Practica determinacin de salmonella

Introduccin

Los miembros del gnero Salmonella son agentes causantes de infeccin intestinal en seres humanos y animales. Entre los agentes de enfermedades transmitidas por los alimentos, el gnero Salmonella es uno de los principales causantes de casos mortales por las complicaciones surgidas entre los pacientes afectados. La tasa de mortalidad se sita alrededor del 4.1 % y los huevos, carnes y productos crnicos derivados, son los alimentos que ms comnmente transmiten la Salmonella al hombre.El hbitat principal de los microorganismos de este gnero es el conducto intestinal del ser humano, de los animales domsticos, de los pjaros, de los reptiles y, ocasionalmente, de los insectos. Debido a que es una bacteria de origen intestinal, es excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas. Cuando las aguas contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por el ser humano o por los animales, elmicroorganismo vuelve al sistema digestivo donde se multiplica y ser nuevamente eliminado a travs de las heces, continuando el ciclo. Los insectos y roedores tambin participan en la diseminacin ambiental de estos microorganismos. La dosis infectante es variable, segn el serotipo; en general, el nmero de clulas necesarias para desencadenar la sintomatologa (nusea, vmitos, dolores abdominales, cefaleas escalofros y diarreas) oscila entre 103 y 106 UFC/g de alimento para algunos serotipos y entre 109 y 1011 para otros.

Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad, siguen siendo portadoras por tiempo considerable y pasan a ejercer un importante papel en la diseminacin del agente, especialmente si participan en la cadena de produccin y comercializacin de alimentos.El agente etiolgico lo constituye la Salmonella entrica con 7 subespecies divididos en serotipos; actualmente se reconocen ms de 2000 serotipos.Son bacilos Gram-negativos, aerobios no esporulados, mviles por flagelos pertricos, no encapsulados y poseen 3 tipos de antgenos: O somtico, Flagelar H y Envoltura Vi, son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo fermentativo.

Fundamento

En el hombre causan dos cuadros clnicos: fiebre tifoidea y gastroenteritis. Esta ltima es considerada como una intoxicacin alimentaria y se manifiesta tras 12-36 horas de ingerir el alimento con vmitos, nuseas, dolores abdominales, fiebre y diarrea que persisten durante 1 a 7. El reservorio son las personas portadoras y animales enfermos. La transmisin se realiza a travs de los alimentos, destacando la carne y productos crnicos la leche y los huevos.Cuando un alimento est contaminado con salmonelas suele contener tambin gran cantidad de entero bacterias muy similares. Por ello es necesario realizar un enriquecimiento de la muestra en medios selectivos que propician el crecimiento de Salmonella frente a otras bacterias presentes. Por otra parte, como se suele exigir la ausencia de este microorganismo en el alimento, los anlisis deben ir enfocados a demostrar que efectivamente no se encuentra en el alimento.La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la identificacin especfica de un microorganismo.

Objetivo La presente prctica tiene como objetivo desarrollar la metodologa llevada a cabo para realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de Salmonella en muestras de alimentos. En nuestro caso carne molida de res.

Materiales 200 gr muestra(Carne de res molida) 1.Portaobjetos 1.Cubreobjetos 1.Pipeta Pasteur 1.Gradilla 1.Asa bacteriolgica 1.Asa recta 1 mechero Fisher 2 matraz Erlenmeyer de 250 Ml 1 Incubadora a 42.5 C 1 Incubadora a 35 C Refrigerador Plumn marcador para vidrio. Pipetas de 10 ml y de 2 ml Homogeneizador stomacher

Medios de cultivo 2 cajas con agar (AVB) 2 cajas con agar Agar Bismuto Sulfito (ASB) 1 tubo con caldo (CTT) 1 tubo con Caldo Rappaport Vassiliadis (CRP) 1 tubo con agar triple azcar hierro (TSI) 1 tubo con agar hierro lisina (LIA) 3 tubos de caldo urea. Diluyente agua peptonada 250ml

Procedimiento

Preenriquecimiento

Tarar el recipiente estril que se vaya a utilizar para la trituracin Introducir, aspticamente, el alimento 25g agregar el medio diluyente 225ml. Procesar en el stomacher u otro homogeneizador por 30 segundos. Incubar a 35C durante 24 horas. Homogenizar por 30 segundos.

Enriquecimiento Con una pipeta de 2 ml medir 1 ml de muestra colocarla en el tubo que contiene 9 ml de caldo (CTT) y agregar 0.2ml de yoduro yodurado. Con una pipeta de 2 ml medir 1 ml de muestra colocarla en el tubo que contiene 9 ml de caldo (CRP) y agregar 0.2ml de yoduro yodurado. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Incubar a 42.5C durante 24 horas.

Aislamiento Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar dos gotas biconvexas y descargar en el medio de cultivo Extender el inculo sobre una pequea zona de la placa de Petri. Esterilizar el asa para trazar dos estras a partir del inculo depositado. Una de ellas se hace slo hasta el centro de la placa de Petri. Volver a esterilizar el asa y se realizan una serie de estras paralelas a las dos primeras. Luego de esterilizar el asa nuevamente, se hacen una serie de estras perpendiculares a las dos primeras, pero comenzando desde el lado opuesto al depsito y sin llegar a tocarlo El aislamiento se realizara del caldo (CTT) hacia los medios (AVB, ASB) y del caldo (CRT) hacia los medios (AVB, ASB). Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) a 35C durante 48 horas.

Prueba presuntiva

Observar si existe colonia sospechosa. Agar (AVB) colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar (ASB) las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 horas adicionales si en este tiempo no hay la prueba se considera negativa.

Identificacin bioqumica

Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI), otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo. Incubar por 24 horas 2 a 35C. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar ms colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

1. Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfhdrico.

2. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfhdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin.

Prueba de ureasa

Con un asa estril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 horas a 35C.

Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa

Identificacin serolgica

Colocar con un asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina. Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioqumicas complementarias

Diagrama de flujoPrueba de ureasa

Preenriquecimiento

Positiva

Si

Enriquecimiento

Fin

NoSeleccin

Confirmacin serolgica

Colonias tpicas

Prueba caractersticaNo

Si

Fin

Si

NoIdentificacin de salmonella

Identificacin

TSI - TSI - LIA- LIA-

LIA -

Puede ser salmonella

Si

FinNo

Efectuar pruebas bioqumicas complementarias

TSI + TSI - LIA- LIA+

LIA -

Resultados

TSI4 -4A5Fermentacinde glucosa-++++FermentacinLactosa/o sacarosa---++Produccin deH2S--+-+++EjemplostpicosPseudomonasMorganellaProvidenciaShigellaCitrobacterSalmonella Edwarsiella ProteusE.coliEnterobacterKlebsiellaE. coli H2S+Salmonella lactosa positivaTubo 4Abundante gas evidenciado por ruptura de agarLIA

Fermentacin de glucosa-Desaminacin de la lisina(rojo oscuro en tendido)+

Fermentacin Lactosa/o sacarosa-Descarboxilacin de Lisina+

Produccin de H2S-Fermentacin de glucosa+

UreasaPositivo color prpuraNegativo color amarillo en el fondo del agar

Pruebas de grupo somticas (O).Positivo aglutinacin en mezcla de pruebaNegativo ninguna aglutinacin en mezcla de prueba

Anlisis y discusin de resultadosLas carnes crudas son uno de los principales vehculos de transmisin, ya que este patgeno ha estado implicado en una buena cantidad de brotesen esta prctica se analizcarne de resConclusionesBibliografa

Escartin FE. Microbiologa Sanitaria, agua y alimentos. Mxico: Editorial EDUG Guadalajara, 1978.

American Public Health Association: Compendium of methods the Microbiological Examination of Food Second Edition. USA: Washington DC, 1984.

Secretara de Salud. Proyecto de norma oficial mexicana. N.O.M. - 114 - SSA1 - 1994: Determinacin de Salmonella en alimentos. Mxico (DF): SSA, 1995.

Secretara de Salud. Manual de procedimientos para el examen microbiolgico de superficies y utensilios. Mxico (DF): SSA, 1995.

Anexos

Tabla TLM INTERPRETACIN DEL GNERO SALMONELLA BASADO EN MEDIOS DE CULTIVOS: AGA TSI, LIA y MIO. (M.E. Valenzuela, J. Astorga, ISP 1991TSI GAS H2SLIA GAS H2SMicroorganismo

K/A +K/K +Salmonella subespecie I OtrasSalmonella

K/A + -K/K + Salmonella choleraesuis. OtrasSalmonella

K/A - -K/K Salmonella thyphi.

K/A +K/K +Salmonella .thyphi

K/A + -K/A + Salmonella sp. Salmonella.Paratyphi A

K/A - -K/A - -Salmonella.Paratyphi A

K/A +K/A +Salmonella.typhi (excepcin)

A/A, +, +K/K, + +Salmonella subg.3 (Arizona)

K/A + +K/ K + +Salmonella sub-especie I ySalmonella .sub especie III (Arizona)

K/A + +K/A + +Salmonella. Sp. y Citrobacter freundi