)

5.Mais tarde, outros colaboradores de Prof. Willstätterencontraram um outro composto com a mesma fórmulaquímica do caroteno, que eles chamaram licopeno6.Outros pesquisadores também cristalizaram compostoscom fórmulas químicas similares de extratos de outrasplantas ou algumas lesmas e deram outros nomes a estesnovos compostos. Por outro lado, os trabalhos de Tswett

indicaram que, nas mesmas plantas estudadas pelogrupo de Willstätter, a cromatografia indicou doiscarotenos, isto é, dois compostos com posições noscromatogramas diferentes, mas com espectros muitosimilares e com a mesma fórmula química do “caroteno” do grupo de Willstätter, e, também, duas xantofilas7,8. Ogrupo de Willstätter classificou estes resultados comoartefatos; de o seu ponto de vista, “o composto” aplicado no topo da coluna isomerizou durante a sua passagempela coluna9. Os químicos que viviam na Europa noinício do século 20 acreditavam que as plantas tinhamum “caroteno” e uma “xantofila”. Porém, já haviam sido observadas algumas diferenças nos seus espectros,pontos de fusão e atividade ótica.

O interesse em carotenoides foi reforçadopelas observações que eles fizeram a respeito de umimportante relacionamento com a vitamina A. Em1928, foi verificado que a vitamina A se originou docaroteno10,11.

O projeto de Lederer visava resolver assimilaridades e as diferenças entre observações deKuhn e Winterstein, que, utilizando o processo deextração e de cristalização, encontraram similaridades entre a xantofila chamada lutein, extraída dopigmento de gema de ovo, a xantofila extraída decertas folhas e um novo composto, chamadazeaxantina, encontrada em extratos de grão de milhono laboratório de Prof. Paul Karrer em Zürich,utilizando os mesmos procedimentos12.

Verificando que se tratava de compostos compropriedades muito similares e que a solução desteproblema somente poderia ser obtida pela aplicação deum método melhor de “isolamento” dos compostos,Lederer, cuja tese de doutorado estudou as propriedadesde alcaloides de índole, buscou na literatura a respostaque procurava. Nesta pesquisa bibliográfica, eleencontrou uma referência ao livro de Palmer13 e, nolivro, uma referência ao livro e aos trabalhos de Tswett.Discutindo com o Prof. Kuhn este “novo” método deseparação descrito por Palmer, ele indicou que, ao queparece, esse método foi inicialmente desenvolvido porTswett. Neste momento, Kuhn lembrou-se que antes desair da Universidade de Munich, onde ele passou deassistente (posição equivalente de um professorassistente doutor) do Prof. Willstätter para uma posiçãode Professor Titular na Universidade de Zurich, o Prof.Willstätter presenteou-o com a sua cópia da traduçãopara a língua alemã da tese de Tswett. Prof. Kuhnlocalizou onde ele havia guardado a cópia da tese deTswett e Lederer baseou seu projeto nos métodosdescritos nesta tese.

Tratando de carotenoides, Lederer utilizou umacoluna com 7 mm de diâmetro interno recheada com


8 www.scient iachromatographica .com

Figura 1. Edgar Lederer (1908-1988) e Richard Kuhn(1900-1967) em 1931.

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carbonato de cálcio e aplicou um extrato de gemas de100 ovos, eluindo com dissulfeto de carbono. Mereceindicar que o primeiro trabalho do grupo de Willstättercom gema de ovos, utilizando extração e cristalização,consumiu 6000 ovos. Lederer encontrou duas bandasbem separadas após um certo período de eluição etirou-as da coluna, seguindo as instruções de Tswett.Extraindo cada uma das bandas com metanol, Ledererconsegui cristalizar duas xantofilas, uma similar àxantofila encontrada nas folhas por Kuhn e Wintersteine outra similar à xantofila do grão de milho descrita pelaProf. Karrer. Em outras palavras, a gema de ovo contémduas diferentes xantofilas, uma similar a xantofila(lutein) encontrada em extratos de folhas e outra(zeaxanthin) similar a encontrada em grão de milho.

Continuando os seus estudos em cromatografialíquido-sólido, Lederer isolou, utilizando uma colunarecheada com alumina “fibrosa” (fabricada pelaMerck), dois diferentes carotenos (hoje chamadosα-caroteno e β-caroteno) do extrato de cenuras, umcom atividade ótica e o outro sem, confirmando que oscarotenos isolados pelos grupos de Kuhn e de Karrerforam diferentes. Com uma coluna recheada comcarbonato de cálcio, ele isolou dois compostos, umcarotenóide (lutein) idêntico ao isolado de gema deovos e o seu epóxido (taraxantina), de um extrato dedente de leão coletado no jardim do instituto. Estesexperimentos, realizados em um período de poucassemanas, resultaram em três artigos publicados noinício de 193114-16. Em 1933, em razão de ameaças deHitler, Lederer mudou-se para França e Witterstein,para Suíça. Kuhn permaneceu em Heidelberg e, juntocom vários outros colaboradores, continuou os estudossobre os carotenoides. No período entre 1931 e 1938, ogrupo de Heidelberg publicou 52 trabalhos aplicando acromatografia líquido-sólido. O Prof. Kuhn foiindicado para o Prêmio Nobel de 1938 por seustrabalhos nesta área, mas foi proibido de recebê-lo pelogoverno alemão.

Após ler as publicações de Kuhn e Lederer,Prof. Paul Karrer (figura 2) e seus colaboradores naUniversidade de Zürich imediatamente adotaram estenovo método de isolamento, aplicando cromatografiaem coluna de alumina para purificar a vitamina Aextraída de fígados de peixes e elucidando as estruturas dos carotenos e da vitamina A17,18. Este grupo tambémcontinuou seus estudos de carotenoides e outrasvitaminas, cujos resultados geraram 49 trabalhosaplicando a cromatografia líquido-sólido no período1931-1938. Em 1937 o Prof. Karrer recebeu o PrêmioNobel por suas pesquisas sobre os carotenoides e asvitaminas A e C.

Um outro pesquisador na área de carotenoides, o Prof. Lászió Zechmeister da Universidade de Pécs(figura 3), na Hungria, também aplicou acromatografia líquido-sólido após ler os trabalhos degrupo de Heidelberg. Os interesses do Prof.Zechmeister focalizaram nos componentesencontrados na pimenta-doce vermelha da Hungria eele utilizou colunas recheadas com uma mistura decarbonato de cálcio e o hidróxido de cálcio pararealizar as suas separações (figura 4)19. Um livrosobre carotenoides, publicado em 1932, já continhaum capítulo sobre a utilização de cromatografia para a separação de pigmentos20. Sua contribuição maisimportante foi um livro, cuja primeira edição foi em1937, sobre o método cromatográfico, que eleescreveu junto com seu mais importante colaborador,Lászió Cholnoky21. Este livro foi um sucessoabsoluto e sua segunda edição foi publicada em193822, confirmando a cromatografia como uma dasferramentas mais importantes para os químicosorgânicos europeus e mundiais.

Nessa década, os aparelhos utilizados portodos os grupos europeus não diferiam muito dossistemas de Tswett: tubos de vidro de 15 a 80 cm decomprimento com diâmetros de 1 a 3 cm para

Figura 2. Um retrato de Paul Karrer (1889-1971). Figura 3. Uma foto de László Zechmeister (1889-1972).



separações em escala menor e até 10 cm de diâmetropara algumas separações preparativas (figura 5). Ouso de pressão ou vácuo, como descrito por Tswett,também ajudou as separações. Como Tswett, elesrealizaram a eluição somente até o ponto que sugeriuque todos os componentes foram separados e, depois,removeram a fase estacionária da coluna para extrairas bandas individuais com um solvente apropriadopara espectrometria ou cristalização. Para oscompostos coloridos, as bandas separadas foramidentifcadas visualmente. Quando havia suspeitadoda presença de compostos incolores, as bandas eramreveladas por suas fluorescências, utilizando tubos dequartzo23,24. No meio da década de 1930, algunspesquisadores iniciaram o processo de eluiçãocompleta25,26, mas o uso de um detector no final dacoluna somente foi descrito alguns anos mais tarde.

Como resultado da explosão de aplicações decromatografia, em 1939, somente dez anos após acrítica de Schertz sobre as supostas deficiências dométodo de Tswett, o Prof. Karrer indicou que “é umerro pensar que uma preparação purificada porcristalização é mais pura que uma obtida por análisecromatográfica. Em todas as investigações recentes, apurificação por cromatografia é considerada muito

superior à purificação por cristalização”27. Elecontinuou, indicando que “nenhuma outra descobertatem influenciado e ampliado o campo de químicaorgânica tanto como as análises cromatográficas poradsorção, desenvolvidas por Tswett”. De fato, desde oinício da década de 1930, a maioria das purificações,bem como outras separações em escalas diversas,foram feitas por cromatografia líquido-sólido e muitascontinuam usando esta técnica até a presente data.

Referências Bibliográficas1. C.H. Collins, Sci. Chromatogr. (São Carlos), 2009, 1 no 1, 7-20.

2. M.Tswett, Ber. Deutsch. Bot. Ges. 1906, 24, 316.

3. M. Tswett, M., Ber. Deutsch. Bot. Ges. 1906, 24, 384.

4. F.M. Schertz, Plant Physiol. 1929, 4 337.

5. R. Willstätter, W. Meig, Ann. Chem. 1907, 355, 1.

6. R. Willstätter, H.H. Escher, Z. Physiol. Chem. 1912, 76, 214

7. M. Tswett, “Khromofilly v Rasttitel’nom – Zhivotnom

Mire (Chromphylls in the Plant and Animal World)”

Karbasnikov Publishers, Warsaw, 1910.

8. M. Tswett, Ber. Deutsch. Bot. Ges. 1911, 29, 630.

Figura 4. Cromatograma dos pigmentos encontrados na pele de pimenta-docevermelho da Hungria. A parte superiorda coluna continha CaCO3 e a parteinferior Ca(OH)2. A fase móvel foi éterde petróleo (fração de ponto de ebulição

de 60-80 oC). Bandas: (a) α-caroteno;

(b) β-caroteno; (c) γ-caroteno; (d) esterde criptoxanteno; (e) ester dezeaxantina; (f) ester de captanina; (g)ester de capsorutina. Figura 5. Diagramas de algumas das colunas utilizadas na década de 1930 [27].

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9. R.Willstätter, A. Stoll, “Untersüchungen über Chlorophyll:

Methoden und Ergebnisse”, Springer-Verlag, Berlin, 1913.

10. B. von Euler, H. von Euler, H. Hellström, Biochem. Z.,

1928, 203, 370.

11. T. Moore, Biochem. J., 1930, 24, 692.

12. P. Karrer, J. Salomon, H. Wehrli, Helv.Chim. Acta,

1929, 12, 790.

13. L.S. Palmer, “Carotenoids and Related Pigments. The

Chromolipids”, Chemical Catalog Co., New York,

1922.

14. R. Kuhn, E. Lederer, Naturwissenshaften, 1931, 19,

306.

15. R.Kuhn, A.Winterstein, E. Lederer, Z. Physiol.Chem.

1931, 197, 141.

16. R. Kuhn, E. Lederer, Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1931,

64, 1349.

17. P. Karrer, R. Morf, K.Schöpp, Helv. Chim.Acta, 1931,

14, 1036.

18. P. Karrer, K.Schöpp, R. Morf, Helv. Chim.Acta, 1931,

15, 1158.

19. L. Zechmeister, L. Cholnoky, Ann. Chem., 1934, 509,

269.

20. L. Zechmeister, em “Handbuch der Pflanzenanalyse”,

G. Klein, Ed., vol. 3, Springer Verlag, Vienna, 1932.

21. L. Zechmeister, L. Cholnoky, “Die

Chromatographische Adsorptionmethode”, Springer

Verlag, Vienna, 1937.

22. L. Zechmeister, L. Cholnoky, “Die

Chromatographische Adsorptionmethode”, 2a ed.,

Springer Verlag, Vienna, 1938.

23. A. Winterstein, K.Schön, Z. Physiol.Chem. 1934, 230,

139.

24. P. Karrer, K.Schöpp, Helv. Chim.Acta, 1934, 17, 693.

25. H.N. Holmes, H. Cassidy, R.S. Manly, E.R. Hartzler, J.

Am. Chem. Soc. 1935, 57, 1990.

26. W. Koschura, Z. Physiol.Chem. 1936, 239, 89.

27. P. Karrer, Helv. Chim.Acta, 1939, 22, 1149.

28. E. Geeraert, M. Verzele, Chromatographia, 1978, 11,

642.

2009 | v . 1 | n . 2 13


PREPARO DE AMOSTRAS

Microextração em sase sólida no capilar (in-tube SPME) paraautomação das análises de fármacosem fluidos biológicos

Maria Eugênia C. Queiroz

Universidade de São PauloFaculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto14040-901 – Ribeirão Preto (SP)[email protected]

ResumoO sistema in-tube SPME, desenvolvido em conjunto com a cromatografia líquida, (LC) tem sido utilizado para a

automação das análises SPME/LC de solutos menos voláteis e/ou termicamente instáveis. O sistema in-tube SPME/LC

pode ser montado fixando um capilar de sílica fundida aberto, revestido internamente com a fase extratora (ou uma

coluna capilar de cromatografia gasosa), entre a alça de amostragem e a agulha do injetor automático do LC ou,

simplesmente, substituindo a alça de amostragem. A técnica in-tube SPME/LC, quando comparada à SPME

convencional, minimiza o volume da amostra, permite a extração e concentração dos solutos em linha com a separação e

detecção cromatográfica, ou seja, automação dos métodos cromatográficos, que resulta em maior precisão analítica e

menor tempo de análise. Como as amostras são injetadas no sistema, praticamente em seu estado fisiológico, diminui a

exposição dos analistas aos fluidos biológicos. O desenvolvimento de novas fases extratoras in-tube SPME, tais como

polímeros impressos molecularmente (MIP), monolítica e imunosorvente resultou em maior seletividade/especificidade

analítica, C-18/diol, a extração direta dos solutos com exclusão das

macromoléculas, β-ciclodextrina (β-CD), formação de complexos de

inclusão entre os fármacos e β-CD e (poli)pirrol, alta permeabilidade e

interações intermoleculares ácido-base.

AbstractThe in-tube SPME system developed in combination with the liquid chromatography (LC) has been used for

the automation of analyses SPME/LC of less volatile and/or thermally unstable solutes. The system in-tube SPME/LC

can be done by fixing an open silica capillary column, internally coated with the phase stationary (or a capillary

column gas chromatography), between the injection loop and injection needle of the LC autosampler, or simply,

substituting the injection loop. The technique in-tube SPME/LC, when

compared with the conventional SPME, minimizes the sample volume,

allows automation of the chromatographic methods by means of

extraction and concentration of the solutes on-line with separation and

chromatographic detection that results in better analytical accuracy and

Palavras-chave

Microextração em fase sólida no

capilar, fármacos, fluidos biológicos.

Keywords

In-tube solid-phase microextraction;

drugs; biological samples.

Maria Eugênia C. QueirozEditora

1. Processo In-Tube SPME/LC 1-18

O sistema denominado in-tube SPME,desenvolvido em conjunto com a cromatografialíquida, (LC) tem sido utilizado para a automação dasanálises SPME/LC de solutos menos voláteis e/outermicamente instáveis.

O sistema in-tube SPME/LC pode ser montadofixando um capilar de sílica fundida aberto, revestidointernamente com a fase extratora (ou uma colunacapilar de cromatografia gasosa), entre a alça deamostragem e a agulha do injetor automático do LC ou, simplesmente, substituindo a alça de amostragem.Como ilustra a figura 1a, uma alíquota da amostra, presente no frasco do injetorautomático LC, é aspirada, transportadaao capilar e dispensada novamente nofrasco, a vazão constante. Estas etapassão referidas como ciclosaspirar/dispensar, as quais sãoexecutadas repetitivamente, conformeprograma do injetor automático. Omecanismo de extração é baseado nasorção do soluto à fase extratora.Durante o processo de extração, aválvula do injetor LC deverá estar naposição carregar (figura 1a). O capilartem sido condicionado com metanol oucom a fase móvel, antes do processo deextração.

Quando atingido o equilíbrio desorção, os solutos, pré-concentrados nocapilar, são dessorvidos rapidamente dafase extratora por meio da percolação dafase móvel (processo dinâmico), ou desolvente orgânico (processo estático),após posicionar a válvula do injetor LCna posição injetar (figura 1b). Em razãoda espessura do capilar, o processo dedessorção é rápido e ausente de efeito dememória.

A dessorção estática deverá serrápida e eficiente, com reduzido volume de solvente orgânico. A capacidade da

coluna e a solubilidade do solvente orgânico na fasemóvel deverão ser consideradas. Para um capilar de60 cm x 0,25 mm di, o processo de dessorção tem sido

realizado com 40 µL de solvente. Os solutos dessorvidos são transportados para

a coluna analítica (LC) para separação cromatográfica e posterior detecção. Desta forma, a técnica in-tubeSPME não necessita de interface especial SPME-LCpara dessorção dos solutos.

Para evitar o bloqueio do capilar, as amostrascom partículas têm sido filtradas em filtros commicroporos; já para os fluidos biológicos, as proteínas têm sido removidas por micro filtragem por



precision, and short analysis time. As the samples are injected in the system, practically in its physiological state,

decreases the exposition of the analysts to biological fluids. The development of new in-tube SPME phases increases

the ability and the potential for in-tube SPME. Molecularly imprinted polymer, monolithic and imunoaffinity phases

allowed high analytical selectivity/specificity, biocompatible RP-18/diol, the direct extraction of the drugs with

exclusion of proteins, β-cyclodextrin (β-CD), interactions by inclusion complexes between drugs and β-CD, and

polypirrole, high permeability and acid-base intermolecular interactions.

Figura 1. Esquema do processo in-tube SPME. (a) extração e (b) dessorção.

2009 | v . 1 | n . 2 15


centrifugação (Microsep TM) ou precipitação com

alguns µL de ácidos, sais, acetonitrila ou metanol.A eficiência da extração SPME tem sido

determinada pelo do número de mols do soluto extraídopela fase estacionária do capilar. Para as fases extratoras, nas quais o mecanismo de extração é baseado noprocesso de absorção, a quantidade de soluto extraídopode ser expressa segundo a Equação 1:

nA = KA Vf Vs C°A / (KA Vf + Vs) (eq.1)

Onde nA representa o número de mols dosoluto extraído pela fase extratora, após terestabelecido o equilíbrio de partição entre as fases. Vf e Vs: os volumes da fase extratora do capilar e da

amostra, respectivamente. C°A: a concentração inicialde soluto na amostra, e KA: o coeficiente de partiçãodo soluto.

2. Otimização das variáveis in-tube SPMEO aumento da espessura da fase extratora, do

diâmetro interno e do comprimento do capilar temresultado em maiores taxas de extração, no entanto,este procedimento poderá causar picos largos, comcauda ou dessorção não quantitativa dos solutos. Nasdeterminações de antidepressivos não tricíclicos emfluidos biológicos para fins de monitorizaçãoterapêutica 16, 17 foram utilizados capilares de 70 a 80cm de comprimento, finos filmes, os quais resultaram

em extrações eficientes, cromatogramas bem definidose ausência de efeito de memória, após processo dedessorção. Nestes ensaios, as taxas de recuperação doprocesso in-tube SPME aumentaram com ocrescimento do volume da amostra (figura 2) . Osvolumes do capilar e da seringa (injetor automático)foram considerados nos experimentos. O volume de

amostra selecionado foi de 100 µL, com vazão de 315

µL min-1 (figuras 2 e 3). Para valores de vazãoinferiores a este intervalo, as extrações apresentarammenor eficácia e aumento do tempo de análise, já paravalores superiores, observamos formação de bolhas aolongo do capilar e redução da eficácia da extração.

O tempo requerido para atingir o equilíbrio departição do soluto entre as fases durante o processoin-tube SPME pode ser expresso segundo a Equação 2.

te = L [1 + KA x (Vf/Vv)] / m (eq.2)

Onde L representa o comprimento do capilar,

KA: coeficiente de partição, Vf: volume da fase

extratora do capilar, Vv: volume livre do capilar, µ:

velocidade linear da amostra. Durante as extrações, as

variáveis: L, Vf , Vv e o valor KA são fixos; desta forma,

o tempo de extração depende da velocidade linear da

amostra.

O equilíbrio de sorção entre as fases tem sido

atingido rapidamente, em razão da percolação da

amostra no capilar (ciclos aspirar/dispensar), processo

equivalente à agitação na SPME convencional. Para as

0 50 100 150 200 2500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Áre

ad

op

ico

(mA

U)

Volume de amostra aspirada/dispensada (uL)

MIRTAZAPINA CITALOPRAM

PAROXETINA DULOXETINA

FLUOXETINA SERTRALINA

Figura 2. Otimização do vol ume de amostraaspirada/dispensada para as análises in-tube SPME deantidepressivos em amostras de plasma. Condições in-tubeSPME: amostra plasma (0,5 mL) enriquecida com osantidepressivos na concentração de 500 ng mL-1, diluídacom 0,5 mL de solução tampão borato (0.05 mol/L, pH 9.0); 15 ciclos, vazão de 625 µL min-1.

0

50000

100000

150000

200000

Áre

ad

op

ico

(mA

U)

Vazão dos ciclos aspirar/dispensar (uL/min)

1 2 3




Figura 3. Otimização da vazão para as análises in-tubeSPME. Condições in-tube SPME: amostra de plasma (0,5mL) enriquecida com os antidepressivos na concentração de 500 ng mL-1, diluída com 0,5 mL de solução tampão borato(0.05 mol/L, pH 9.0); 100 µL de amostra foiaspirada/dispensada durante 15 ciclos.

análises de antidepressivos não tricíclicos em amostras

de plasma 17, o equilíbrio de sorção foi alcançado após

15 ciclos (figura 4). O número excessivo de ciclos

poderá resultar em dessorção parcial do soluto, durante

a etapa dispensar, ou em picos cromatográficos com

caudas.

Em condição ideal, a percolação da amostra no

capilar por meio dos ciclos aspirar/dispensar deverá

ser realizada até atingir o equilíbrio de partição dos

compostos com a fase estacionária. No entanto,

quando alta sensibilidade analítica não é requerida,

extrações fora do equilíbrio têm sido realizadas com o

objetivo de diminuir o tempo de análise. Queiroz et al. 17, na tentativa de aumentar a

eficiência da extração in-tube SPME com o capilarOV-1701 (14% cianopropilfenil metilpolisiloxano)e/ou diminuir o número de ciclos aspirar/dispensar,inseriram uma etapa aguardar entre os comandosaspirar e dispensar no programa (tabela 1). Noentanto, não foi observado aumento significativo nastaxas de extração.

Embora as colunas capilares GC convencionais,com fase líquida quimicamente ligada (entrecuzada),sejam estáveis na presença de água ou solventesorgânicos, elas podem ser facilmente deterioradas napresença de ácidos inorgânicos ou bases fortes. Destaforma, torna-se necessário a avaliação da estabilidade da fase estacionária, quando exposta à fase móvel durante o processo de dessorção. A robustez das fases, OV-170117 e imunosorvente 16 foram confirmadas após 100 e 20extrações, respectivamente, sem variações significativas nas taxas de recuperação.

Como a fase extratora OV-1701 não étrocadora de íons, extrai somente espécies não iônicas presentes na amostra, o pH da amostra de plasma foiajustado com a adição de solução tampão borato, 0,05mol L -1 pH = 9,0 17. A diluição da amostra comsolução tampão resultou na diminuição daviscosidade da matriz biológica, favorecendo adifusão dos solutos na fase extratora (figura 5).



0 5 10 15 20 25 30 35 400

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Áre

ad

op

ico

(mA

U)

Número de ciclos aspirar/dispensar




Figura 4. Otimização do número de ciclos aspirar/dispensarpara as análises in-tube SPME. Condições in-tube SPME:amostra de plasma (0,5 mL) enriquecida com os antidepressivos na concentração de 500 ng mL-1, diluída com 0,5 mL de soluçãotampão borato (0.05 mol/L, pH 9.0); 100 µL de amostra foiaspirada/dispensada com vazão de 625 µL min-1.

AÇÃO POSIÇÃO QUANTIDADE VAZÃO ALTURA DA AGULHA* / PASSOS

LAVAR AGULHA ––––––250 µL (água metanol,

50:50 v/v)–––––– ––––––

VÁLVULA INJETOR CARREGAR –––––– –––––– ––––––

ASPIRAR DE FRASCO A 200 µL de água 625 µL min-1 5 mm

DISPENSAR EM FRASCO B 200 µL de água 625 µL min-1 5 mm

REPETIR –––––– 2 VEZES 625 µL min-1 2 ANTERIORES

ASPIRAR DE AMOSTRA 100 µL 315 µL min-1 5 mm

AGUARDAR –––––– 2 MINUTOS –––––– ––––––

DISPENSAR EM AMOSTRA 100 µL 315 µL min-1 5 mm

REPETIR –––––– 9 VEZES –––––– 3 ANTERIORES

ASPIRAR DE AMOSTRA 100 µL 315 µL min-1 5 mm

AGUARDAR –––––– 2 MINUTOS –––––– ––––––

DISPENSAR EM AMOSTRA 100 µL 315 µL min-1 5 mm

REPETIR –––––– 9 VEZES –––––– 3 ANTERIORES

VÁLVULA INJETOR INJETAR –––––– –––––– ––––––

AJUSTAR A SAÍDA INJETAR –––––– –––––– ––––––

Tabela 1. Programa utilizado nas extrações in-tube SPME.

2009 | v . 1 | n . 2 17


Para evitar a obstrução do capilar, peladeposição dos sais, a adição de sal à amostra deplasma (efeito salting out) tem sido pouco avaliadanas análises in-tube SPME.

3. Fases seletivas e aplicações da técnica in-tube SPME/LC para análise defármacos em fluidos biológicos

Várias colunas capilares GC encontram-sedisponíveis no comércio com diferentes fasesestacionárias, diâmetros internos, comprimentos eespessuras de filme, as quais podem ser utilizadascomo capilar extrator. A seleção da fase extratora(líquidas), como em SPME, baseia-se na regra similar solubiliza similar. Por exemplo, em coluna apolarcomo a fase líquida, polidimetilsiloxano, compostoshidrofóbicos são retidos de forma seletiva; no entanto, os compostos hidrofílicos apresentam maior afinidade com a fase polietileno glicol.

O poli(pirrol) (PPY), em razão de suapermeabilidade (estrutura porosa) e propriedadesmultifuncionais, que resultam em interaçõesintermoleculares ácido-base, dipolo-dipolo, hidrofóbica, π–π, ligação de hidrogênio com os solutos, tem sidoavaliado como fase extratora SPME para análises /LC de fármacos em fluidos biológicos 4, 8, 11.

O filme de (poli)pirrol tem sido polimerizadono interior do capilar de sílica pela passagem dasolução do monômero, solução oxidante e N2.Durante a polimerização química, a cor do capilarmuda gradualmente de amarelo para preto, indicandoa formação do filme (revestimento) de PPY, nointerior da superfície do capilar (figura 6). Embora, ofilme de PPY possa ser facilmente formado pelapolimerização química, o revestimento terá firmeaderência, somente na superfície de capilar polar.

Queiroz et al. têm avaliado o (poli)pirrol nasanálises in-tube SPME/LC com detecção fluorescente,para separação enantiosseletiva de fluoxetina enorfluoxetina em amostras de plasma (figura 7).

O (poli)pirrol, quando comparado às fasesconvencionais GC, apresentou extrações mais eficientes para as análises de anfetaminas em urina e cabelo 8, de

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Áre

ad

op

ico

(mA

U)

pH da matriz

4,5 7,0 9,0 10,0




Figura 5. Otimização do pH da matriz para as análisesin-tube SPME. Condições in-tube SPME: amostra deplasma (0,5 mL) enriquecida com os antidepressivos naconcentração de 500 ng mL-1, diluída com 0,5 mL desolução tampão; 100 µL de amostra foi aspirada/dispensadadurante 15 ciclos com vazão de 625 µL min-1.

Figura 6. Oxidação química da polimerização do (poli)pirrol.

Figura 7. Cromatograma in-tube SPME/LC com detecçãofluorescente (lex: 230 nm e lem: 290 nm) de amostra deplasma enriquecida com os antidepressivos na concentração de 300 ng mL-1. 1: S-norfluoxetina, 2: R-norfluoxetina, 3:S-fluoxetina, 4: R-fluoxetina. Coluna: Chiralcel OD-R (250x 4,6 mm) - Chiralcel Tech®.



β-bloqueadores em urina e soro 4 e de verapamil eprincipais metabólitos em várias matrizes biológicas,como plasma, urina e cultura de célula 11. O capilar PPYmostrou-se estável nas condições de análise, permitindoa utilização em centenas de determinações.

Pawliszyn et al. 7 desenvolveram um capilarde (poli) éter-éter-cetona (PEEK) empacotado comfase de acesso restrito, ou seja, superfície hidrofílicabiocompatível (diol, ADS) na parte externa ehidrofóbica (octadecilsilano, C18) no interior dosporos da partícula do sorvente. As macromoléculas,tais como as proteínas dos fluidos biológicos, nãopenetraram nos poros (barreira física) e foramexcluídas rapidamente, ao passo que as moléculashidrofóbicas penetraram nos poros e foram retidas,pelo processo de partição. O material ADSbiocompatível permitiu análise direta debenzodiazepínicos em amostras de soro, sem remoção prévia de proteínas.

Os polímeros impressos molecularmente(MIP) foram sintetizados, como sorvente, paraanálises in-tube SPME/LC de propanolol emamostras de soro 7. Os MIP têm sido obtidos porpolimerização na presença de uma molécula molde aser impressa, ou seja, esqueleto polimérico formadoao redor do soluto, ou de uma molécula com estruturaanáloga. Após a polimerização, a molécula impressa é removida por dissolução ou evaporação (quando sãosolutos voláteis), revelando sítios de ligação, ou seja,cavidades sintéticas equivalentes em forma e tamanho do analito. Em razão da memória molecular dopolímero, o método in-tube SPME/LC padronizadoapresentou alta seletividade e em limites de detecção

de 0,32 µg/mL, com detecção LC-UV. O capilar MIPfoi utilizado em mais de 500 extrações, sem perdasignificativa da eficiência, demonstrando excelenterobustez, estabilidade mecânica e química 7.

As ciclodextrinas possuem em sua estruturagrupos hidroxila primários e secundários orientadospara o exterior. Assim, possuem exterior hidrofílico euma cavidade interna hidrofóbica. Tal cavidadepermite às ciclodextrinas complexarem moléculasque apresentem dimensões compatíveis.

O capilar β-ciclodextrina (β-CD), preparadopela técnica sol-gel, foi utilizado para análises in-tubeSPME/LC de anti-inflamatórios em urina, peloreconhecimento molecular, ou seja, formação de

complexos de inclusão entre os fármacos e β-CD. A

robustez do capilar β-CD foi confirmada após 250extrações, sem perda significativa da eficiência dasextrações.

As fases monolíticas possuem estrutura sólidae altamente porosa, de micro (< 2 nm) oumesoporosos (2 a 50 nm) e canais relativamentegrandes (2 µm), que favorecem altas permeabilidade e retenção.

Yi Fan et al. 12 sintetizaram cilindrosmonolíticos poliméricos orgânicos, polimerização insitu no capilar de sílica fundida de ácidometacrílico-dimetacrilato de etilenoglicol por meio do aquecimento de uma mistura de monômero, agente deentrecruzamento, um iniciador e agentes porogênicos. A funcionalização da fase monolítica, pelaincorporação de moléculas hidrofóbicas e de gruposácidos, favoreceu a extração de fármacos básicos emamostras de soro, resultando em limites de detecção(detecção UV) de 6,5 a 12,8 ng mL-1. O aumento daeficiência das extrações permitiu a utilização decapilares com menor comprimento, 20 cm.

Queiroz et al.16 avaliaram a especificidade dasinterações antígeno-anticorpo nas análises in-tubeSPME/LC-MS de fluoxetina em amostras de plasma,com capilar imunosorvente com anticorposantifluoxetina imobilizados. Os anticorposantifluoxetina foram obtidos por meio de imunizações em coelhos. Os compostos de baixa massa molar, nãosão capazes de obter ou iniciar uma resposta imune.Em razão deste fato, antes da imunização, asmoléculas de fluoxetina foram modificadas pelasligações às moléculas de albumina de soro bovino. Oimunosoro policlonal resultante, mistura complexa de anticorpos distintos, gerados por diferentes clones decélulas, foi purificado em coluna DEAE-Sefarose.

Para a imobilização dos anticorpos junto àsuperfície interna do capilar de sílica fundida, esta foiinicialmente ativada com (amino)propil trietoxissilano(APTES), resultando em grupos de aminas primárias.O reagente glutaraldeído, em sequência, foi utilizadopara modificar esta superfície, permitindo a ligação das moléculas dos anticorpos, pelas reações entre o grupoamina da proteína e o grupo aldeído da superfície(figura 8).

A fase imunosorvente apresentou reatividadepara fluoxetina e seu metabólito norfluoxetina, noentanto, com o aumento da concentração destefármaco em amostras de soro na faixa deconcentração de 100 a 500 ng/mL, não foi observadoaumento linear na massa extraída. Desta forma, ométodo “in-tube” SPME/LC-MS é capaz deidentificar a presença de norfluoxetina, permitindo aanálise qualitativa em amostras de soro, mas nãoapresenta resposta linear para as análisesquantitativas.

2009 | v . 1 | n . 2 19


Fármacos (matriz) Ciclos, volume e vazão Capilar Detecção (LD) Referências

Ranitidina(urina)

10 ciclos - 30 µL100 µL min-1

Omegawax 250 LC-UV

(1,4 ng mL-1) Kataoka et al. 1999 2

Antidepressivos(urina)

80 µL min-1 t = 10 min

DB-1 µLC-UV

(5 ng mL-1) Saito et al. 2000 3

β-bloqueadores(urina, soro)

15 ciclos - 30 µL 100 µL min-1 Polipirrol

LC-MS (0,1 ng mL-1)

Wu et al. 2000 4

Anfetaminas(urina)

15 ciclos - 30 µL 100 µL min-1

Omegawax 250 LC-MS

(0,3-0,8 ng mL-1) Kataoka et al. 2000 5

Benzodiazepínicos(soro, urina)

10 ciclos - 30 µL 0,3 mL min-1

Supelco-Q PLOT LC-MS

(0,02-2,0 ng mL-1) Yuan et al. 2000 6

Propanolol(soro)


MIP LC-UV

(0,3 µg mL-1) Mullett et al. 2001 7

Anfetaminas(urina, cabelo)


PolipirrolLC-MS

(8-56 ng L-1) Wu et al. 2001 8

Antidepressivos(urina)

80 µL min-1 DB-5 CE-UV

(44-153 ng mL-1) Jinno et al. 2001 9

Benzodiazepínicos(soro)


RAM / ADS LC-UV

(24 - 26 ng mL-1) Mullett et al. 2002 10

Verapamil e metabólitos(plasma, urina)


PolipirrolLC-MS

(5-8 ng mL-1) Walles et al. 2002 11

Teobromina, teofilina e cafeína(urina)

4-6 min - 1 µg mL-1 (amostra)0,04 mL min-1

Poli(MAA-EGDMA)

LC-UV(6,6-12 ng mL-1)

Fan et al. 2004 12

Anti-inflamatórios(urina)

50 s - 250 µL (amostra)300 µL min-1 β-ciclodextrina

LC-UV(18-38 ng mL-1)

Wang et al. 2005 13

Propanolol enantiômeros(urina)

0,04 mL min-1 β-ciclodextrinaCEC-UV

(4-7 ng mL-1)Feng et al. 2007 14

Cortisol(saliva)

20 ciclos - 40 µL (amostra)150 µL min-1 Supelco Q PLOT

LC-MS(5 pg mL-1)

Kataoka et al. 2007 15

Fluoxetina(soro)

15 ciclos - 100 µL (amostra)315 µL min-1 Imunosorvente

LC-MS(5 ng mL-1)

Queiroz et al. 2008 16

Antidepressivos não tricíclicos(plasma)

2 ciclos - 50 µL (amostra)400 µL min-1 OV-1701

LC-UV(20 a 50 ng mL-1)

Queiroz et al. 2008 17

Nicotina, cotinina, nornicotina,anabasina e anatabina

(urina e saliva)

25 ciclos - 40 µL (amostra)150 µL min-1 CP-Pora PLOT amina

LC-MS(15-40 pg mL-1)

Saito et al. 2009 18

LD: limite de detecção, LC-UV: cromatografia líquida com detector ultravioleta, MIP: polímero molecularmente impresso, µLC:micro LC,LC-MS: cromatografia líquida com detector de espectrometria de massas, RAM/ADS: material de acesso restrito / aquil diol silica.MAA-EGDMA: ácido metacrílico-dimetacrilato de etilenoglicol, β-bloqueadores: nadolol, pindolol, acebutolol, timolol, metoprolol,oxprenolol, labetalol, propanolol, alprenolol. Benzodiazepínicos: clonazepam, axazepam, temazapam, nordazepam, diazepam.Antidepressivos: desipramina, nortriptilina, imipramina e amitriptilina, anti-inflamatórios: cetoprofen, fenbufem e ibuprofen; Antidepressivosnão tricíclicos: mirtazapina, citalopram, paroxetina, duloxetina, fluoxetina e sertralin; .OV1701: 14% cianopropil fenil metil polisiloxano.

Tabela 2. Aplicações da técnica in-tube SPME na análise de fármacos em fluidos biológicos.

A extração imunosorvente é baseada noprocesso de adsorção. As fases extratoras, nas quais oprocesso de adsorção é predominante, têm sidocaracterizadas pelas isotérmicas de adsorção (massaextraída versus concentração adicionada nasamostras), com faixa não linear próxima a máximacapacidade do sorvente. As isotérmicas de adsorçãotêm apresentado faixa linear para baixasconcentrações e platô de saturação em concentraçõesque excedem a concentração de saturação crítica. Ométodo in-tube SPME-LC/MS para as determinações

de fluoxetina em amostras de soro apresentoulinearidade na faixa de 5 a 50 ng mL-1.16

A estabilidade da fase imunosorvente foi avaliadaapós duas semanas de armazenamento do capilar emsolução tampão fosfato e 0.05% de azida sódica. Não foiobservada mudança significante nos resultados, quandocomparados aos obtidos com o capilar recentementedesenvolvido 16.

Algumas aplicações da técnica in-tube SPME,para análise de fármacos em fluidos biológicos, sãoilustradas na tabela 2.

4. ConclusõesO sistema in-tube SPME/LC pode ser

facilmente montado, fixando-se o capilar de sílicafundida revestido internamente com a fase extratoraentre a alça de amostragem e a agulha do injetorautomático do LC ou, simplesmente, substituindo aalça de amostragem.

As variáveis (volume da amostra, número deciclos aspirar/dispensar, vazão da amostra e pH daamostra) deverão ser otimizadas, para que as extraçõesin-tube SPME ocorram em condições correspondentesao equilíbrio de sorção.

A técnica in-tube SPME/LC, quandocomparada à SPME , além de minimizar o volume daamostra, permite a extração e concentração dos solutosem linha com a separação e detecção cromatográfica,ou seja, automação dos métodos cromatográficos,resultando em maior precisão analítica e menor tempode análise. Como as amostras são injetadas no sistema,praticamente em seu estado fisiológico, diminui aexposição dos analistas aos fluidos biológicos.

Considerando o processo de dessorção, atécnica SPME, com dessorção em fase líquida(off-line) é bem simples e pouco dispendiosa, noentanto, não é possível injetar 100% do solutodessorvido, já a técnica in-tube SPME, além deminimizar perdas do soluto, durante o processo deextração, todo o soluto extraído é introduzido nosistema analítico, aumentando a sensibilidadeanalítica.

O desenvolvimento de novas fases extratorasin-tube SPME, tais como MIP, monolítica eimunosorvente permitiu maiorseletividade/especificidade analítica, C-18/ADS, aextração direta dos solutos com exclusão das

macromoléculas, β-CD, formação de complexos de

inclusão entre os fármacos e β-CD e PPY, altapermeabilidade e interações intermolecularesácido-base.

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Uno de los problemas fundamentales de lacromatografía consiste en la determinación delnúmero correcto de componentes presentes en unamezcla compleja; el otro aspecto importante estárelacionado con su identificación inequívoca. Lapreparación de la muestra, la columna cromatográfica

usada, su dimensión y la polaridad de la faseestacionaria, junto con la resolución y la selectividad,los sistemas de inyección y detección (selectividad ysensibilidad), entre otros aspectos, inciden sobre elreconocimiento del número de componentesregistrados en la mezcla.1

2009 | v . 1 | n . 2 23


CROMATOGRAFIA GASOSA (GC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

¿Cuántos componentes hay en una mezcla? Respuesta cromatográfica

Elena E. Stashenko*, Jairo René Martínez

Universidad Industrial de Santander, Escuela de Química.Centro de Investigación de Excelencia, CENIVAM, Laboratorio de Cromatografía. BucaramangaColombia* [email protected]

ResumoLa determinación del número de componentes en una mezcla de sustancias compleja es un problema

fundamental para el que se pueden encontrar soluciones con diferente nivel de exactitud, en función de las

decisiones tomadas a todo lo largo del proceso analítico, desde la

preparación de la muestra, pasando por la técnica cromatográfica usada,

el modo de inyección, la columna cromatográfica, y el sistema de

detección. En este artículo se presentan ejemplos que ilustran la

incidencia de varios de estos parámetros sobre la respuesta a cuántos

componentes tiene una mezcla.

AbstractThe number of components determination in a complex mixture of substances is a fundamental problem for

which various solutions with different accuracy may be applied, as a function of decisions taken along the analytical

process, starting from sample preparation, following to the

chromatographic technique, the injection mode, the chromatographic

column, and the detection system employed. This article presents some

examples to illustrate the incidence of several of these parameters on the

definition of how many components are really present in a complex

mixture.

Palavras-chave

GC; GCxGC; Sistemas de

detección; Swinglea glutinosa;

monocrotalina.

Keywords

GC; GCxGC; Detection systems;

Swinglea glutinosa;

monocrotaline.

Elena E. StashenkoEditora

La cromatografía de gases (GC), técnica enuso intensivo en muchas ramas de la ciencia, ya pormás de un medio siglo, tiene su más grande fortalezaen la determinación de cuántos componentes y en quéproporción se encuentran en una mezcla. Sinembargo, la capacidad de establecer la naturaleza y laestructura química de estos compuestos separados ycuantificados, es bastante ambigua y reducida, yrequiere de detectores espectroscópicos. Entre ellos,el más usado, es el detector espectrométrico de masas(MS). MS permite obtener la “huella digital” de lamolécula, i.e. su espectro de masas, que proporcionala información sobre la masa molecular, composiciónelemental (si se usan espectrómetros de masas de altaresolución), grupos funcionales presentes y, enalgunos casos, la geometría e isomería espacial de lamolécula2,3.

De las características más relevantes de la

columna cromatográfica se destaca su resolución, osea la capacidad para separar los componentes conconstantes de distribución, KD muy cercanas. Laresolución cromatográfica es función de muchosparámetros operacionales; en primer lugar, de ladimensión de la columna, o sea, su longitud (L),diámetro interno (I.D.) y el grosor de la faseestacionaria (df). A mayor número de componentespresentes en la mezcla, y a mayor similitud estructural entre ellos (isomería), se requieren columnas máslargas, para la separación de los compuestos, pero,para el mismo propósito, se pueden emplear columnas de menor diámetro interno. Obviamente, elincremento de la longitud de la columna aumentanotoriamente el tiempo de análisis. Es así, como elanálisis de hidrocarburos poliaromáticos (PAHs) sehace en columnas de 30 m de longitud, mientras que la separación de hidrocarburos en gasolinas requierecolumnas más largas, de 100 m. Un efecto similar, que conduce al incremento de la resolución, pero aún máspronunciado que el aumento de la longitud de lacolumna, lo ejerce la reducción del diámetro interno(I.D.). El aumento en 2 veces de la longitud de lacolumna, duplica su resolución, mientras que lareducción en 2 veces del diámetro interno de lacolumna, aumenta la resolución 4 veces. La reducción de diámetro de las columnas hasta 0.1 y 0.05 mm(columnas micro-bore), conduce a la aparición de lallamada cromatografía rápida (fast chromatography),que permite separar las mezclas complejas en tiempode segundos. Pero ello conduce también a unadramática reducción de la capacidad de muestra, osea, no será posible hacer el análisis en columnasmicro-bore de compuestos a nivel de trazas. La

selección de la longitud y el diámetro interno de lacolumna es un compromiso muy importante entre eltiempo de análisis, la resolución requerida y lasensibilidad4,5.

El grosor de la fase estacionaria (f.e.) se escoge de acuerdo con la volatilidad de la muestra. Mezclasde compuestos muy volátiles requieren las columnascon mayor grosor de la fase estacionaria, de hasta 5µm. Compuestos con alta temperatura de ebullición,por ejemplo, PAHs o esteroides, se analizan encolumnas con df más pequeño, e.g., 0.25 µm o menor.El aumento del espesor de la fase estacionariaconduce al incremento de la retención de loscompuestos, lo que requiere el aumento de latemperatura de columna para acelerar la elución decomponentes, pero ello, conduce también alincremento del sangrado (bleeding) de la faseestacionaria, que se vuelve más pronunciado atemperaturas altas en columnas con mayor df. O sea,la volatilidad (presión de vapor) de las sustancias es la mejor guía para la selección correcta del grosor de lafase estacionaria: a mayor presión de vapor (menortemperatura de ebullición) de los componentes, serequieren mayores valores de df de la faseestacionaria.

La selección de la polaridad de la f.e. estácondicionada por el tipo de muestra, su composición y la polaridad de los componentes a analizar. Encolumnas apolares, e.g. poli(dimetilsiloxanos),generalmente, los compuestos eluyen de acuerdo consus puntos de ebullición; en columnas polares, e.g.,poli(etilenglicol), las fuerzas intermoleculares (entreel polímero de la f.e. y el analito) y los momentosdipolares de las sustancias gobiernan su retención y elorden de salida de la columna. Es por esto que para las mezclas complejas, que contienen componentes tantopolares, como apolares, se requiere a menudo llevar acabo su análisis en dos columnas, de polaridadortogonal, tal como se hace, por ejemplo, para elanálisis de aceites esenciales, aromas y perfumes. En

la Figura 1 aparecen dos cromatogramas típicos delaceite esencial aislado de la cáscara de limón africano(Swinglea glutinosa), analizado en dos columnas conf.e. diferentes, polar (polietilenglicol) y apolar(polidimetilsiloxano). Se puede observar, cómocambian los tiempos de retención (tR) de loscomponentes con la polaridad de la f.e. Por ejemplo,citronelal, aldehído monoterpénico, compuesto polar, eluye mucho más tarde en una columna polar que en la apolar.

Debido a que los tR de los componentes sonfunción de muchos parámetros, entre los cuales



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figuran la dimensión de la columna, la polaridad de laf.e., la programación de la temperatura del horno y lavelocidad del flujo de gas de arrastre, para sucomparación en diferentes columnas se utilizan losíndices de retención, cuyos valores deben en teoríadepender solo de la polaridad de la f.e. (en realidad, latemperatura también tiene efecto sobre el valor deíndice de retención determinado)6. Los índices deretención de los componentes en una mezcla,llamados a menudo índices de retención de Kováts, semiden en dos columnas de diferente polaridad, conrespecto a los tiempos de retención de hidrocarburoslineales (parafinas), analizados en estas columnas,bajo las mismas condiciones operativas y sirven como una base de datos de referencia y de comparaciónjunto con los espectros de masas-, para laidentificación de las sustancias en una mezcla.

En conclusión, la respuesta correcta a lapregunta cuántos componentes hay en una mezcla,depende, entre otros factores, de la resolución de lacolumna (polaridad de la f.e. y las dimensiones de lacolumna), y también de otros factores operacionales,tales como la velocidad del gas de arrastre (paracolumnas capilares, de diámetro interno igual o menor de 0.32 mm, generalmente, la velocidad lineal mediadel gas transportador es de 25 – 40 cm/s) y de laprogramación de la temperatura del horno, puesto que las constantes de distribución KD son funciones tantode la naturaleza del analito, la polaridad de la f.e., lavelocidad y el tipo del gas de arrastre, como tambiénde la temperatura de la columna7. El rango detemperatura del horno a programar (por ejemplo, 45 –300 °C) depende del intervalo de temperaturas deebullición de los componentes en la mezcla; lavelocidad de calentamiento de la columna es funciónde su longitud, e.g., entre más larga es la columna máslento debe ser su calentamiento.

Cuántos componentes hay en una mezcladepende también de cómo se preparó ésta, o sea de la

técnica de extracción, la limpieza (clean-up) delextracto y la separación de interferencias, así comodel grado de concentración del extracto8. En la

Figura 2 aparecen cromatogramas típicos deextractos (corrientes iónicas totales, TIC) de “lavado” de manos con disolvente (acetona), con diferentesgrados de concentración con una corriente denitrógeno, i.e., 1:2 y 1:200 veces, respectivamente. La diferencia de los dos extractos es inmensa, aunque elnúmero de componentes en cada uno de ellos es elmismo; en el extracto con mayor grado de

concentración se “descubre” la presencia de unnúmero de componentes mucho más alto y sevislumbran sobre todo aquellas sustancias, que seencuentran a nivel de trazas.

En la Figura 3 se observan las diferencias, encuanto al número de los componentes, registrados enun aceite esencial del limón africano (Swingleaglutinosa, Familia Rutaceae), al inyectarlodirectamente a la columna cromatográfica (soluciónal 30% en diclorometano, split 1:30) o al introducir sufracción volátil, obtenida por la técnica demicro-extracción en fase sólida (SPME) en fase vapor o espacio de cabeza, headspace (HS). Como la técnica HS-SPME tiene una importante característica de nosólo extraer los volátiles, sino también concentrarlossobre la fibra, se pueden observar más componentesen el cromatograma del extracto de HS-SPME delaceite, en comparación con los que se observan en elcromatograma obtenido con la inyección directa de lasolución del aceite en disolvente9.

Figura 1. Cromatogramas típicos del aceite esencial obtenidode la cáscara de limón africano. A. Columna con f.e. polar(DBWAX, 60 m x 0.25 mm x 0.25 µm). B. Columna con f.e.apolar (DB-1, 60 m x 0.25 mm x 0.25 µm). Detector deionización en llama (FID). Relación Split 1:30. Programaciónde la temperatura: 40 °C (5 min) @ 3 °C/min hasta 250 °C (5min). Volumen de inyección - 1 µL (20% en diclorometano). a – p-Cimeno; b – Linalool; c – α-Bergamoteno; d –cis-Allocimeno; e – Citronellal; f – Neral.



Abundance

Time --> 10.00 20.00 30.00 40.00

TIC: MUESTR2.D

A

50.00 60.00 70.00 80.00

3000000280000260000240000220000200000180000160000140000120000100000

80000600004000020000

Abundance

Time --> 10.00 20.00 30.00 40.00

TIC: MUESTR1.D

B

50.00 60.00 70.00 80.00

3000000280000260000240000220000200000180000160000140000120000100000

80000600004000020000

Figura 3. Cromatogramas típicos (TICs) de: A. Fracción volátil obtenida por HS-SPME (fibraPDMS/DVB) de la fase vapor del aceite esencial puro de limón africano (Swinglea glutinosa). Tiempo de exposición de la fibra (PDMS/DVB) – 5 min, temperatura 30 °C. Relación split 1:30; B. Aceite esencial,obtenido por hidrodestilación, de la cáscara de limón africano (Solución al 30% en diclorometano,inyección split 1:30). Columna DB-1MS (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm), f.e. 100% poli(dimetilsiloxano).Detector selectivo de masas (MSD, EI, 70 eV). Modo de adquisición full scan (m/z 30 – 400).

Figura 2. Cromatogramas típicos (TIC) de extractos de “lavado” de manos con disolvente (acetona),con diferentes grados de concentración (bajo flujo de nitrógeno). A. Concentración 1:2; B.Concentración 1:200. Columna DB- 5 (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm), f.e. 5%-fenil-poli(metilsiloxano).Inyección split (1:30). Volumen de inyección 1 µL. Detector selectivo de masas cuadrupolar (MSD).Impacto de electrones (EI), 70 eV. Modo de adquisición full scan (m/z 30 – 400).

Otro parámetro, absolutamentefundamental para determinar cuántoscomponentes hay en una mezcla, es elmodo de inyección de la mezcla alcromatógrafo. En un puerto de inyecciónestándar, split/splitless, el flujo de gas en la válvula split determina la fracción de lamuestra que entra a la columna; a mayorrelación split, menor cantidad de lamuestra ingresa a la columna. Las muestras concentradas se inyectan en modo dedivisión de la muestra, sólo una pequeñaalícuota entra a la columna; por otra parte,la necesidad de analizar compuestos anivel de trazas, por ejemplo, en muestrasambientales o forenses, requiere latransferencia completa de la muestra a lacolumna, sin su división, lo que se hace enel llamado modo splitless. Por ejemplo, enla Figura 4 se puede observar la diferenciamuy grande en el número de compuestosregistrados en cromatogramas del aceiteesencial de limón africano, inyectado endos modos, split y splitless. El modosplitless implica la transferencia lenta (ca.1 mL/min) de la muestra a la columna a través delpuerto de inyección caliente, lo que puede conducir ala descomposición térmica y/o a la isomerización dealgunos componentes de la mezcla, tal como se puedeobservar en el cromatograma (Figura 4, A),caracterizado por el aumento de la co-elución de loscompuestos estructuralmente similares (aquí,sesquiterpenos con tR de 27 a 33 min) y/o,posiblemente, por su isomerización térmica en elpuerto de inyección.

Un modo de transferencia completa de lamuestra a la columna, que evita la discriminación decomponentes por su volatilidad y peso molecular, esla inyección on-column, i.e. la aplicación de lamuestra directamente en la cabeza de la columna.Podría éste ser un modo de inyección “ideal”, pero,para muchas muestras, existe el riesgo de lacontaminación severa de la columna, debido a quealgunos componentes (interferencias) no volátiles se“filtrarán” a la columna, o sea no se retendrán en elliner del puerto de inyección y pasarán directamente ala columna analítica, contaminándola severamente.Se requiere, luego, el uso de una pre-columna(retention gap), unida al puerto de inyección y a lacolumna analítica, para prevenir la deposición deinterferencias en la última.

En la Tabla 1 se puede observar la diferencia en el número de componentes registrados en cantidadesrelativas (> 0.005%) en la muestra de aceite esencial delimón africano, analizado en la misma columna yprogramación de su temperatura y con el mismosistema de detección (FID), pero usando diferentesmodos de inyección (split, splitless, on-column,HS-SPME).

Tabla 1. Número de componentes registrados (> 0.005%) enel aceite esencial de limón africano (Swinglea glutinosa),analizado en la columna DB-1MS (100%-polidimetilsiloxano, 60 m x 0.25 mm x 0.25 µm), con el sistema de detección –FID, en función de diferentes modos de inyección.

Modo de inyecciónNúmero de

componentesVolumen de

inyección, µL

Split (1:30) 25 1.0

On-column 45 0.2

Splitless ca. 60 1.0

HS-SPME (Split 1:30) 57 -

Otro aspecto muy importante de la inyecciónen el modo splitless es el tiempo de la transferencia dela muestra a la columna, que es prolongado (ca. 1min), lo que puede generar la descomposición térmica de algunos de sus componentes, por ejemplo,determinados pesticidas organofosforados,carbamatos, nitroaromáticos, esteroles, alcaloides,

12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

A

12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

B

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Figura 4. Cromatogramas típicos del aceite esencial del limón africano(Swinglea glutinosa), inyectado a la columna en modos: A. Splitless y B.Split (1:30). Columna DB-1MS (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm), f.e. 100%poli(dimetilsiloxano). Volumen de inyección – 1 µL (Solución del aceite endiclorometano, 30%). Detector selectivo de masas (MSD, EI, 70 eV). Modode adquisición full scan (m/z 30 – 400).

Figura 5. Cromatogramas del extracto obtenido por SFE (CO2) de alimento para pollos preparado con base en la harina desorgo. Columna DB-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm), 5%-fenil-poli(metilsiloxano). Volumen de inyección – 1 µL (Solución delextracto SFE en diclorometano). Detector selectivo de masas (MSD, EI, 70 eV). Modo de adquisición full scan (m/z 30 – 450).Picos mayoritarios, asimétricos, corresponden a los ácidos grasos no derivados. A. Inyección en modo splitless; B – Inyecciónen modo splitless pulsado. La flecha indica el registro de una sustancia termolábil, identificada con base en su espectro de masascomo la monocrotalina.



entre otros. Para posibilitar el análisis de compuestostermolábiles, a nivel de trazas, en modo splitless, se ha ideado un modo especial de splitless “pulsado”, quese realiza incrementando la presión en la cabeza de lacolumna durante la inyección, mientras que lamuestra es transferida a la columna. En este caso, eltiempo de residencia de la muestra en el liner caliente(250 – 300 °C) del puerto de inyección se reducedramáticamente y, con ello, la probabilidad de ladescomposición térmica de algunos componentes.

Un ejemplo interesante de esta importanteaplicación del modo splitless pulsado fue eldescubrimiento de la presencia de un alcaloidepirrolizidínico (la monocrotalina) en alimento para pollos. Hace dos años, ocurrió un accidente en varias granjasavícolas en Bucaramanga (Colombia), acompañado de lamuerte de miles de pollos. La autopsia de aves mostró ladestrucción de hígado y pulmón, evidenciando laintoxicación mortal con una sustancia pronunciadamente

hepatotóxica y neumotóxica. El análisis del alimento parapollos, elaborado con base en la harina de sorgo, y que fue el primer sospechoso en causar su intoxicación y lamuerte, sin embargo, no reveló la presencia de residuosde pesticidas, ni de aflatoxinas; tampoco un examenmicrobiológico descubrió contaminación bacteriana. Elextracto del alimento se obtuvo por dos métodos, i.e., (1)extracción Soxhlet con diclorometano y (2) con fluidosupercrítico (SFE, CO2). Ambos extractos se analizaronen una columna DB-5 de 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm,5%-fenil-poli(metilsiloxano), usando el sistema dedetección selectiva de masas y dos modos de inyección,splitless y splitless pulsado. En la Figura 5 aparecenregistrados dos cromatogramas del extracto SFE delalimento, inyectado en modos splitless y splitlesspulsado. La última técnica de inyección permitió registrar un “nuevo” componente en la mezcla, que posiblementepadece la destrucción en el puerto de inyección cuando lamuestra se introduce a la columna en modo splitless.

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

500000

10000001500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

45000005000000

5500000

6000000

65000007000000

7500000

8000000

8500000

Time-->

Abundance TIC: ALIMENTO.D

8.59 8.72 8.89 9.64 11.38

18.58 19.26 21.45

22.53

22.74

25.22 25.36

26.70

26.85

26.90 26.93

26.99

27.04 27.12

27.15

27.28

A

BTIC: ALIMENT.D

22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

25.63

27.10

27.1927.2827.40

28.47

29.97

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Analizados por cromatografía de gases condetección selectiva de nitrógeno y fósforo (NPD), enambos extractos (Soxhlet, SFE) se confirmó lapresencia de un compuesto nitrogenado (Figura 6),cuya identidad química se estableció a través de suespectro de masas, que correspondió a lamonocrotalina (Figura 7), uno de los alcaloides mástóxicos de la familia de los alcaloides pirrolizidínicos.La monocrotalina puede encontrarse en plantas devarias familias; en este caso particular, como mostróla investigación, la fuente de la monocrotalina en elalimento para pollos era la planta Crotalaria retusa(Familia Leguminoceae), cuyas semillas, que

contenían la monocrotalina, se cosecharon junto conlas del sorgo y luego contaminaron el alimentopreparado, en dosis letal para los pollos10.

De esta manera, se establece claramente laimportancia de escoger correctamente el sistema deinyección de la muestra al cromatógrafo; de ellodepende tanto la sensibilidad en la detección decomponentes en trazas, como el número registrado enla mezcla a separar. La columna cromatográfica y elsistema de inyección son elementos importantes en larespuesta correcta a la pregunta: ¿Cuántoscomponentes hay en una mezcla?

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

750000

800000

Time -->

Abundance TIC: MUEST41R.D

Figura 6. Cromatograma típico del extracto de alimento para pollos, aislado por SFE (CO2). Detectorselectivo de nitrógeno y fósforo (NPD). Columna DB-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm),5%-fenil-poli(metilsiloxano). Volumen de inyección – 1 µL (Solución del extracto SFE en metanol).Modo de inyección – splitless pulsado.

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 3200

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

m/z-->

Abundance Scan 6868 (34.079 min): GRANO2.D120

136

236

93

43

80

67106

157 254194 281 325171 207 220

N

H

O

O

O

H

HO

H3C

HOH3C CH3

H

O

Figura 7. Espectro de masas de la monocrotalina (M+., m/z 325). Ionización por impacto de electrones (EI, 70 eV).

En una mezcla tan compleja como es elextracto de café, es difícil establecer el númerocorrecto de componentes presentes, aunque se use una columna cromatográfica larga (50 ó 60 m).Actualmente, se conocen y han sido detectados en elaroma de café más de 800 compuestos de muy diversanaturaleza química. Una de las estrategiasconvencionales, cuando no hay acceso a lacromatografía total (Comprehensive GC x GC),consiste en emplear varios sistemas de detecciónselectiva11. Obviamente, esto incrementa el costo delanálisis, pero permite hacerlo por familias decompuestos, según el tipo de heteroátomo o el grupofuncional presente en la molécula (e.g., N, S, gruposelectronegativos, aromáticos, etc). Si se encuentransustancias co-eluidas, pero una de ellasgenera una señal en un detector selectivo,mientras que la otra es “transparente” para él, es posible acercarse con mayor precisión a larespuesta de cuántos componentes hay enuna mezcla, al emplear una serie dedetectores selectivos. En la Figura 8,aparece un fragmento del cromatograma (A), obtenido con un detector selectivo de masas(corriente iónica total), donde se resalta elpico correspondiente a la co-elución de dossustancias, una oxigenada y la otra azufrada.Un análisis de la mezcla de sustancias delaroma de café tostado, aislado por la técnicade purga y trampa con solvente, empleandoun detector fotométrico de llama (FPD) enmodo de azufre, permite vislumbrarclaramente la presencia de los componentesazufrados (Figura 8, C), muchos de loscuales co-eluyen con otros compuestos delaroma de café aislado (Figura 8, B). Unanálisis similar se puede hacer con undetector selectivo de nitrógeno y fósforo(NPD) o con el de captura de electrones(ECD), así como con un detector de masasoperado en modo de monitoreo de ion(es)seleccionado(s) característicos paradeterminado grupo de compuestos, para verdiferentes clases de sustancias presentes enuna mezcla enormemente compleja, como loes el aroma de café.

Nuevamente, para aproximarse a lacontestación correcta a la pregunta sobrecuántos componentes hay en una mezcla, esnecesario tener en cuenta y poder combinarvarias estrategias convencionales: en primerlugar, la preparación misma de la muestra, sulimpieza (clean-up), eliminación de

interferencias, concentración y selección correcta dela técnica de extracción; en segundo lugar, es elsistema de separación optimizado, i.e. la columna, sulongitud, diámetro interno, el grosor de la faseestacionaria, la selección correcta de la polaridad de la fase, la programación de temperatura y la velocidaddel gas de arrastre, entre otros parámetros; como ya seha mostrado, es vital la selección correcta del modo de inyección, volumen de la muestra inyectado y elsolvente usado; y, por último, el sistema de detecciónjuega un rol fundamental para garantizar lasensibilidad de registro (volumen de detector, gasmake-up, temperatura, etc.) de los componentes de lamezcla.



8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 min

A

B

C

2-[(Metiltio)metil]-furano

2-Furanometanol acetato

min5 10 15 20 25

10.00 20.00 30.00 35.00 50.00 55.00

a b c d

Figura 8. Cromatogramas típicos del aroma de café tostado, aislado por latécnica de purga y trampa (P&T) con solvente (diclorometano) simultánea.Columna DB-5 (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm), 5%-fenil-poli(metilsiloxano). Volumen de inyección – 1 µL (Solución en diclorometano). Modo deinyección – split (1:30). A. Fragmento de la corriente iónica total(cromatograma). Detector selectivo de masas (MSD, EI, 70 eV). Modo deadquisición – full scan (m/z 30 – 350). Se observa la co-elución de doscompuestos, oxigenado y azufrado. B. Corriente iónica total(cromatograma) del aroma de café. MSD (EI, 70 eV). Full scan. Más de300 picos registrados (>0.005%). C. Cromatograma del mismo extracto dearoma de café, obtenido con detector fotométrico de llama (FPD). a-Tiofeno; b – 2-Metiltiofeno; c – Tetrahidrotiofeno; d – 2,4-Dimetiltiofeno.

X

p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9

Y

Pulsos

1D

A

X

Y X

Y

p4 p5

2D

1 m

x 0

.1 m

m x

0.1

µm

2D

1DTiempo, min25 m x 0.25 mm x 0.25 µm

Tiempo, s

GC (1D) x GC (2D) B

Sin embargo, el mayor desafío para laseparación de mezclas complejas lo presenta lafrecuente co-elución de picos cromatográficos desustancias con constantes de distribuciónextremadamente cercanas; es cuando muchasestrategias convencionales, enumeradas arriba,también fallan o son insuficientes. La cromatografíamultidimensional, que permita separar los picos desustancias parcial o totalmente co-eluidas, en unasegunda columna, a través de la operación de “cortede corazón” (heart-cutting), usando válvulasneumáticas de conmutación (hoy en día también se haintroducido la tecnología micro-fluídica) entre las dos columnas y desviando parte del eluyente de la primera a la segunda columna, ha jugado un papel importanteen el desarrollo de métodos de separación de mezclascomplejas. La cromatografía multidimensionalrequiere por lo menos dos detectores y puede tenerconfiguraciones de hasta tres columnas en el mismohorno o en hornos cromatográficos separados. Juntocon esto y otras estrategias convencionales, hoy en día existe una de las soluciones modernas, exhaustivas,aunque aún poco accesible para la mayoría de loslaboratorios, para la separación de mezclasmulticomponente, que es la llamada cromatografía degases completa o total bidimensional (Comprehensive GCxGC), cuyas aplicaciones y desarrollos crecen díatras día, durante los últimos 15 años12-14.

En cromatografía de gases total (GC x GC) seutilizan dos columnas, unidas entre sí por medio de un modulador. En contraste con la cromatografía degases multidimensional convencional, la GC x GCrequiere un solo detector; ambas columnas puedenestar en el mismo horno o en dos hornos separados.Existen diferentes tipos de moduladores, e.g.,modulador térmico rotatorio (“sweeper”), sistemacriogénico “jet”, moduladores de válvulas ymodulador criogénico longitudinal, entre otros. Eleluente de la primera columna, por medio delmodulador, se fracciona en “tajadas” muy pequeñas,que una tras otra, en fila, de la primera columna,discretamente, ingresa a la segunda (Figura 9). Laprimera columna (1D) es una columna convencional,de longitud de 25 ó 30 m, y la segunda columna (2D)es de cromatografía rápida, o sea, una columna muycorta y micro-bore. Las fases estacionarias en ambascolumnas son “ortogonales”, i.e., si la primera esapolar, la segunda columna es polar y vice versa. Eltiempo de modulación, o sea, del traspaso de unapequeñísima porción de eluente de la primeracolumna a la segunda, debe ser muy corto ycomparable, pero no más largo, con el tiempo deelución de un componente en la segunda columna. Por

ende, ésta última es muy corta y muy delgada ypermite separar los componentes en unos pocossegundos. Debido a que la segunda columna estáconectada con el detector, éste (MSD, FID o µ-ECD)debe tener una velocidad de lectura y procesamientode señal muy alta. En la mayoría de los casos, eldetector de masas de tiempo de vuelo (Time-of-Flight, TOF) es la mejor, aunque aún muy costosa, opción.

En la Figura 10 aparece el cromatogramatípico del aceite esencial de limón africano (Swingleaglutinosa), analizado por GC x GC-MS-TOF, con unsistema criogénico modulado longitudinalmente(Laboratorio del Prof. Dr. P. Marriot, RMIT,Melbourn, Australia)15. En la representación gráficabidimensional (Figura 10, B) se observan claramentelos componentes separados en la segunda columna,que fueron co-eluidos en la primera columna.

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Figura 9. Principio de separación de componentes de unamezcla en un sistema de dos columnas de cromatografíatotal (Comprehensive GC x GC), unidas por un modulador.A. “Cortes” en pequeñas porciones del eluente de la primera columna; B. Separación de cada porción, que ingresadiscretamente, de la primera a la segunda columna“ortogonal” rápida.



En la Tabla 2 aparecen los números decomponentes registrados en cantidad relativa mayorde 0.005%, en diferentes sistemas cromatográficos,según el modo de inyección, el tipo de analizador(detector) y la “dimensionalidad” de la técnica (una odos columnas unidas).

Finalmente, como se puede observar, larespuesta a la pregunta de cuántos componentes hayen una mezcla multicomponente, no es tan sencilla yse puede dar con diferente grado de exactitud, quedepende de toda una gama de “trucos”cromatográficos convencionales y nuevos, mucho

500 1000 1500 20000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Retention time (s)

AAbundance

B

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Figura 10. Cromatograma típico del aceite esencial de limón africano (Swingleaglutinosa), analizado por GCxGC-MS-TOF, con el sistema criogénico moduladolongitudinalmente. A. Primera dimensión: columna BPX-5 (5%-fenil-polimetilsiloxano,30 m x 0.25 mm x 0.25 µm), inyección split (1:30); B. Separación en la segunda columnapolar BP-20 (polietilenglicol, 0.26 m x 0.1 mm x 0.1 µm), unida con el detector de masasde tiempo de vuelo (TOF). Resaltadas, se observan regiones con la separación de picos enla segunda dimensión, que tenían los mismos tiempos de retención en la primera columna.

Modo de inyección Volumen de inyección, µL Columna Sistema de detecciónNúmero de componentes

(>0.005%)

Split, 1:30 1 DB-1MS, 60 mGC-MSD, Q*

Full scan25

Splitless 1 DB-1MS, 60 mGC-MSD, Q*

Full scanca.60

On-column 0.2 DB-1MS, 60 mGC-MSD, Q*

Full scan45

Split, 1:30 1 BPX-5, 30 mGC-TOF

Full scan47

Split, 1:30 1BPX-5, 30 m

BP-20, 0.26 m

GCxGC-TOF

Full scanca. 75

Tabla 2. Número de componentes registrados (> 0.005%) en el aceite esencial de limón africano (Swinglea glutinosa), según latécnica cromatográfica empleada (modo de inyección, detectores, columnas, dimensionalidad)

*Q – Detector cuadrupolar

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más modernos y avanzados, como la cromatografíatotal GCxGC, ideada para acercarnos con másprecisión a la determinación del número verdadero delos componentes en una mezcla, contando tanto losco-eluidos, como aquellos a nivel de trazas (y esto, sin tener en cuenta aún los isómeros quirales presentes!).

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15. P. Marriot. J. Sep. Sci., 27 357 (2004).

ERRATANo artigo "Cromatografia de gases como herramienta de estudio de la composición química y capacidad antioxidante de especies vegetales ricas entimol y carvacrol, cultivadas en Colômbia" de Amner Muñoz-Acevedo, Jairo R. Martínez y Elena E. Stashenko, publicado no vol. 1 nº 1, páginas67-78, houve um equívoco de editoração. Os valores constantes nas Tabelas 1 e 2, páginas 72, 73 e 74 devem ser todos divididos por 10 (dez).

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (LC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas:finalmente “compatíveis”?

ResumoA cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE) é uma das principais técnicas utilizadas na

análise de compostos não voláteis e/ou termicamente instáveis. Apesar de ser uma excelente técnica de separação, a

HPLC necessita de uma técnica confirmatória quando a análise qualitativa (confirmação da identidade química) é

também necessária. Dentre as várias opções existentes neste momento, a espectrometria de massas é a técnica que

melhor fornece as informações estruturais necessárias; o acoplamento

entre estas duas técnicas dá origem a uma ferramenta analítica versátil e

de grande potencial na análise qualitativa e quantitativa: a LC/MS

(Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas). O

presente artigo apresenta de forma crítica e detalhada os fundamentos

do acoplamento LC/MS.

AbstractHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) is one of the most utilized analytical techniques for

determination of non volatile and thermally unstable compounds. Although being a separation technique, HPLC

requires a confirmatory technique when qualitative analysis is being performed. Amongst the several available

complimentary techniques, Mass Spectrometry is the one that supplies

the structural information required to complement the HPLC

separation; by coupling these two techniques, a powerful tool become

available for qualitative and quantitative analysis: LC/MS (Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry). This paper presents in a critical

and detailed description the fundamentals of the LC/MS technique.

Palavras-chave

Cromatografia Líquida; HPLC;

CLAE; Espectrometria de Massas;

LC/MS.

Keywords

Liquid Chromatography; HPLC;

Mass Spectrometry; LC/MS.

Fernando M. Lanças

Universidade de São PauloInstituto de Química de São Carlos13560-970 – São Carlos (SP)[email protected]

Fernando M. LançasEditor



1. Introdução: Fundamentos daCromatografia Líquida Moderna(HPLC ou CLAE)

A instrumentação necessária para aCromatografia Líquida Moderna é mais complexa esofisticada do que aquela empregada emCromatografia Líquida Clássica. Apesar de que, emalguns casos mais simples, um equipamento maismodesto pode ser empregado; na separação equantificação de amostras complexas, um grau maiorde sofisticação é, usualmente, necessário.Diferentemente da cromatografia gasosa, na qualtodos os itens do cromatógrafo são enclausurados emuma caixa “selada”, em cromatografia líquida, osequipamentos são, frequentemente, modulares.Assim, geralmente, é possível intercambiar ummódulo de um equipamento (um detector, porexemplo) de uma marca por um equivalente de outramarca, o que permite que os equipamentos sejammontados com módulos provenientes de diferentesfabricantes, de acordo com o interesse do usuário.Isso permite ao usuário configurar um cromatógrafolíquido de acordo com as suas necessidades epreferências, e não de acordo com modelos rígidospreestabelecidos1.

A figura 1 ilustra um diagrama esquemático de um LC moderno. O solvente, também denominadoeluente ou fase móvel, acondicionado em um frascoapropriado, é impulsionado, ou aspirado, por umabomba de alta pressão em direção à coluna. Nocaminho, a amostra é introduzida na fase móvel, porde uma válvula de introdução de amostra (ou válvulade injeção) e arrastada para a coluna, na qual ocorre a

separação. O efluente da coluna é direcionado paraum detector, que acusa a presença dos analitos eluídos da mesma. O sinal gerado pelo detector é captado porum software apropriado, tratado no computador, e umcromatograma é gerado, mostrando a variação dosinal do detector em função do tempo de análise 2-5.

As técnicas cromatográficas de análise estãoentre as principais técnicas de separação,especialmente na análise de substâncias presentes emmatrizes complexas, tais como fluidos biológicos,produtos naturais, sedimentos de rio e outras. Isto sedeve, principalmente, à sua capacidade de separaçãodos componentes presentes nas misturas em função da eficiência e do poder de resolução das colunasmodernas.

A cromatografia líquida foi definida naprimeira década do século passado, pelos trabalhos do botânico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos eramfocalizados na separação de pigmentos em umacoluna empacotada com partículas, pigmentos estesextraídos de plantas usando solventes 6.

Geralmente, atribui-se a Csaba Horváth ao redorde 1970 a proposta da sigla HPLC (inicialmentesignificando “High Pressure Liquid Chromatography”e, posteriormente, com a evolução da técnica, “HighPerformance Liquid Chromatography”).

Em cromatografia líquida moderna (HPLC ouCLAE), o uso de detectores como Índice de Refração7,8,Ultravioleta9-12, Espalhamento de luz13-15,Fluorescência16 e outros17, aliados a softwaresdedicados, permitem a análise quantitativa doscomponentes das misturas em concentraçõesextremamente baixas. Apesar de tais características, autilidade desta como técnica de identificação é bastante

Figura 1. Diagrama ilustrativo das principais partes de um cromatógrafo líquido moderno.

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limitada1. Mesmo com grandes esforços obtidos pelouso de colunas de diferentes polaridades,desenvolvimento de sistemas de índices de retenção eoutros artifícios, a análise qualitativa é sujeita a muitoserros devido ao uso dos tempos de retenção para aidentificação dos analitos. Apesar do tempo de retençãoser característico de um composto, ele não é único, ouseja, vários compostos podem ter o mesmo tempo deretenção nas condições cromatográficas empregadas 18.Desta forma, poderá ocorrer coeluição entre várioscompostos, sendo o pico identificado como apenas umdeles (ou então como outro composto ainda). A maneiraencontrada para solucionar este problema foi,inicialmente, utilizar um detector fotométrico operandonas regiões ultravioleta e visível (UV-VIS) do espectro,no qual dois comprimentos de onda distintos erammonitorados (usualmente 220 nm e 254 nm). A razãoentre o sinal obtido com um padrão analítico para os dois comprimentos de onda (A220/A254) deveria ser a mesmaque a obtida para o composto suspeito. Certamente, umgrande inconveniente neste caso é a necessidade deconhecer-se o composto a ser identificado (ou, pelomenos, ter uma suspeita de sua identidade) para que uma solução de um padrão analítico do composto suspeitopudesse ser preparada, analisada pelo mesmo método e,posteriormente, comparada com a do composto-alvo oususpeito. O desenvolvimento dos detectores UV-VIS de comprimento de onda variável, baseados nosespectrofotômetros ao invés dos fotômetros, permitiu aobtenção dos espectros completos de um picocromatográfico nesta região espectral19. Apesar de umavanço em relação às situações anteriores, os espectrosobtidos para uma grande quantidade de picos presentesem amostras complexas eram de pouco auxílio devido àfalta de especificidade dos mesmos e a similaridadeentre vários dos compostos em análise. Odesenvolvimento dos detectores baseados em arranjos(malhas) de diodos (“Photodiode Array”, PDA),adicionou mais uma facilidade: o uso de vários diodospara adquirir e armazenar dados de uma faixa espectral e o desenvolvimento de computadores rápidos, com boamemória e a custos compatíveis, permitiram a geração

de espectros tridimensionais e o uso de softwaresapropriados para determinação automática da pureza depicos cromatográficos. Apesar de o grande avanço emrelação à situação existente no início dodesenvolvimento da técnica, a identificação positiva dospicos cromatográficos ainda era uma situação difícil, namaioria dos casos. Este quadro teve uma mudançarecentemente com o desenvolvimento de novasferramentas que permitiram uma melhora noacoplamento entre cromatografia líquida eespectrometria de massas (LC/MS)20,21.

2. Fundamentos da Espectrometria de Massas (MS)

A história da Espectrometria de Massasmoderna é geralmente considerada como havendosido iniciada com os experimentos de J.J.Tomson(Figura 2) sobre raios catódicos. Ao aplicar um campo elétrico no tubo, Tomson, em 1897, observou umadeflexão do elétron dentro do mesmo (Figura 3),sendo esta considerada uma das primeirasdeterminações da razão m/z. Tomson ganhou oprêmio Nobel de Física em 1906 por estes estudos.

Figura 2. J.J. Tomson, considerado o “pai” daEspectrometria de Massas moderna.

Figura 3. Esquema dos experimentos de J.J. Tomson com raios catódicos. À esquerda, montagem antes da aplicação do campoelétrico; à direita, deflexão do elétron com a aplicação do campo.

O desenvolvimento da Espectrometria deMassas até seu estágio atual resultou em um númeroconsiderável de ganhadores do Premio Nobel emQuímica e em Física diretamente vinculados aosavanços na técnica (Figura 4), além de outros que autilizaram na solução de problemas aplicados dediferentes áreas do conhecimento. A Tabela 1 resumeos principais avanços na área.

Tabela 1. Avanços importantes no desenvolvimento daEspectrometria de Massas(MS).

Data Pesquisador Local Contribuição

1897 J.J.TomsonManchester,England

Experimentos com tubos deraios catódicos, os quais são considerados o início daEspectrometria de Massas

1953 W. Paul AlemanhaInvenção do quadrupolo edo Íon trap

1968 M. Dole USADesenvolvimento doElectrospray

1974 Horning USA Desenvolvimento do APCI.

1983 Vestal USADesenvolvimento doThermospray

1984 J.Fenn USADemonstração daaplicabilidade prática doElectrospray

De acordo com o Prof. J. B. Fenn (Figura 5),ganhador do Premio Nobel em Química no ano de 2002pelo trabalho pioneiro no uso de Electrospray comofonte de ionização branda para espectrometria de massas 22, “a Espectrometria de Massas é a arte de medirátomos e moléculas para determinar suas massasmoleculares. Tal informação sobre a massa ou peso émuitas vezes suficiente, frequentemente necessária, esempre útil na determinação da identidade de umaespécie. Para praticar esta arte, colocamos carga nasmoléculas de interesse, isto é, os analitos, e entãomedimos como as trajetórias dos íons resultantesrespondem, sob vácuo, a várias combinações decampos elétricos e magnéticos. Claramente, a condição “sine qua non” deste método é a conversão demoléculas neutras de um analito em íons ”.

A Figura 6 ilustra um esquema genérico esimplificado de um espectrômetro de massas (MS). Aamostra a ser analisada é introduzida por um “inlet”(dispositivo para a introdução da amostra noespectrômetro) e direcionada para a fonte deionização. Nos estágios iniciais do desenvolvimentoda técnica, a amostra era introduzida pela vaporização direta da mesma; com o desenvolvimento das técnicas cromatográficas tornou-se bastante comum o uso deum cromatógrafo como fonte de introdução daamostra no MS. Neste último caso, os picoscromatográficos gerados pela separação doscomponentes da amostra são individualmenteintroduzidos na fonte de ionização do MS para geraros íons a serem posteriormente separados noanalisador e encaminhados para detecção equantificação. Um software apropriado instalado emum computador efetua os cálculos, gera os espectrosde massas a serem impressos e comanda as funções do espectrômetro.



Figura 4. Ganhadores do Premio Nobel em Química e em Física associados diretamente ao desenvolvimento da Espectrometriade Massas (MS).

Figura 5. J. B. Fenn, um dos ganhadores do Premio Nobelem Química, no ano de 2002, pelo trabalho pioneiro no usode Electrospray como fonte de ionização branda paraespectrometria de massas.

2.1. Sistemas de introdução da amostra (“inlets”)

A inserção direta, ou seja, a introdução direta da amostra na fonte de íons do espectrômetro sem préviaseparação, é uma técnica pouco utilizada atualmente,uma vez que o MS sozinho é melhor para a análise decompostos puros. No passado, o composto alvo erapreviamente isolado e então inserido diretamenteatravés de uma sonda, processo lento e que dificultavaa análise de impurezas em concentrações muitobaixas23. A alternativa para amostras com elevadavolatilidade era o acondicionamento da amostra emfrascos de vidro no formato de balões; as amostras

eram introduzidas no MS pela abertura de válvulas decontrole (Figura 7). Nas últimas décadas, oacoplamento da Espectrometria de Massas com aCromatografia Gasosa (GC-MS) por meio do uso defontes de ionização apropriadas, notadamente, aionização por impacto eletrônico (EI) e ionizaçãoquímica (CI) possibilitaram o uso da técnica MS emanálises rotineiras. A GC-MS é uma ferramentaanalítica poderosa, utilizada usualmente na análise demisturas complexas de compostos em fase gasosa. Istolimita a técnica à análise de compostos voláteis esemivoláteis, de baixa polaridade e baixa massamolecular. Para compostos de massa molecular maiore/ou maior polaridade e menor volatilidade, oacoplamento entre Cromatografia Líquida eEspectrometria de Massas (LC-MS) é a técnica depreferência. Os sistemas de ionização utilizados nestecaso serão comentados no próximo item.

2.2. Fontes de Ionização

As formas de ionização que tiveram maiorsucesso, e por isso são as mais empregadas noacoplamento GC-MS, são o impacto eletrônico (EI) ea ionização química (CI). Essas formas de ionizaçãooperam em baixas pressões (Figura 8), usualmentedenominadas vácuo (na verdade, não ocorre formação de vácuo mas uma diminuição da pressão na fonte deíons com o auxílio de bombas denominadas,incorretamente, de bombas de vácuo). Dentre elas, oimpacto por elétrons é, de longe, a mais popular, umavez que usualmente fornece um grande número deíons os quais permitem a identificação da substânciaem estudo.

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Figura 6. Esquema das principais partes de umEspectrômetro de Massas.

Figura 7. Sistema para Inserção (Introdução) direta de Amostra Gasosa em MS.

As fontes de ionização, inicialmenteinvestigadas para o acoplamento LC-MS, forambaseadas no impacto eletrônico (EI) e na ionizaçãoquímica (CI) empregadas com sucesso noacoplamento GC-MS. Entretanto, devido àsdiferentes características existentes entre as fasesmóveis empregadas nas duas técnicas de separação(GC e HPLC), este acoplamento mostrou-seinadequado para análise de compostos em baixasconcentrações, além de não apresentarem robusteznecessária. Após décadas de esforços novas fontes deionização foram desenvolvidas as quais são capazesde combinar duas características em um mesmosistema: facilitar a transferência da amostra que sai dacoluna para a fase gasosa (interface coluna-MS) e aionização da amostra. As fontes que mostrarammelhor desempenho no acoplamento LC-MSproduzem a ionização em pressão atmosférica (API,Atmospheric Pressure Ionization) ao invés de vácuocomo em EI e CI utilizadas em GC-MS (Figura 9). Asformas de ionização mais utilizadas no momento noacoplamento LC-MS, as quais operam à pressãoatmosférica são: Electrospray (ESI, “ElectrosprayIonization”) > Ionização Química à PressãoAtmosférica (APCI, “Atmospheric PressureChemical Ionization”) > Ionização por Fótons àPressão Atmosférica (“Atmospheric Pressure Photon Ionization”). Dentre estas, o Electrospray é, de longe, a forma de ionização mais empregada no acoplamento LC-MS, seguida da APCI. A ionização por fótons,APPI é mais recente, sendo a terceira forma deionização mais empregada nesta técnica 24 .

Ionização pelo processo Electrospray

A ionização pelo processo Electrospray (ESI)permite a criação de íons na pressão atmosférica aoinvés de vácuo. Neste processo, a amostra é dissolvida em um solvente, usualmente não polar, e pressurizadaem um tubo capilar feito de aço inox, ao qual éaplicada uma voltagem tipicamente entre 3.000 e5.000 V. Como resultado, o líquido emerge do capilarà pressão atmosférica, na forma de um aerossol. Asgotículas formadas perdem sucessivamente o solvente (são dessolvatadas) e os íons fluem para oespectrômetro de massas induzidos pelos efeitos daatração eletrostática e pelo vácuo (lembrar que apenas o processo de ionização ocorre à pressão atmosférica;a partir deste ponto, o espectrômetro de massas seencontra sob “vácuo”).

Os detalhes de como efetivamente ocorre oprocesso Electrospray ainda é motivo de muitadiscussão e controvérsia. Os dois mecanismos maisaceitos para explicar o fenômeno são o proposto porDole25, em 1968, também conhecido comomecanismo do resíduo de carga ou da fissão, e oproposto por Iribarne e Tomson 26, em 1976,conhecido como mecanismo da evaporação do íon.De acordo com Dole, à medida em que as gotículasevaporam, sua carga permanece inalterada. Ainda deacordo com este mecanismo, como a tensãosuperficial das gotículas é incapaz de se opor às forças repulsivas resultantes da carga imposta, estas“explodem” em inúmeras gotículas menores,denominada “explosão” coulômbica. Este processocontinua até que apenas um íon do analito permaneça;



Figura 8. Montagem das principais partes de um espectrômetro de massas típico, ilustrando a fonte de íons dentro de um sistema submetido a alto vácuo.

Figura 9. Montagem das principais partes de um espectrômetro de massas típico, ilustrando a fonte de íons fora do sistema dealto vácuo. Neste caso, a ionização ocorre à pressão atmosférica (API).

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após a evaporação da última gotícula do solvente,forma-se um íon em fase gasosa. De acordo com omecanismo proposto por Iribarne e Tomson,pequenas gotículas são também formadas na explosão coulômbica, como o proposto por Dole. A diferençaprincipal entre estes modelos é que Iribarne eTomson6 propõem que a partir da formação dasgotículas, a força do campo elétrico na superfíciedestas é suficientemente elevada para removê-las dasuperfície, transferindo diretamente para a fase gasosa energeticamente mais favorável para íons solvatados.

A Figura 10 ilustra de forma simplificada estes dois mecanismos, evidenciando na parte superior aformação das gotículas, processo comum aos doismecanismos, e a partir daí as diferenças entre omodelo da evaporação do íon e o da fissão ouexplosão Coulômbica.

Mais recentemente, M. Cole propôs que osdois mecanismos podem operar simultaneamente 28.O mecanismo de Dole 25, ou do resíduo de carga, seria predominante em massas superiores a 3.000 Daltons

(Da); o mecanismo de Iribarne e Tomsom26, ou daevaparação do íon predominaria em massasinferiores. De qualquer forma, nenhuma daspropostas encontra unanimidade entre os usuários daionização via Electrospray.

Uma montagem típica de uma sonda deElectrospray colocada à frente e ortogonal à entradados íons é apresentada na Figura 11. Observa-se queum gás em contracorrente, usualmente N2, é utilizadopara diminuir os aglomerados de íons indesejáveis

que se formam (“clusters”), assim como para facilitaro processo de eliminação do solvente (dessolvatação).

No modo de ionização Electrospray (ESI), oefluente da coluna de cromatografia líquida entra nasonda do ESI com carga balanceada; quando a deixa,carrega uma carga iônica líquida. Para assegurar que a ESI seja um processo contínuo, a solução precisacompensar a carga por processos eletroquímicos nosquais uma superfície condutiva age como eletrodo, no qual ocorre transferência de elétrons (Figura 12). OElectrospray pode ser operado no modo positivo ounegativo, dependendo do sinal da tensão aplicada. Nomodo positivo, as gotículas que saem do “spray” terão carga positiva e o eletrodo receberá os elétrons,ocorrendo um processo de oxidação. De formaanáloga, no modo negativo o oposto ocorrerá.

Figura 10. Mecanismos da evaporação do íon e da fissãoCoulômbica (modificado de Cech e Enke) 27 .

Figura 11. Desenho simplificado de uma sonda paraElectrospray. À esquerda, figura esquemática da sonda; àdireita as setas ilustram o caminho percorrido pelonitrogênio em contracorrente, empregado para minimizar os “clusters” no espectro, assim como para auxiliar noprocesso de eliminação do solvente (dessolvatação).

O desenho básico de uma interface paraLC-MS utilizando a ionização via Electrospray éapresentado na Figura 13. A saída da coluna deHPLC é conectada à sonda (“probe”), formada por um tubo capilar de metal circundado por um fluxo de gásnebulizador (geralmente N2). Aplica-se umadiferença de potencial de alguns milhares de voltsentre a ponta do tubo de metal e o cone de amostragem (para melhor visualização, veja Figura 11), criandoum “spray” formado por gotículas do analito na fasemóvel, e o gás nebulizador. O solvente é entãoevaporado (usualmente com auxilio de aquecimentoda sonda para facilitar a evaporação), pelos processosdescritos na Figura 10, fazendo com que a gotículadiminua sucessivamente de tamanho, até que os íonsdo analito evaporem e sejam direcionados para o conede amostragem indo, então, para o analisador de íons.

Ionização Química à Pressão Atmosférica(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)

A introdução da ionização química à pressãoatmosférica (APCI) é usualmente atribuída a Horning, o qual, em 1973, demonstrou o funcionamento destemodo com várias técnicas de introdução da amostra,incluindo a HPLC 30. Esta técnica de ionização temsido utilizada principalmente na análise de moléculasnão polares e mais voláteis, as quais não apresentamas características desejáveis para serem convertidasem íons na fase gasosa a partir de uma fasecondensada – como um líquido em HPLC. Na técnica

APCI (Figura 14), os analitos provenientes da colunade cromatografia líquida são introduzidos na sonda(usualmente um tubo capilar de vidro o qual écircundado e continuamente lavado com um gásdenominado de “make-up” gás ou gás auxiliar,usualmente N2) cuja extremidade é circundada por um sistema de aquecimento e dentro da qual um gásadicional passa continuamente para volatilizar aamostra e solvente (gás nebulizador). Próximo à



Figura 12. Os íons formados no processo Electrospray são conduzidos para o contraprato pelo campo elétrico aplicado.(modificado da referência 29).

Figura 13. Interface do tipo Electrospray utilizada para oacoplamento LC-MS.

sonda, é instalada uma agulha metálica, denominadade eletrodo de descarga tipo corona, que, submetido aum potencial de alguns milhares de Volts, provocará o aparecimento do denominado efeito corona. Esteefeito ocorre quando um material condutor ésubmetido a um campo elétrico elevado, provocandouma descarga parcial e tendo como resultado umaruptura elétrica da atmosfera circundante do condutordevido à ionização provocada pelo efeito corona. Nocaso do acoplamento LC(APCI)MS, o efluente dacoluna, ao sair da sonda, conterá vapores do analito,da fase móvel e gás nitrogênio; a fase móvel seráionizada pelo efeito corona descrito, reagindo com oanalito em fase gasosa.

Utilizando-se uma interface do tipo APCI,pode-se operar tanto no modo positivo (PCI, PositiveChemical Ionization), quanto no modo negativo(NCI, “Negative Chemical Ionization”). O sucessodo processo dependerá basicamente da afinidadeprotônica do analito. No modo positivo, o analito (M)precisa ter uma afinidade por prótons maior do que oeluente (BH+), de maneira que o analito irá abstrair opróton dele, formando uma espécie denominada “ionquase-molecular” (“quasi-molecular ion”), deacordo com a Equação 1:

PCI: BH+ + M → [M+H]+ + B (eq.1)eluente analito “quasi-molecular ion”

sendo BH+ = ácidos de Bronsted.

O “quase-molecular íon” formado neste casocorresponderá à molécula original protonada, ou seja,com uma unidade de massa a mais do que o íonmolecular (espécie formada quando espécie originalperde apenas um elétron). Portanto, subtraindo-seuma unidade de massa do “quase-molecular íon” épossível, neste caso, obter-se a massa molecular doanalito em estudo.

No modo negativo (Eq.2), a afinidade porprótons da fase móvel (eluente) deverá ser menor doque o analito, de maneira que o analito irá doar opróton para o eluente:

NCI: B- + M → [M-H]- + BH (eq.2)eluente analito “quasi-molecular ion”

sendo B- = bases de Bronsted

Neste caso, o “quase-molecular íon”corresponderá ao analito desprotonado, ou seja, comuma unidade de massa a menos que o íon molecular, oque permite a determinação da massa molecular doanalito.

Apesar da transferência de prótons ser a formamais comum em ionização química, a formação dediversos adutos tem sido também utilizada comsucesso nesta técnica. Um exemplo bastante comum éa formação de adutos com sódio ou potássio, dandoorigem aos íons [M+Na]+ e [M+K]+ ao invés de[M+H]+. Quando sais provenientes de ácidos fracos ebases fracas como o acetato de amônio sãoempregados na fase móvel, pode ocorrer formação deadutos do tipo [M+NH4]+.

Fotoionização à Pressão Atmosférica(Atmospheric Pressure Photoionization , APPI)

O princípio da interface APPI baseia-se naabsorção de fótons de luz pelo analito, ocasionando suaionização com perda de um elétron, e formando umcátion radicalar do tipo M·+ (por simplicidade,usualmente representado por M+). Este íon radicalarpoderá ser detectado nesta forma, ou participar dereações com o ambiente que o circunda, formandooutros íons os quais serão detectados31. O processo maiscomum, neste caso, será a abstração de um átomo dehidrogênio do solvente32, de acordo com a Equação 3:

M + hv → M·+ + e-

M·+ + HX → [M+H]+ + X- (eq.3)

Uma variação deste procedimento consiste no uso de um Dopante (D), substância ionizável a qual éadicionada à fase móvel para carregar cargas(alternativamente, um solvente fotoionizável pode serutilizado para o mesmo propósito), conforme Equação 4.

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Figura 14. Interface do tipo APCI (Atmospheric PressureChemical Ionization) para LC-MS.

D + hv → D+

D+ + M → [M+H]+ + D [-H] (eq.4)

Nesta técnica, tanto os íons produzidos porionização do solvente, quanto pelo dopante, podemreagir com moléculas neutras do analito (viadiferentes processos como transferência de prótons ou reações de transferência de carga) provocando aionização do analito em estudo33. Quando um dopante é empregado nesta técnica de ionização, o sistema seassemelha bastante ao APCI, daí a técnica ser também denominada “photoionization-induced APCI” ou“dopant APPI” 32.

No momento da redação deste artigo, existiamdois fornecedores principais de fontes APPI utilizadas em equipamentos de diferentes fabricantes: a Syagen(USA), que produz uma fonte de geometria abertacom uma lâmpada de elevada intensidade, e quetambém pode utilizar dopantes, e a MDS Sciex(Canadá), que projetou uma fonte que inclui um tubode reação para aumentar as reações íon-dopante.

A ionização produzida por esta fonte éusualmente branda, com o aparecimento de poucosíons no espectro, uma vez que o potencial de ionizaçãoda maioria dos solventes é acima de 10 eV, energia dofóton primário emitido por uma lâmpada de Criptônio(Kr), usualmente empregada nesta técnica.

Um esquema de uma fonte de APPI é mostrado na Figura 15. Comparando-se com a Figura 14,observa-se a grande similaridade entre as fontes(APPI e APCI), com a principal diferença sendo asubstituição da agulha de descarga corona utilizadaem APCI por uma lâmpada UV em APPI.

Comparação entre as fontes de ionizaçãoElectrospray (ESI), APCI e APPI

A Figura 16 ilustra a faixa aproximada deaplicações destas formas de ionização utilizadas emLC-MS, e sua comparação com a faixa típica de usoda GC-MS. Observa-se alguma sobreposição entreelas, sendo que a GC-MS, tanto empregando EIquanto CI, representa o extremo para moléculas nãopolares e de baixa massa molecular, enquanto que aLC-MS, empregando Electrospray como fonte deionização, representa o outro extremo ideal paraanálise de moléculas mais polares e de massamolecular maior.

Como regra geral, a ESI é preferível para aanálise de compostos bastante polares ou iônicos,termolábeis, ou com massa molecular elevada(superior a 1.000 Da). Compostos não polares ou depolaridade muito baixa tendem a apresentar melhorionização empregando-se APPI, enquanto que ospouco polares e de polaridade intermediáriageralmente dão bons resultados com APCI.

Com relação a operação em fluxos (vazões)mais elevados da fase móvel, a APCI é bastantesensível à faixa de operação, diminuindo a suacapacidade de ionização com a diminuição do fluxo(vazão). Por outro lado, tanto o ESI quanto APPIfuncionam bastante bem em fluxos baixos,compatíveis com o uso de colunas capilares e nano.

A ESI é uma técnica de ionização bastanterobusta, sendo a mais utilizada no presente, emespecial para a análise de proteínas, aminoácidos, evárias substâncias de interesse em bioanalítica,alimentos e farmacêutica. A alternativa mais recente



Figura 15. Interface do tipo APPI (Atmospheric PressurePhotoionization) para LC-MS.

Figura 16. Principais características das formas de ionizaçãoempregadas em LC-MS e sua comparação com GC-MS.

para a análise de compostos não polares é a APPI;entretanto, em se tratando de uma técnicarelativamente nova, ainda está em fase deaprimoramento e várias novas aplicações estão sendopublicadas. Novos desenvolvimentos instrumentais(fonte com outras gases que não o Kr; multifontecontendo ESI/APCI/APPI, e lâmpadas mais intensas)estão em andamento, sugerindo que a APPI poderá, acurto prazo, tornar-se a forma de ionização de escolhaem LC-MS para substâncias não polares33.

Enquanto que a ESI funciona muito bemsomente em fase reversa (em fase normal poderánecessitar de reações pós-coluna para adequar ascondições da fase móvel aos requisitos para obter-seboa ionização), a APCI e APPI funcionam melhor emfase normal e razoavelmente bem em fase reversa.Outro aspecto a ser considerado é a “supressão deíons”, a qual é mais comum em ESI do que nas outrasduas formas de ionização discutidas neste trabalho.Este fenômeno ocorre devido a uma competição naionização quando a amostra contém sal ou analitosque podem sofrer ionização com facilidade nascondições utilizadas no experimento. A eliminação(ou minimização) deste efeito é importante paraanálise quantitativa, e deve ser levado em contaquando no desenvolvimento do métodocromatográfico. Em APCI este efeito é poucopronunciado, e em APPI praticamente inexistente 34.

Finalmente, a estabilidade térmica do analitoem estudo é importante, e a APCI é a pior dentre astrês formas de ionização para análise de compostostermolábeis, seguida da APPI. O ESI é o modo deionização preferível para analitos de baixaestabilidade térmica.

2.3. Analisadores de Massas

O efluente da coluna cromatográfica, após serionizado – geralmente à pressão atmosférica (API)por um dos processos descritos no item anterior (ESI,APCI ou APPI) - é direcionado para o analisador demassas. Os analisadores de massas separam os íons de acordo com a relação existente entre suas massas ecargas, ou seja, a razão m/z. As características deconstrução e operação diferem de um analisador paraoutro, assim como seus benefícios e limitações. Umavez que existe hoje uma grande diversidade deanalisadores de massas, a escolha do mais apropriadodeve ser efetuada considerando-se a aplicação (ex.faixa de massas desejada), desempenho (ex.resolução) desejado e custo (em função do tipo deanalisador, um MS para o acoplamento LC-MS podevariar desde algumas dezenas de milhares de dólares,

até valores superiores a um milhão de dólares, preçoFOB). Em função destes fatores, não existe umanalisador de massas o qual seja ideal para todas asaplicações, conforme discutido há 2 décadas porBrunnee35.

2.3.1. Analisadores de massas baseados em setoreselétricos e magnéticos

Nos estudos experimentais sobre a naturezados “raios catódicos” (elétrons), J. J. Thomsonempregou campos magnéticos e elétricos a um feixede elétrons obtendo uma estimativa da razão m/e paraeste feixe 36. O equipamento utilizado é consideradocomo o precursor dos espectrômetros de massasmodernos, muitos dos quais ainda utilizando osmesmos princípios com pequenas modificaçõestecnológicas.

Em um espectrômetro de massas de deflexãomagnética, os íons ao deixarem a fonte são aceleradosa uma alta velocidade, passando por um setormagnético no qual um campo magnético é aplicado na direção perpendicular à da direção do movimento doíon. Quando uma aceleração é aplicadaperpendicularmente à direção de movimento de umobjeto qualquer, sua velocidade permanece constantee o mesmo viajará em um caminho circular. Assim, osetor magnético segue um arco; o raio e o ângulo doarco variam de acordo com os detalhes de construção.Um setor magnético sozinho irá separar íons deacordo com a razão massa/carga; entretanto, aresolução neste caso será limitada pelo fato de que osíons saindo da fonte não terão exatamente a mesmaenergia e, portanto, não terão exatamente a mesmavelocidade. Para melhorar a resolução, adiciona-seum setor elétrico que focaliza os íons de acordo comsuas energias cinéticas. O formato será o mesmo docampo magnético, ou seja, em arco, uma vez queaplicará uma força perpendicular à direção domovimento do campo.

Nos espectrômetros denominadosequipamentos “de setores”, dois tipos de princípiosfísicos (campos associados aos setores) sãoempregados: magnético (B) e elétrico (E). Um íon decarga ze movimentando-se em um campo magnéticoB descreverá um movimento circular de raio rm, noqual a força centrífuga é igualada à força que o campomagnético exerce sobre o íon, de acordo com aEquação 5:

ze Bvmv

rm

=2

(eq.5)

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por meio da qual pode-se determinar mv, a quantidade de movimento (Eq.6):

mv = ze B rm (eq.6)

Neste caso, o campo magnético funciona como um separador baseado na quantidade de movimentoou “momentum”, mv. Para que íons de mesma massa ecarga sigam o mesmo caminho (rm) em um campomagnético (B) fixo, é necessário que o “momentum”(ou, alternativamente, para uma dada massa avelocidade v ou a energia cinética mv2/2) sejaconstante.

Acelerando o íon em um campo elétrico Va,conferindo ao mesmo uma energia cinéticaconhecida, teremos:

mvze Va

2

2= (eq.7)

Pela Eq. 6, a velocidade v pode ser dada por :

vze B rm=

m(eq.8)

Substituindo a velocidade v (Eq.8) na Eq. 7,teremos:

m ze B r mze Vm

a

[( / )]

2

2

= ou (eq.9)

m ze B r

mze Vm

a

( )2 2 2

22

= ou (eq.10)

ze B r

mze Vm

a

2 2 2

2

= ou (eq.11)

Portanto,

ze B r m ze Vm a2 2 2

2 = (eq.12)

Isolando-se m obtem-se (Eq.13)

ze B r

mze Vm

a

2 2 2

2

= ou

ze B r

Vmm

a

2 2

2= (eq.13)

Dividindo-se os dois lados por z obtem-se(Eq. 14)

e B r

V

m

zm

a

2 2

2= (eq.14)

Portanto, neste caso a razão m/z do íon é umafunção dos parâmetros experimentais B e Va,conforme mostra a Eq. 14 rearranjada:

m

z

e B r

Vm

a

=

2 2

2(eq.15)

Neste caso, a energia cinética dos íonsdependerá de suas energias iniciais e da distribuiçãoespacial antes da aceleração. Assim, é formado umsetor eletrostático.

Quando os íons se movem por um campoelétrico radial, o caminho será determinado por:

mv

r

zeVe

de

2

= (Eq.16)

Ve = potencial aplicado nos pratosd = distância entre os pratosre = raio do caminho dos íons no campo elétrico

Para uma dada geometria, re e d são fixos; opotencial aplicado Ve seleciona a energia cinética mv2/2.

À medida em que os íons se movem com amesma velocidade por dos dois setores (elétrico emagnético), suas velocidades podem ser igualadasnos dois setores, de acordo com a Equação 17:

zeBr

m

zeV r

mdm e e= (Eq.17)

Esta equação permite medir-se um espectro demassas pela varredura do campo eletrostático (Ve),magnético (B) ou ambos, de acordo com:

m

z

ed

V rB r

e e

m= 2 2(Eq.18)

Observa-se que a razão m/z é independente dopotencial de aceleração inicial (Va).

A Figura 17 ilustra um espectrômetro de massas denominado de duplo foco ou duplo setor (magnético e elétrico). Espectrômetros deste tipo são capazes deoperarem em elevadas resoluções (frequentementeacima de 10.000) na determinação de massassuperiores a 15.000 Da, com exatidão de massaselevada. Estes parâmetros podem ser ampliados paravalores ainda melhores, diminuindo-se a voltagemaplicada e estreitando as fendas. Porém, isto ocorrerá às custas de uma diminuição significativa dasensibilidade. Uma diminuição no espalhamento deíons e melhora na transmissão dos mesmos pode serconseguida operando a fonte de íons em valoreselevados (superiores a 8.000 V), o que cria umadificuldade para o acoplamento LC-MS, empregandoESI como modo de ionização devido à formação dearco voltaico pela elevada voltagem e pressõesrelativamente altas. Este problema tem sido corrigidoem instrumentos de geração mais moderna. Comoocorre com qualquer outro equipamento, estesinstrumentos apresentam vantagens e limitações,dependendo da aplicação e dos recursos financeirosdisponíveis.



As principais vantagens apresentadas pelosequipamentos que utilizam setores elétrico emagnético como analisadores de íons são a altaresolução e exatidão de massas. As principaislimitações são o elevado custo e complexidade (tantona aquisição, operação, quanto manutenção),velocidade limitada de varredura, sensibilidade baixaquando operado em resoluções elevadas, potenciaisproblemas no acoplamento com LC-ESI devido aformação de arco voltaico. Em função destascaracterísticas, e das limitações, este tipo deinstrumento, atualmente, é mais empregado emmedidas de massas com alta resolução e em estudosbásicos em MS, tais como estudos de fragmentação.

2.3.2. Analisadores de massas do tipo Quadrupolo

O quadrupolo é o analisador de massas maispopular no momento devido, principalmente, à suasimplicidade, preço relativamente baixo, boalinearidade em análises quantitativas, facilidade deser entendido e operado. Apesar de usualmente seroperado em resolução baixa (tipicamente R= 1.000),esta pode ser aumentada em condições favoráveispara valores superiores a 4.000. Sua exatidão demassas encontra-se, geralmente, entre 0,1 e 0,2unidades de massa atômica (u.m.a., a.m.u. ou Dalton), e a faixa de massas usualmente entre 10 e 4.000 u.m.a.

O quadrupolo é composto de quatro barras,usualmente feitas de metal (quadrupolos de vidro jáforam produzidos e comercializados, porémdescontinuados), dispostas em dois pares (Figura 18).Apesar das barras com sessão de choque hiperbólicoserem mais eficientes, por questões econômicasutiliza-se usualmente barras cilíndricas. Um par debarras é mantido em um potencial elétrico positivo,enquanto que o outro a um potencial negativo. Umacombinação de corrente contínua (DC) e

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Figura 17. Esquema simplificado de um espectrômetro de massas de duplo foco ou duplo setor.

Figura 18. Arranjo das quatro barras utilizadas em umanalisador do tipo quadrupolo.



radiofrequência (Rf) é aplicada nas barras. O parpositivo de barras atuará como um filtro para massasmais elevadas, enquanto que o par negativo age comoum filtro para massas pequenas. Os quadrupolosoperam a uma resolução constante (a qual depende darazão Rf/DC), mantendo a razão Rf/DC constante.Considerando-se uma dada amplitude para asvoltagens Rf e DC, somente os íons que apresentaremdeterminada razão massa/carga (m/z), a qual estejaem ressonância com o campo aplicado, irão passarpelas barras do quadrupolo e serão detectados. Osdemais íons que entrarem no quadrupolo terão suastrajetórias instáveis e, como consequência, atingirãoas barras e serão eliminados pela bomba de vácuo(Figura 19). Estas voltagens aplicadas criam nasbarras um campo hiperbólico dado por (Eq.19):

Φ = + −( cos( . )V V t

x y

rdc rf ω

2 2

0

(eq.19)

A força sobre o íon posicionado nascoordenadas x,y será proporcional à sua distância doeixo z, e a sua janela de estabilidade determinada pelafrequência da Vrf (ω) e pela razão Vrf/Vdc. A distânciaentre as barras (r0) e a frequência do potencial RF (ω)são constantes para um dado quadrupolo, e asequações de movimento que descrevem esta janela deestabilidade podem ser numericamente resolvidas emfunção de dois parâmetros (Eq. 20 e 21):

aeV

m r

dc=4

202ω

(eq.20)

qeV

m r

rf=2

202ω

(eq.21)

Mantendo constante a razão Vdc/Vrf, umgráfico de a x q permite definir graficamente umalinha de estabilidade dos íons. Frequentemente arazão Vdc/Vrf é selecionada de maneira que uma janelade 1 Da é escolhida, resultando em uma resoluçãounitária em toda a faixa de massa analisada.

2.3.3. Analisadores de massas do tipo “Ion Trap”

Os analisadores do tipo “ion trap”(aprisionadores de íons) são também denominados dequadrupolo tridimensional ou quadrupolo “ion trap”, enquanto que os quadrupolos descritos no itemanterior são denominados simplesmente quadrupolosou, alternativamente, quadrupolos lineares. Nosanalisadores do tipo “ion trap” um eletrodohiperbólico na forma de um anel (denominado “ringelectrode”) é colocado entre dois eletrodoshiperbólicos denominados, eletrodos “end cap”.Uma voltagem Rf (corrente alternada, AC), deamplitude variável V e com frequência ao redor de 1MHz, é aplicada ao “ring electrode”, enquanto que os eletrodos “end cap” são aterrados (Figura 20). Osdois eletrodos “end cap” apresentam um orifício nocentro; o eletrodo superior permite a passagem dosíons provenientes da fonte de ionização (eletrodo deentrada) e direcionados para o “ring electrode”, enquanto que o orifício do eletrodo de saída servepara direcionar os íons ejetados para detecção (Figura21). Neste tipo de analisador normalmente não seaplica voltagem DC (corrente direta); apenas a Rf.Tipicamente, o filamento é ligado e os íons dentro do“trap” (armadilha) – formados ou nele introduzidos – com um valor de m/z acima de um limite estabelecidopor V serão aprisionados (“trapped”) por um tempo

Figura 19. Esquema de um analisador do tipo quadruplo mostrando que os íons em ressonância com o campo aplicadoatravessam as barras e dirigem para o detector onde serão registrados.

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ao redor de 1 ms (milisegundo). O filamento é entãodesligado, e uma varredura de V é executada paraobter-se um espectro de massas. Os íons de razãomassa/carga igual a m/z serão acelerados na direçãodo eixo z, e ejetados pelo eletrodo “end cap” de saídados íons sendo, então, detectados. As equações quedescrevem o movimento dos íons do “íon trap” sãosimilares às descritas para o quadrupolo linear, e nãoserão discutidas.

A repulsão entre íons de mesma cargaconfinados no centro do “trap” tende a desestabilizarsuas trajetórias por dispersão (efeito “space-charge”).Para contornar este problema, adiciona-se um gás –

usualmente He ou H2 a uma pressão de 10-3 torr - oqual “resfria” os íons por colisão (perda de energiacinética), mantendo-os aprisionados com refocalização para o centro do trap e aumentando a resolução esensibilidade.

Juntamente com o quadrupolo linear, o “iontrap” é um dos analisadores de íons mais populares nomomento devido a seu custo relativamente baixo(comparável ao quadrupolo) e pequeno tamanhopodendo ser utilizado na obtenção de analisadoresque ocupam pouco espaço. Sua resolução é similar àdo quadrupolo linear (unitária), podendo seraumentada empregando-se varreduras mais lentas emuma faixa de massas menor. Nestas condições,resoluções próximas de 5.000 podem ser obtidas. Asaplicações típicas deste analisador são similaresàquelas do quadrupolo.

2.3.4. Analisadores de massas do tipo“Time-of-Flight” (Tempo de Vôo)

Apesar de ser geralmente aceito que o conceito do analisar do tipo TOF foi desenvolvido por WilliamStephens37,38, na Universidade da Pensilvânia (USA)em torno de 1946, foram William Wiley e I.H.McLaren da empresa Bendix (USA) os pioneiros adesenvolverem e comercializarem um equipamentodeste tipo, no final de 1955 39.

Em um sistema do tipo TOF, os íons formadosna fonte de ionização são extraídos e acelerados emalta velocidade por um campo elétrico em um tubolongo denominado usualmente “drift tube”, após oqual atingem o detector. A velocidade alcançada peloíon acelerado é proporcional à raiz quadrada de suarazão m/z – por simplicidade, assume-se serinversamente proporcional à massa. De formaanáloga, o tempo necessário para um íon atravessar otubo será inversamente proporcional à raiz quadradada razão m/z – também por simplicidade, é comumassumir-se que o mesmo é proporcional à massa - uma vez que a distância entre a formação do íon e odetector é fixa (depende do comprimento do tubo). AFigura 22 ilustra de forma esquemática um analisadordo tipo TOF em uma de suas configurações maissimples, enquanto que a Figura 23 apresenta cópia deuma página da patente original de Stevens.

O princípio de operação do TOF baseia-se namedida do “tempo de voo” de um íon dentro doespectrômetro de massas. Uma vez que as dimensõesdo tubo e a energia cinética dos íons são bemconhecidas, o cálculo da razão m/z torna-se simples.

Figura 20. Eletrodos que formam a parte principal de umanalisador do tipo “ion trap”. O eletrodo central (em formade anel, ou “ring electrode”) é circundado por doiseletrodos sendo um de entrada e outro de saída dos íons.

Figura 21. Visão geral de um analisador do tipo “ion trap”ilusrando os eletrodos de entrada, central (“ring electrode”)e de saída.



Figura 22. Desenho esquemático de um analisador do tipo TOF em uma configuração linear, um deseus modos mais simples.

Figura 23. Página da patente [USA- 2612607] onde Stephens descreve seu analisador tipo TOF. O pedido de patente foipreenchido em 5 de abril de 1947, e a patente confirmada em setembro de 1952 . |Source=United States Patent and TrademarkOffice |Date=1952 |Author= USPT).

A energia cinética de um íon submetido a umcampo elétrico E será dada por (Eq. 22):

mvzeE

2= (eq.22)

onde E é a energia do campo elétrico usado naaceleração do íon em Volts; m a massa do íon; z acarga do íon; e a carga de um elétron e v a velocidadefinal do íon após a aceleração.

Isolando-se a velocidade nesta equação,obtem-se a Equação 23:

vzeE

m= 2

(eq.23)

Uma vez que a distância da fonte de íons aodetector é conhecida e igual a d, o tempo t necessáriopara o íon atravessar o tubo será (Equação 24):

td

v

d

zeE

m

d

m

zeE

= = =

2

1

2 2

1

2(eq.24)

Como d, e, e E são constantes e podem seragrupadas como c, o tempo de voo t de um íon seráproporcional à raiz quadrada da razão m/z (Equação 25) :

tm

zc= 1

2(eq.25)

Ou seja, medindo-se o tempo de vôo t a razãom/z será determinada, uma vez que os componentesdo termo c são constantes.

Uma vez que para a medida do tempo t éfundamental estabelecer o início e final do evento, osíons precisam ser formados por ionização pulsada (aduração do pulso é ao redor de 0,2 a 1 milisegundo –ms). Isto torna possível converter o efluente líquidodo LC em um pacote contendo os íons a seremacelerados. Apesar de a precisão na medida de tempoinfluenciar diretamente na determinação correta darazão m/z, a energia cinética inicial e a distribuição

espacial dos íons serão importantes. Variações naenergia cinética e na posição do íon ao entrar na etapade aceleração irão modificar sua energia, provocandoerros na medida do tempo de voo e, comoconsequência, da razão m/z, resultando em perda deresolução no TOF.

A introdução de um refletor (tambémconhecido como espelho de íons ou espelhoeletrônico) e o uso de técnicas ortogonais deintrodução dos íons (o-TOF) contribuíram para amelhora da resolução por meio de um aprimoramentono controle ou compensação do espalhamento inicialde energia e na distribuição espacial dos íons.

O reflectron (tipo de TOF que utiliza umrefletor no tubo de voo), proposto pelo pesquisadorrusso, Boris A. Mamyrin 40,41, utiliza um campoelétrico aplicado a uma série de grades ou eletrodos(também denominados pratos ou discos) para revertera direção da trajetória dos íons que entram nele. Pormeio deste dispositivo, os íons de mesma razão m/zchegam ao mesmo tempo no detector, ainda queapresentem diferenças em sua energia cinética.

A parte (a) da Figura 24 mostra uma ilustraçãode um íon formado na fonte sendo acelerado pelo“drift tube” em direção ao detector, sem ajuda doreflectron. Na parte (b) da mesma figura o reflectron éligado observando-se que a trajetória do íon agoraserá curva, a dispersão dos íons de mesma razão m/z édiminuída e a resolução aumentada, e os íonsretornam ao “drift tube” antes de serem detectados.

Desenvolvido inicialmente como um sistemade um único estágio, o reflectron evoluiu para um deduplo estágio, largamente empregado emanalisadores atuais. O relectron de um estágio (Figura25 a) consiste em uma região na qual é aplicadoapenas um campo elétrico, podendo ser linear ou nãolinear. O reflectron não linear pode ter campo curvo 42

ou quadrático 43.

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Figura 24. Esquema simplificado de um TOF com o reflectron fora de operação (esquerda) e em operação (direita), ilustrando acurva na trajetória dos íons provocada pelo reflectron.

Um reflectron de duplo estágio possui duasregiões nas quais são aplicados campos elétricosdiferentes (Figura 25b); o campo aplicado na primeira região, o estágio é maior, o que reduz o tamanho doequipamento e melhora a focalização dos íons 44.

Um campo eletrostático constante éempregado no reflectron para reflexão do feixe deíons em direção do detector. Os íons de maior energiapercorrerão uma distância maior no reflectron,enquanto que os íons de menor energia percorrerãouma distância menor. A Figura 26 é uma fotografia deum reflectron evidenciando as placas metálicas queconduzem a voltagem formando um campo elétrico oqual reflete os íons.

Além do uso do reflectron, outra forma deaumentar a resolução utilizando analisador do tipoTOF é com o uso de geometria ortogonal (o-TOF).Neste sistema os íons são produzidos de formacontínua na fonte de ionização (Electrospray, porexemplo) e acelerados e focalizados com ajuda delentes apropriadas. A seguir, aplica-se uma aceleração pulsada ortogonal (perpendicular) ao movimento dosíons, os quais irão adquirir velocidades as quais sãoindependentes de suas velocidades adquiridas pelaaceleração na fonte (Figura 27).

O desempenho do oa-TOF (TOF com aceleração ortogonal) pode ser ainda melhorado com a adição deum gás. Este colide com os íons em um guia de váriospolos (usualmente, um quadrupolo ou hexapolo

operando apenas com radiofrequência – modo“rf-only”) diminuindo a energia (“resfriando”) dos íonsantes de entrarem na região de aceleração ortogonal,também denominada “pulser”, resultando nafocalização dos íons em um feixe de diâmetro menor. Na região de alto vácuo situada antes do “pulser”, umconjunto de lentes eletrostáticas torna o feixe de íons

paralelo, minimizando problemas dedivergência na direção de aceleração.A combinação destes sistemas –aceleração ortogonal e resfriamentopor colisão com gás, juntamente como reflectron, aumentaram a resoluçãodos atuais TOF MS, sem diminuir suasensibilidade.

A Figura 28 ilustra o esquemade um TOF MS atual de altaresolução, com aceleração ortogonale reflectron. Os hexapolos e

quadrupolos servem de guia para os íons no modoTOF, podendo ser utilizados para uma montagem emtandem ou MS-MS do tipo Q-TOF (quadrupolo-tempode voo). Estes equipamentos possuem elevadaresolução (no modo linear a resolução é limitada), boasensibilidade, velocidade de varredura muito rápida(importante para picos cromatográficos estreitos).Porém, exigem eletrônica bastante sofisticada, bomcontrole do tempo e da energia inicial e distribuiçãoespacial dos íons. Sua aplicação é bastante ampla,especialmente quando alta resolução é necessária. Afaixa de massas que analisa é ampla (teoricamenteilimitada, mas, na prática, massas muito elevadas –muito superiores a 500.000 Da - são difíceis de seremdeterminadas com boa precisão e exatidão).



Figura 25. Esquema de um reflectron (a) um estágio, linear(b) duplo estágio.

Figura 27. Página da patente {U.S. Patent 7230234}onde T.Kobayashi descreve um espectrômetro de massas do tipotempo de voo (TOF) com aceleração ortogonal (“Orthogonalacceleration time-of-flight mass spectrometer” (submetidoem 13 de julho de 2005 por Tatsuji Kobayashi ).

Figura 26. Reflectron de duplo estágio contendo 46 placas metálicas (Shimadzu, Japão).

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2.3.5. Outros tipos de Analisadores de Massas

Apesar de existirem outros analisadores demassas para MS, os três descritos até o momento(quadrupolo, “ion-trap” e TOF) são, de longe, os maisempregados no acoplamento LC-MS. Enquanto queos dois primeiros são compactos, apresentam grandesimplicidade, baixo custo, e facilidade operacional,apresentam como principal limitação a baixaresolução. O TOF, por outro lado, perde para os doisanalisadores nestes quesitos, mas apresenta resoluçãomuito superior, principalmente no modo ao-TOF, oque pode ser necessário em análises que requeiramalta resolução. Outro tipo de analisador de massas,introduzido comercialmente mais recente e de custoainda acentuadamente elevado (porém com resoluçãoigualmente superior aos 3 analisadores já discutidos)é o FTICR (“Fourier Transform Ion CyclotronResonance” ou Ressonância Ciclotrônica de Íonscom Transformada de Fourier).

O FTICR-MS, também conhecido apenascomo FT-MS, foi desenvolvido por Mel Comisarow e Alan G. Marshall, na Universidade de BritishColumbia, Canadá, em 1974 45. Os fundamentos datécnica foram baseados no uso da Ressonância de Íons em Ciclotron – Espectrometria de Massas (ICR-MS),

publicado por Hipple em 1949 46 e na existência dofenômeno bem estabelecido e conhecido do uso deTransformada de Fourier em Ressonância MagnéticaNuclear (FT-NMR).

Em FT MS, os íons gerados na fonte passampor uma série de estágios de diminuição de pressão,em direção a um alto vácuo. Ao entrarem na cela(Figura 29), que serão aprisionados (“ion trap”), atemperatura estará próxima ao zero absoluto e apressão ao redor de 10-8 bar. Isto é conseguidomantendo-se a cela dentro de um supercondutor dealto campo magnético (geralmente entre 4,7 e 13Tesla, valores estes que têm sido aumentadorapidamente) o qual é resfriado pelo emprego denitrogênio e hélio, ambos no estado líquido. Aopassarem pelo campo magnético B, os íons terão suatrajetória descrita por um movimento circular em umplano perpendicular ao do campo (Figura 30). A força F sentida por um íon de carga z e velocidade v aoentrar no campo magnético B será dada pelaexpressão de Lorentz (Eq. 26):

F = z v x B (eq.26)

Os íons não são expulsos da cela graças a umapequena voltagem (corrente contínua) aplicada aos

Figura 28. Analisador do tipo TOF com sistema de aceleração ortogonal e Reflectron, podendo operar no modoLC-MS/MS na configuração Q-TOF (quadrupolo -TOF) ou no modo LC-TOF utilizando o quadrupolo apenascomo filtro de massa ao invés de analisador, ou seja, aplicando apenas radiofreqüência, Rf (“Rf-only mode”).



eletrodos de aprisionamento (“trapping electrodes”)a qual gera um campo elétrico E perpendicular aocampo magnético B.

A frequência de rotação de um íon no ciclotron (ωc) depende de sua massa (m) e carga (z) de acordocom a Equação 27:

ωπc

zB

m=

2(eq.27)

No início do experimento nenhum sinal éobservado, pois o raio do movimento é muito pequeno.Varrendo-se a radiofrequência RF pulsada pelas placas de excitação existentes na cela, é possível excitar-secada íon com razão m/z. Cada frequência de excitaçãoentra em ressonância com determinado íon e o excitapara órbitas maiores, onde induz uma correntealternada entre as placas do detector (Figura 31). Acorrente induzida tem a mesma frequência de ciclotrondos íons, e intensidade proporcional a seu número.Quando a frequência sai de ressonância para uma dada

razão m/z, os íons retornam ao estado primitivo e umoutro pacote de íons com a próxima razão m/z seráexcitado e o processo continua desta forma. Para efeitoprático, entretanto, considera-se as frequências comosimultâneas, resultando em espectros complexos davariação da frequência com o tempo. Este sinalcomplexo gerado sofrerá deconvolução por meio demétodos, empregando transformada de Fourier 47,resultando em espectros que apresentam a variação deintensidade em função da frequência ωc.Rearranjando-se a Equação 27, obtém-se a expressãoque relaciona m/z com a frequência ωc, a qual permite aconversão então do espectro para intensidade emfunção da massa, de acordo com a Eq. 28:

m

z

B

c

=2πω

(eq.28)

Uma calibração do sistema deve ser feita nestemomento. Estas transformações, representadas naFig. 31, podem ser melhor visualizadas na Figura 32.

Figura 29. Foto de uma cela ICR de um espectrômetro de massasLTQ-FT-ICR da Thermo-Electron. A cela é feita de placas de cobre emforma cilíndrica e insataladas em um sistema de vácuo. Acessível emhttp://en.wikipedia.org/wiki/File:ICR_Cell.jpg. O autor da foto é Jeff Dahle o acesso à mesma foi efetuado em 21.02.2009.

Figura 30. Movimento de um íon antes e depois do processo de excitação, mostrando a órbita ciclotrônica percorrida. Em (a) os íons aprisionados oscilam com amplitude térmica baixa,incoerente; em (b) a excitação varre os íons em órbita eletrônica coerente; em (c) umpré-amplificador e digitalizador pegam os potenciais induzidos na cela.

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Figura 31. Esquema simplificado de um sistema FT-ICR-MS ilustrando a deteção e geração de sinal via oaprisionamento de íon (“ion trap”).

Figura 32. Etapas de transformação do sinal até obter-se o espectro de massas na formam/z versus intensidade do íon.

O FT MS é o analisar de massas para usoacoplado com LC (Fig. 33) que apresenta a maiorresolução (superior a 106, ou seja, quase ilimitada),sensibilidade e velocidade de aquisição de dados.Entretanto, seu custo ainda é elevado, possuindo umatecnologia mais complexa que os demais analisadores descritos, especialmente em relação ao alto vácuonecessário. Sua principal aplicação, no momento, éem estudos onde uma resolução extremamenteelevada é necessária, ou para estudos fundamentais de fragmentação de moléculas.

2.4. Detectores

O detector é o ultimo módulo de umespectrômetro de massas (Figura 6). Assim como oanalisador é considerado o coração de umespectrômetro de massas, o detector pode serentendido como seus olhos. Novos detectores sãonecessários para corrigir, melhorar e ampliar adetecção de íons e, portanto, nossa “visão química” 48. O detector registra a carga induzida ou a correnteproduzida quando um íon atravessa uma superfície ou

atinge sua superfície. No caso de umequipamento que possa efetuar umavarredura de massas, o sinal produzido no detector durante uma varredura emfunção da razão m/z ou posição do íon navarredura, irá gerar um espectro demassas (Figura 34). Assim, um espectrode massas é um registro dos íonsdetectados em função da razão m/z.

As principais fontes de ionização e os analisadores mais utilizados nomomento foram comentados, assim como a significativa evolução tecnológicanestas áreas. Entretanto, os detectores deíons não receberam a mesma atenção; amaior parte do avanço deveu-se amelhoras nos conceitos existentes do queem inovações brilhantes.

Existe atualmente uma grandevariedade de detectores para MS, sendo aescolha efetuada a partir do projeto doespectrômetro e suas aplicações analíticas. Os mais empregados serão discutidos aseguir; o leitor interessado no assunto deve consultar a excelente revisão de Barnes ecolaboradores 48.

2.4.1. Chapas Fotográficas

As chapas fotográficas foramempregadas como primeiro sistema dedetecção em larga escala paraespectrometria de massas. J.J. Thompsonutilizou chapas fotográficas comanteparos luminescentes para visualizar emostrar espectros de massas. Foto-placassensíveis a íons foram, posteriormente,colocadas na região de vácuo de umespectrômetro de massas para a detecçãodireta de íons. Até recentemente estesdispositivos eram fabricados, e algunsainda se encontram em utilização ao redor do mundo. A Figura 35 ilustra um



Figura 33. Acoplamento LC(ESI)-FT MS (Cromatografia Líquida eEspectrometria de Massas com Transformada de Fourier empregando umafonte de ionização do tipo Electrospray).

Figura 34. Registro da abundância (ou intensidade) dos íons detectados emfunção da razão massa/carga (m/z), denominado espectro de massas, para ocomposto n-decano (C10H22).

2009 | v . 1 | n . 2 57


diagrama de funcionamento de um detector baseadoem chapa fotográfica, juntamente com o resultado daexposição de vários íons em função da relação m/z.

Apesar de a simplicidade e alguns aspectospositivos, este tipo de detector apresenta váriasdesvantagens e limitações. A sensibilidade é baixa,aquém da requerida na maioria das aplicações atuais,precisão ruim, difícil quantificação, faixa lineardinâmica pequena, além da necessidade de revelar aimagem depois do experimento.

2.4.2. Detector de Faraday

Também chamado de copo de Faraday, por sua geometria mais popular lembrar este formato, odetector consiste em um copo feito de metal (Figura36) projetado para captar partículas carregadas embaixas pressões (“vácuo”). A corrente é medida e seuvalor utilizado para determinar a quantidade de íonsou elétrons que chegam no copo.

Apesar de não apresentar a mesmasensibilidade de uma multiplicadora de elétrons estedetector, amplamente usado nos primórdios da MS, éainda empregado na determinação de partículascarregadas devido a sua exatidão em função da relaçãodireta entre a corrente medida e o número de íons.

2.4.3. Detectores baseados na multiplicação de elétrons (EM)

Os detectores baseados na multiplicação deelétrons (EM, “Electron Multiplier”) são os maisutilizados atualmente para detecção de íons, podendoter várias geometrias diferentes. Os modelos maisantigos eram baseados na tecnologia da detecção defótons por tubos denominados fotomultiplicadoras(PMT). As multiplicadoras de elétrons utilizam comocatodo um metal, óxido metálico ou liga que apresentafacilidade em perder elétrons quando atingida por umíon. Os elétrons removidos do catodo por processodenominado emissão secundária ou SEM ( “secondary electron multiplier” - cada elétron gera entre 1 e 3novos elétrons, em média) serão direcionados para um

Figura 35. Detector do tipo chapa fotográfica paraespectrometria de massas.

Figura 36. Esquema de um detector do tipo Copo de Faraday

eletrodo que apresenta uma diferença de potencialpositiva em relação ao catodo, atraindo os elétrons.Este processo é multiplicado em cascata em várioseletrodos colocados no tubo, denominados dinodos(tipicamente entre 6 e 20 por EM). Cada dinodoapresenta uma diferença de potencial em relação aoanterior entre 100 V e 200 V, facilitando a atração doselétrons gerados no processo (Figura 37). Ao final doprocesso, um elevado número de elétrons é coletado no anodo para cada íon que chegou inicialmente nocatodo, com um fator de amplificação bastanteeficiente (usualmente, uma corrente contendo mais que 106 elétrons é gerada para um único íon incidindo naEM). Este tipo de EM é também conhecido como“discrete-dynode SEM”, ou seja, eletromultiplicadorade emissão secundária com dinodos discretos.

Um “dinodo contínuo” pode ser construído apartir da deposição de um filme de um materialsemicondutor em uma superfície isolante, usualmente em forma de funil, ao qual uma voltagem negativa éaplicada na entrada (mais larga) epositiva na saída (mais estreita). A diferença de voltagem dentro dotubo produz um campocontinuamente acelerado. Os íons, ao atingirem a superfície daentrada do detector, produzem aemissão de elétrons secundáriosos quais produzirão a emissão deoutros elétrons em cascata. Nofinal do processo, um eletrodoseparado (anodo) é utilizado paracoletar os elétrons multiplicados.Estes detectores, encontrados em

várias geometrias, são conhecidos como“continuous-dynode EM” (CDEM) ou “channelelectron multiplier” (CEM). Uma das versões maisutilizadas deste detector atualmente é comercialmente denominada de Channeltron.

Uma forma geométrica diferente para estesdetectores do tipo dinodo contínuo é o pratomulticanal (“multichannel plate, MCP). O MCP 48 éconsiderado como um arranjo bidimensional emparalelo de uma série de pequenas multiplicadoras deelétrons de dinodo contínuo - cerca de 10-100 µm dediâmetro cada. Os microcanais, cerca de 100 porMCP, são construídos em paralelo, no formato deprato ou disco, ao invés de funil (Figura 38). Quandoum íon atinge a superfície emissiva próxima daentrada do microcanal, irá ocorrer um processosimilar ao que ocorre nas CDEM. Os íons, ao saíremdo microcanal, serão coletados em um anodo paradetecção da corrente, como nas SEM.



Figura 37. Multiplicação de elétrons em uma EM (“electron multiplier”). À esquerda, desenho esquemático de como ocorre aamplificação dos elétrons em uma EM de dinodos discretos; à direita desenho de uma EM de dinodos contínuos, do tipoChanneltron.

Figura 38. Detector MCP (“multichannel plate”).

2.4.4. Considerações finais sobre os detectores de íons usados em MS

O detector é, muito provavelmente, a parte dainstrumentação em MS que sofreu a menor evolução.Dentre os atributos desejáveis para um detector deíons em espectrometria de massas, pelo menos osseguintes devem constar 48: resposta a uma amplafaixa de massas; baixo ou nenhum ruído; altaestabilidade; resposta independente da massa;detecção simultânea; resposta rápida. Do ponto devista prático, deveria apresentar pouca ou nenhumamanutenção; durabilidade; facilidade de sersubstituído e barato. Nenhum detector existente nomercado preenche estes requisitos desejáveis, ficando a escolha dependendo do projeto do equipamento edos requisitos analíticos para o qual o equipamentoserá utilizado. Na prática, na maioria dosinstrumentos utilizados para o acoplamento LC/MS,em especial do tipo quadrupole e “íon trap”, asmultiplicadoras de elétrons (EM) apresentam uma boa razão entre custo e benefício, sendo as preferidas. Nos sistemas MS nos quais o analisador é do tipo TOF a parte eletrônica do detector precisa registrar oespectro de massas completo dentro do tempo de voodos íons, usualmente na faixa entre 1 e 100 µs, comlargura de pico da ordem de nano-segundos (ns). Osdetectores empregados neste caso usam velocidadesde amostragem da ordem de GHz, o que ainda limita aresolução do TOF quando adequadamente ajustado49. A detecção de íons aprisionados e ainda emmovimento pode ser feita pela corrente induzida emeletrodos adjacentes. No caso de um equipamento dotipo FTICR-MS, os íons aprisionados ou emressonância são detectados pelas correntes que elesinduzem em um par de placas de detecção em umacela cúbica de ICR (Fig. 39). Uma vez que adeterminação eletrônica de frequência pode ser

bastante exata, a razão m/z pode ser determinada comalta resolução e elevada exatidão de massa,especialmente quando a amostra pode ser medidamais de uma vez. Isto é possível porque sendo estatécnica baseada na medida de corrente de imagens, amesma não é destrutiva, permitindo que os íonspermaneçam na cela, sejam reexcitados várias vezes edetectados 50.

2.3. O Acoplamento entre CromatografiaLíquida e Espectrometria de Massas(LC/MS): Finalmente compatíveis ???

Durante os primeiros trabalhos visando oacoplamento entre técnicas cromatográficas eespectrometria de massas, a discussãoinvariavelmente terminava na seguinte disputa: acromatografia era um “mero” sistema de introduçãode amostras para a espectrometria de massas, ou aespectrometria de massas era um “mero” detector para cromatografia? Certamente as duas correntesencontraram seus defensores, a ponto de uma empresa americana haver cunhado, na década de 1970, o termo “mass selective detector” (MSD) para descrever umespectrômetro de massas dedicado a funcionar comodetector para cromatografia gasosa. Oscromatografistas achavam a espectrometria de massas muito complexa e cara para ser utilizada comodetector, e os espectrometristas de massas achavam acromatografia desnecessária para seus estudos.

A popularização das duas técnicas mostrouaos usuários o que cada uma delas tem de melhor: acromatografia como uma técnica de separação e aespectrometria de massas, de identificação.Certamente os extremistas ou radicais, de qualquerdos lados – como o pesquisador americano, que emseu website escreve que se uma análise não pode ser

feita por espectrometria de massas éporque não vale a pena fazê-la - nãocontribuem nem um pouco, como emoutros campos do conhecimento, para oavanço na área. Os menos radicaisperceberam, há muito tempo, que oacoplamento entre elas pode trazerbenefício para ambas as áreas,especialmente com as novas exigênciasde melhora na sensibilidade dosmétodos, aumento na complexidade das amostras, exigência de maiores critérios para identificação de compostos deinteresse na área ambiental, saúde,forense, alimentos e outras. Asimplificação dos computadores para o

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Figura 39. Esquema de um detector do tipo corrente-imagem para FTICR MS.

nível pessoal (PC) com custos razoáveis edesempenho muito superior, fez com que na décadade 1980 o acoplamento GC/MS já fosse uma técnicaanalítica madura. Devido às diferenças existentesentre as propriedades de gases e líquidos, acromatografia líquida acoplada a espectrometria demassas (LC/MS) não conseguiu o mesmo êxito.Varias interfaces foram desenvolvidas na tentativa deacomodar o eluente da coluna de HPLC em elevadapressão e volumes: introdução direta de líquidos(DLI); correia giratória (“moving belt”) spraytérmico (“Thermospray”); feixe de partículas(“Particle Beam”) e outros. Entretanto, oacoplamento somente começou a se tornar popularapós o desenvolvimento das técnicas de ionização apressão atmosférica (API), notadamente o“Elesctrospray”, ocorrido no final da década de 1980e início da década seguinte. Nos últimos anos, umagrande melhora tem sido vista no desempenho doscromatógrafos, espectrômetros de massas e noacoplamento entre eles. Ainda assim, o acoplamentoentre cromatografia líquida e espectrometria demassas não atingiu, até o momento, a mesmapopularidade do acoplamento GC/MS, por diversasrazões. Uma delas certamente é a demora naminiaturização da LC quando comparada com a GC, e as perdas dela decorrentes. Outro fato é que enquantoem GC/MS podemos contar com a ionização viaimpacto com elétrons (EI) para estudos estruturais,esta técnica não teve êxito em LC/MS, especialmentedevido à ionização da fase móvel de massa molecularpróxima a compostos de comum interesse na técnica(em GC emprega-se usualmente H2 ou He como fasemóvel, o que não interfere na formação de íons deinteresse na técnica). Em LC/MS utiliza-se técnicasde ionização a pressão ambiente (API), consideradastécnicas brandas de ionização as quais geram poucosíons para ajudarem na determinação da estruturaquímica dos analitos investigados. Assim, a técnicaLC/MS tem, até o momento, sido mais empregada emrotina de estudos para confirmação de compostos alvo do que determinação da identidade dos compostosdesconhecidos de interesse. O desenvolvimento eposterior aprimoramento das técnicas denominadas“tandem MS” (MS/MS ou MSn) representam umgrande avanço no acoplamento com cromatografia,gerando sistemas como LC/MS/MS que se tornarambastante populares nos últimos anos. Esteacoplamento será motivo de outro trabalho nestasérie, a ser publicado em outro número do ScientiaChromatographica.

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2009 | v . 1 | n . 2 63


QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI) / PONTO DE VISTA

Impurezas de Degradação

ResumoOs profissionais da química analítica têm colocado como desafio o isolamento dos compostos presentes em

outros compostos. Considerando que os compostos em pesquisa podem ser subprodutos ou, ainda, impurezas quepodem possuir complexidade de cadeia carbônica e grupos funcionais, a exigência para as técnicas identificativas eseparativas é cada vez maior.

Todo produto quando é sintetizado ou extraído possui um equilíbrio reacional que mantém estruturas

estáveis àquela condição de temperatura, pressão, umidade, salinidade, pH, viscosidade, solubilidade, velocidade,

etc. A partir do momento em que este equilíbrio é interrompido, por exemplo, oxidações ou perda de água podem

levar a reações secundárias que modifiquem o meio e, por consequência, novas estruturas podem se tornar

presentes no agora denominado produto final. Resíduos de reagentes da

rota química, resíduos de solventes utilizados na fabricação e produtos

de reações secundárias diversas passam a compor as denominadas

IMPUREZAS do produto ou ativo principal, ou simplesmente

IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO.

AbstractNowadays analytical chemistry scientists must face the challenge of isolating compounds that are present in

minor quantities in other compounds. Considering that the target substances can be reaction byproducts, impurities

or degradation compounds which can present complex carbonic chains and functional groups,

sophisticated identification and separation techniques are required.

Every synthesized or extracted product presents an equilibrium of chemical reactions that keep molecular

structures stable to certain conditions like temperature, pressure, humidity, salinity, pH, viscosity, solubility, speed,

etc. When this equilibrium is disrupted by physical or chemical agents like light, heat, oxidation, dehydration,

secondary reactions may take place and, as a consequence, new

structures can appear in the final product. These structures, along with

reagent residues from the chemical route of production and residues of

solvents, compose the IMPURITIES of the active ingredient

or DEGRADATION IMPURITES.

Palavras-chave

Impurezas, impurezas de degradação,

isolamento de compostos.

Keywords

Impurity, degradation impurity,

composed isolation.

Flávio Leite

Diretor da T& E AnalíticaCampinas (SP)[email protected]

Flávio LeiteEditor



1. Classificação das ImpurezasAs impurezas podem ser classificadas ou

subdivididas, em função de suas origens, como:a) Impurezas provenientes da rota química da

síntese de fabricaçãob) Impurezas residuais de solventes ou os

denominados IOV (impurezas orgânicasvoláteis)

c) Impurezas de Degradação Intrínsecas dareação do produto. Permanecem presentesmesmo depois dos processos depurificação.

d) Impurezas de Degradação por Exposição:

• Algumas dessas impurezas são formadascom o tempo de vida do produto, por meiode oxidação lenta com o ar atmosférico,micro reações de impurezas com o ativoprincipal, micro reações de impurezas comimpurezas, absorção de água originandohidrólises, ambiente de armazenamentointerferente ou fora de compatibilidade(como exemplo: próximo a produtosvoláteis), luminosidade e temperatura dearmazenamento.

• Impurezas geradas em procedimentosde validação da metodologia analíticade teor, visando antecipar a formação de impurezas por meio da exposição doativo ou da mistura contendo o ativo, em condições forçadas, denominadas de“stress” químico ou físico. È importantepara o item seletividade, no qual aimpureza formada não deve interferir na quantificação do ativo principal, ouainda, no item toxicidade.

2. Impurezas de rota químicaAnaliticamente, podem se tornar conhecidas

por meio das informações bibliográficas, oupublicações dos fabricantes, ou ainda, em artigosacadêmicos. Hoje, na competitividade de mercado, há interesse dos fabricantes em mostrar que o produto éisento de determinadas impurezas, principalmentetóxicas, ou que possam afetar a qualidade do produtofinal, quer como excipiente ou como produtoprincipal. Do ponto de vista analítico, se a impureza éconhecida, provavelmente haverá uma metodologiacom técnica que a determina.

3. Impurezas residuais voláteisImpurezas voláteis e semivoláteis, normalmente

são cromatografadas pela técnica Cromatografia emFase Gasosa. Com o acoplamento desta cromatografiaao espectrômetro de massas, há uma enormepossibilidade de identificação, tendo em vista que oespectrômetro de massas, acoplado a cromatografia emfase gasosa, técnica separativa por excelência e oespectrômetro de massas deste acoplamento, possuiestabilidade no feixe de elétrons que promove a quebrada molécula, gerando fragmentação constante paraaquela molécula. Com essa constância na quebra deelétrons e ajuda da informática, consegue-se estabelecerbiblioteca de moléculas padrões, permitindo compararos fragmentos provenientes da composição da amostracom os fragmentos padrões, dando confiabilidades daordem de 99% em identificação. Este acoplamento ainda permite a quantificação dos compostos, contra padrõesreferenciados ou pela integração em área porcentual.

4. Impurezas de degradação intrínsecasAlgumas impurezas de degradação são

conhecidas e descritas em bibliografias. Nafarmacêutica, são chamadas de Substâncias Relatadas,pois são reconhecidamente interferentes da eficácia doproduto quando introduzida no meio biológico. Doponto de vista analítico, é de baixa complexidade, poisse é conhecida, provavelmente haverá situaçãoanalítica para sua identificação e quantificação.

5. Impurezas de degradação porexposição

Os espécies que compõem um produto querseja um ativo de alta pureza (lembrar que não hácomercialmente, substância de pureza 100%) ou umamistura, podem com o tempo se interagirem formando novas substâncias. Se essas novas substâncias nãoforem identificadas após o processamento, sãodenominadas de impurezas de degradação.

Se as impurezas de degradação forem seapresentando (evoluindo) com o tempo de vida doproduto, maior será a complexidade analítica para suadeterminação. Devido a esta complexidade,introduzem-se os denominados estudos de Estabilidade.Nesses estudos, acompanha-se a evolução do produtopor estimativa de tempo que concluirá como o Tempoou Prazo de Validade deste produto. Na farmacêutica e

em alimentos, esse estudo pode levar de semanas aalguns anos, é a chamada estabilidade de longa duração.Esta estabilidade, do ponto de vista comercial, apesar defundamental, resulta lançamento tardio do produto nomercado consumidor, além do patrocinador ter custodurante o período de tempo estabelecido para o estudo.

Para estimar o prazo de validade, utiliza-se daestabilidade condições de energia, acima dasambientais, denominado de Estabilidade Acelerada.Nesta estabilidade, alguns parâmetros de comparação, com a situação ambiente como exemplo, podem serintroduzidos: temperatura, umidade relativa,hidrólise, luminosidade, oxidação (esta oxidaçãopode utilizar da ação do oxigênio ou da oxidaçãoquímica por meio de transferência de elétrons).

A estabilidade, propriamente dita, buscaverificar a redução do ativo de interesse, na condiçãoforçada, e extrapolar esta redução para um prazo devalidade ao produto. Este prazo pode ser avaliado porequações da cinética química ou, se encontradas,publicações oficiais. No Brasil, pode-se citar a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) ouorganismo internacionais, como o ICH (InternationalConference on Harmonisation) e FDA (Food and DrugAdministration). A estabilidade forçada ou acelerada,como colocado anteriormente, também, buscaresultados para o estudo da Seletividade na análise doativo presente numa mistura (produto). Se uma misturapossui todos seus componentes conhecidos, pode-seestabelecer parâmetros de observação do“aparecimento” dessas impurezas, em comparação comum tempo zero (produto antes de receber o aumento deenergias). Estas impurezas podem ser originárias dadegradação de excipientes ou da degradação do próprioativo ou, ainda, da junção de ambas. A complexidadeestá em identificar e quantificar esta nova substância,pois as conhecidas nas matérias-primas já foramrealizadas em ensaios próprios (muitas commonografias existentes em compêndios da área, como oÍndice Merck; Hand-Books; Farmacopeias; artigoscientíficos etc., porém, quando em mistura, constituidesafio aos analistas e aos conhecimentos em químicaqualitativa e quantitativa.

6. Análise das impurezas de degradaçãoConsiderando um determinado método

analítico, por cromatografia em fase líquida comdetecção na luz ultravioleta, os compostos queproduzirão sinal analítico (picos), são os que possuem absorção desta luz; por exemplo, compostos cominsaturações na cadeia carbônica.

6.1. Situação 1: Método não Visualiza

Utilizando-se deste método sobre as amostrascolocadas sob os efeitos de energia (stress), poderãoresultar em impurezas que não sejam absorvidas pelaluz ultravioleta. Desta forma, o sinal analítico não será percebido. A partir deste momento, se inicia acomplexidade analítica, pois não basta trocar osistema de detecção, ou melhor, para cadametodologia ou técnica ou, ainda, detecção de adireção analítica, se não se consegue “enxergar” oproduto gerado pela energia.

6.2. Situação 2: Método Visualiza

Caso utilizando da metodologia, um ou maissinais são observados, como saber a relevância domesmo em quantidade ou toxicidade. Em termos dequantidade, existem os artifícios; no caso da análiseinstrumental, das integrações que resultam em umvalor de área. A porcentagem da área da impureza emrelação as demais áreas não deixa de ser uma medidaquantitativa, porém, não real. Por quê? Porque aabsorção de luz é diferente em intensidade paradiferentes moléculas. Como fazer então? Se houverliteratura e a substância for comercial, problemaresolvido. Caso contrário, isolar e ter quantidadesuficiente para propor uma identificação maisacreditável e utilizar do fator de resposta para melhorquantificação. É um trabalho de pesquisa.

7. Técnicas analíticas Técnicas Separativas: As técnicas analíticas

mais comuns e utilizadas para separar são as técnicascromatográficas em suas várias modalidades, como:CCD: Cromatografia de Camada Delgada, oucromatografia de capa fina ou TLC (Thin LayerChromatography) ou, ainda, cromatografia de placa ,tanto em papel, como em sílica ou outros suportes. CC:Cromatografia de Coluna, cuja eluição do solventesobre a fase estacionária ocorre pela ação da gravidade.HPLC (High performance (pressure) liquidChromatography) ou CLAE: Cromatografia Líquida deAlta Eficiência. CFG: Cromatografia em Fase Gasosa.

As técnicas mencionadas como separativas,hoje instrumentalizadas, têm permitido obter, pormétodos comparativos, a análise qualitativa, emconcepção normal ou com acoplamentos comdetectores específicos. Essas técnicas buscam oconhecimento da distribuição das espécies na amostra com a finalidade de seletividade e isolamento para a

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identificação. Considerando a existência de umasubstância de referência, ou simplesmente a razão deáreas de uma corrida analítica, obter a quantificação.

Outras técnicas podem vir a compor a pesquisa da identificação de uma molécula, após o processo deseparação, técnicas como: UV/VIS: Espectrometriade absorção a luz ultravioleta e Visível. MS:Espectrometria de Massas. IV: EspectrometriaVibracional à luz Infravermelha. RMN: RessonânciaMagnética Nuclear de Próton ou Carbono (maiscomuns), entre outras.

8. Isolando uma impureza ou um ativo

Um exemplo que pode ser complexo e emproduto natural: consideremos uma planta comrelatos de que o “chá” de suas folhas é benéfico paraalgum sintoma do ser humano. A pesquisa para buscar espécies químicas presentes de origem orgânica e,posteriormente, correlacioná-las com o sintoma,normalmente, consiste, inicialmente, noconhecimento da planta, “habitat” e logicamentepossuir uma amostra das referidas folhas. Uma dasformas de trabalhá-las é secá-las ao sol de formaprotegida para evitar interferências. A seguir, sãoobtidos extratos a partir de água e solventesorgânicos. Desta forma, as espécies são transferidaspara os solventes de acordo com suas polaridades e

constantes dielétricas dos solventes, como pode serobservado no fluxograma abaixo, que exemplificaalguns solventes. O Etanol é o solvente de maiorutilização no processo de extração, porém, outrossolventes, como metanol, isopropanol, ciclohexano,diclorometano, acetato de etila, éter etílico, toluenoetc. também podem ser utilizados. A mistura desolventes com polaridades e constantes dielétricasdistintas produz ações extrativas com forçasintermediárias, podendo promover melhoria naextração de algumas espécies químicas.

Os extratos são submetidos à caracterização de duas formas: Induzida, quando a busca estádirecionada para espécies químicas já conhecidas,cujos padrões (substância de referência) sãodisponíveis para a pesquisa. Esse tipo de pesquisa, decerta forma, é mais rápida, pois há direções analíticasjá previstas em referências bibliográficas ou no grupoda pesquisa. A Não Induzida, ou quando há poucainformação disponível, inicia-se por pesquisabibliográfica avançada, baseada nos relatos da açãosobre o organismo. Como exemplos, para efeitocalmante, buscam-se substâncias com açãoneurológica; para efeito de redução da pressãoarterial, buscam-se substâncias com ação no sistemacirculatório etc. Antes do início do estudo analítico,alguns pesquisadores procuram maior embasamentocientífico, trabalhando com a experimentação “invivo” do denominado “chá”.

Parte da Planta Seca e Macerada Filtração, decantação, centrifugação

Água

Hexano

Acetona / CHCl3

Evaporação

Análise oudesenvolvimento

analítico

Evaporação

Evaporação

Evaporação

Evaporação

Evaporação

Pouco solúvel

Fase aquosa

Fase orgânica

Fase orgânica

Fase aquosa

Fase aquosa

Fase não aquosa

Pouco solúvel

Pouco solúvel

Separação

Separação

Separação

Solúvel

Solúvel

Solúvel

Figura 1. Exemplo ilustrativo de um processo de extração em fitoquímica.

Obtido o extrato, podem ser propostas asseguintes etapas, as quais, contudo, devem serconsideradas como gerais ou básicas:

1 Obtenção do Espectro de Absorção à luznas regiões do ultravioleta e da luz visível(UV/Vis). Desta forma, pode-se verificarpresença de espécies químicas insaturadas(presença de dupla ligação) e espéciesquímicas coloridas (apresentam gruposcromógenos fortes).

2 Obtenção de Espectro Vibracional à luzInfravermelho (IV). Desta forma, podem-seobservar os grupos funcionais mais evidentesdas espécies químicas (o grupo funcionalclassifica a molécula. Por exemplo: Álcooispossuem o grupo funcional OH-; Aromáticos,o anel benzênico) presentes no extrato.

3 Baseando-se nos solventes de extração,inicia-se o estudo separativo por CCD ouCC, podendo-se prever a quantidade deespécies ou grupos de espécies presentesnaquele extrato. Neste momento, pode-seisolar o grupo e iniciar pesquisa decaracterização avançada, dando início àchamada análise preparativa.

4 A CFG, normalmente acoplada ao MS, podeser aplicada, analisando-se o composto talqual (apenas filtrado) diretamente ou osvapores do seu espaço aéreo (técnica de“Head Space”). O acoplamento CFG/MSpor impacto de elétrons permite comparaçãocom bibliotecas de espectros, as quaisapresentam, atualmente, cerca de 400000espectros de substâncias catalogadas. Ascomparações são acompanhadas deprobabilidade de acerto, na qual umacomparação com 95% de probabilidade é uma assertividade expressiva para a pesquisa.

5 A maioria das espécies químicas presentesnas plantas, excetuando-se a água e espécies minerais, são poucos voláteis, necessitandoa intervenção da HPLC. Neste caso,inicia-se a opção pelo modo de eluição, ouseja, em fase reversa (fase estacionária debaixa polaridade e fase móvel polar) ou fasenormal (fase estacionária polar e fase móvelapolar ou de baixa polaridade), além dosistema de detecção. Baseando-se na CCD,pode-se optar pelo sistema de detecção porabsorção à luz Ultravioleta (UV) ou peloÍndice de Refração Diferencial (IR), comoprincipais. Outros detectores são

disponíveis, como por exemplo o PAD(Photo Diode Array), que permite varredura de comprimentos de onda, facilitando abusca do melhor sinal analítico. Atualmente, pelo acoplamento da HPLCcom a MS, denominado LC/MS ou, ainda,o tanden LC/MSMS, obtém-se espectrosou fragmentogramas que permitem fazerpropostas de caracterização ou compararestes espectros com padrões de referênciadisponíveis.

6 Avançando ainda mais na caracterização,um cromatograma do extrato de umfitoterápico pode conter na condiçãoanalítica da pesquisa de 4 a 130 sinaisanalíticos, entre espécies, isômeros,contaminações etc. Uma forma trabalhosade isolar esses sinais é utilizando-se daanálise preparativa. Se a técnica a serutilizada for a HPLC, denomina-seCromatografia Líquida Preparativa. Nestatécnica, à medida que as espécies sãoseparadas na coluna cromatográfica, oeluído é coletado em um recipiente, comoum tubo de ensaio. Após várias coletas, nomesmo tempo do sinal analítico da espécie,procede-se a evaporação do solvente,obtendo-se o extrato seco ou ainda umextrato concentrado daquela fração. Estafração é encaminhada para técnicas comoIV, MS e RMN. O IV, como jámencionado, permite visualizar os gruposfuncionais presentes; o MS permite umaproposta do peso molecular e os fragmentosgerados a partir da quebra da molécula. ORMN permite maior conhecimento dacadeia carbônica. Desta forma, pode-seaprimorar a proposta de caracterização daespécie química sobre esta amostra.

7 Informações sobre de composição térmicatambém ajudam na busca da estrutura deuma espécie ou até de uma formulação,como exemplo nas AT (análises térmicas)em suas principais variantes ATG ( análisetérmica gravimétrica) que por aquecimento controlado decompõe a espécie química ou a mistura; desta forma, pode-se quantificarperda de água, perda de dióxido de carbono etc. e a ATD (análise térmica diferencial)que permite determinar se houve perda ouganho de energia, ou seja, reaçõesendotérmicas e exotérmicas.

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8 Obtida a proposta mais aceita sobre aidentidade da espécie presente, podem sertomados dois caminhos preferenciais:ensaio de pesquisa clínica em cobaias ouverificação se esta espécie está presente em outras plantas. Caso esta espécie sejamajoritária ou única para esta planta,passa-se a denominá-la de substânciamarcadora ou simplesmente marcador.

9 Esta substância, agora considerada ummarcador, recebe tratamento de purificaçãoe pode ser comercialmente vendida comomarcador. Como exemplo, a quercetina noGinkgo Biloba se constitui em uma dasespécies químicas que comporão osginkgoflavonoides presentes nesta planta.

Atualmente, a análise de um produto fitoterápico em produto acabado pode ser feita com a comparaçãoentre cromatogramas, espectros etc., caso os marcadores sejam inexistentes ou indisponíveis comercialmente.Neste caso, essa análise é denominada de “PerfilCromatográfico”. Porém, quando os marcadores sãodisponíveis, as análises devem ser orientadas pelasmonografias existentes em farmacopeias ou compêndios da área para uma melhor uniformidade de informações.Ainda hoje persiste a dificuldade para a validação dasmetodologias analíticas envolvendo ummonofitoterápico, mesmo com a existência demarcadores. A mistura de dois ou mais fitoterápicos noproduto final, mesmo conhecendo-se os marcadores, éconsiderada uma análise complexa e demorada do ponto de vista de desenvolvimento e validação.

9. Estabilidade do produtoCom as devidas proporções aos produtos

fitoquímicos, ou fitoterápicos (quando utilizado paraação farmacológica), nos produtos sintéticos, comofármacos (remédios), alimentos, enfim, produtos deconsumo, as mesmas direções poderão ser utilizadas.Porém, como criar energia para antecipar o estudo deestabilidade de longa duração. As fontes de alteraçãosobre a química de um produto, mais próximas emconhecimento são:

a) Luz; b) Umidade relativa do ar; c) Temperatura ambiente; d) Ar atmosférico.

Quando se trata de produto de consumo aestabilidade em função do clima é estabelecidomundialmente por Zona 1, 2, 3 e 4.

De acordo com ANVISA-Brasil

Tabela 1. Zonas de Estabilidade de acordo com ANVISA-Brasil

ZonasTemperaturaConsiderada

(°C)

Umidade Média Relativa

(%)

Exemplo dePaíses

Zona 1(temperada)

21 45 Chile; USA

Zona 2(subtropical)

25 60África do

Sul, México

Zona 3(quente e seca)

30 35Austrália,Marrocos

Zona 4 (quente e úmida)

30* a40**

75 Brasil

* estabilidade de longa duração** estabilidade acelerada

De acordo com o draft da WHO (World Health Organization-Organização Mundial da Saúde)

Tabela 2. Zonas de Estabilidade segundo draft WHO (World Health Organization-Organização Mundial da Saúde)1-6

Zona Definição

CritérioMédia anual da

temperaturamedida ao ar

livre/média anualda pressão devapor d’água

Condiçõesdo ensaioem LongaDuração

Exemplode Países

1Clima

Temperado≤ 15 °C /≤ 11 hPa

21 °C /45% RH

Chile; USA

2Clima

Subtropical eMediterrâneo

>15 a 22 °C /> 11 a 18 hPa

25 °C /60% RH

Áfricado Sul,México

3Clima Quente

e Seco> 22 °C /≤ 15 hPa

30 °C /35% RH

Austrália,Marrocos

4AClima quente

e úmido> 22 °C /

> 15 a 27 hPa30 °C /

65% RHArgentina

4BClima quentee muito úmido

> 22 °C /> 27 hPa

30 °C /75% RH

Brasil

Referências:[3] a [8].

9.1. Luz

Se estudarmos sobre da luz, pode-se verificarque trata-se de uma composição de cores que formamo denominado espectro. Em termos de energia, a luzultravioleta produz energia destacada e hojelargamente estudada em seus diferentescomprimentos de onda.

9.2. Umidade relativa do ar

Como efeito, a umidade introduz água namolécula. Essa introdução pode resultar na reação dehidrólise, ou ainda potencializar o caráter ácido ou básico, próprio da molécula em estudo. No caso de fármacos(remédios) é comum submeter o produto formulado ou amatéria-prima, ao contato com ácidos e bases.



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9.3. Temperatura ambiente

Como as fontes anteriores, a temperatura é umagente de ação sobre a velocidade das reações, de acordocom van’t Hoof (Jacobus Henricus van’t Hoff - 30 deagosto de 1852, Roterdã, Países Baixos - 1 de março de1911, Berlim - muito conhecido pelos estudos de cinética eequilíbrio químico - Prêmio Nobel de Química em 1901).

9.4. Ar atmosférico

Considerando que a composição básica do aratmosférico é em média 20% de oxigênio e que atua noprocesso oxidativo das substâncias, quer de forma lenta(amarelidão de uma folha de papel), forma rápida(combustão) e extremamente rápida (explosão), deve ser levada em consideração no processo de estabilidade.

A operação de estabilidade não será discutidaneste livro, pois várias são as situações para taldecisão. Para não se alongar, a ANVISA, MAPA,ICH, FDA possuem normas definidas para estudo deestabilidade, que incluem produtos fotodegradáveis,termolábeis etc., assim como, a ação de fazer asrespectivas estabilidades.

10. Operacionalizando o estudo de impurezas de degradação

Sabe-se que submetendo-se uma substância ou uma mistura de substâncias a situações de energiadiferentes do ambiente, pode resultar em degração dacomposição. Muito se discute qual seria a condiçãomais representativa, pois poucas instituições arriscamuma definição, ao passo que os resultados a seremobtidos, podem ter ou não pertinência. É comumencontrar em literaturas: “Obter as impurezas dedegradação por: temperatura, umidade, luz,oxidação, hidrólise ácida e básica.”

Sempre será difícil é definir qual temperaturae umidade, qual quantidade de luz e para a oxidação e hidrólise ácida e base, qual o reagente e quais asconcentrações.

Considerando as intempéries médias no Brasil eescolhendo parâmetros de aumento de energia para aevolução reacional, para a TEMPERATURA, talvez, amaior temperatura encontrada seja próxima a 50oC,então, pode-se estabelecer 50 ou 60oC. Para a média deUMIDADE RELATIVA, 60 a 80% são boas estimativas.

Para LUZ, consideremos a Luz Ultravioleta. Aradiação UV faz parte da luz solar que atinge a Terra. A radiação UV que atinge a Terra se divide em radiaçãoUVA e UVB (os raios UVC não atingem a Terra). AsRadiação UVA e UVB são radiações que o olhohumano não consegue enxergar. A diferença entre eles

está no comprimento de onda. A radiação UVAapresenta comprimento de onda de 315-400nm. Já osraios UVB têm comprimento de onda de 280-315nm(nanômetros). Os raios UVC são menores que 280nm(usados em microbiologia ou salas de esterilização).

Como curiosidade, os raios UVA atingem ascamadas mais profundas da pele. Por isso são osprincipais responsáveis pelo desenvolvimento docâncer de pele, envelhecimento precoce, bronzeamento (escurecimento) e catarata (doença nos olhos que podecausar cegueira). A radiação UVB atinge as camadasmais superficiais da pele. Quando há uma exposiçãosem os devidos cuidados, esta radiação leva avermelhidão (eritema) e queimaduras solares. Avermelhidão geralmente tem início 2 a 7 horas após ocontato com o Sol de forma prolongada e contínua.

Cerca de 95% dos raios ultravioleta que atingema Terra são do tipo UVA e apenas 5% são UVB. Issoporque a camada de ozônio absorve muito melhor osraios UVB. A luz UVB, por ser mais segura e dominada, é opção desejável para o estudo de degradação.

Tabela 3. Percentagens indicadas para cada tipo delâmpada, correspondente à parcela de irradiância sobre ototal da Região Ultravioleta de 260 a 400nm (conformenormas ASTM e projeto de norma ABNT)

Faixa, nmLâmpada

UVB (313nm)

Referência

Luz Solar*

260 – 270 <0,1% 0

271 – 280 0,1-0,7% 0

281 – 290 3,2-4,4% 0

291 – 300 10,7%-13,7% 0

301 – 320 38,0-44,6% 5,6%

321 – 340 25,5-30,9% 18,5%

341 – 360 7,7-10,7% 21,7%

361 – 380 2,5-5,5% 26,6%

381 – 400 0,0-1,5% 27,6%

Fonte: [9].Notas: A. As faixas e valores indicados foram obtidos em mediçõesfeitas (internacionalmente), sobre a distribuição espectral paralâmpadas de diferentes idades e operando em diferentes níveis deirradiância controlada. As faixas indicadas são baseadas no limite de 3desvios-padrão da média destes valores. Lâmpadas que atendem estasdistribuições disponíveis no mercado, podem ter níveis de irradiânciadiferentes, mas mantém esta mesma distribuição espectral relativa.B. Os valores de referência de luz solar são mostrados apenas a títuloindicativo, e foram obtidos no CIE (Comitê Brasileiro de Iluminação, órgãodo Inmetro http://www.inmetro.gov.br/metCientifica/cie/Publicacoes_biblioteca.pdf), publicação CIE No 85 da tabela 4 Solar Spectral Irradiance.

A indústria Philips é uma das fabricantes delâmpadas de luz UVB para usos específicos. Duaslâmpadas são propostas pela empresa a de bandaestreita (TL-01) e banda larga (TL-12).

Banda Estreita: é utilizada para ensaios comnecessidade definida do específico comprimento deluz UVB. Em termos de Brasil, não é fácil de seencontrar comercialmente, havendo necessidade de

importação. É encontrada na potência de 20 e 40W (aemissão aumenta com a potência)

Banda Larga: é utilizada para ensaios quesimulam o espectro da luz UVB. Em termos de Brasil,é mais fácil de se encontrar comercialmente. Éencontrada na potência de 20 e 40W ( a emissãoaumenta com a potência)

Quanto a HIDRÓLISE, há vários aspectos, alémda hidrólise simples em água, deve-se levar emconsideração o caráter do meio, portanto, pH(s) ácido ebásico são desejáveis. Deve-se evitar o uso de oxiácidos, como o ácido sulfúrico, este, sobretudo pelo fato de serdesidrante. O Ácido Clorídrico, por estar presente nosorganismos vivos e por ser ácido forte, fica comoindicado e o NaOH como base forte com grau dedissociação próxima a 100%. As concentrações iniciaisdevem ser soluções diluídas, portanto, menores que 1molar, preferencialmente dez vezes menor (0,1molar).

A OXIDAÇÃO pode ocorrer por ação dooxigênio, ou pelo processo de oxirredução. Considerando a oxidação por oxigênio, o reagente mais “fácil” do pontode vista experimental é o peróxido de hidrogênio (águaoxigenada). Considerando o produto na máximaconcentração, a densidade relativa descrita emcompêndios é de 1,463 g/cm3. Considerando o cálculoem massa, e a dificuldade da pesagem de alíquota, 2 mLdeste peróxido de hidrogênio, diluídos a 100 gramas emágua, resulta numa solução próxima a 3% (m/m) doperóxido de hidrogênio. No caso da oxirredução,transferência de elétrons, torna-se preferencial paraespécies metálicas, por exemplo, verificar ocomportamento do Ferro II na presença do Cobre II.

De forma geral, as condições de um “stress”ficam estabelecidas para a menor condição. Umaumento dos valores dessa condição é de extremaresponsabilidade, para com o resultado. O temporeacional também é difícil prever, pois espéciesdiferentes reagem diferentemente com o tempo decontato. Tempo maior que 24 horas são desejáveis,principalmente por serem reações em meio diluídos.Como as reações são para o produto, normalmente estãona solução de análise; desta forma, podem-se estimarproporções entre a solução do produto e o “stressante”,em 1:1 até 10:1 entre a solução de análise do produtodefinida no método e as soluções “stressantes”.

Para os parâmetros: Luz, Temperatura eUmidade algumas considerações são colocadas paraavaliações quanto ao aumento de energia sobre oproduto em estabilidade na busca de formação deimpurezas de degradação:

Luz: para ensaios científicos, não é possívelutilizar da luz de uma lâmpada fluorescente comumpois luz ultravioleta, produzida por excitação de vaporde mercúrio em argônio, é convertida em luz brancapor meio da cobertura de fósforo na superfície internado tubo. A quantidade de luz UVB liberada para oambiente, nesta lâmpada fluorescente de ambiente, épraticamente nula, visto que a lâmpada é feita em vidro, o qual impede a passagem da luz UVB (lembrar quenos espectros de absorção por ultravioleta, utiliza-se de cubeta de quartzo e não de vidro) e, ainda, em muitoscasos, o vidro é recoberto por uma camada de plásticoque também impede a passagem dessa luz. Daí o fatode se utilizar da luz fluorescente UVB específicas,como colocado neste capítulo.

Temperatura: 50 ou 60 oC são suficientes, anão ser em casos de produtos com vida declarada paratemperaturas superiores ou inferiores (caso dearmazenagem em geladeira devido a termolabilidade).

Umidade Relativa: A umidade relativamédia, principalmente em países tropicais, é da ordem de 65%, se considerarmos umidade forçada ou fora da média, 75% é uma quantidade suficiente. Existemliteraturas com umidade forçada a 90% (condição dechuva ou muito próxima de chuva).

Quadro 1. Resumo para condição de “STRESS”.

Oxidação ao peróxido de hidrogênio

Solução a 3% (m/m)

Hidrólise ácida ao HCl Solução 0,1M

Hidrólise básica ao NaOH Solução 0,1M

LuzUltravioleta B–fluorescente Banda Larga-20W

Umidade Relativa 75%

Temperatura 60°C

Oxidorredução Soluções de Cu(II) 0,1M ou menor.

Banda larga

250 275 300 325 350 375 400nm

Figura 3. Banda larga.

Banda estreita

Ou

tpu

t (a

.u)

250 275 300 325 350 375 400nm

Figura 2. Banda estreita.



11. Forçando o “stress”Pode-se aumentar ou diminuir a concentração das

soluções, luz/umidade/temperatura e tempos deexposição. É importante entender a necessidade de“stressar” o produto, o que se espera e qual a correlação aser feita, portanto, tempos de exposição, concentrações,intensidades devem ser avaliadas química e físicamentepelo analista em função do objetivo do estudo.

12. Situações que podem ser previstasTodo sistema reacional é passível, de micro

reações ou de reações que alterem substancialmente omeio. Desta forma, a condição analítica podetornar-se inviável e a busca por uma nova condiçãoanalítica leva ao ciclo: nova condição nova validaçãonova técnica. Alguns exemplos são colocados:

1 Nas reações com soluções, pode resultarem precipitações de novas espécies;

2 Podem ocorrer polimerizações;3 Pode alterar a estrutura das espécies e elas

não “aparecerem” na condição analítica;4 Pode ocorrer alteração de cor, que

dificultará a análise na condição analítica;5 Adição de NaOH sobre uma solução

alcoólica contendo, principalmente, ometanol; forma-se, no meio reacional, ometóxido, base mais forte eu a inorgânica;

6 Considerando que o método prevejaextração com solvente para, posteriormente, reconstituição, é também de se supor que aimpureza possa não ser extratível nosolvente do método analítico utilizado;

7 Interações com a embalagem;8 Reações conhecidas da química, como

oxidação de aldeídos a alcoóis, hidrólise de ésteres, enfim, o os conhecimentos daQuímica são sempre bem-vindos, comoreações de adição, eliminação, substituição,hidratação, oxidação etc.

13. Quantificando impurezas não conhecidas

O ideal na análise quantitativa é ter padrãoconfiável da espécie em análise. Num estudo deimpurezas de degradação, normalmente não seconhece a impureza gerada. Esta impureza pode seroriginária, por exemplo, da degradação do ativo, dosexcipientes, da reação entre ativo e excipientes, dentre a mistura e solventes específicos.

Isolar a impureza é possível (complexo).Lembrando que a quantidade de impurezas que foremdetectadas, normalmente é sempre pequena, o que exigetrabalho analítico intenso para se obter massa suficientepara uma identificação precisa. De posse dessa massa,deve-se garantir o grau de pureza da mesma. Atribuir um nome a essa impureza, por resultados analíticos, nemsempre são comparáveis com nomes de impurezascomerciais. Todo esse trabalho é altamente custoso e otempo de estudo pode se elevar por longos períodos, desemana a anos. Tal fato para uma única impureza e oensaio pode resultar em mais que uma impureza.

Ensaiar isoladamente os constituintes daamostra até a solução de análise, também é possível,apesar de trabalhoso, porém, pode-se identificarmelhor a fonte geradora de impureza, caso a origemseja uma das substâncias que compõem o produto enão de sua reação com o meio.

A quantificação por fator de resposta é uma boaopção para se ter uma valor orientativo de grandeza.Pois a partir do momento que se observa a presença deuma impureza, a próxima pergunta é: “quanto tem”?Pode-se usar o fator de resposta do ativo principal, quenormalmente possui padrão de referência à disposição.Qual o erro nesta determinação? A impureza pode nãoter o mesmo fator de resposta do ativo principal, destaforma, um sinal de pequena intensidade da impurezaanalisada com seu respectivo padrão poderia resultar em concentração mais elevada que quantificada com o fatorde resposta o ativo principal, o contrário também éverdadeiro, ou seja, um sinal elevado de intensidade daimpureza, se quantificada com seu respectivo padrão,poderia resultar numa concentração de menorconcentração que a quantificada com o fator de respostado ativo principal. Apesar do erro analítico, esta técnica(alguns denominam de semiquantitativa) é uma boareferência quantitativa para este tipo de ensaio.

14. Impurezas de degradação para metais, semimetais e ametais

Só se aplica em casos nos quais a alteração donúmero de oxidação é de fundamental importância naaplicação. Como exemplo, o antimônio utilizado notratamento da “úlcera de Bauru”, no qual a mudançado número de oxidação do antimônio, resultado emdor elevada quando ministrado na forma injetávelmuscular. Como segundo exemplo está a aplicaçãosobre complexos metálicos, verificando o quanto émantido na forma de quelato e na forma do metal emestado não quelato.

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15. Análise de impurezas de degradação por outras técnicas

As técnicas cromatográficas, em seusdetectores e acoplamentos, são as melhores para oestudo de impurezas de degradação, porém, nem todasas técnicas permitem análise de impurezas dedegradação (como muitas descritas em compêndiosoficiais para a análise do ativo, quer em matéria-primacomo na mistura que resulta o produto acabado), comoexemplo: volumetria, colorimetria, potenciometria,absorção a luz ultravioleta e visível, infravermelho etc.Técnicas que normalmente determinam a quantidadedo produto presente no produto em análise. Há casos,porém, que o conhecimento químico sobredeterminado produto induz a busca de novoscompostos, como exemplo, a glicerina, que apesar deanálise por via volumétrica, ou ainda cromatográfica, aformação de peróxidos é fundamental no estudo de suadegradação. Outros exemplos, como o cumeno, quepode ser analisado via CFG a sua oxidação podemresultar em hidroperóxido de cumila.

Vários compostos possuem sua quantificaçãopor métodos microbiológicos, principalmente na áreade fármacos. Para estes compostos, como neomicina,bacitracina, estudos bibliográficos e desenvolvimento por técnicas mais apuradas, como acoplamentosLC/MS podem oferecer resultados passíveis deavaliação.

16. Toxicidade ou GenotoxiUm dos objetivos da busca pelas impurezas de

degradação é conhecer a toxicidade ou possívelmutagenicidade da impureza; o que é pertinente, vistoque impurezas, mesmo em baixa concentração,podem resultar tóxicas para quem consome o produto.

Neste caso, o ensaio de toxicidade só épossível com o isolamento da(s) espécie(s), o que já écomplexo e penoso em se obter massa suficiente paraa identificação/quantificação e massa suficiente paraos ensaios da própria toxicidade. Desta forma, oensaio completo de impurezas de degradação torna-se possivelmente longo e custoso para empresas quegeram produtos de consumo, no entanto, a matéria éfarta para alimentar as Universidades em suas tesesacadêmicas.

O ensaio de AMES e o DL50 são citados, entreoutros, em literaturas que tratam sobre o tema.

Algumas substâncias já possuem literaturaquanto à degradação e toxicidade destas impurezas,facilitando o trabalho do analista.

17. ConclusãoÉ um estudo que o autor considera importante

para moléculas novas e ou composições inéditas casocontrário, é preferível conhecer melhor os insumos quecomporão o produto final, ter literaturas sobre cada um,conhecer o fornecedor e a rota química, estudar a químicada mistura reacional antecipadamente dentre as possíveisdireções. Desta forma, serão reduzidos os impactos quepoderão advir quando do estudo da determinação deimpurezas de degradação no produto final emestabilidade, quer acelerada ou em longa duração.

É um estudo complexo que, no jargão popular,seria chamado de “coisa de gente grande”, ou seja,exige muito conhecimento científico e recursostécnicos. Portanto; boa sorte.

18. Referências Bibliográficas1. LEITE, Flávio - Validação em Análise Química- 5ª

Edição- Editora Átomo- 2008

2. LEITE, Flávio - Análise de Fitoterápicos (Artigo) -

Revista Racine - 2006

3. ANVISA- RE Nº. 1, DE 29 DE JULHO DE 2005.

Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/e-legis/>.

4. ICH Topic Q 1-F Stability Data Package for Registration

Applications in Climatic Zones III and IV- Junho 2006.

Disponível em: <http://www.emea.europa.eu/

pdfs/human/ich/042102en.pdf>

5. GUIDANCE FOR INDUSTRY ANDAs: Impurities in

Drug Substances U.S. Department of Health and Human

Services Food and Drug Administration Center for Drug

Evaluation and Research (CDER) June 2009 Office of

Generic Drugs R1 Disponível em: <http://www.fda.gov/

downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInfor

mation/Guidances/UCM172002.pdf>.

6. WHO-World Health Day 2010. Disponível em:

<http://www.who.int/world-health-day/en/index.html>

7. ANVISA-REVISTA RACINE- Estabilidade de

Medicamentos no Âmbito da Farmacovigilância -

Janaína de Pina Carvalho, Alzeir Santana Santos,

Argentina Santos de Sa, Christiane dos Santos Teixeira

e Marcia Santos Nogueir. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/farmacovigilancia/trabalho

s/RACINE_ESTABILIDADE.pdf>.

8. WHO- Draft regional guidelines on stability testing of active

substances and pharmaceutical products EM/RC53/12

August 2006. Disonível em: <http://www.who.int/>.

9. Q-LAB- Lâmpadas-Folheto ilustrativo e explicativo.

Disponível em: <http://www.emite.com.br/qp/

LampadasUV.htm#Despectr#Despectr>.



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CROMATOGRAFIA MULTIDIMENSIONAL

ResumoEste trabalho apresenta alguns aspectos importantes no desenvolvimento da técnica de Cromatografia

Líquida Bidimensional. As técnicas cromatográficas multidimensionais surgiram com base na limitação existente

nos métodos monodimensionais em aumentar a capacidade de picos de um cromatograma e, também, como

alternativa para maximizar a separação cromatográfica. A técnica de cromatografia Líquida Bidimensional pode

ser usada off line ou on line e, por razões de desempenho, a última,

também chamada de Abrangente (LC×LC), tem despertado maior

interesse pela sua extrema capacidade de resolver amostras complexas.

Neste trabalho pretende-se apresentar alguns tópicos relacionados a

esta técnica, sem, contudo esgotar o assunto, uma vez que essa é uma

técnica em franco desenvolvimento na atualidade.

AbstractThis work presents some important aspects in the development of the technique of Two-dimensional Liquid

Chromatography. The multidimensional chromatographic techniques appeared starting from the existent limitation in

the one-dimensional methods in increasing the peak capacity of a chromatogram and, also, as alternative to maximize

the chromatographic separation. The technique of two-dimensional liquid chromatography can be used offline or

online and, for performance reasons, the last, also called Comprehensive (LC×LC), has been waking up the interest

due to its high capacity to resolve complex samples. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography

(LC×LC) approaches offer high peak capacity which leads to significantly

improved analytical performance over single-column liquid

chromatography. In this work we intend to present some related topics in

this technique, without, however, to saturate the subject, once this is at the

present time a technique in great development.

Cromatografia LíquidaBidimensional

Rosângela Assis Jacques*, Elina Bastos Caramão*

Universidade Federal do Pampa Universidade Federal do Rio Grande do SulUNIPAMPA Instituto de QuímicaBagé, (RS) 91501-970 – Porto Alegre (RS)Brasil [email protected] [email protected]

Palavras-chave

Cromatografia líquida

multidimensional, LC×LC, LC-LC.

Keywords

Multidimensional Liquid

chromatography, LC×LC, LC-LC.

* As autoras agradecem ao CNPq e a FINEP pelo auxílio na forma de bolsa.

Elina Bastos CaramãoEditora



1. IntroduçãoA cromatografia líquida monodimensional

(1D-LC) é largamente aplicada para amostras reais em muitos campos, entretanto, os métodos de separaçãomonodimensionais, frequentemente, não têm poderde resolução satisfatório para amostras complexas, asquais requerem um grande número de pratos teóricospara sua completa caracterização1,2. Estatisticamente,quando o número de componentes de uma amostraexcede a 37% da capacidade de picos, a resolução fica comprometida2,3. A melhor solução para esteproblema está no uso de sistemas multidimensionais(MD), nos quais as dimensões são baseadas emdiferentes mecanismos de separação4,5. Os métodosmultidimensionais são caracterizados por um grandeaumento no poder de resolução se comparados aosmonodimensionais.

Particularmente no caso da cromatografialíquida, uma grande variedade de mecanismos deseparação pode ser usada com diferentes graus deseletividade, como:3 fase normal (NP), fase reversa(RP), exclusão por tamanho (SEC), troca iônica (IEX) ou afinidade (AC).

Como consequência, a cromatografia líquidabidimensional (2D-LC), quando aplicada a este tipode amostra, gera um aumento na capacidade de picos,na seletividade e na resolução.

Na cromatografia gasosa, embora diversasfases estacionárias estejam comercialmentedisponíveis e com diferentes seletividades, omecanismo de retenção é dependente, sobretudo, dopeso molecular e da temperatura de ebulição dosoluto. Na HPLC, entretanto, há uma grandevariedade de mecanismos de separação com variadasseletividades. Por esta razão, a ortogonalidade em LC × LC (2D-LC on line) é um conceito mais difícil de ser definido e apresenta um maior número depossibilidades teóricas. Deve-se notar também que acombinação de certos modos de LC pode apresentaruma série de dificuldades, tais como imiscibilidadedas fases móveis, precipitação de sais usados comotampão, incompatibilidade da fase móvel da primeiradimensão com a fase estacionária da segundadimensão4,5.

Técnicas de cromatografia líquidamultidimensional offline (2D-LC heart-cut) são, poresta razão, mais usadas no pré-tratamento de matrizescomplexas. Neste caso, as frações são coletadas nasaída da primeira coluna e são reinjetadas em outra

coluna, podendo fazer isso em outro momento; seriaum processo semipreparativo na primeira dimensão.Este método, entretanto, apresenta uma série dedesvantagens, como: grande consumo de tempo,dificuldade de automação e possibilidade decontaminação, além de baixa reprodutibilidade.

Um método cromatográfico é consideradomultidimensional se os mecanismos de separação nasdiferentes dimensões forem diferentes e se os analitos, que são separados em uma dimensão, permanecemseparados nas outras dimensões, ou seja, a segundadimensão não deve afetar a separação obtida naprimeira dimensão6.

Como já citado, a 2D-LD pode ser realizadaoffline ou online. O primeiro tipo (offline) é mais fácilde ser executado, mas é geralmente demorado, poucoreprodutível e suscetível a perdas de amostra econtaminação. Já o procedimento on line é mais difícil de operar e necessita de interfaces específicas, porém,é mais rápido e mais reprodutivo3.

No modo off line, uma parte da amostra éinjetada na segunda coluna, obtendo-se várioscromatogramas correspondentes a cada partereinjetada. Este sistema é também chamado heart-cut, indicando que uma parte importante da amostra éreanalisada5,7, e é representado por um traço de uniãoentre as duas siglas: LC-LC. Quando toda a amostra éreinjetada na segunda dimensão, tem-se a técnicachamada de abrangente (“comprehensive”)8-10 e érepresentado por um símbolo de multiplicação entreas duas siglas: LC×LC. A diferença entre essas duastécnicas está, portanto, na análise de uma amostrainteira no processo abrangente e de partes da amostrano processo heart-cut.

2. Alguns aspectos da LC-LCA cromatografia líquida bidimensional tipo

heart-cut é uma técnica aplicada quando somente uma pequena parte dos componentes (de picos) éselecionada de uma matriz complexa e injetada nasegunda coluna (figura 1). Neste caso a primeiradimensão (primeira coluna) é usada como uma formade clean-up da ou pré-concentração da amostra6. ALC-LC é, talvez, o método cromatográficomultidimensional mais usado. As principaisaplicações da LC-LC são a purificação de analitos,enriquecimento de amostras, e melhoramento daeficiência da separação e da sensibilidade da análise.

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A instrumentação para LC-LC utilizaequipamentos normais de HPLC, com uma bombaextra e uma válvula de seleção (switching) com váriasposições conectando as duas colunas. O efluente daprimeira coluna pode ser direcionado, movimentandoa válvula, para o descarte, para o detector ou para asegunda coluna. Esta válvula pode ser tambémchamada de transfer ou válvula de transferência.

A transferência pode ser realizada de diversasmaneiras, dependendo da aplicação. Pode serrealizado pela mudança na configuração das válvulasde injeção de amostra. Tipicamente, uma amostra éinjetada em uma pequena coluna da primeiradimensão usando um eluente fraco. Os analitos sãoretidos na coluna enquanto os componentes da matrizsão eluídos para o descarte. Os analitos são entãoeluídos para a segunda coluna (segunda dimensão)por uma simples troca de posição da válvula usando omesmo eluente ou outro de maior força. Também épossível transferir mais de uma fração usando o modode stopped-flow.

Os tipos mais comuns de interfaces para osistema LC-LC (heart-cut) usando diferentesconfigurações de válvula de transferência são: atransferência direta (1); transferência direta com troca de eluente (2) e transferência com backflush (3).

As figuras a seguir, obtidas com base nareferência 6 com algumas modificações, representamesquematicamente este processo:

A transferência direta se dá em duas etapas(figura 3). Na primeira etapa (A) a amostra é injetadana coluna 1 e o efluente segue pela coluna até odescarte enquanto o eluente é bombeado para a coluna 2. Na segunda etapa (B), movendo-se a válvula detransferência a fração de interesse é transferida para aColuna 2. O mesmo eluente é usado para ambas,eluição e separação, na coluna 1. Depois datransferência, a válvula é retornada a posição original.

Figura 2. Esquema geral do Equipamento para LC-LC[baseado na ref. 6]

Figura 3. Esquema da LC-LC com transferência direta daprimeira para a segunda coluna – (A) alimentação inicial e(B) transferência para a segunda coluna. [baseado na ref. 6]

Figura 1. Representação esquemática do processo deLC-LC (heart-cut) [baseado na ref. 6]

A transferência direta com troca de eluente(figura 4) também pode ser descrita em duas etapas:(A) a amostra é injetada na coluna 1 pela bomba 1 e oefluente segue pela coluna até o descarte enquanto oeluente é bombeado para a coluna 2 e (B) movendo-se a válvula de transferência, a fração de interesse étransferida para a coluna 2. O eluente da bomba 2 éusado para a coluna 2. Depois da transferência, aválvula é retornada à posição original

As duas etapas para a transferência combackflush estão representadas na figura 5, na primeiraetapa, (A) a amostra é injetada na coluna 1 pela bomba 1 e o efluente segue pela coluna até o descarteenquanto o eluente é bombeado para a coluna 2 pelabomba 2, e (B) movendo-se a válvula detransferência, a fração de interesse é transferida para a Coluna 2. O eluente é enviado na direção oposta daseparação na coluna 1.

Habitualmente, somente um detector é usadoem LC-LC, embora seja possível usar dois. Oprimeiro, para monitorar a separação na primeiracoluna, e o outro, para a segunda coluna. Durante oprocesso de otimização, entretanto, o segundodetector é também conectado à primeira coluna parapermitir a separação e para que a fração sejatransferida. A fração eluída deve ser a mais estreitapossível (pico estreito) para tornar o volumetransferido bastante reduzido.

Um parâmetro importante que afetadiretamente o volume de fração transferida é odiâmetro da primeira coluna. Quanto mais estreita(menor diâmetro) for a coluna da primeira dimensão,menor será o volume a ser transferido para a segundadimensão.

Por exemplo: se o diâmetro da coluna decresce de 4,6 mm para 2,1 mm, o tamanho da fraçãotransferida diminui de 1 mL para 0,2 mL. Entretanto,a capacidade da coluna também decresce com odiâmetro interno. Um bom compromisso entrediâmetro e fração transferida é atingido com colunasde 2-3 mm de d.i. na primeira dimensão. Asdimensões da segunda coluna não são críticas, masesta não deve apresentar diâmetro menor que a colunausada na primeira dimensão.



Figura 5. Esquema da LC-LC com transferência com backflush da primeira para a segunda coluna – (A) alimentação inicial e (B)transferência para a segunda coluna. [baseado na ref. 6]

Figura 4. Esquema da LC-LC com transferência com trocade eluente da primeira para a segunda coluna – (A)alimentação inicial e (B) transferência para a segundacoluna. [baseado na ref. 6]

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3. Alguns aspectos da LC×LCA Cromatografia líquida bidimensional

abrangente (LC×LC) é a técnica na qual toda aamostra é separada nas duas dimensões conforme sepode ver na figura 66.

Uma separação bidimensional só pode serchamada de abrangente se:

• Todas as partes da amostra são submetidasaos dois diferentes processos de separaçãocromatográfica;

• Percentagens iguais de todos oscomponentes da amostra (perto de 100 % ou menos) passam pelas duas colunas e,eventualmente, chegam ao detector;

• A separação (resolução) obtida na primeiradimensão é essencialmente mantida.

A Cromatografia Líquida BidimensionalAbrangente (LC×LC) é usada quando se querinformação analítica de todos os componentes daamostra e não de apenas uma parte desta.

A técnica de LC×LC é geralmentedesenvolvida usando um ou dois sistemas de HPLCequipados com colunas conectadas por um sistema detransferência (chamado de transfer ou modulador)localizado entre os dois sistemas. O modulador cortaas frações do efluente da primeira coluna e localiza-asna segunda coluna, na qual ocorre um processo maisrápido de separação. A fração injetada na segundacoluna deve ser completamente analisada antes deocorrer nova modulação. O tempo de separação nasegunda coluna deve ser igual ou menor que a duração de um período de modulação. É também importanteque sejam realizadas pelo menos três ou quatromodulações (cortes) para cada pico que elui daprimeira dimensão, a fim de evitar perda deinformação na separação no sistema bidimensional.Possibilitando ganho em seletividade, sensibilidade ereprodutibilidade9.

Tipicamente, um sistema LC×LC combinaduas colunas com diferentes mecanismos deseparação a fim de alcançar uma boa separação,confiável identificação e quantificação11,12.

Um típico sistema de LC×LC estáesquematizado na figura 713

Normalmente, são usados dois tipos deconfigurações de válvulas de transferência (oumoduladores): um utiliza três colunas para fazer aseparação simultânea, sendo duas colunas iguais nasegunda dimensão e o outro com apenas duas colunas. As figuras a seguir, obtidas também com base nareferência 6 com algumas modificações, representamesquematicamente este processo.

A figura 8 apresenta um sistema com apenasduas colunas. Neste sistema o efluente passa pelacoluna 1 (A) e segue para um dos loops (1 ou 2).Enquanto a fração é coletada no loop 1, a fração noloop 2 está sendo encaminhada para a separação nacoluna 2. Após esta separação, a válvula é entãomodificada (B) e a fração no loop 1 é transferida para a

Figura 6. Representação esquemática do processo deLC×LC (abrangente) [baseado na ref. 6]

Figura 7. Sistema típico de LC×LC consistindo de duas bombas de HPLC, um injetor, duas colunas interfaciadas por uma válvula de transferência com dois loops deamostragem idênticos e um detector [baseado na ref. 13].



coluna 2 enquanto a próxima fração é coletada no loop2. Este procedimento é repetido durante toda a análise.O tempo de análise na segunda dimensão deve ser omesmo usado para preencher o loop (1 ou 2).

A figura 9 apresenta um sistema LC×LC usandoduas colunas na segunda dimensão. Neste sistema oefluente passa pela primeira coluna e segue para acoluna 2a ou 2b, que são idênticas (A). Enquanto umafração é transferida para a coluna 2a a fração anteriorestá sendo separada na coluna 2b. A válvula é entãomodificada (B) e a próxima fração segue para a coluna2b, enquanto a fração anterior é separada na coluna 2a.Este procedimento é repetido durante toda a análise. Otempo de análise na segunda dimensão deve ser omesmo para as duas colunas e igual ao tempo necessáriopara fazer a modificação da válvula. O volume injetadonas duas colunas deve ser, portanto, igual.

O principal requisito para que um sistemabidimensional seja abrangente é que quaisquer doiscompostos separados na primeira dimensão

mantenham-se separados após passar pela segundadimensão, isto é, o mecanismo de separação nasegunda coluna não deve afetar a separação atingidapela primeira coluna7-10.

Karger et al.14, Giddings9 e Guiochon et al.15

foram os primeiros a atentarem para o fato de que acapacidade de picos em uma separação abrangente(nc,2D) corresponde não à soma das capacidadesindividuais nas duas dimensões, mas ao produtodestas capacidades de picos (1nc and 2nc,respectivamente), de forma semelhante a GC×GC

nc,2D = 1nc × 2nc

A história do desenvolvimento da teoria e daprática da LC×LC foi recentemente revisada por Stolle colaboradores16.

O primeiro sistema de LC×LC foi introduzidopor Erni e Frei17, seguidos por Bushey e Jorgenson18

nos anos 80 e seus trabalhos foram baseados em doismétodos principais: uso de uma válvula de 8- a 10-canais, equipada com dois loops de amostragem, os

Figura 8. Representação geral do sistema LC×LC com apenas duas colunas, uma na primeira dimensão e outra na segundadimensão [baseado na referência 6]

Figura 9. Representação geral do sistema LC×LC com duas colunas na segunda dimensão [baseado na referência 6]

quais permitem a transferência contínua da primeirapara segunda coluna cromatográfica19. A primeiracoluna é geralmente uma microbore e a segunda éuma coluna rápida. Também usaram transferência deuma coluna convencional para duas colunas decromatografia rápida em paralelo, sem a utilização deloop de estocagem intermediário.

Jorgenson e Bushey18 utilizaram LC×LC paraseparação de proteínas, com um tempo de análise total de 6 horas. Desde então, a técnica vem crescendo com aplicações, variando desde meio ambiente atéproteínas16-19

Sistemas bidimensionais abrangentes têm sidoutilizados na análise de Biomoléculas20-24,polímeros25, ácidos orgânicos26,27, essências earomas28,29, antioxidantes30-32, fármacos33,34 etc.

Em sistemas 2-D, diferentes modoscromatográficos são combinados para aumentar onúmero de compostos separados em amostrascomplexas de acordo com a distribuição dasdiferentes propriedades das amostras. Em LC×LC, oefluente da primeira dimensão é transferido onlinepara a segunda dimensão para ter um máximoaumento da capacidade de picos em amostrasmulticomponente35-37.

3.1. Variáveis importantes em um sistema LC×LC

3.1.1. Seletividade, ortogonalidade e capacidade de picos

A seletividade da coluna é o primeiro conceitoa ser considerado quando se propõe uma separaçãobidimensional, uma vez que esta propriedade édiretamente relacionada com a ortogonalidade e coma capacidade de picos. As seletividades das colunasusadas nas duas dimensões devem ser diferentes paraque se tenha um ganho na capacidade de picos. Alémdisso, a composição da fase móvel, o tipo de eluição(isocrática ou por gradiente), o fluxo do eluente e, emalguns casos, a temperatura são alguns parâmetrosque requerem cuidadosa definição durante o processode otimização. Os melhores resultados são obtidosnos sistemas chamados ortogonais, ou seja, semcorrelação entre os tempos de retenção nas duasdimensões.

A capacidade de picos (n2D) do sistemaLC×LC, como já foi discutido anteriormente, édefinida pelo produto da capacidade de picos daprimeira dimensão e da segunda dimensão9,38,14. Paramisturas complexas, caracterizadas pela distribuiçãoaleatória de picos, necessita-se de uma alta

capacidade de picos para resolver todos oscomponentes. Alguns métodos para calcular o valorde n2D foram propostos e revisados recentemente por Dixon e Perrett39. Independente do método usado, éimportante ressaltar que o cálculo de n2D écomplexo, e, na prática, o seu valor teórico é difícil, se não impossível, de ser determinado.

Sistemas bidimensionais com seletividades nãocorrelacionadas raramente são encontrados na práticae, por consequência, para se obter um expressivoaumento na resolução, as condições operacionais emambas as dimensões devem ser cuidadosamenteotimizadas. Os aspectos mais importantes que afetamos resultados de uma separação bidimensionalabrangente incluem3:

• escolha da fase estacionária, da fase móvel e da temperatura e seus efeitos sobre aseletividade na separação;

• definição dos gradientes de temperatura oude solvente na primeira e na segundadimensão visando o aumento na capacidade de picos;

• compatibilidade entre as fases móveis daprimeira e da segunda dimensão e o seuefeito sobre a fração transferida entre asduas dimensões;

• definição das dimensões da coluna e dofluxo na primeira e na segunda dimensão,do volume das frações transferidas e dafrequência dos ciclos de transferência deamostra;

• definição da modulação de transferência daamostra com o objetivo de reduzir oalargamento do pico e aumento dafocalização do mesmo.

3.1.2. Resolução e velocidade de amostragem

O aumento no poder de resolução da LC×LC éexpresso também pela equação da resolução.Giddings38 mostrou que em um sistemamultidimensional, no qual RsD1 e RsD2 são asresoluções entre um par de picos em cada dimensão, aresolução global Rs pode ser dada por:

Rs ≅ (RsD1 + RsD2)1/2

Uma condição fundamental para um sistema2D abrangente é manter a resolução na primeiradimensão, o que pode ser atingido produzindo umnúmero suficiente de amostragens (modulações) porpico (3 ou 4, segundo Murphy et al.)40.

Isto é particularmente importante se acontribuição da primeira dimensão para a separação

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multidimensional como um todo for alta. Na prática,separações 2D devem ser bastante rápidas paraassegurar um número adequado de amostragens(ciclos de modulação). O tempo de amostragem deveser 1,5 vezes menor que o desvio padrão do tempo deretenção na primeira dimensão41.

Depois de determinar o tempo de análise na

segunda dimensão (≅ igual ao tempo de amostragem),o fluxo da fase móvel na primeira dimensão pode serotimizado para permitir 3 ou 4 amostragens por pico.Isso é idealmente atingido usando um programa degradiente de eluição que mantém as larguras de picoconstantes durante toda a análise.

3.2. Desenvolvimento do método para LC×LC

A resolução, assim como o tempo de análise na segunda dimensão, é limitada pelo volume dos loopsde amostragem na válvula da interface3. O pequenovolume do loop é necessário para que chegue umabanda estreita na cabeça da segunda coluna. Alémdisso, se a fase móvel usada na primeira dimensão émenos forte que a fase móvel da segunda dimensão,ocorre a reconcentração da fração da primeira colunaem uma zona estreita na cabeça da segunda coluna(focalização na coluna - on-column focusing)42.

Com este objetivo, é conveniente o uso de uma coluna de HPLC microbore na primeira dimensão,operando com um baixo fluxo, e uma coluna detamanho convencional na segunda dimensão,operando com um alto fluxo.

Neste caso, o pequeno diâmetro da coluna em1D garante a minimização da diluição e produz umfluxo compatível com o volume injetado na 2D. Aetapa de pré-concentração na cabeça da coluna em 2Dnão é necessária e se evita a incompatibilidade entreos solventes usados nas duas dimensões7,43. Outravantagem está no menor consumo de solvente ao seusar coluna microbore, além de sua alta eficiência naseparação. A principal desvantagem destas colunasestá na sua menor capacidade, embora seja possívelum grande volume de injeção, com uma diminuiçãotolerável na eficiência.

Um efeito maior da fração transferida éencontrado quando se usam colunas em vez de loopsna transferência para a segunda dimensão11,44–47.

Seja qual for a configuração do sistemaLC×LC usado, a separação na segunda dimensão temque ser completada antes que a próxima fração sejatransferida. Análises rápidas na segunda dimensãopodem ser conseguidas usando-se colunasmonolíticas, as quais permitem altos fluxos de fase

móvel sem perda significativa de resolução, comgradiente de fase móvel tanto na primeira como nasegunda dimensão11,43,47,49.

Uma alternativa ao uso de colunas monolíticasé o uso de elevadas temperaturas50,51. O decréscimo naviscosidade do eluente permite um rápido reequilíbrioda coluna em razão do alto fluxo na mesma pressãomáxima. Além disso, altas temperaturas reduzem aperda na eficiência que ocorre em elevados fluxos.

Colunas curtas convencionais têm sidoempregadas, mas o tempo de reequilíbrio da coluna éalto e a reprodutibilidade do gradiente écomprometida. Neste caso a segunda coluna pode sermaior e o número de amostragens para cada pico daprimeira dimensão fica muito baixo11,31,47. Com estaconfiguração, usa-se somente um gradiente desolvente em todo o processo e durante todo o tempode análise47,52.

3.2.1. Tratamento dos dados obtidos em LC×LC

Em LC×LC usa-se, normalmente, um únicodetector instalado depois da segunda coluna. Odetector pode ser acoplado à primeira dimensãodurante o desenvolvimento do método. A maioria dosdetectores de HPLC podem ser usados em LC×LC. Se a separação na segunda dimensão é muito rápida, aaquisição dos dados tem que ser suficientementerápida para garantir picos estreitos. Detectores dearranjo de diodos (UV-DAD) e de massas (MS)podem adicionar uma terceira dimensão à análise,fornecendo informações sobre a estrutura doscompostos3. O sistema LC×LC produz um númeromuito grande de dados, com informações das duasdimensões, e este número é grandemente aumentadoao usar estes dois detectores, de tal forma que osdados precisam ser tratados por softwares específicos, gerando gráficos bi ou mesmo tridimensionais.

As dificuldades aumentam quando se quer auma análise quantitativa. A integração dos picos éfeita pela soma das áreas de cada pico na segundadimensão correspondente a um dado analito, os quaissão integrados usando um algoritmo de integraçãoespecífico.

Até o momento, a área de software dedicadopara LC×LC não está bem desenvolvida3 e um únicosoftware que faça esta integração ainda não estádisponível comercialmente. Um software dedicadodeveria processar os dados adquiridos automaticamentee então transformá-los em um cromatogramabidimensional, permitindo toda a informação necessáriapara executar análise qualitativa e quantitativa39.



4. ConclusõesO processo de LC×LC pode ser realizado pela

simples adição de uma válvula de vários canais entredois sistemas de HPLC convencionais. Muitasconfigurações diferentes têm sido desenvolvidas eaplicadas à análise de amostras complexas reais dediferentes origens, porém, o desenvolvimento demétodo em LC×LC pode ser mais difícil e demoradoque os sistemas 1D-LC ou LC-LC off line (heart-cut).Entretanto, o grande potencial em termos deseparação e identificação justifica o uso da LC×LC.Um número grande de publicações já existentes naliteratura confirma que a tecnologia ainda se encontraem um estágio exploratório, mas evolui para uso emanálises de rotina.

Progressos no desenvolvimento deinstrumentos comercialmente disponíveis, comsoftwares dedicados para a conversão direta de dadoscrus em cromatogramas bi ou tridimensionais, e paraanálise qualitativa e quantitativa irão, sem dúvida,permitir avanços consideráveis na análise de amostras complexas não passíveis de análise por HPLC ou GCmonodimensionais.

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TROUBLESHOOTING (TS)

Uma visão técnica para acompreensão e resolução deproblemas em sistemas decromatografia líquida

Álvaro José dos Santos Neto

Universidade Federal de AlfenasDepartamento de Ciências Exatas37130-000 – Alfenas (MG)Brasilá[email protected]

ResumoComo apresentado na edição de lançamento da Scientia Chromatographica, esse espaço tratará do assunto

Troubleshooting em cromatografia – o entendimento e a resolução dos problemas mais comuns apresentados pelos

sistemas e métodos cromatográficos de análise. Nessa edição, uma introdução à técnica e às estratégias de

troubleshooting em sistemas e métodos cromatográficos será

apresentada. Na segunda parte do artigo haverá a descrição do sistema

de cromatografia líquida de alta eficiência, com uma visão voltada ao

entendimento e prevenção de problemas comumente encontrados.

AbstractAs presented in the release edition of the Scientia Chromatographica, this column will deal with

Troubleshooting in chromatography – addressing the comprehension and resolution of the usual problems depicted

by chromatographic systems and methods of analysis. In this edition, we will present an introduction to the

concepts and strategies of the troubleshooting technique, applied for

chromatographic systems and methods. In the second part, a description

of the high performance liquid chromatographic system will be

presented, focusing on the understanding and prevention of the most

usual problems that a chromatographist is used to deal with.

Palavras-chave

Técnica de troubleshooting;

cromatografia líquida; CLAE;

manutenção em cromatografia.

Keywords

Troubleshooting technique;

liquid chromatography; HPLC;

chromatography maintenance.

Álvaro José dos Santos NetoEditor

Como apresentado na edição de lançamento daScientia Chromatographica, esta coluna tratarádaquilo que em inglês chama-se Troubleshooting, ouseja, de maneira resumida, em português, pode-secompreender esse termo como a identificação eresolução de problemas em um sistema ou processo.Dessa forma, a abordagem de troubleshooting emcromatografia tem o objetivo de observar, isolar ecorrigir problemas, de maneira direta, simples, racional e eficiente. Adiante, estratégias para a sistematizaçãoda identificação e resolução dos problemas serãoapresentadas, servindo de guia para a abordagem dasfalhas que surgirem no decorrer do uso de um sistemacromatográfico ou relacionado. Pretende-se abordar asdiversas formas de cromatografia instrumental, porexemplo, cromatografia líquida, gasosa e com fluidosupercrítico, bem como os assuntos relacionados a ela(preparo de amostras, tratamento dos dados,acoplamento com outras técnicas). A cromatografialíquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE para aqueles que gostam do termo em português) está presente como ferramenta de análise nos mais diversos laboratórios e,dessa forma, será a primeira a receber a nossa atenção.

Para que o usuário da técnica torne-se umprofissional (cromatografista) mais capacitado eprontamente apto para atuar na identificação eresolução de problemas, uma compreensão dofuncionamento de cada parte do sistema decromatografia é imprescindível. Por essa razão, nesseprimeiro artigo, haverá uma discussão relativamentedetalhada dos princípios de funcionamento e operaçãode cada parte de um HPLC, bem como serão indicadosos problemas mais comuns que ocorrem em cada parte. Obviamente, seria praticamente impossível endereçarcada um dos eventuais problemas que podem ocorrerem cada parte de um sistema HPLC, da mesma forma,uma discussão detalhada de cada problemareconhecido resultaria em um livro sobre resolução deproblemas em HPLC. Nessa coluna, tentaremosabordar, ao longo do tempo, os aspectos maisrelevantes que forem considerados pelo editor,contando com a grande colaboração, sugestão e críticados leitores/colegas cromatografistas. Conformenecessário, um pouco da teoria da cromatografia seráapresentada como subsídio para a compreensão eresolução de problemas específicos que estiveremsendo discutidos. Acreditamos que a compreensão dosfundamentos básicos da teoria e técnica da HPLC sãoos requisitos que juntamente com a experiênciaadquirida habilitam um cromatografista para atuar com propriedade, tanto em análises de rotina quanto nasáreas de pesquisa.

Quando há um problema? O que fazer nesse caso?

Antes de adentrar ao assunto da técnica deHPLC, gostaria de destacar os fundamentos da técnicade Troubleshooting. O primeiro passo pararesolvermos um problema é sabermos que estamosdiante de um. Ou seja, precisamos da resposta para apergunta “Quando há um problema?”. Para isso,precisamos reconhecer o funcionamento normal donosso equipamento, de maneira a reconhecer quandoalgo de anormal vem a surgir. É prática recomendadaem qualquer laboratório, mesmo que não exigida pelarotina, manter um caderno com anotações sobre ofuncionamento do equipamento. Da mesma forma, éinteressante ter um conjunto de condições padrão deuso, sob o qual se obtém determinado resultado. Porexemplo, com uma determinada coluna e ao utilizar-secerto método, obtém-se um reconhecidocromatograma para a mistura teste, bem como oregistro de certo intervalo de pressão para a coluna. Ossentidos do cromatografista também são importantesferramentas no reconhecimento de problemas: ruídosou vibrações anormais podem ser indícios de peçasdesgastadas, mal lubrificadas, quebradas, malcolocadas etc.; vazamentos ou bolhas podem servisualmente detectados, bem como as anormalidadesreportadas pelo cromatograma; um eventualaquecimento ou liberação de odor característico podeindicar a ocorrência de queima ou superaquecimentode placas ou componentes eletrônicos.

Ao reconhecer o problema, “O que fazer nessecaso?”, primeiramente, é importante saber se ele podeser resolvido pelo próprio cromatografista ou se haverá a necessidade de assistência técnica especializada. Muitos procedimentos podem ser realizados pelo própriocromatografista e são inclusive listados e descritos nosmanuais de operação e manutenção rotineira dosequipamentos. Por outro lado, outros procedimentosfazem parte apenas dos “manuais de serviço” restritosaos técnicos especializados e treinados paramanutenções mais avançadas. O cromatografista devereconhecer até onde pode atuar e quando chega a hora de pedir socorro a um profissional habilitado para fazer amanutenção daquele equipamento.

As sugestões que serão apresentadas nessacoluna, serão de caráter genérico. Apesar deculturalmente as instruções de uso dificilmente seremlidas, deve ser entendido que as sugestões apresentadas aqui não se prestam a substituir os manuais de uso emanutenção dos equipamentos. Esses manuais contêminformações específicas e detalhadas para oequipamento, de uma determinada marca e modelo, em



particular. Por exemplo, em um procedimento demanutenção, um manual de boa qualidade trazdiagramas com vista explodida e procedimento passo apasso para acessar um determinado problema.

Ao efetuar modificações no hardware doequipamento, tudo deve ser devidamente anotado esistematizado. Por exemplo, ao se suspeitar de maufuncionamento de uma check valve, a flutuação depressão deverá ser registrada, a válvula marcada,trocada e então a pressão aferida e comparada com aanteriormente registrada. Imagine a dor de cabeçacausada por não se marcar uma check valve defeituosa que foi substituída e posteriormente utilizá-la comopeça de reposição ao se fazer a manutençãopreventiva de outro HPLC. O registro dosprocedimentos de manutenção tem uma vantagemadicional, pois servem como referência quando umproblema similar voltar a ocorrer.

Em tempo, é importante destacar que, apesarde algumas pessoas associarem o acrônimo HPLCcom “High Problem Liquid Chromatography”, umsistema bem cuidado, com manutenções preventivasbem executadas e em dia, dificilmente terá problemasde hardware complicados de serem resolvidos.

Os fundamentos da Técnica de Troubleshooting

Dentre os objetivos da técnica detroubleshooting, estão incluídos: a identificação dosproblemas tão logo ocorram; a pronta localização da(s)causa(s); a solução rápida do problema. É importante,ainda, que o procedimento seja documentado para queuma nova ocorrência seja mais facilmente identificadae resolvida. Como comentado anteriormente, aobservação cuidadosa do bom funcionamento doequipamento é um excelente termômetro para saberquando algo de errado surge no sistema ou nosresultados esperados. Essa técnica de isolamento esolução de problemas baseia-se na sistematização, demaneira lógica, da busca pelo problema. As principaisestratégias adotadas seguem a seguir:

1. Uma mudança de cada vez

A abordagem do problema deve ser feita demaneira lógica e sequencial. Cada alteração ousubstituição de componente ou peça deve ser feitaindividualmente para que então outra possibilidadeseja avaliada. Apesar da realização de mudanças etestes individuais soar como uma perda de tempo, essa é a melhor maneira de se isolar o problema,

reconhecendo-o e resolvendo-o. Algumas vezes, umlaboratório não tem tempo para tal procedimento,nesse caso, uma revisão completa da parte sobsuspeição, no sistema, é realizada. Se o problemarealmente estiver localizado naquele módulo ou parte, provavelmente será resolvido, porém à custa de umdispêndio de recursos maior e sem a compreensão doque realmente causou o problema. Se a causa doproblema for sistemática, não se saberá comopreveni-la, correndo-se o risco de haver recorrência,obrigando a uma nova intervenção. Um exemploclássico é a troca da coluna ou pré-coluna quando seapresenta um aumento de pressão no sistema de LC.Nem sempre essa é a estratégia que surte efeito e não é a maneira mais eficiente de iniciar os testes detroubleshooting. O isolamento da linha do solvente,ponto a ponto e sequencial, entre a bomba e odetector, poderia rapidamente resolver o problema.Um filtro entupido após a bomba, ou mesmo umaválvula de injeção parcialmente obstruída poderiamser a causa do problema, evitando a substituiçãodesnecessária de uma coluna ou pré-coluna.

2. Confirme a presença do problema e a sua solução

Ao deparar com um problema, é importanteque este seja confirmado por uma segunda injeção,antes que mudanças no método ou sistema comecem a ser feitas na busca pela sua causa. Às vezes, umartefato cromatográfico causado por uma bolha de aresporádica pode levar à caça pelo problema, quandoele não mais está presente. Da mesma forma, éimportante confirmar se a mudança feita no sistemaou método, ao se abordar um problema, é realmenteefetiva, antes de se partir para um novo teste. Umexemplo que leva muitos cromatografistas em buscade problemas no método, preparo de amostras ousoluções de padrões é o aparecimento de picosinesperados em corridas cromatográficas comgradiente. Algumas vezes, esse(s) pico(s) pode(m) ser decorrentes de contaminante(s) presentes na água ousolventes orgânicos utilizados, e não aparece(m) emseparações isocráticas. No uso de gradiente, umcontaminante pode ser pré-concentrado no início dacorrida cromatográfica, quando a fase móvel não temforça suficiente para eluí-lo, e então, ao se iniciar arampa do gradiente, ele será eluído na forma de umpico cromatográfico inesperado. Para observar-se que o problema não é diretamente relacionado com ométodo aplicado às amostras ou padrões, bastariateste com uma corrida cromatográfica em que não sefaz injeção alguma.

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3. Substitua a parte sob suspeição por outra reconhecidamente boa

Um teste rápido e eficiente de ser feito emlaboratórios com mais de um equipamento (ou compeças de reposição disponíveis) é a substituição departe ou módulo por outro que sabidamente apresentabom funcionamento. A troca de um detector, em casos de problemas com a linha de base, por exemplo, é uma boa forma de indicar se o problema reside naquelaparte do sistema. Para essa estratégia, teria inúmerosexemplos pessoais interessantes, que ao longo dotempo, nessa coluna, serão abordados. Uma extensãodessa estratégia é a devolução da parte substituídaquando essa mudança não resultar na resolução doproblema. Digamos que a parte substituída seja umacheck valve ou lâmpada do detector. A parte usadadeverá ser retornada, para evitar um acúmulo de peças ou partes que ainda não esgotaram a sua vida útil.Exceções para esse caso são as partes que apresentamdano irreparável quando são substituídas (porexemplo, alguns selos) ou partes que já seaproximavam do momento da substituição emprocedimentos de manutenção preventiva.

4. Tenha condições de referência

Como mencionado anteriormente, tenhareferências para saber se o desempenho do LC estáadequado. Por exemplo, uma mistura teste conhecidaé geralmente adequada para avaliar se uma colunaestá funcionando apropriadamente ou se apresentaproblemas em sua eficiência de separação.

5. Mantenha anotações

Conforme recomendado anteriormente, asanotações dos procedimentos de troubleshootingfuncionam como referência para problemas quepossam surgir posteriormente. Recomendamos doistipos de anotação: anotações no formato de umrelatório simplificado de troubleshooting, em que ostestes realizados e suas observações são indicadas, até que o problema seja resolvido (sugere-se o esquema:sintoma, causa e solução, para esse tipo de anotação);anotações temporárias para cada mudança executada.As anotações no formato de relatório servem dereferência para todos os cromatografistas dolaboratório/empresa, agilizando os procedimentosfuturos. O objetivo desse último tipo de anotação émanter controle sobre as mudanças que estão sendofeitas em cada passo do procedimento de verificação

do problema. Por exemplo, as pressões devem seranotadas ao se eliminar cada parte da linhacromatográfica, entre a bomba e o detector, ao sebuscar a causa de um problema de elevação da pressão no sistema cromatográfico.

6. Preveja as falhas e atue antecipadamente na manutenção

Algumas pessoas têm a impressão de que amanutenção preventiva é perda de dinheiro, poisantecipa a troca de peças que poderiam durar umtempo a mais. Esse pensamento é certamente falho em laboratórios de rotina/prestação de serviços, e muitasvezes também em laboratórios de pesquisa.Primeiramente, ao se adotar a técnica detroubleshooting, as falhas no sistema tornam-se muito mais previsíveis. Além disso, a própria rotina demanutenção sugerida pelo fabricante do equipamentoé um indicativo dos pontos que mais merecematenção. O esquema de manutenção para oequipamento pode ser baseado no tempo de uso de um determinado componente, ou em outro indicativoqualquer (por exemplo, relação sinal/ruídoapresentado pelo cromatograma de um padrãoanalítico, redução na energia da lâmpada, elevação dointervalo de flutuação da pressão das bombas etc.). Ao se estabelecer a manutenção preventiva, ela pode seragendada para um período mais adequado dentro deuma faixa de alerta/indicativa de manutenção. Esseúltimo aspecto é o que faz a diferença nos custosfinais desse procedimento. Imagine um projeto emexecução, o qual envolva a análise de centenas oumilhares de amostras. Uma falha no decorrer doprojeto, exigindo a manutenção imediata do sistema,poderia implicar na perda dos resultados até entãoprocessados, causando prejuízo muito maior do queos gastos com a manutenção preventiva que teriaevitado o problema. Em última instância, amanutenção preventiva também evita gastosadicionais desnecessários, decorrentes de falhassecundárias ocasionadas pela falta de manutenção.Por exemplo, pedaços de um rotor (peça do interior de uma válvula injetora) desgastado poderiam serarrastados pela fase móvel e causar o entupimento deuma coluna; ou o vazamento de fase móvel por umselo desgastado poderia comprometer o sistemaeletrônico de um cromatógrafo. Felizmente, existemoutros meios de prevenir esses problemas, mas amelhor maneira de se evitar “dores de cabeça” ainda éa manutenção preventiva.

7. Cuidado com as soluções tampão

De tão importante e recorrente, resolvemos daratenção a um caso concreto nesse último item. O uso desoluções tampão ou contendo eletrólitos (nem sempre asolução preparada é um “tampão” – revejam o conceitode tampão antes de reportarem o uso de um em seusmétodos…) é muito comum, especialmente emcromatografia em fase reversa e de troca iônica. Aremoção da solução tampão do sistema, quando fora deuso, ou na troca por outro método, não deixa de ser umitem preventivo. Algumas dessas soluções podemcausar corrosão, abrasão ou mesmo cristalização(levando ao bloqueio das linhas). Outra preocupação é odesenvolvimento de microrganismos devido a soluçõestampão em condições fisiológicas, acarretandoproblemas secundários. A regra nesse caso é a remoçãoda solução tampão, do sistema e da coluna, quando forade uso. A solução ideal para esse procedimento deveconter uma composição similar àquela da fase móvel,substituindo a solução tampão por água pura. Deve-seevitar a lavagem do sistema e coluna, previamenteusados com soluções salinas, diretamente com 100% desolvente orgânico (principalmente se este foracetonitrila). Um procedimento desse tipo pode levar àprecipitação do sal, causando problemas desde a bombaaté o detector. Um último cuidado ao se deixar o sistemacromatográfico parado é evitar o preenchimento dastubulações com água pura. O emprego de água nastubulações também permite o desenvolvimento demicro-organismos, os quais requererão um extensivoprocedimento de limpeza e substituições de peças, casovenha a acontecer. Uma forma simples e segura deacondicionar o sistema é a utilização de uma misturaaquoso-alcoólica nas tubulações e linhas do sistema;uma solução contendo mais do que 20% de metanol já éadequada para prevenir esse problema.

A lógica da Técnica de Troubleshootingna localização do problema

O uso de procedimentos lógicos na resoluçãode problemas é a chave do troubleshooting. Algumasfalhas, como o vazamento de uma conexão, são fáceisde localizar e corrigir. Por outro lado, distorções nospicos cromatográficos podem ser causadas pordiversas razões, necessitando-se de procedimentosmais cuidadosos para o isolamento do problema. Paraos problemas que não são de óbvia solução, umaabordagem sistemática é importante para que sechegue ao isolamento e correção do real causador dofato por meio de um caminho mais curto do que asimples procura aleatória pela causa do problema.

A. Examine todo o sistema

A primeira etapa ao deparar com um problemaé fazer uma varredura rápida de todo o sistema(hardware e método). Inicie a observação doreservatório da fase móvel, seguindo até o descarte dodetector, verificando se há alguma causa óbvia quepossa ser identificada visualmente ou que possa serinferida devido às características do método. Procurepor vazamentos, bolhas, trocas nas linhas das fasesmóveis, excesso de pressão, falta de controle detemperatura, rack de vials mal posicionado, vials comvolume insuficiente, equívoco na seleção da colunaetc. Com relação ao método observe o uso equivocado de um método errado, ou falhas na digitação daproporção ou vazão da fase móvel, limites ajustadospara as pressões (inferior e superior), erro no ajuste do comprimento de onda do detector ou nas condições de detecção para outros tipos de detectores. Esse deve ser um procedimento rápido, porém muitas falhas dosistema ou do operador são, felizmente, solucionadasdiretamente nessa primeira avaliação.

B. Observe as alterações que foram feitas no sistema ou método

Se a falha ou problema não for localizadoseguindo o item anterior, determine as mudançasrealizadas no sistema ou método e que podem ter dadocausa ao fato. Por exemplo, houve algum procedimentode manutenção, houve a reposição de alguma parte oumódulo do sistema, houve mudança no método,trocou-se a fase móvel, ou injetou-se alguma amostraincomum? Nesse item a sugestão de manter-se o registro das alterações e procedimentos realizados no sistema émuito útil. As mudanças realizadas, sob uma análisecuidadosa, podem indicar a causa do problema surgidono sistema. Mesmo que essas mudanças não indiquem acausa do problema, o seu conhecimento pode ajudar naposterior investigação do caso.

C. Teste as condições de referência

Para problemas que causam mudanças noperfil cromatográfico, a injeção de uma mistura dereferência pode solucionar o problema. Dessa forma,pode-se relacionar o problema com uma característica da amostra ou do sistema. Se o cromatograma dereferência está adequado, o problema estárelacionado, de alguma forma, com os procedimentosdependentes da amostra. Por exemplo, a injeção depadrões diluídos em 100% de solvente orgânico, pode apresentar picos duplos ou com ombros; uma injeção

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de solução-teste previamente conhecida, e nessascondições conhecidas, resultará em umcromatograma adequado, indicando que a causa dospicos anômalos esta relacionada à amostra, e não como sistema cromatográfico/coluna. Porém, se ambos oscromatogramas apresentam-se inadequados, algorelacionado ao sistema cromatográfico está causandoo problema. Nesse caso, focalize a atenção nalocalização, passo a passo, da causa do problema

Essa discussão apresentada acerca da técnicade troubleshooting deve ser usada em conjunto com oentendimento das fontes/causas de problemas quepodem ocorrer em um sistema ou métodocromatográfico. A discussão pontual do entendimento e resolução desses problemas específicos emcromatografia será o tema mais recorrente nessacoluna, todavia entendemos que o seu emprego, sebaseado nas técnicas e estratégias apresentadas acima, tornará o sucesso mais facilmente alcançável. Emadição a essa coluna, muitos manuais deequipamentos apresentam uma descrição dosproblemas mais comuns e suas possíveis causas esoluções. Além disso, alguns catálogos de empresasespecializadas em suprimentos para cromatografiaapresentam listas resumidas de troubleshooting emsuas especialidades. Alguns livros em inglês tambémapresentam uma discussão mais ampla sobre oassunto.1,2 Em síntese, siga os seguintes passos:mantenha anotações sobre os procedimentosrealizados no sistema cromatográfico, amostrasinjetadas no sistema e na coluna cromatográfica;quando estiver em busca da solução de um problemano sistema cromatográfico, faça apenas uma mudança de cada vez; se a mudança não resolver o problema,via de regra, retorne à configuração original; rotule(como peças usadas) ou descarte as peçassubstituídas, e identifique a posição correta quandoforem removidas temporariamente para algum teste;quando o problema for corrigido e a causaidentificada, crie uma pequena nota no caderno detroubleshooting relacionando sintoma, causa esolução; requisite peças em substituição às peças doestoque de manutenção que forem usadas; troqueinformações com seus colegas de laboratório ougrupos de discussão, faça buscas nos registros docaderno de troubleshooting do equipamento econsulte a literatura, geralmente outras pessoas jápassaram pelos problemas que você está encontrandono momento; ao reconhecer um problema, faça umavarredura em busca da causa, mas não se afaste dasregras de troubleshooting; não se esqueça de injetarsoluções ou testes anteriores que permitam comparar

com um cromatograma de referência (idealmenteregistrado nos cadernos de controle referentes aoequipamento ou à coluna); se necessário, comoestratégia para isolamento do problema, substituamódulos ou partes destes, por equivalentesprovenientes de equipamentos que estão em adequado funcionamento.

Como a compreensão dofuncionamento do sistema de HPLCpode ajudar na solução dos problemas?

A solução de problemas envolvendocromatografia é mais bem executada quando secompreende o funcionamento do sistemacromatográfico e os princípios que regem a separação.Como visto anteriormente, o sistema cromatográfico, o cromatograma, ou ambos, indicam quando umproblema surge. Da mesma forma, a solução doproblema é obtida por meio da investigação dosindícios apresentado pelo sistema ou cromatograma.Obviamente, um conhecimento sobre o sistema e sobrea teoria por trás da separação cromatográfica éimprescindível. Do contrário, qualquer mudança feitano sistema, em busca de solução para o problema, nãopassará de mero procedimento, infundado, de“tentativa e erro”, levando à perda de tempo e dinheiro.Nessa parte do artigo, trataremos de fazer umaapresentação sobre cada parte que geralmente estápresente em um sistema de HPLC, apresentandoinformações necessárias para uma boa compreensãodos procedimentos de troubleshooting. Uma visãoainda mais detalhada da instrumentação em HPLCpode ser obtida na referência 1 ou em outros livrosespecializados.

Para aqueles que não estão familiarizados commuitas marcas e modelos de cromatógrafos líquidos,existem basicamente dois tipos de sistemas, quanto ao arranjo. Há sistema modulares, que podem seridentificados pela presença de módulos distintos paraas bombas, desgaseificador, injetor, compartimentopara a coluna, detectores etc.; e há sistemascompactos ou monoblocos. Os primeiros geralmenteapresentam maior versatilidade de configuração epodem sofrer atualizações/incrementos maisfacilmente, dependendo da configuração, ocupam umespaço maior que os equipamentos monoblocos e sãocaracterizados pelo empilhamento dos módulos. Osúltimos costumam ser vendidos para finalidades maisespecíficas e tem atualização (upgrade) relativamente mais difícil, estes encontram boa aplicação emlaboratórios com rotina bem definida. Em ambos os



tipos de equipamento os componentes/partes sãopraticamente os mesmo, mudando apenas o tipo deintegração/agrupamento entre eles.

Um trabalho envolvendo separaçãocromatográfica por HPLC começa antes mesmo dechegar-se à frente do equipamento. A escolha desolventes orgânicos adequados (geralmente descritoscomo grau HPLC), de água ultrapurificada e dereagentes com alto grau de pureza, é imprescindível,especialmente nos casos de análise em gradiente. Nopreparo da fase móvel a filtração de soluções obtidas a partir da solubilização de solutos sólidos (geralmentesoluções tampão) é necessária para evitar quemateriais particulados sejam introduzidos no sistemacromatográfico (membranas de 0,22 ou 0,45 µm,compatíveis com a fase móvel, são adequadas a esseprocedimento). Além disso, caso o cromatógrafo nãopossua sistema de desgaseificação integrado, esseprocedimento deve ser executado antes da fase móvelser introduzida no sistema.

A aspersão de um gás inerte (geralmente hélio)na fase móvel é um dos métodos mais eficientes pararemoção dos gases dissolvidos na solução.1 Algunsequipamentos possuem inclusive um sistema deaspersão de hélio integrado. Mais práticos epopularizados atualmente são os sistemas online a vácuo integrados ao cromatógrafo e que se baseiam emmembranas semipermeáveis ao gás (Fig. 1). Problemasrelacionados a uma insuficiente desgaseificação sãomais comuns do que se pode imaginar. A tolerância aosgases na fase móvel vai depender sobretudo dasensibilidade da bomba e do detector. O aparecimentode bolhas é mais crítico em misturas orgânico-aquosas(geralmente acetonitrila-água ou metanol-água, em fasereversa, por exemplo), pois a solubilidade dos gasesnesse tipo de mistura é menor do que nas soluçõesorgânica e aquosa separadas. Com esse tipo de misturapodem persistir bolhas na fase móvel após a purga pelosdesgaseificadores online. Em razão do tamanho dasbolhas formadas, algumas delas podem não sercompletamente permeadas pelo desgaseificador avácuo. Nesse caso, uma solução simples é a sonicaçãoda fase móvel por 5 a 10 minutos, antes da introdução no sistema cromatográfico. Apesar da sonicação, por si só,não ser um método de desgaseificação tão eficientequanto a aspersão de hélio ou a aplicação de vácuo, elaserve para a rápida remoção do excesso de gásinsolubilizado no momento da mistura entre o solventeaquoso e o orgânico, auxiliando a etapa online posterior.A filtração a vácuo dessa mistura, por membranafiltrante, algumas vezes também resolve o problema doexcesso de bolhas de gás.

As fases móveis são geralmente acondicionas emfrascos de vidro apropriados (Fig. 2) e colocadas emcompartimento adequado, sobre o cromatógrafo. Casonão haja compartimento adequado (geralmente supridocom o cromatógrafo), recomenda-se o emprego de umabacia retangular que se adapte sobre o equipamento. Acolocação de frascos diretamente sobre o equipamentopode levar a acidentes, ocasionando o derramamento delíquido sobre componentes sensíveis do equipamento. Osfrascos devem ser tampados para evitar a entrada dematerial particulado e a contaminação, bem como evitar aevaporação de solventes. Alguns frascos comerciaispossuem tampas com filtros de ar, porém essas tampaspodem ser facilmente adaptadas no laboratório. Atravésda tampa deve existir orifício para a entrada do tubocoletor da fase móvel, e em caso de sistema de aspersãode hélio, também para esse. Na entrada do tubo coletor écomum a utilização de um filtro de 10 µm (geralmente deaço inoxidável 316 ou polietileno de altíssima densidade), enquanto na saída do tubo de aspersão de hélio usa-se um“filtro” de 2 µm para a dispersão do gás (Fig. 3).

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Figura 1. Desgaseificador online a vácuo, o solvente entrano sistema por uma das portas, passa por fina tubulaçãocomposta por membrana semipermeável aos gases e sai dosistema em direção à bomba ou válvula seletora dogradiente de baixa pressão.

Figura 2. Exemplo de frasco para acondicionamento dafase móvel.

Na maior parte das bombas, a troca desolventes pode ser feita por um processo de purga,comandada por meio de software ou no painel daprópria bomba cromatográfica. Esse procedimentofaz com que a fase móvel passe através do tubo deentrada (geralmente um tubo de Teflon® –politetrafluoroetileno – de 1/8”), pelo sistema dedesgaseificação online, se presente, fluindo até abomba cromatográfica e sendo desviado, pela válvulade purga, para o descarte. Esse procedimento tambémpode ser feito manualmente por meio de aspiraçãocom uma seringa comum, adaptada na saída daválvula de purga. Geralmente esse procedimento énecessário e recomendado quando o tubo de entrada ea bomba encontram-se sem fase móvel. A não ser quea bomba seja extremamente robusta, a sucção degrande volume de ar pelo tubo de entrada impede abomba de realizar a purga automática da fase móvel,requerendo a purga manual. Apesar de esse problemaser de fácil observação, já foi testemunhada, inúmeras vezes, essa ocorrência em laboratórios. Geralmente,esse problema ocorre pela falta de constatação, pelooperador, de que o tubo de entrada está seco. Nessecaso, o operador solicita uma purga automática e nãoobserva se a fase móvel está fluindo pelo tubo deentrada até o descarte. Após esse procedimento depurga, o operador tenta estabelecer um fluxo de fasemóvel pela coluna, mas constata que não há elevaçãoda pressão (no caso de utilizar fase móvel compostapor apenas um tipo de solvente) ou que háinstabilidade da pressão, com repetidas quedasbruscas, (geralmente no caso de utilização de fasemóvel binária, ternária ou quaternária). Umprocedimento prático para constatar o bomfuncionamento das bombas é permitir a entrada de um pequenino segmento de ar através do filtro de entradano início da purga e acompanhar o seu caminhar pelotubo até ser eliminado pelo desgaseificador ou serremetido ao descarte pela válvula de purga.

Apesar de existirem outros tipos de bomba, asmais utilizadas atualmente são aquelas baseadas na

combinação de dois pistões reciprocantes (em série(tandem) ou em paralelo). Em ambas as bombas ofuncionamento do pistão é o mesmo. Movido por umsistema mecânico controlado eletronicamente, opistão exerce um movimento cíclico de avanço erecuo promovendo o enchimento e esvaziamento dasua câmara. Para a vedação do espaço existente entrea parede da câmara e o pistão, utiliza-se um selo dematerial elastomérico. Esse selo, para melhorvedação, possui uma mola no seu interior (Fig. 4). Adiferença entre as duas bombas está no tamanho dospistões, no caminho feito pelo solvente e no númerode check valves. Primeiramente, check valves sãoválvulas de retenção, ou seja, válvulas que permitem o fluxo de solventes em apenas um sentido.Basicamente são válvulas, ativas ou passivas, comuma ou mais esferas em seu interior, e que bloqueiama passagem da fase móvel quando esta é pressionadano sentido contrário ao fluxo permitido. Na bombacom dois pistões reciprocantes em paralelo, para cadapistão há duas check valves uma de entrada e outra desaída. Bem como os pistões, as check valvesfuncionam alternadamente. Enquanto um pistãoimpulsiona a fase móvel da sua câmara para o sistemacromatográfico, tendo a check valve de saída aberta ea de entrada fechada; o outro admite a fase móvel,proveniente do reservatório, em sua câmara, tendo aválvula de entrada aberta e a de saída fechada. Aochegar ao fim dos seus cursos, os pistões e as válvulasinvertem os seus papéis, garantindo umimpulsionamento quase contínuo da fase móvel para o sistema. A Figura 5 esquematiza esse tipo de bomba.Nas bombas com pistões em série há apenas um par de check valves localizadas na entrada e saída da câmarado primeiro pistão. Esse primeiro pistão geralmentetem o dobro do volume do segundo. Na primeirametade do ciclo, esse primeiro pistão impulsiona afase móvel do interior da câmara para o sistemacromatográfico, tendo a válvula de saída aberta e a deentrada fechada. Todavia, metade do volume da fasemóvel impulsionada, em vez de ser direcionada aosistema cromatográfico, ocupa-se de preencher oespaço de admissão gerado pelo segundo pistão dasérie. Ao fim da primeira metade do ciclo defuncionamento, a câmara do segundo pistão estácompletamente cheia e a do primeiro, vazia; nessemomento ocorre a inversão dos movimentos e dascheck valves. O primeiro, pistão inicia a admissão denova fase móvel, proveniente do reservatório,enquanto o segundo pistão incumbe-se deimpulsionar a fase móvel contida em sua câmara parao restante do sistema. A Figura 6 ilustra esse tipo debomba.



Figura 3. Exemplos de filtros de admissão de fase móvel.

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Figura 4. Exemplos de selo de vedação (vista ampliada) epistões de safira, usados em bombas de HPLC.

Figura 5. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pistão em paralelo. Figura cedida como cortesia pelo Dr.Lincoln F. M. Coutinho3.

Figura 6. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pistão em série. Figura cedida como cortesia pelo Dr.Lincoln F. M. Coutinho3.

As bombas de pistões seriais são mais baratas erobustas do que aquelas de pistões em paralelo, noentanto, tem inferior qualidade na alimentação dosolvente. Geralmente sob um mesmo regime de vazão, apulsação das bombas com pistões em paralelo é menordo que aquela das bombas seriais. Em vazõesconvencionais, superiores a 1,0 mL/min, geralmente asduas bombas apresentam desempenhos bastantesatisfatórios. Para vazões mais baixas, recomenda-se oemprego de bombas com pistões em paralelo, uma vezque possuem um inferior limite de trabalho, com menornível de pulsação, esse é o caso comum de sistemasHPLC que alimentam espectrômetros de massas cominterfaces do tipo electrospray. A manutenção e osproblemas mais comuns em uma bomba de HPLCenvolvem os selos e as check valves. Ambos têm umavida útil e implicam na estabilidade da pressão exercidapela bomba. Enquanto os selos podem apresentar falhasestruturais e gerar vazamentos, as check valves podemapresentar dificuldade na abertura e fechamento,também perturbando a pressão e vazão da fase móvel.Os maiores cuidados exigidos por essas partes da bomba envolvem a limpeza, quanto a materiais particuladospresentes na fase móvel. A cristalização dos sais de umasolução tampão pode levar ao desgaste (ranhuras) doselo, a travamentos e desgaste da check valve e, emúltima instância, a quebra dos pistões e danos em suacâmara. Algumas bombas apresentam uma segundacâmara, posterior à câmara de admissão da fase móvel, aqual permite a lavagem do corpo do pistão. Ela é deespecial uso quando se faz o emprego contínuo desoluções tampão em altas concentrações. Recomenda-se a utilização de solução aquosa contendo entre 10 e 20 %de metanol para evitar, por um lado, a cristalização dossais no solvente orgânico, e por outro o crescimento demicroorganismos. O principal sintoma indicativo deproblemas com selos é a incapacidade de manter apressão no interior da bomba. Como isso se dá com ovazamento da fase móvel, dependendo do caso pode-seobservar esse vazamento. Os problemas com seloscostumam ser resolvidos com a sua substituição, éimportante escolher o tipo de selo adequado à fasemóvel que se utiliza no sistema. No caso das checkvalves, também há manifestação de instabilidade napressão. Com um exame detalhado é possível identificarqual a válvula problemática e proceder com o seuconserto ou substituição. As check valves em caso demau funcionamento, algumas vezes, podem serrecuperadas por meio da lavagem em banho deultrassom. Geralmente utiliza-se primeiramente água(podendo estar acidificada com ácido nítrico), umasegunda lavagem com água pura, no caso da lavagemcom ácido, e posteriormente um solvente orgânico

(metanol ou acetonitrila). Um cuidado adicional é amontagem correta das check valves, evitando-se a suainversão ou troca entre as portas de entrada e saída.Geralmente, na saída da bomba encontra-se mais umfiltro, convém observar se há obstrução dele,principalmente quando um problema de elevação depressão ocorrer exclusivamente em uma das bombas dosistema. Esse tipo de entupimento costuma decorrer dafalta de manutenção do sistema de vedação da válvulade purga, o material elastomérico de vedação podefragmentar-se e obstruir o primeiro obstáculo à suapassagem, no caso, o filtro de saída da bomba. Outrasmanutenções requeridas pelas bombas são de maislongo prazo e podem envolver a substituição de pistõesou diafragmas, e a limpeza e lubrificação da partemecânica do acionamento dos pistões. A substituição depistões e diafragmas pode constar dos manuais demanutenção do usuário, enquanto geralmente a limpezae lubrificação das partes mecânicas requerem a aberturada bomba e costumam ser feitas por técnicoespecializado ou com maiores conhecimentos.Eventualmente sensores eletrônicos da posição dospistões podem falhar e gerar problemas difíceis de serem detectados sob uma primeira inspeção. Nesse caso, aestratégia de substituição dos componentes funcionamuito bem para o isolamento do problema. Para maiores detalhes sobre o funcionamento e partes dos diferentestipos de bombas, sugerimos uma consulta à referência 3, a qual pode ser obtida pela web.

Ainda sobre o sistema de bombeamento dossolventes, alguns realizam separações baseadas em fasemóvel com composição invariável, ou seja, separaçõeschamadas isocráticas. Enquanto outros utilizam degradientes entre diferentes fases móveis, as quais podem ser binárias, ternárias ou quaternárias. Os sistemasisocráticos dependem de apenas uma bomba e a misturaadequada para a fase móvel pode ser feita diretamenteno recipiente de fase móvel. É evidente que sistemaspara gradiente podem também fazer uma misturaisocrática apropriada. Os sistemas para gradiente podem ser de dois tipos (baixa e alta pressão), e seuentendimento é importante para a compreensão deproblemas que podem ocorrer. Nos sistemas de baixapressão, apenas uma bomba é utilizada, porém esta éprecedida por uma válvula seletora de fase móvel(composta por válvulas solenoides). A composição finalda fase móvel é obtida pela segmentação proporcionaldos diferentes solventes, os quais passam pela bomba etem o término da homogeneização realizada por ummisturador. O gradiente é controlado pelo sistemaeletrônico, o qual calcula os tempos que cada uma dasválvulas solenoides ficam abertas, permitindo que acorreta proporção da mistura seja obtida. Os sistemas



com gradiente de alta pressão possuem uma bomba paracada uma das fases móveis misturadas. A proporçãoentre os solvente é ajustada pela fração da vazão de cadabomba que constitui a vazão total utilizada. As saídas decada uma das bombas confluem para um misturador quehomogeneíza a fase móvel que é destinada para orestante do sistema. Os sistemas com gradientes de baixa pressão são mais baratos, uma vez que utilizam apenasuma bomba e um seletor de solventes, em contraste como gradiente de alta pressão que precisa de uma bombapara cada solvente da mistura. Por outro lado, aplicações que necessitem de vazões mais baixas e que sejam muito sensíveis a inomogeneidades da fase móvel nãoapresentam bons resultados com gradiente de baixapressão. Sob baixas vazões, causa atrasos no gradiente(em razão do volume morto do sistema) podendoinviabilizar a separação e sua repetibilidade, e, alémdisso, a insuficiente homogeneização causa aumento noruído da linha de base do cromatograma. Em sistemas de baixa pressão, uma estimativa do volume morto docromatógrafo deve estar bem clara para evitar problemas de seleção incorreta das condições do gradiente. Muitasvezes, gradientes com colunas de 2,1 mm de diâmetrointerno, sob vazão de aproximadamente 0,2 ml/min,acopladas a espectrômetros de massas com detecção porelectrospray são incompatíveis com sistemas de baixapressão. Um cuidado adicional com o gradiente de baixa pressão é a correta desgaseificação da fase móvel, comoa mistura inicia-se ainda sob baixa pressão, eventuaisbolhas de gás podem ser formadas pela menorsolubilidade dos gases na mistura orgânico-aquosa, emrelação aos solventes não misturados. Uma válvulaseletora de solventes composta por quatro válvulassolenoides é representada na Figura 7.

Após o sistema de pressurização da fasemóvel, encontra-se, nos sistemas capazes de elaborargradientes, um misturador. Esse misturador costumater um volume de mistura regulável que deve serajustado de acordo com as características de uso dosistema. Um exemplo de ajuste inadequado é aseleção do maior volume de mistura para análises sobgradiente em vazões reduzidas. Atrasos superiores adez minutos podem ser constatados dependendo dacombinação inadequada que for realizada,especialmente em sistemas com gradiente de baixapressão.

A fase móvel, após deixar a câmara de mistura, é destinada ao sistema de injeção. Convém ressaltarque toda a linha da fase móvel, após a bomba, deve ser resistente às pressões utilizadas para a obtenção deadequada vazão pela coluna cromatográfica. Alémdisso, os diâmetros internos desses tubos devem seradequados às vazões utilizadas. Tubos com diâmetrointerno muito reduzido levam a um desnecessárioaumento de pressão, além de maiores riscos deentupimento. Por outro lado, um diâmetro internorelativamente exagerado causa atraso do gradiente e,se depois do sistema de injeção, alargamentoindesejado dos picos cromatográficos. Os tubos maisempregados nos sistemas convencionais são de açoinoxidável e têm 1/16” de diâmetro externo. Outromaterial muito utilizado para as tubulações deequipamentos em que se deseja maior inércia química(geralmente para biomoléculas) é o polieteretercetona (PEEK) também de 1/16” de diâmetro externo.Alguns sistemas de nano-HPLC e HPLC capilarapresentam tubulações mais finas com diâmetroexterno de 1/32”, geralmente de PEEK revestidointernamente por sílica fundida e podem apresentardiâmetros internos de poucos micrômetros. Umcuidado adicional refere-se aos conectores usado emHPLC. Nem todas as portas de conexões dasdiferentes marcas de cromatógrafos, válvulas ecolunas apresentam as mesmas características. Aescolha cuidadosa pode evitar desde o emperramentode conectores inadequados, até distorçõescromatográficas como picos duplos, com cauda(tailing) ou com frontes (fronting) em virtude doexcesso de volume morto entre o injetor e a coluna ouentre a coluna e o detector. Muitos conectores atuaispodem e são suficientemente atarraxados com ospróprios dedos. Em caso do emprego de chaves nasconexões, recomenda-se que a força utilizada não seja em demasia, geralmente ¼ de volta após a conexão ser atarraxada manualmente já é suficiente para evitarvazamentos. Um vazamento persistente costuma sercausado por incompatibilidade entre os conectores ou

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Figura 7. Exemplo de válvula para seleção de solventes emgradiente de baixa pressão.

conectores danificados. Um excesso de força podecausar a quebra de um conector e levar a necessidadede assistência técnica do fabricante.

Há diversos sistemas de injeção para HPLC, os mais encontrados atualmente são as válvulas manuais(em sistemas de menor custo) ou os injetoresautomáticos. No injetor manual, uma válvula de 6 vias e 2 posições permite que, com o auxílio de umaseringa, a alça de amostragem (loop) seja preenchida(totalmente ou parcialmente) pela amostra. Após essaetapa de carregamento da amostra (load), a válvula écomutada (girada) de maneira a introduzir a alça deamostragem na linha cromatográfica, posicionando-aentre o sistema de bombeamento e a colunacromatográfica. Os maiores cuidados com relação aoprocedimento de injeção manual concernem a umaadequada limpeza da válvula, entre as injeções, paraevitar que efeitos de memória (carry over) sejamobservados. Como todas peças móveis, oscomponentes da válvula têm uma vida útil e devemsofrer manutenção após um certo número de injeções.Um último cuidado consiste em não esquecersoluções corrosivas ou salinas no interior da válvula,uma vez que essas podem danificá-la seriamente. Ossistemas de injeção automática podem apresentardiferentes arranjos, cada qual com suaspeculiaridades. Dentre os mais usados, algunssimplesmente mecanizam as mesmas funções que ooperador executa na injeção manual, preenchendo aalça por meio do impulsionamento da amostra comuma seringa; outros preenchem a alça por meio dasucção da amostra até a alça; e um terceiro tipo tem aagulha de amostragem integrada à alça deamostragem. As velocidades de injeção e demaiscaracterísticas dependem do tipo de sistema deinjeção empregado pelo amostrador automático.Dentre os três tipos apresentados, o último é o maismoderno e o que geralmente apresenta maioresvelocidades de injeção, bem como redução do efeitode memória. Obviamente, costumam ser os mais caros e com mais componentes para manutenção e fonte deproblemas. Para um troubleshooting mais detalhadorelacionado aos sistemas de injeção, uma melhorcompreensão do funcionamento de cada um se faznecessária. Infelizmente, nesse momento, umdetalhamento maior estenderia em demasia estadiscussão. Material bem detalhado sobre os diversossistemas de injeção pode ser encontrado na web.4

O injetor, como visto anteriormente, é oresponsável pela inserção da amostra no sistemacromatográfico, permitindo que esta chegue até acoluna e tenha, idealmente, todos os seuscomponentes separados. Entretanto, a amostra, na

maioria dos casos, só pode ser injetada depois de tersido adequadamente preparada. O adequadotratamento da amostra envolve o emprego de diversastécnicas de preparo de amostras. Esses procedimentos são bastante especializados e merecem atençãodetalhada desse periódico, podendo ser consultadosna seção “Preparo de amostras”. Eventualmente,problemas que tenham relação com o preparo deamostras serão discutidos nessa coluna. Para omomento, o mais importante acerca da forma que aamostra deve encontrar-se para ser introduzida,refere-se a sua compatibilidade com a fase móvelempregada no início da corrida cromatográfica. Apósadequadamente tratada, via de regra, a amostra deveestar solubilizada na fase móvel empregada no inícioda corrida. Como nem sempre isso é possível, algunscuidados devem ser tomados, pois muitos problemasde distorção dos picos cromatográficos são causadospor erros na introdução da amostra. Primeiramente, aamostra deve estar completamente solubilizada nasolução de injeção, devendo ser preferencialmentefiltrada, ou centrifugada, para a remoção de qualquermaterial particulado em suspensão. Caso a fase móvelseja muito diferente da solução a ser injetada, éimportante verificar se a amostra não precipitará aoser introduzida no sistema. De preferência,especialmente nos casos de grande volume de injeção, a força de eluição do solvente da amostra deverá sermenor do que aquele da fase móvel do início dacorrida. Por exemplo, em injeções em fase reversa, aporcentagem de solvente orgânico da solução daamostra não deve superar, em muito, aquela da fasemóvel. Um caso clássico de incompatibilidade é ainjeção de soluções contendo 100% de acetonitrila oumetanol, em corridas em fase reversa iniciando combaixos teores de solvente orgânico na fase móvel.Todavia, as distorções nos picos cromatográficos sãodependentes do método e dos analitos a seremseparados, e podem estar ausentes em alguns casos.

Após ser adequadamente introduzida nosistema cromatográfico, deseja-se que a amostraatinja a coluna cromatográfica com o formato de umabanda o mais estreita possível. Esse formato depende,entre outras, da qualidade da injeção e daminimização do volume morto entre o injetor e acoluna. A coluna cromatográfica em HPLC, via deregra, é um tubo de aço inoxidável preenchido com afase estacionária adequada. A diversidade de colunascromatográficas é incalculável. Há colunas quevariam em escala, desde diâmetros de poucosmicrômetros até alguns centímetros, isso emequipamentos que podemos classificar como HPLCde bancada. Daí surge classificações que vão desde o



nano-HPLC até o HPLC preparativo. Quanto ao tipode material de empacotamento é comum o empregoatual de partículas de sílica desde superiores a 10 µmde diâmetro em colunas preparativas até sub-2 µmpara separações de altíssima eficiência; materiaispoliméricos particulados ainda continuam sendoutilizados; bem como tem sido ampliado o uso decolunas monolíticas a base de sílica ou orgânicas,tanto em escala capilar quanto na convencional.Muitos problemas encontrados em separaçõescromatográficas têm causas que, de alguma forma,relacionam-se com a coluna cromatográfica. Operfeito entendimento de seu funcionamento dependetambém de conceitos teóricos que em momentoadequado serão abordados. Para o momento, convémdestacar que a coluna cromatográfica, exceto no casode amostras muito limpas, merece algum tipo deproteção. Uma das causas mais comuns de perdasprecoces de colunas cromatográficas, problemas deeficiência e distorção de picos cromatográficosrelaciona-se com a obstrução do filtro de entrada,posicionado justapostamente no início da coluna.Esse filtro é referido como frit, em inglês, outraduzido livremente como ‘frita’, em português.Algumas vezes, a sua obstrução pode ser resolvidacom procedimentos de lavagem da coluna, e emcolunas antigas, permitia-se inclusive a suasubstituição; de qualquer maneira, a melhor forma deevitar-se esse tipo de problema é a prevenção. É muito divulgada a utilização de pré-colunas, as quais sãoposicionadas precedendo a coluna cromatográficapropriamente dita. Apesar de ser a forma deprevenção de problemas mais popularizada, emmuitos casos, o uso de um filtro de linha, em vez dapré-coluna, surte os mesmos efeitos, ou ainda permiteresultados superiores, em termos de menoralargamento dos picos. Maiores discussões sobre asvantagens e desvantagens de filtros de linhas oupré-colunas ficam para outro momento, o fato é queao menos um deles é recomendado para prolongar avida da coluna. Um filtro de linha obstruído éfacilmente substituído e tem um preço módico,enquanto colunas caras podem ser perdidas se estesnão forem utilizados. Finalmente, as colunas,idealmente, são mantidas em um forno, para controlede temperatura. Apesar de variações na temperaturaimplicarem em diferentes tempos de retenção eseletividades, ao menos em escala convencional, nãoé viável a separação por programação de temperatura(como ocorre na cromatografia em fase gasosa).Outros dispositivos que podem requerer e apresentarcontrole de temperatura são os injetores automáticos e alguns detectores. O resfriamento das amostras é

desejado para prolongar a sua conservação no interiordo amostrador automático, enquanto o controle detemperatura de detectores, por exemplo, UV/Vis oueletroquímico, é importante para aumentar aestabilidade da linha de base do cromatograma.

Sob condições ótimas, os componentes daamostra apresentam desiguais taxas de interação coma fase estacionária da coluna e são eluídos comdiferentes tempos de retenção. Para que essescompostos sejam observados, há a necessidade de umsistema de detecção, que possibilite o registro naforma de picos em um cromatograma. Os picosregistrados em um cromatograma fornecem uma ideia com relação à identidade dos compostos separados, ea área dos picos relaciona-se com a quantidade decada composto. Atualmente, há uma gama muitogrande de detectores que podem ser usados em umHPLC. O mais popular detector para HPLC é oUV/Vis, o qual pode ser encontrado também na forma mais sofisticada que emprega um arranjo defotodiodos (comumente referido como DAD ou PDA, do inglês, diode array detector ou photodiode array),para detecção simultânea de todos os comprimentosde onda em um determinado intervalo do espectroUV/Vis. Outros detectores que podem serencontrados, dependendo da especialidade dolaboratório, são detectores de fluorescência, de índicede refração, de espalhamento de luz por evaporação(evaporative light scattering detector), de dicroísmocircular, eletroquímico e de condutividade.Equipamentos mais sofisticados e que constituemanalisadores espectrométricos, em vez de merosdetectores para cromatografia, são os espectrômetrosde massas (MS) e os espectrômetros de ressonânciamagnética nuclear (NMR). Evidentemente, oprimeiro grupo atualmente encontra um grau dedivulgação muito maior do que o segundo, eequipamentos do tipo LC-MS/MS têm ganhado muito espaço e atenção nos laboratórios. Apesar de customuito mais elevado do que o de um HPLC-UV, umLC-MS/MS, em todos os seus modos de análise,expande significativamente as fronteiras de atuaçãodas técnicas cromatográficas. Detalhes sobre oscuidados e particularidades referentes aoacoplamento LC-MS fogem ao escopo deste artigo,mas eventualmente serão retomados em momentosmais oportunos. De maneira geral, todos os detectores requerem um certo tempo de estabilização, essetempo pode ir de alguns minutos (detectores UV) atéalgumas horas (detectores eletroquímicos). Uma dicaé aproveitar o tempo de estabilização para realizar opreparo das amostras a serem injetadas. Um detalheque evita problemas em alguns detectores, geralmente

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UV/Vis e de fluorescência, é a utilização de um tubode descarte que gere certa pressão após a cela dedetecção. Algumas vezes, o encurtamento do tubo dedescarte, ou a simples eliminação dele para coleta defrações imediatamente após o detector, pode levar aosurgimento de bolhas que atrapalharão ocromatograma. A súbita despressurização após acoluna pode levar à insolubilização do gás dissolvidona amostra e o aparecimento de bolhas, que, emúltima instância, podem ficar retidas no detectorcausando artefatos no cromatograma. Um últimoalerta quanto a esse procedimento é a observação dapressão máxima suportada pela cela de detecção, docontrário esta pode apresentar vazamentos ou mesmoser danificada.

Os sistemas cromatográficos atuais sãocontrolados eletronicamente. Apesar de poder-seexecutar a grande maioria das funções pelo módulo ou interface de controle do equipamento, o meio maisutilizado é o controle via software, instalado em umcomputador. Além do controle do equipamento, osoftware comumente apresenta um pacote defuncionalidades para facilitar o tratamento e ainterpretação dos dados, bem como a geração derelatórios e a exportação dos resultados. Dessa forma,um conhecimento rudimentar da eletrônica einformática relacionada ao sistema cromatográfico édesejado, uma vez que alguns problemas são aílocalizados.

Atualmente, os sistemas cromatográficospermitem que injeções sejam programadas e o sistemamonitorado à distância, tal facilidade permite quecromatógrafos trabalhem 24 horas processando asamostras. No caso de deixar o sistema em esperadurante a noite, para que o mesmo método sejaretomado no dia seguinte, recomenda-se deixar umapequena vazão de fase móvel fluindo pelo sistema.

Algo em torno de 10% da vazão normal já é suficiente,e para maior economia de fase móvel pode operar-seem modo de reciclagem de fase móvel. O detector e orestante dos módulos devem ficar desligados até o diaseguinte. Quando o sistema for desligardefinitivamente, é importante fazer a limpeza de todasas linhas utilizadas e acondicioná-lo com solventeapropriado, bem como a coluna cromatográfica.

Concluindo, ao se adquirir experiência naoperação rotineira de um sistema de cromatografialíquida de alta eficiência, bem como ao se adquirirconhecimento técnico e teórico a respeito da HPLC,muitos desses procedimentos e observações tendem atornarem-se intuitivos. O mais importante nasanálises de rotina, por mais experiência que se tenha, é fazer tudo da mesma maneira e na mesma sequência,para que se obtenham resultados comparáveis.

Referências Bibliográficas1. Dolan, J.W. and Snyder, L.R. Troubleshooting LC

systems – A comprehensive approach to troubleshooting

LC equipment and separation. Totowa, New Jersey:

Humana Press. (1989) 500p.

2. Kromidas, S. Practical problem solving in HPLC.

Weinhein: Wiley-VCH. (2000) 178p.

3. Coutinho, L.F.M. Desenvolvimento de Instrumentação

Dedicada a Cromatografia Líquida Capilar (cLC).

2008. 219 f. Tese de Doutorado – Instituto de Química de

São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2008.

Disponível em: <http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/

75/75132/tde-05122008-171742/> Acesso em: 27 abr. 2009.

4. CHROMacademy. HPLC Autosamplers. Disponível

em: <http://www.chromacademy.com/HPLC-Autosamplers/

index.html> Acesso em: 27 abr. 2009.

Este Departamento tem como objetivo divulgar eventos da área decromatografia e técnicas relacionadas, tanto no Brasil quanto em outros países.

2009Maio

Evento: XXXVIII Reunião Anual da SBBqData: 16 a 19Local: Hotel Monte Real Resort, Águas de Lindóia (SP)Informações: http://www.sbbq.org.br/v2/

Evento: 33rd International Symposium on Capillary Chromatography & Electrophoresis

Data: 17-23Local: Portland, OR, USAInformações: http://www.casss.org/

Evento: 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ)Data: 29 de maio a 2 de junhoLocal: Fortaleza (CE)Informações: http://www.sbq.org.br/32ra/

Junho

Evento: 57th ASMS Conference on Mass SpectrometryData: 31 Maio – 4 JunhoLocal: Philadelphia, PAInformações: http://www.asms.org/

Evento: HPLC 2009 Data: 28 Junho – 2 de JulhoLocal: Dresden, GermanyInformações: http://www.hplc2009.com/



Calendário Geral

Agosto

Evento: Ninth International Symposium on Mass Spectrometry in the Health and Life Sciences: Molecular and Cellular Proteomics

Data: 23-27Local: San Francisco, CA, USAInformações: http://donatello.ucsf.edu/symposium/

Evento: 18th International Mass Spectrometry ConferenceData: 30 Agosto – 4 SetembroLocal: Bremen, GermanyInformações: http://www.imsc-bremen-2009.de/

Setembro

Evento: 6th. Symposium on the Practical Applications of Mass Spectrometry (Mass Spec 2009)

Data: 15-17Local: Philadelphia, USAInformações: http://www.casss.org/

Evento: 32nd. International Ion Chromatography SymposiumData: 19-23Local: Malahide, IrelandInformações: http://www.casss.org/

Outubro

Evento: XVI Congresso Brasileiro de ToxicologiaData: 10-14Local: Belo HorizonteInformações: http://www.sbtox.org.br/pages/detail.php?item_id=102

Dezembro

Evento: BrMassData: 12-15Local: The Royal Palm Plaza, Campinas - SPInformações: http://www.brmass.com.br/congresso



2010

Evento: Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afim (SIMCRO 2010)

Data: 14-16 de setembroLocal: "Arts and Convention Center", Campos do Jordão - SP - BrasilInformações: www.simcro.org; [email protected]

Evento: XIII COLACROLocal: ChileInformações: www.colacro.org

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O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) é parte da AssociaçãoInternacional de Cromatografia, entidade de direito privado, sem fins lucrativos.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dosusuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria deMassas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quantoprático.

A filosofia educacional do IIC é : “ ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelosDiretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipetécnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pós-graduados nosmelhores centros do país na área, e pós-graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores édisponibilizada no website do IIC.

O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC.Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (data

show-computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursosinstrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slidesapresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em várioscursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. Amaior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciadono folheto explicativo de cada curso.



Instituto Internacional de Cromatografia

Calendário IIC - 2º semestre 2009

Mês Dias Curso

Agosto 25, 26, 27 e 28 LC/MS e LC/MS/MS

Setembro 21, 22, 23 e 24 GC/MS e GC/MS/MS

Outubro

1 e 2 Análise cromatográfica de biodiesel

05, 06, 07, 08 e 09 Auditoria em Sistemas de Qualidade

27 e 28 Técnicas de preparo de amostras

Novembro3 e 4 ISO 17025

5 e 6 Validação de Métodos Cromatográficos

Dezembro 1, 2, 3 e 4 Cromatografia Líquida Moderna (HPLC)

• O I.I.C. oferece também cursos "in-house" ("in-company"). Interessadosnesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria)todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo deinscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitadopara melhor aproveitamento dos participantes

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações

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O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido peloIIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas dedivulgação dos materiais por ele produzido. Esses materiais podem ser adquiridos doIIC através do website www.iicweb.or/bookstore.

LANÇAMENTO

Cromatografia Líquida ModernaFernando M. Lanças

Livro publicado pela Editora Átomo emmaio de 2009, aborda de forma simples e didáticaos principais assuntos relacionados àCromatografia Líquida Moderna (HPLC ouCLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas,Detectores, até aspectos da Validação, Preparo daAmostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos osinteressados em iniciar-se ou atualizar-se nestatécnica.

BOOKSTORE

Cromatografia em Fase GasosaFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitosoutros aspectos da Cromatografia Gasosa.Altamente recomendado para os iniciantes natécnica, os quais encontrarão explicaçõesdetalhadas e simples a respeito da maior parte dosfundamentos básicos da técnica.



Bookstore

Validação de Métodos CromatográficosFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, descreve os princípios da validação de métodos cromatográficoscom detalhes. Enfoque também a validação deinstrumentação e a adequação dos sistemas (“system suitability”) frente aos requisitos dos órgãosregulamentadores de resultados analíticos. O livro éacompanhado de um software, denominadoValidate – versão demonstração – desenvolvido emcolaboração com o Dr. Vitor Hugo P. Pacces, o qualauxilia no processo de validação.

Extração em Fase SólidaFernando M. Lanças

De autoria do Prof. Lanças, este livroapresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássicaempregando cartuchos até as mais atuais comodiscos, placas, ponteiras, e outras. Também discuteos princípios da micro extração em fase sólida(SPME) e da extração por sorção em barras deagitação (SBSE).

O Scientia Chromatographica é o primeiroperiódico da América Latina dedicadoexclusivamente às técnicas Cromatográficas erelacionadas ( preparo de amostras, espectrometriade massas, técnicas eletroforéticas e outras). Editado pelo Instituto Internacional de Cromatografia, operiódico conta com um corpo de co-editores comlarga experiência na área, respaldado por um grupode consultores ("advisory board") de grande renome internacional.

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scichro v1n2 corrigidoa cromatografia líquido-sólido (cls), isto é, a realização de uma...

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