revision preliminar de medios de cultivo empleados en

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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE

ENFERMEDADES EN PLANTAS

LORENA CURVELO GUTIERREZ

JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y

VETERINARIA

BOGOTÁ 2010

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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE

ENFERMEDADES EN PLANTAS



TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar los títulos de

Microbiólogo Agrícola y Veterinario y Microbiólogo Industrial

DIRECTORA

MARIA CLEMENCIA FORERO DE LA ROTTA




VETERINARIA

BOGOTÁ 2010

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946

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RECOPILACION DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,

DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS



APROBADO

Ma. Clemencia Forero de la Rotta, David Gómez Méndez

Ing. Agrónoma M.Sc. Fitopatologia Microbiólogo M.Sc.

Directora Jurado




VETERINARIA

BOGOTÁ 2010

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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,

DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS



APROBADO

Ingrid Schuler García, Ph.D Janeth Arias Palacios, MSc.

Decana Académica Directora

Facultad de Ciencias Carreras de Microbiología




VETERINARIA

BOGOTÁ 2010

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................... 7

1. INTRODUCCION ................................................................................................... 8

2. JUSTIFICACION .................................................................................................... 10

3. MARCO TEORICO ................................................................................................. 11

3.1. LOS HONGOS FITOPATOGENOS .......................................................................... 11

3.1.1. CARACTERISTICAS GENERALES ................................................................... 12

3.1.1.1. NUTRICION Y CRECIMIENTO ....................................................................... 13

3.1.1.2. ESTRUCTURAS SOMATICAS ........................................................................ 15

3.1.1.3. REPRODUCCION .............................................................................................. 17

3.2. CLASIFICACION TAXONOMICA .............................................................................. 19

3.2.1. CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS ............................. 20

3.2.1.1. HONGOS INFERIORES ................................................................................... 20

3.2.1.2. HONGOS SUPERIORES ................................................................................. 21

3.3. Características y estructuras de los hongos inferiores ........................................... 25

3.3.1. Phylums, Oomycetes y Zygomycetes ................................................................ 25

3.4. Características y estructuras de los hongos superiores ......................................... 25

3.4.1. Subdivisión DEUTEROMYCOTINA .................................................................... 25

3.4.2. Subdivisión ASCOMYCOTINA ............................................................................ 26

3.5.1. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.......................................... 26

4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 29

4.1. Objetivo General ........................................................................................................... 29

4.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 29

5. METODOLOGIA .................................................................................................. 30

6. RESULTADOS .................................................................................................... 31

7. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SEMILLAS .... 31

8. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SUELO Y

AGUA ......................................................................................................................... 32

9. MEDIOS DE USO GENERAL .............................................................................. 38

10. MEDIOS SELECTIVOS ....................................................................................... 41

10.1. PHYLUM Oomycetes ........................................................................................... 42

10.2. PHYLUM Ascomycetes ...................................................................................... 52

10.3. PHYLUM Deuteromycetes .................................................................................. 58

11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................................... 79

12. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 81

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13. ANEXOS ............................................................................................................. 84

RESUMEN

Como consecuencia del apoyo que se ha venido desarrollando a la

investigación sobre fitopatología en Colombia se ha venido experimentando en

los últimos años un acelerado crecimiento del interés por los hongos

causantes de enfermedades en cultivos de importancia económica en

Colombia.

En este proceso, proyectos fomentados por varias instituciones como el ICA,

CORPOICA, universidades entre otras instituciones han incrementado este

interés y han aumentado el número de especies de hongos que hoy en día

están siendo estudiadas.

Para este proceso de investigación se han tenido en cuenta los diferentes

aspectos que intervienen en el establecimiento de los cultivos, para convertirla

en una actividad productiva, capaz de competir con las actividades productivas

tradicionales. En este sentido en varios proyectos se consideran de importancia

los esfuerzos hechos en el campo de la agricultura, con un estudio fitosanitario

de varias especies de plantas. Algunos de ellos abarcaron el reconocimiento de

plagas y enfermedades, presentes en los distintos estados del desarrollo de las

plantas, desde la etapa de semillas y viveros hasta la fase productiva ya

cadenas de comercialización.

Estas investigaciones contemplan garantizar el éxito de las inversiones que se

realizan en el establecimiento de los cultivos. Se ha sabido que a medida que

aumenta las poblaciones de una especie en cultivo, también aumenta el riesgo

de la presencia de plagas o enfermedades que interfieren en la actividad.

Mediante diferentes observaciones e inquietudes planteadas en diferentes

investigaciones en el campo fitopatológico se ha considerado necesario

recopilar la información que se presenta sobre los medios de cultivo que se han

empleado en estudios de microorganismos peretenecientes a los phylums

Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes como agentes causantes de

enfermedades en plantas , con el fin de facilitar al investigador el estudio de

estos hongos; por otro lado se espera que a través del tiempo se puedan

8

recopilar, complementar y mantener actualizada la información sobre los

diferentes medios de cultivo que son de uso común y específicos en estudios

sobre los agentes causantes de enfermedades en las plantas.

Se espera que este documento sea el punto partida para una herramienta de

gran utilidad, tanto para el investigador, docente que se dedica al estudio de

enfermedades de cultivos de importancia económica en Colombia quienes

actúan como observadores para atender las necesidades del productor.

1. INTRODUCCION

Los hongos son los mayores causantes de pérdidas en cultivos de interés

económico en Colombia, por lo tanto de ahí se deriva la importancia del su

estudio de su estudio, de manera que sea posible realizar aislamientos que

permitan su óptimo crecimiento y conocer sus características fisiológicas y

biológicas, utilizando no solamente medios que permitan su crecimiento

micelial sino promover la formación de sus estructuras reproductivas que

faciliten no solamente su identificación, sino también estudiar su

comportamiento durante el proceso de interacción entre la planta y el ambiente,

mediante el uso de medios específicos.

Entre las causas principales de enfermedades en las plantas están los factores

abióticos como la humedad, luz, temperatura, oxígeno, pH y nutrientes, y

bióticos como bacterias, hongos, virus, protozoos, nematodos, insectos y otras

plantas parasitas. Estos últimos factores causan daños en cualquier estructura

de la planta (raíz, tallo, hojas, flores o fruto), ocasionando enfermedades como

pudrición de la raíz, manchas foliares, tizones, royas, carbones y antracnosis,

entre otras.

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A diferencia del trabajo con las bacterias, sólo mediante la observación directa

de las características del hongo y su inoculación posterior en la planta sana,

podemos identificar el agente causante de una enfermedad fungica. Los

hongos fitopatogenos han sido observados haciendo raspados o cortes finos de

los tejidos afectados, para la identificación y clasificación taxonómica muchas

veces se hace necesario aislarlos y estudiarlos posteriormente en el

laboratorio.

Una de las tareas más importantes y necesarias para el investigador es lograr

el cultivo puro de un hongo, ya sea para su diagnostico o para el estudio de

patogenicidad generada en la planta, o para evaluar la resistencia varietal de

un cultivo en cuestión. La tarea se dificulta por la abundancia de

microorganismos que a menudo presentan requerimientos nutricionales

similares. Al realizar el aislamiento de un hongo, aparecen frecuentemente

muchos organismos no deseados que ejercen una actividad negativa sobre los

aislamientos por competencias no deseadas para el organismo de interés, ya

que otros organismos se desarrollan en los medios de aislamiento con mayor

rapidez por ser menos exigentes en su alimentación, mientras que los

patógenos no se desarrollan o lo hacen con dificultad. Para restringir el

desarrollo de microorganismos no deseados, se han desarrollado inhibidores

que permitan disminuir su actividad, tales como la modificación del pH y los

niveles de sustancias nutritivas en el medio, o la adición de antibióticos,

sustancias tóxicas entre otros.

La ausencia de una guía que permita recopilar toda la información acerca de

los medios de cultivo usados en la identificación de hongos patógenos, es el

objetivo principal para la realización de esta revisión preliminar. Este

10

documento realiza una revisión bibliográfica de manera que logra compilar

algunos medios de cultivo más importantes así como la composición,

preparación y empleo orientado hacia el cultivo, aislamiento e identificación de

los principales hongos patógenos que afectan cultivos de importancia

económica en Colombia.

El presente trabajo reúne y cita brevemente en la primera parte las

características generales de los hongos patógenos como su nutrición y

crecimiento, estructuras somáticas y reproducción, así como también su

clasificación taxonómica. En la segunda parte se presentan las características

de los medios de cultivo de uso común, algunos de los usados para el

aislamiento de microorganismos que se encuentran en semillas, agua y en la

tercera y última parte se incluyen los medios correspondientes para los

principales patógenos que ocurren sobre cultivos especies cultivadas de

importancia económica.

A este manual se recurrirá para la consulta de medios generales y específicos

de hongos fitopatógenos que puedan darnos precisión al diagnostico de las

enfermedades de las plantas, así como para los procedimientos de

preparación que se lleven a cabo en el laboratorio para el aislamiento y será un

aporte para todas las personas interesadas en el área de la fitopatología.

2. JUSTIFICACION

El diagnostico de laboratorio es esencial para la determinación de la

enfermedad y necesario cuando se trata de establecer la identidad de un

agente causal. Los medios de cultivo constituyen una parte importante en el

11

análisis, ya que permiten el aislamiento y el cultivo de los agentes causales de

enfermedades.

Actualmente en los laboratorios de investigación y de análisis de muestras no

se cuenta con una recopilación general de recursos bibliográficos sobre los

medios de cultivo de interés en el área de la fitopatología, es así como surge

este compilación el cual colecciona toda la información acerca de los medios

de cultivos específicamente de los microorganismos pertenecientes a los

phylums Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes causantes de grandes

pérdidas en cultivos de importancia económica en nuestro país.

El presente trabajo pone a disposición de los profesionales, fitopatólogos,

técnicos, estudiantes y entidades de apoyo un instrumento que sirva de

orientación y que sea material de consulta sobre los medios de cultivo que

existen y son utilizados para el aislamiento de hongos fitopatógenos de

importancia en Colombia.

3. MARCO TEORICO

3.1. LOS HONGOS FITOPATOGENOS

Los hongos y las bacterias son los dos principales grupos de organismos cuya

forma de vida predominante es saprofita y que obtienen sus nutrientes por la

secreción de enzimas extracelulares en el medio en que se desarrollan. En la

mayoría de los casos, son incapaces de atacar a organismos vivos debido a la

presencia de barreras físicas o químicas. Sin embargo, algunos han superado

esas barreras y pueden atacar a plantas o animales vivos. Los hongos, con su

amplia gama de enzimas degradadoras de carbohidratos, son más importantes

12

en las plantas, mientras que las bacterias, la mayoría de las cuales muestran

una mayor efectividad en la degradación de las proteínas, son más importantes

como patógenos de animales. Los hongos son quizá aún los fitopatógenos más

importantes, aunque con el desarrollo de fungicidas eficientes y variedades

resistentes están adquiriendo una importancia similar a los virus, que rara vez

pueden controlarse mediante cualquier método, (Manners, 1996).

3.1.1. CARACTERISTICAS GENERALES

Los hongos constituyen un grupo de microorganismos carentes de clorofila,

pero recuerdan a las plantas verdes ya que generalmente tienen una pared

celular y son inmóviles, aunque algunos pueden presentar células

reproductivas móviles, la mayoría de hongos se reproducen mediante esporas.

Sin embargo, no poseen tallos, raíces ni hojas, ni presentan un sistema

vascular desarrollado como tienen las plantas superiores. Los hongos son

generalmente filamentosos y casi todos multicelulares, además sus núcleos

pueden ser observados con facilidad. Sus estructuras somáticas, con algunas

excepciones, tienen una ligera diferenciación y prácticamente no presentan

división en sus funciones. (Manners, 1996).

Los filamentos que constituyen el cuerpo de los hongos aumentan de tamaño

por crecimiento apical, lo que los diferencia de las bacterias. Estos filamentos

pueden ser septados o no y se les denomina hifas, las cuales al agruparse

constituyen el micelio.

La composición de la pared celular es muy variable en los diferentes hongos y

algunas veces aun en el mismo individuo en diferentes fases de su ciclo vital.

Los principales componentes de la pared son varios tipos de carbohidratos:

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celulosa, pectosa, callosa, quitina, etc. los cuales pueden presentarse solos o

mezclados entre ellos o con otras sustancias.

La presencia de celulosa, la cual predomina en los hongos inferiores, puede ser

detectada por tratamiento con cloroioduro de zinc, pero algunas veces la

reacción queda encubierta porque tienen ciertos depósitos de lípidos en la

parte exterior de la célula, los cuales deben disolverse primero, como sucede

en Monoblepharia. (Manners, 1996).

En los hongos Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, y los más

evolucionados de Ficomycetes, no se detecta celulosa en la pared celular pues

esta ha sido reemplazada por otros carbohidratos, principalmente quitina, que

la cual se encuentra acompañada de otros componentes formando así la pared

celular. Además, pueden presentarse otras sustancias como carbonato de

calcio y otras sales. (Manners, 1996).

3.1.1.1. NUTRICION Y CRECIMIENTO

Los hongos obtienen sus alimentos propagándose en organismos vivos, como

parásitos, o descomponiendo la materia orgánica como saprofitos. La mayoría

de los hongos conocidos, sean estos parásitos o no, son capaces de vivir sobre

materia orgánica muerta, como lo muestra el hecho de que pueden ser

cultivados artificialmente sobre medios sintéticos.

Los hongos que viven sobre materia orgánica muerta y que son incapaces de

infectar tejidos vivos se denominan saprofitos obligados. Aquellos capaces de

causar enfermedades o de vivir sobre materia orgánica muerta, de acuerdo con

las circunstancias, se denominan parásitos facultativos o saprofitos facultativos,

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según prevalezca un estado u otro, y los que solo pueden vivir de protoplasma

vivo, parásitos obligados. (Manners, 1996).

El organismo infectado por un parasito es conocido como hospedante. Es

probable que cuando se sepa más acerca de la fisiología de los hongos

seremos capaces de idear medios sintéticos sobre los cuales crezcan los

llamados parásitos obligados.

Los hongos difieren de las plantas verdes en que requieren alimentos

elaborados para vivir y son incapaces de fabricarlos ellos mismos. Los

diferentes hongos tienen distintos requerimientos de alimentos. Algunos son

omnívoros y pueden subsistir sobre cualquier cuerpo que contenga materia

orgánica; otros son más estrictos en su dieta y unos pocos –los parásitos

obligados- no solo requieren protoplasma vivo para alimentarse sino que son

altamente especializados para las especies plantadas y aun para las

variedades del hospedante que parasitan. (Manners, 1996).

Las superficies de las hojas y otras partes de las plantas portan trazas de

nutrientes exudados de las células epidérmicas. Cuando los saprofitos son

capaces de crecer sobre estas porciones se dice que son epifilos, los cuales

producen trastornos al vegetal o reducen el porcentaje de luz aprovechable por

este para la fotosíntesis y dificultan el intercambio gaseoso, como sucede con

el género Capnodium. (Manners, 1996).

A veces resulta una intima asociación entre el hongo y la planta,

beneficiándose ambos; esta condición se llama simbiosis o parasitismo

controlado. Ejemplo de esto son los líquenes y las micorrizas. (Mayea y

Padrón, 1983).

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Un gran número de plantas en condiciones naturales presenta esta última

asociación, a la cual el hongo brinda una mayor capacidad para extraer

sustancias minerales deficitarias en el suelo con más eficacia que las raíces de

la propia planta. Si realizamos un corte a una de estas estructuras, podremos

ver muchas hifas intercelulares y micelios externos bien desarrollados que son

las micorrizas exotróficas. En otras pueden observarse las hifas sólo en el

interior de las células como por ejemplo, Rhizoctonia sp. en las orquídeas,

cuyas micorrizas se denominan entonces, endotroficas. Cuando se forman

masas muy ramificadas con vesículas en las células corticales más viejas

tenemos la micorriza arbuscular-vesicular. (Mayea y Padrón, 1983).

El equilibrio entre la condición de enfermedad o el mutuo beneficio es

controlado por condiciones externas. Se han hallado micorrizas aun en las

Pteridophytas fósiles, (Mayea y Padrón, 1983).

3.1.1.2. ESTRUCTURAS SOMATICAS

El talo de los hongos consiste típicamente en hilos o filamentos microscópicos,

los cuales se ramifican en todas las direcciones. Cada uno de estos filamentos

es conocido como hifa, la cual es tubular y esta hecha de una pared fina,

transparente a partir de una capa de protoplasma que varía en grosor.

Dependiendo de las especies, el protoplasma puede ser continuo o puede ser

interrumpido a intervalos irregulares por paredes trasversales, las cuales

dividen la hifa en células. Las paredes trasversales son llamadas septos. En las

formas septadas, los protoplasmas de cada lado de un septo están conectados

por medio de un poro central. Las hifas que no tienen septos son llamadas

aseptadas, cenocíticas o continuas. Comúnmente se encuentran vacuolas,

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gotitas de grasa y otras inclusiones en el citoplasma. La masa de hifas que

constituye el talo de un hongo es llamado micelio. El micelio de algunos hongos

superiores puede dar lugar a cuerdas gruesas, los rizomorfos, donde las hifas

pierden su individualidad y forman tejidos complejos que exhiben una división

del trabajo. Esta masa en forma de cuerda, tiene una corteza gruesa, dura y un

extremo de crecimiento cuya estructura recuerda el ápice de una raíz.

(Manners, 1996).

Los rizomorfos son resistentes a condiciones adversas y permanecen latentes

hasta que vuelven las condiciones normales. El crecimiento se reanuda

entonces y el rizomorfo alcanza una gran longitud dentro del hospedante

desarrollándose entre las células (intercelular) o penetrando en ellas

(intracelular). Las hifas intracelulares de muchos hongos, especialmente de los

parásitos obligados de plantas, obtienen nutrientes a través de haustorios,

órganos de absorción especializados, que el hongo introduce en las células de

la planta hospedante a través de un pequeño poro abierto en la pared celular.

Los haustorios son excrecencias de las hifas somáticas y pueden adoptar la

forma de nudo, de lanza o ser ramificados. (Manners, 1996).

Las hifas de los hongos saprófitos se ponen en íntimo contacto con el sustrato

y obtienen los alimentos por difusión directa a través de las paredes hifales, y

causan la desintegración de la materia orgánica que utilizan para su nutrición.

El micelio de un hongo comienza generalmente como un tubo germinativo corto

que emerge de una espora en germinación. Las esporas son pequeñas

unidades de propagación producidas por muchos hongos, y sirven para la

perpetuación de la especie. (Manners, 1996).

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Durante ciertos estados del ciclo de vida de muchos hongos, el micelio se

organiza en tejidos flojos o compactamente trenzados, que se distinguen de las

hifas sueltas que ordinariamente componen el talo. Se usa el término

plecténquima para designar todos los tejidos fungosos y, dentro de él, existen

dos tipos generales: prosénquima flojamente entrelazado, en el que las hifas

componentes quedan más o menos paralelas y sus células típicamente

alargadas se distinguen fácilmente como tales y el pseudoparénquima, que

consiste en un tejido formado por células más o menos isodiamétricas u ovales,

agrupadas estrechamente, que recuerdan las células del parénquima de las

plantas superiores. En este tipo de tejidos fungosos las hifas han perdido su

individualidad, y no son fácilmente distinguibles como tales. (Agrios, 2005)

El prosénquima y el pseudoparénquima componen varios tipos de estructuras

somáticas y reproductivas que aparecen en muchos hongos: el estroma y el

esclerocio. Un estroma es una estructura somática compacta y similar a un

colchón sobre la cual se forman usualmente las fructificaciones, y el esclerocio

un cuerpo de reposo, resistente a condiciones desfavorables, que pueden

permanecer latente por largos periodos y germinar cuando se reanuden las

condiciones favorables, (Mayea et al, 1983 y Agrios, 2005).

3.1.1.3. REPRODUCCION

Los hongos se reproducen principalmente mediante esporas. Las esporas son

estructuras reproductoras o especializadas para la propagación del hongo, que

constan de una o varias células. Estas estructuras pueden formarse

asexualmente (mediante la separación de pequeños fragmentos del micelio en

esporas) o ser el resultado de un proceso sexual. (Agrios, 2005)

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En los hongos inferiores, las esporas asexuales se forman en el interior de un

saco denominado esporangio y son diseminadas en el momento en que se

rompe esta estructura o a través de una abertura que posee. Algunas de esas

esporas se mueven mediante flagelos y se les denomina zoosporas; otras

esporas asexuales denominadas conidios se desprenden de las células

terminales o laterales de hifas especializadas denominadas conidióforos. En

algunos hongos, las células intercalares o terminales de una hifa se alargan,

están rodeadas por una pared densa y se separan para formar clamidosporas.

En otros grupos de hongos, las esporas asexuales (conidios) se forman en el

interior de estructuras de pared gruesa denominadas picnidios. (Agrios, 2005)

La reproducción sexual, o los procesos que se asemejan a ella, se presentan

en la mayoría de los grupos de hongos. En algunos de ellos, un par de células

(gametos) de tamaño y forma semejante se fusionan y producen un cigoto,

denominado zigospora. En otros grupos, los gametos son de tamaño distinto y

al cigoto que forman se denomina oospora; algunos hongos, no se forman

gametos definidos, y en lugar de ello un micelio se fusiona con otro micelio

compatible. La Phylum Ascomycetes produce habitualmente ocho esporas

sexuales en el interior del cigoto (el asca) y a esas esporas se les denomina

ascosporas. Los hongos de la Phylum Basidiomycetes forman sus esporas

fuera del cigoto (denominada basidio) y a esas esporas se les denomina

basidiosporas. (Agrios, 2005)

Hasta la fecha no se sabe que los hongos imperfectos (Phylum Fungi

Imperfecti) se reproduzcan sexualmente, debido a que este fenómeno no se

presenta en este amplio grupo de hongos o a que aun no se ha podido

descubrir en ellos.

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La fusión de los núcleos sexuales del cigoto genera un núcleo diploide (2N), las

primeras divisiones de este núcleo son de tipo meióticas, de ahí que el hongo

contenga núcleos haploides (1N) durante todo su ciclo de vida, excepto en el

momento en que se han fusionado los núcleos gaméticos. Sin embargo, en

algunos grupos de hongos, en particular en los basidiomycetes y en menor

grado en los ascomycetes, las células de todo el micelio o de ciertas partes de

él contienen un par de núcleos haploides, los cuales se mantienen separados

en el interior de la célula. A dicho micelio se le denomina dicariótico, pero se

comporta de manera bastante semejante a como lo hace un micelio diploide

(en que ambos núcleos se mantienen fusionados). (Agrios, 2005)

En la mayoría de los hongos, los gametos masculino y femenino se forman en

un mismo micelio (como es el caso de los hongos hermafroditas). Cuando los

gametos masculinos fecundan a los femeninos del mismo micelio, al hongo se

le denomina homotálico. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los gametos

masculinos fecundan únicamente a los gametos femeninos de otro micelio

sexualmente compatible por lo que se dice que el hongo es heterotálico,

(Agrios, 2005).

3.2. CLASIFICACION TAXONOMICA

La clasificación de los hongos presenta innumerables dificultades, pero el

estudiante principiante no necesita, por el momento, hacerse cargo de ellas. Es

bueno aclarar que no todo esta establecido en micología, y que las diferencias

de opinión entre los micólogos sobre la clasificación son tan numerosas y, a

menudo, tan grandes, que en la literatura especializada se encontraran serias

discrepancias. Tales diferencias de clasificación son originadas por las distintas

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interpretaciones de los datos fragmentarios de que se dispone sobre la

estructura, desarrollo y fisiología de los hongos, y habrá de continuar existiendo

hasta que se cubran los claros de nuestro conocimiento.

La taxonomía tiene un doble propósito: primero, nombrar los organismos de

acuerdo con algún sistema internacionalmente aceptado, de manera que, del

modo menos confuso, los micólogos puedan intercambiar sus observaciones

sobre determinados hongos; segundo, indicar, tanto como sea posible, las

mutuas relaciones de los hongos y también sus relaciones con otros

organismos. A medida que aumenta el conocimiento, nuestra clasificación va

cambiando; los nombres de los organismos permanecen no permanecen

estables, ya que a medida que conocemos nuevos hechos acerca de los

mismos, se hace necesario ir modificando nuestros conceptos sobre sus

relaciones, lo que ha su vez demanda la reclasificación y el cambio de nombre,

(Alexopoulos, 1996).

3.2.1. CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS

Los hongos y Chromystas que producen enfermedades en las plantas

constituyen un grupo diverso debido a su abundancia y diversidad, aquí solo se

presentará una clasificación de algunos de los géneros , que son considerados

en esta recopilación preliminar, sin tener en cuenta los biotrofos o parásitos

obligados. patógenos mas importantes.

3.2.1.1. HONGOS INFERIORES

Phylum: OOMYCETES. (Mohos acuáticos). Tienen un micelio alargado.

Producen zoosporas en zoosporangios. Las oosporas se forman por la fusión

de gametos morfológicamente distintos. (Alexopoulos, 1996).

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Familia: Pythiaceae

Géneros: Pythium produce el ahogamiento de las plántulas, pudrición de

semillas y raíces y el tizón algodonoso de los céspedes.

Phytophthora. P. infestans produce el tizón tardío o “gota de la papa” y otras

especies que producen además de las pudriciones de la raíz, pudriciones en el

tercio inferior de numerosas plantas y en algunos frutos.

Phylum: ZYGOMYCETES. (Mohos del pan). Hongos terrestres. Producen

esporas asexuales no móviles en esporangios. No forman zoosporas.

Orden: Mucorales. Producen zigosporas. Las esporas asexuales no móviles se

forman en esporangios terminales.

Géneros: Rhizopus sp. produce la pudrición blanda de los frutos y hortalizas.

Choanephora. C cucurbitarum produce la pudrición blanda de la calabaza

(Alexopoulos, 1996).

3.2.1.2. HONGOS SUPERIORES

Phylum: ASCOMYCETES (Hongos de saco). Producen grupos de ocho

esporas asexuales, denominadas ascosporas, en el interior de un saco

denominado asca.

SubPhylum: EUASCOMYCETES. Las ascas se forman en ascocarpos.

Serie: PYRENOMYCETES (Hongos periteciales). Las ascas se forman en

cuerpos fructíferos que presentan una abertura denominada ostiolo (peritecios).

Orden: Sphaeriales sp. los peritecios poseen paredes firmes y colores oscuros.

Géneros: Ceratocystis. C. ulmi produce la enfermedad del olmo Holandés.

Diaporthe sp. produce el tizón de la vaina del frijol, la melanosis de los cítricos y

la pudrición del fruto de la berenjena.

Endothia. E. parasítica produce el tizón del castaño.

Glomerella. G. cingulata produce manchas antracnosis y la pudrición amarga

del manzano.

Gnomonia sp. produce la antracnosis o mancha foliar de varias plantas.

Rosellinia sp. produce las enfermedades de la raíz de la vid y de los árboles

frutales.

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Orden: Hypocreales. Los peritecios son de colores claros, rojos o azules.

Géneros: Claviceps. C. purpurea produce el cornezuelo del centeno.

Gibberella sp. ocasiona la pudrición del pie o tallo del maíz y de pequeños

granos.

Nectria sp. produce el cáncer del tallo y rama de los arboles. (Alexopoulos,

1996).

Serie: PSEUDOSPHAEROMYCETES. (Hongos ascostromáticos). Presentan

estromas en forma de peritecio que presentan ascas en cavidades separadas o

en grandes cavidades.

Orden: Myriangiales. Con cavidades dispuestas a varios niveles y que

contienen ascas individuales.

Género: Elsinoe sp. produce las antracnosis de la vid y de la frambuesa y la

sarna de los cítricos.

Orden: Dothideales sp.. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las

cuales contienen muchas ascas. Los peritecios carecen de pseudoparafisas.

Géneros: Dibotryon. D. morbosum produce la modulación negra de las ramas

en cerezos y ciruelos.

Dothidella. D. ulei ocasiona la mancha foliar de los arboles del caucho.

Guignardia. G. bidwellii produce la pudrición negra de las uvas.

Mycosphaerella sp. produce las manchas foliares de muchas plantas.

Orden: Pleosporales. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las cuales

contienen muchas ascas. Los peritecios presentan pseudoparafisas.

Géneros: Ophiobolus. O. graminis produce la enfermedad del pie del trigo.

Physalospora. P. obtusa produce la pudrición negra de las manzanas.

Venturia. V. inaequalis ocasiona la roña de la manzana.

Serie: DISCOMYCETES (Hongos de copa). Las ascas se forman en la

superficie de apotecios carnosos en forma de copa o de plato.

Orden: Helotiales. Las ascas liberan sus esporas a través de una perforación

apical y circular. (Alexopoulos, 1996).

Géneros: Coccomyces. C. hiemalis produce la mancha foliar del cerezo.

Diplocarpon. D. rosae produce las manchas negras de las rosas.

23

Lophodermium sp. produce el tizón de las agujas del pino.

Monilinia. M. fructicola produce la mancha parda de los frutos de hueso.

Rhytisma. R. acerium produce la mancha alquitranada de las hojas de arce.

Sclerotinia. S. sclerotiorum produce la pudrición blanda aguanosa de las

hortalizas.

Orden: Pezizales. Las ascosporas se liberan a través de una estructura en

forma de tapa o cápsula que se localiza en la punta del asca.

Género: Pseudopeziza. P. medicaginis produce la mancha foliar de la alfalfa.

Phylum: FUNGI IMPERFECTI O DEUTEROMYCETES. (Hongos asexuales).

Carecen de estructuras o reproducción sexual o no se sabe que las presenten.

Orden: Sphaeropsidales. Las esporas asexuales se forman en picnidios.

Géneros: Ascochyta. A. pisi produce el tizón del chícharo.

Coniothyrium sp. produce el tizón del tallo de la frambuesa.

Cytospora sp. ocasiona el cáncer del durazno y otros arboles (Valsa representa

su etapa sexual).

Diplodia. D. zeae produce la pudrición del tallo y la mazorca del maíz.

Phoma. P. lingam ocasiona la pierna negra de las crucíferas.

Phomopsis sp. produce el tizón y el cáncer del tallo de varios arboles.

Phyllosticta sp. produce las manchas foliares de muchas plantas.

Septoria. S. apii produde el tizón tardío del apio.

Orden: Melanconiales. Las esporas asexuales se forman en un acervulo.

Géneros: Colletotrichum ocasiona la antracnosis de muchas plantas de cultivo.

Coryneum. C. beijerincki produce el tizón de los frutos de hueso.

Cylindrosporium sp. produce manchas foliares en muchas Phylums de plantas.

Gloeosporium sp. muy parecido a Colletotrichum sp.; produce antracnosis en

muchas plantas.

Marssonina sp. ocasiona el tizón de las ramas y hojas del álamo, la quemadura

de las hojas de fresa y la antracnosis de los nogales.

Melanconium. M. fuligenum poduce la pudrición amarga de la vid.

24

Sphaceloma sp. produce la antracnosis de la vid y de la frambuesa.

Orden: Moniliales. Las esporas asexuales de forman sobre las hifas (o en su

interior) del hongo que se encuentran expuestas libremente a la atmosfera.

Géneros: Alternaria sp. produce manchas foliares y tizones en muchas

plantas. (Alexopoulos, 1996).

Aspergillus sp. produce la pudrición de las semillas almacenadas.

Botrytis. B. cinérea produce el moho gris y los tizones de muchas plantas.

Cercospora sp. una especie de este género produce el tizón temprano del apio.

Cladosporium. C. fulvum produce el moho de las hojas del tomate.

Fusarium sp. produce el marchitamiento y la pudrición de la raíz de muchas

plantas anuales, así como el cáncer de arboles forestales.

Fusicladium sp. produce la roña de la manzana (Venturia representa su etapa

sexual).

Graphium. G. ulmi produce la enfermedad del olmo holandés (Ceratocystis

representa su etapa sexual).

Helminthosporium sp. produce el tizón de los cereales y enfermedades de los

céspedes.

Penicillium sp. produce la pudrición de los frutos y otros órganos carnosos

debido a los mohos azules.

Pyricularia sp. produce el tizón del arroz y la mancha gris foliar de los

céspedes.

Thielaviopsis. T. basicola produce la pudrición negra de la raíz del tabaco.

Verticillium produce la marchitez de muchas plantas anuales y perennes.

Orden: Mycelia Sterilla. No se ha observado o es muy poco frecuente la

formación de esporas asexuales o sexuales en este grupo de hongos.

Géneros: Rhizoctonia sp. produce las pudriciones de la raíz de la corona de

las plantas anuales y mancha parda de los céspedes (su etapa perfecta

corresponde a Thanatephorus).

Sclerotium sp. produce las pudriciones de la raíz y del tallo de muchas plantas

(su etapa perfecta corresponde a Pellicularia sp.).

25

3.3. Características y estructuras de los hongos inferiores

3.3.1. Phylums, Oomycetes y Zygomycetes

Los hongos de la Phylum Oomycetes poseen un micelio cenocítico, alargado,

producen zoosporangios con zoosporas que pueden ser piriformes o

reniformes dependiendo del orden a que pertenezcan, y presentan dos flagelos

de dos tipos, uno tipo látigo y el otro tipo pincel. Las esporas sexuales de

reposo u Oosporas se forman por la fusión de dos gametos morfológicamente

distintos, (Saldarriaga, 2001).

Los hongos de la Phylum Zygomycetes tienen micelio cenocítico, muy

ramificado compuesto por hifas alimentadoras e hifas reproductoras. La

reproducción asexual se realiza mediante esporas no móviles producidas por

esporangios, (Pérez, 1993). Su espora de resistencia es la Zygospora formada

por la unión de dos gametos morfológicamente idénticos, (Agrios, 1995).

3.4. Características y estructuras de los hongos superiores

3.4.1. Subdivisión DEUTEROMYCOTINA

La subdivisión Deuteromycotina comprende aquellos hongos que carecen de

estructuras o reproducción sexual. Son considerados estados conidiales de la

subdivisión Ascomycotina y raramente de la subdivisión Basidiomycotina,

(Gonzalez, 1989). Poseen micelio septado, ramificado y frecuentemente

abundante. Presentan varios tipos de cuerpos fructíferos como Acérvulos,

Picnidios, Esporodoquio, Sinema formado por la unión de conidióforos, y

también presenta conidióforos libres, (Barnett, 1972). Dentro de esta

subdivisión se presenta la Phylum Agonomycetos o micelia esterilia cuyos

26

hongos no presentan conidias, ellos son Rhizoctonia y Sclerotium. El tipo de

cuerpo fructífero es una de las características utilizadas para la clasificación

taxonómica, (Finch y Finch, 1974).

3.4.2. Subdivisión ASCOMYCOTINA

La subdivisión Ascomycotina posee micelio septado, ramificado. Produce

esporas en estructuras llamadas ASCAS. Presentan varios tipos de cuerpos

fructíferos como Peritecios, Apotecios, Cleistotecios y Ascostromas, en ellos se

encuentran las ascas con ascosporas generalmente en número de ocho. Una

excepción a esto es el hongo Taphrina deformas que no forma cuerpo fructífero

y las ascas se encuentran desnudas, (Hanlin, 1990).

3.5. MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el

aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. La

mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera

relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de

patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se ha logrado

a menos que se inoculen en plantas vivas. (Ríos, et.al 2008)

3.5.1. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr

exitosamente el desarrollo de los hongos y entre las más importantes se

encuentran:

1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de

carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno.

27

También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias

que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que

componen los medios. (Ríos, et.al 2008)

2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita

manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo

en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno

es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la

aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. (Ríos, et.al

2008)

3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización

antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo

usando autoclave.

4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 35 oC, pero

existe mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima

para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como

punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el

medio de cultivo.

5. La mayoría de los hongos crecen bien a pH de 5 a 6, pero hay

excepciones. La temperatura y/o pH óptimo para la esporulación puede

ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es

conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar

bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no

toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungico.

6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en

el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan

28

fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero

otros requieren condiciones especiales de calidad y de luz. Este factor

puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con

fines de investigación o para identificar alguna especie en particular.

El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del

hospedante o sustrato natural del hongo a cultivar. La utilidad del medio es

proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más

normal posible. (Ríos, et.al 2008)

Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:

1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente

naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc… se

requieren en forma de extractos o simplemente esterilizando las partes

vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser

superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil

esporulación.

2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales

naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de agar papa

dextrosa , agar V8, agar harina de maíz, son los más usados.

3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo

medio de Komada, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los

medios de cultivo pueden ser:

29

a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar,

proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de

carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas.

b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos

se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como

agente solidificante.

c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente

para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa-

dextrosa. (Ríos, et.al 2008)

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Elaborar una recopilación de medios de cultivo de interés en la identificación de

hongos fitopatógenos mediante revisión de literatura en el área de la

fitopatología.

4.2. Objetivos Específicos

Realizar la selección de los hongos fitopatógenos de importancia en

Colombia teniendo en cuenta su clasificación taxonómica.

Seleccionar los medios de cultivo de uso más común como también de

medios específicos dentro de la práctica en el reconocimiento de hongos

causantes de enfermedades.

30

Determinar la composición, preparación y empleo de cada uno de

los medios seleccionados para el estudio fitopatológico.

5. METODOLOGIA

Como fuente inicial de consulta se revisaron algunos manuales de medios de

cultivo de varios autores, que recopilan composiciones, para diferentes

microorganismos de acción patogénica, en referencias extraídas de revistas

internacionales; estos manuales actualmente se usan en los Laboratorios de la

Clínica de Plantas, de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de

Colombia, sede Bogotá, Laboratorio de Cuarentena Vegetal del Instituto

Colombiano Agropecuario, ICA, el Laboratorio de Fitopatología de la

Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA y algunos

de los que se encuentran en las bibliotecas institucionales y particulares; el

manual usado como guía fue el publicado por Tuite en 1989, que incluye gran

parte de los medios que se encuentran en numeral 7 de esta revisión. En el

caso de aquellos medios que se encontraron para géneros y especies de

microorganismos, se organizaron taxonómicamente de acuerdo con la

clasificación propuesta por Alexopolus (1996) en su libro de Micología y en el

texto Phytopathology de Agrios (2005).

Para seleccionar los medios específicos en el aislamiento de patógenos que se

presentan con frecuencia en los cultivos de importancia económica en el país

(Buriticá, 1998) como flores, frutales, hortalizas, arroz, palma africana, caña de

azúcar, entre otros (Ver anexo 2), se reviso el Directorio de enfermedades en

Colombia del fitopatólogo Pablo Buriticá Céspedes, publicado en el año 1999,

además de artículos sobre investigación fitopatólogia en Colombia.

31

6. RESULTADOS

A continuación se presentan algunos de los principales medios de cultivo

explorados, organizados de la siguiente manera: los de uso común en

aislamiento de microorganismos de acción patogénica que se encuentran en

suelo y cascarilla, los empleados en el aislamiento a partir de semillas, los de

uso general en los laboratorios dedicados a estudios fitopatológicos y varios de

los medios selectivos, usados en investigaciones sobre enfermedades y

patógenos específicos.

7. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE

SEMILLAS

Estos medios son usados para el aislamiento de hongos fitopatogenos a partir

de semillas, los cuales proveen un soporte nutricional para garantizar la

viabilidad de hongo y así lograr su aislamiento.

AGAR PDTA

COMPOSICION CANTIDAD

Papa-Dextosa 100 g

Tergitol 200 ppm

Neomicina 30 ppm

Agar-Agar 10 g

Agua Destilada 1 L

Preparación: Disolver la papa dextrosa y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión agregar los demás componentes y servir.

32

AGAR TCV

Usado para la deteccion de Septoria spp. en semillas


Agar PDA 1 L

Metil Tiofanato 0.02 g

Vancomicina 0.1 g

Tween 2 ml

Preparación: Autoclavar 1 l de Agar PDA y dejarlo enfriar hasta alcanzar una

temperatura de 60°C y agregar 5 ml de la solucion de metil tiofanato,

vancomicina y 4 gotas de Tween.

AGAR GUAYACOL

Medio para detectar Bipolaris (Helminthosporium) oryzae y Alternaria en

semillas de arroz.

COMPONENTES CANTIDAD

Guaiacol 125 g

Estreptomicina 0.5 g

Agar-agar 5.0 g

Agua 1 L

Preparación: Disolver el guaiacol y el agar en un litro de agua destilada,

mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente adicionar la

estreptomicina, servir (Kamal,2009).

8. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE

SUELO Y AGUA

Los medios que se presentan a continuación son usados para el aislamiento de hongos fitopatogenos a partir de muestras de suelo y agua.

AGAR CLORURO DE SODIO - GLUCOSA - DICLORAN

33

Usado como medio selectivo para el aislamiento de Aspergillus flavus de suelo.


Peptona 5 g

KH2PO4 1 g

NaCl 30 g

Glucosa 10 g

MgSO4 x 7 H2O 0.5 g

Agar - agar 20 g

Agua destilada 1L

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar 50 mg de estreptomicina y servir.

AGAR DEXTROSA-PEPTONA-EXTRACTO DE LEVADURA (DPYA)

Para aislamiento y enumeración de hongos del suelo.

COMPOSICIÓN CANTIDAD

Dextrosa 5 g

KH2PO4 1 g

Peptona 1 g

MgSO4 x 7 H2O 0,5 g

NH4NO3 1 g

Extracto de Levadura 2 g

Propionato de Sodio 1 g

Agar-Agar 20 g

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir.

AGAR KRIGSVOLD Y GRIFFIN

34

Medio de cultivo semiselectivo para aislamientos de Cylindrocladium spp. del suelo.


Sucrosa 10 g

KH2PO4 1 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

Bacto oxgall 1.0 g

Peptona 15.0 g

Sulfato de estreptomicina 50.0 mg

Tetraciclina HCl 50.0 mg

Quintozene (PCNB) 75.0 mg

Agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la sucrosa, el oxgall, la peptona, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente adicionar el sulfato de estreptomicina, la tetraciclina HCI y el quintozene y servir (Plant Dis. Rep. 59:543).

AGAR EXTRACTO DE SUELO - ACIDO POLIGALACTURONICO

Usado para el aislamiento de Colletotrichum sp. del suelo.


K2HPO4 4 g

Extracto de suelo 25 ml

KH2PO4 1.5 g

Acido poligalacturonico 10 g

Agua destilada 1L

Agar - agar 17 g

Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir. (Sugar, 2006)

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AGAR MARTIN

Usado para el aislamiento de hongos de muestras de suelo y agua.

RB - O RB - M1

COMPONENTES

Agua destilada 1000 ml 1000 ml

Agar - agar 20 g 18 g

KH2PO4 1 g 0,5 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4 x 7H2O 0,5 g 0,5 g

Peptona 5 g 5 g

Dextrosa 10 g 10 g

Extracto de levadura 0,5 g

Rosa bengala 0,033 g 0,05 g

sulfato de estreptomicina 0,03 g 0,03 g

Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir.

AGAR OAES

Usado para el aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo.


Glucosa 5 g

Extracto de levadura 2 g

NaNO3 1 g

MgSO4 x 7 H2O 0.5 g

KH2PO4 1 g

Propionato de sodio 1 g

Agar - agar 20 g

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Agua destilada 1000 ml

Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión y servir.

AGAR PCNB

Aislamiento de Fusarium spp. a partir de muestras de suelo.

COMPONENTES CANTIDADES

Peptona 15 g

KH2PO4 1,0 g

MgSO4 x 7H2O 0,5 g

Terraclor 0,5 g

Agar - agar 20 g

Clorotetraciclina HCL 50 mg

Sulfato de estreptomicina 100 mg

Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir.

AGAR PEPTONA - ROSA BENGALA

Usado para aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo.


Peptona 5 g

Dextrosa 10 g

KH2PO4 20 g

MgSO4 x 7 H2O 1 g

Rosa bengala 0.5 g

Agar - agar 10 g


Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir.

37

AGAR SUCROSA - PEPTONA - DICLORAN

Usado para el aislamiento y recuento de Aspergillus flavus del suelo.


K2HPO4 0.5 g

Peptona 0.5 g

Sucrosa 20 g

Estreptomicina 50 mg

MgSO4 x 7 H O 0.5 mg

Extracto de levadura 0.5 mg

Rosa bengala 25 mg

Agar - agar 17 g


Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir. Ajustar el pH 5.5 usando HCl 1 N o NaOH 1 N.

CALDO FRIES

Usado para aislamiento de hongos a partir de muestras de suelo

COMPONENTES CANTIDAD

Tartrato NH4 5 g

NH4NO3 1 g

MgSO4 x 7 H2O 0,5 g

KH2PO4 1,3 g

K2HPO4 2,6 g

Sucrosa 30 g


Solucion Stock elementos traza 2 ml


Solucion Stock de elementos traza

38

Li Cl 167 mg

CuCl2 x H2O 107 mg

H2MoO2 34 mg

MnCl2 x 4H2O 72 mg

CoCl2 x 4H2O 80 mg


Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo, luego agregar la solución de elementos traza disolver, llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de presión y servir.

AGAR RB-M2

Usado para aislamiento de Thielaviopsis basicola de suelo. Este medio de cultivo se siembra casi siempre por el método de estrías en superficie, a partir de muestras de material vegetal o muestras de suelo contaminado.


Glucosa 10.0 g

Extracto de levadura 0.5 g

KH2PO4 0.5 g

Peptona 0.5 g

K2HPO4 0.5 g

MgSO4.7 H2O 0.5 g


Quintozene 500.0 mg

Nistatina 30.0 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la peptona, la glucosa, el extracto de levadura, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, luego añadir el sulfato de estreptomicina, el quintozene y la nistatina, ajustar el pH 7.4 y servir (Phytophatology, 54, 1475).

9. MEDIOS DE USO GENERAL

39

Estos medios de cultivos son los más usados a nivel general para el

aislamiento de los hongos induciendo esporulación ya sea para el aislamiento

a partir de tejidos enfermos, donde en algunos de ellos se pueden cambiar

algunas de sus características para favorecer o generar las condiciones

óptimas para el desarrollo del microorganismo patógeno hongo en estudio ya

sea modificando el pH o agregando antibióticos.

AGAR AVENA (OMA-OATMEAL AGAR)


Avena 30 g

Agar 15 g


Preparación: Hervir la avena durante 1 hora en un litro de agua, colar gasa agregar el agar, completar el litro de agua, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR EXTRACTO DE MALTA


Extracto de malta 20 g

Agar 15 g


Preparación: Agregar el extracto de malta en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR EXTRACTO DE MALTA – EXTRACTO DE LEVADURA


Extracto de malta 30 g


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Fosfato de potasio (KH2PO4) 0.5 g

Sulfato de potasio penta hidratado (MgSO4.7H2O) 0.5 g

Agar 20.0 g


Preparación: Agregar el extracto de malta, el extracto de levadura, las sales de azufre y fosforo en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR MIEL PEPTONA


Miel 60 g

Bactopeptona 10 g

Agar 25 g


Preparación: Agregar el agar-agar en el agua destilada, agregar la miel y la bactopeptona, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR PAPA – ZANAHORIA (PCA, POTATO CARROT AGAR)


Papa rallada 20 g

Zanahoria rallada 20 g

Agar-Agar 20 g


Preparación: Hervir la papa y la zanahoria rayada en el agua destilada durante 1 hora, colar, agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR PAPA DEXTROSA (PDA, POTATO DEXTROSE AGAR)

Es uno de los medios de mayor uso en los estudios fitopatologicos ya que permite el crecimiento micelial de las mayoría de los microorganismos de diferentes grupos taxonómicos; en algunos casos limita la esporulación de algunos géneros por lo cual es necesario, esperar el crecimiento micelial y

41

luego usar medios que permitan el desarrollo reproductivo del microorganismo en estudio.


Papa 200 g

Dextrosa 20 g

Agar-Agar 20 g


Preparación: Lavar las papas, cortarlas en cubos y hervirlas en agua destilada por 10 a 20 minutos, colar, agregar el agar-agar y completar a 1 litro, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR AGUA (AA)


Agar- Agar 15 g


Preparación: Disolver el agar-agar en el agua, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

AGAR JUGO V8


Jugo V8 200 ml

CaCO3 3 g

Agar 15 g


Preparación: Agregar el jugo V8, el CaCO3, el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.

10. MEDIOS SELECTIVOS

Para unificar los criterios, en esta revisión se ha adoptado la clasificación

propuesta por ALEXOPOULOS y MIMS (1996) la cual, además de ser

42

relativamente reciente presenta algunos grupos que se han mantenido unidos

pese a mostrar diferencias y se han clasificado en otro taxones con base en

criterios más lógicos.

Se mencionaran únicamente los phylums, ya en casos especiales se enfatizará

en mejor detalle los órdenes.

10.1. PHYLUM Oomycetes

Esta phylum se caracteriza por poseer unas estructuras que permiten que sean

identificados a nivel de género, como son el esporangioforo y los esporangios.

También se caracterizan por poseer un micelio filamentoso, sin divisiones,

ramificado, que crece abundantemente sobre el sustrato, produce esporangios

y esporas con flagelos. En gran parte estos hongos presentan especies

acuáticas, los cuales se reportan como parásitos de algas, animales u otras

formas de vida acuática. Otras especies han ido adquiriendo con el tiempo la

habilidad de actuar como parásitos de plantas superiores y usan el viento como

medio para diseminar sus esporas o esporangios. Su reproducción sexual se

genera por heterogametangios; el donador o gametangio masculino se

denomina anteridio, y el que actua como gametangio femenino o receptor se le

denomina oogonio, estos hematangios se fusionan para dar origen a la oospora

o espora sexual. Esta estructuralmente cuenta con una pared gruesa lo cual le

permite sobrevivir en el suelo o en residuos de cosecha durante períodos

críticos. La reproducción asexual es realizada mediante esporangios, los que

germinan mediante la emisión de un tubo germinativo o de forma indirecta en la

que se rompe el esporangio liberando zoosporas, esta germinación está

43

influenciada por temperatura inferiores a 12°C y humedad suficiente en el.

(Alexopoulos, J. 1996.)

GENERO: Pythium sp.

AGAR SEMILLAS DE CAÑAMO


Semillas de cáñamo 100 g

Agar-agar 20 g

Preparación: Hervir hasta ebullición las semillas de cáñamo en 1 litro de agua destilada, filtrar, ajustar el volumen a 1 litro y adicionar el agar; autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Sembrar e incubar por 5-7 días a 21 °C.

AGAR SEMILLAS DE CÁÑAMO–EXTRACTO DE ZANAHORIA


Semillas de cáñamo 20 g

Extracto de zanahoria molida 100 g

Agar-agar 20 g

Preparación: Hervir las semillas de cáñamo en el litro de agua, adicionar el agar y el extracto de zanahoria molida. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR REISHER


Sucrosa 0.1 g

L–asparagina 0.12 g

KH2PO4 30 mg

MgSO4. 7 H2O 20 mg

CaCl2 0,56 mg

MnCl2 2,88 mg

ZnCl2 1,67 mg

FeCl2 0,10 mg

44

EDTA 11,60 mg

Tiamina HCl 0,04 mg

Endomicina 5 mg


Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver en un litro de agua destilada la sucrosa, la asparagina, el EDTA, la tiamina, los antibióticos y las sales. Mezclar bien y hervir, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Ajustar el pH 7.4.

AGAR MRA


KH2PO4 30 mg

MgSO4 .7 H2O 20 mg

MnCl2 2.68 mg

FeCl2 0.1 mg

Sucrosa 410.0 mg

Tiamina HCl 40.0 mg

K2HPO4 30.0 mg

CaCl2 0.56 mg

ZnCl2 1.67 mg

EDTA 11.0 mg

L-asparagina 120 mg

Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver todos los componentes con el agar en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

.

CALDO SCHIMITTHENNER'S.


Sucrosa 2.5 g

45

KH2PO4 150.0 mg

MgSO4.7 H2O 100.0 mg

Tiamina-HCl 2.0 mg

ZnSO4.7H2O 4.4 mg

MnCl2.4H2O 0.07 mg

CaCL2 55.0 mg

FeSO4.7 H2O 1.0 mg

Asparagina 270.0 mg

Colesterol 10.0 mg

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR EXTRACTO DE MALTA–DEXTROSA–PEPTONA


KH2PO4 1 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

Peptona 1 g

Dextrosa 15 g

Extracto de malta 0.5 g

Agar-agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Adicionar la dextrosa, la peptona, el extracto de malta, las sales y el agar en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Phytophthora sp.

MEDIO 3P COMPOSICION CANTIDADES Extracto de Papa 5 g Agar-Agar 10 g Pimaricina 100 ppm Penicilina 50 ppm

46

Polimixina 50 ppm

Agua Destilada 1 L

Preparación: Adicionar el extracto de papa, el agar-agar en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibioticos y servir. (Medina, FAO 2008)

MEDIO PV

COMPOSICION CANTIDADES Extracto de Papa 5 g Agar-Agar 10 g Pimaricina 100 ppm Vancomicina 200 ppm Agua Destilada 1 L

Preparación: Adicionar el extracto de papa, el agar-agar en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibioticos y servir. (Medina, FAO 2008)

MEDIO BNPRA + Hymexazol COMPOSICION CANTIDADES PDA – Agar 1% Benomyl (50%) 10 μg/mL Nistatina (2000 U/mg) 25 μg/mL PCNB 25 μg/mL Rifampicina 10 μg/mL Ampicillin 500 μg/mL Hymexazol 25 ó 50 μg/mL

Preparación: Adicionar el PDA en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibioticos el benomyl y servir. (Medina, FAO 2008)

MEDIOS SELECTIVOS PARA P. cinnamomi COMPOSICION CANTIDADES Extracto de Papa 5 g Agar-Agar 10 g Nistatina 100 U/mL PCNB 100 ppm Estreptomicina 50 ppm Rosa bengala 60 ppm

Agua Destilada 1 L

Otras Concentraciones

Extracto de Papa 5 g

47

Agar-Agar 10 g

Nistatina 50 ppm Vancomicina 100 ppm PCNB 10 ppm

Agua Destilada 1 L

Preparación: Adicionar el PDA en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs. de presión, agregar los antibióticos, el PCNB y servir. (Medina, FAO 2008)

AGAR Mc INTOSH'S


KH2PO4 1 g

CaSO4.7 H2O 1 g

L–treonina 1 g

Sucrosa 20 g

MgSO4. 7 H2O 1.0 g

Tiamina HCl 0.02g

Micostatina 10.0 mg

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la sucrosa, la treonina, las sales y el agar en el agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión. Agregar la tiamina HCl, DL – treonina y micostatina luego servir. La micostatina primero deber ser disuelta en dimetil sulfoxido (DMSO) (10 ug/ml DMSO al 0.5).

AGAR FRIJOL


Semillas de fríjol (Phaseolus vulgaris) 30 g

Agar 20 g

Agua 1 L

Preparación: Tomar las semillas de fríjol colocarlas en el aguas detilada a calentar por 10 a 20 minutos, filtar con gasa y agregar el extracto de las semillas en el litro de agua destilada con el agar, calentar hasta disolver autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR FRIJOL BLANCO

48


Frijol blanco 50.0 g

Glucosa 2.5 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Tomar las semillas de fríjol colocarlas en el aguas detilada a calentar por 10 a 20 minutos, filtar con gasa y agregar el extracto de las semillas en el litro de agua destilada con el agar y la glucosa, calentar hasta disolver autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR GLUCOSA–NITRATO–ESTEROL


Glucosa 5.4 g

NaNO3 1.5 g

MgSO4 x 7H2O 0.5 g

KH2PO4 1.0 g

Tiamina HCl * 2.0 ml

Agar-agar 17.0 g

Esterol 0.8 g

Agua destilada 1 L

* Preparar una solución stock de 1000 ppm.

Preparación: Disolver en el agua destilada la glucosa, la tiamina, las sales, el esterol y el agar–agar, mezclar bien, hervir hasta disolver totalmente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR HENDRIX


Glucosa 5.4 g

KH2PO4 1.0 g

NaNO3 1.5 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

Tiamina HCl 2.0 g

49

Agar-agar 17.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver todos los reactivos en un litro de agua destilada. Mezclar y hervir hasta disolver completamente. Ajustar el pH a 6.0. Autoclavar a 121°C 10 min 15 lbs de presión y servir. Una vez solidificado el agar, colocar 2 ml de una solución de esterol (20 g de esterol en 2 ml de eter) y extender sobre toda la superficie.

AGAR KLEMMER Y LENNY


KH2PO4 680.0 mg

MnCl2.4H2O 0.07 mg

MgSO4.7H2O 250.0 mg

NaMoO4.2H2O 0.05 mg

CuSO4.5H20 0.08 mg

MnCl2.4H2O 0.07 mg

CaCl2 50.0 mg

ZnSO4.7H2O 4.4 mg

FeSO4.7H2O 1.0 mg

Na2HPO4.7H2O 1.34 mg

L-asparagina 708.0 mg

Tiamina HCl 100.0 mg

Glucosa 15.0 mg

Agar 15.0 g

Agua 1 L

Preparación: Mezclar todos los componentes calentando hasta disolverlos en agua autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, y luego adicionar 60 ml de lípidos de aceite de germen de trigo, servir.

AGAR ASPARAGINA-ACIDO CASAMINO-PECTINA


Asparagina 1 g

Acido casamino 2 g

Pectina de manzana 10 g

50

MgSO4.7 H2O 0.25 g


Glucosa 25.0 g

KH2PO4 0.5 g

Tiamina HCl 0.001g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver el extracto de levadura, la glucosa, la asparagina, la tiamina HCl, la caseína, la pectina, las sales y el agar en el agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR FLOWER-HENDRIX´S


NaNO3 2 g

KH2PO4 1 g

MgSO4.H2O 0.5 g

Sucrosa 30 g

Acido galico 425 mg

Quintozene 25 mg

Extracto de levadura 0.5 mg

Tiamina HCl 2.0 mg

Rosa de bengala 0.5 mg

Agar-agar 20 gr

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver todos los reactivos y el agar en agua destilada calentando hasta disolverlos. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir

AGAR GARBANZO


Semillas de garbanzo 250 g

Sucrosa 20 g

Agar 15 g

51

Preparación: Lavar las semillas de garbanzo (Cicer arietinum) en agua potable por una hora, remojarlas en agua destilada de la noche a la mañana. Eliminar el agua y triturar las semillas. Agregar 500 ml de agua y llevar a ebullición por una hora, filtrar a través de una gasa. Separadamente disolver el agar y la sucrosa, y añadirlos al filtrado. Ajustar el volumen a 1 litro. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR HARINA DE MAIZ


Agar harina de maíz 1000 ml

Piramicina 100 ppm

Penicilina G* 50 ppm

Sulfato de polimixina B 50 ppm

*Termo labil

Preparación: Disolver la harina de maíz, en un litro de agua destilada, adicionar el agar, mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión. Disolver los antibióticos en agua destilada estéril y añadir después de autoclavar el medio.

AGAR HENDRIX Y KUHLMAN


NaNO3 2.00 g

FeSO4 0,01 g

KCI 0,50 g

MgSO4.7H2O 0.05 g

KH2PO4 1.00 g

Sucrosa 30.00 g


Rosa de bengala 60.00 mg

PCNB 10.00 mg


Agar 15.00 g

Agua 1 L

Preparación: Disolver la sucrosa, el extracto de levadura, la rosa de bengala, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a

52

121°C 15 min 15 lbs de presión; adicionar el PCNB, la micostatina, y el sulfato de estreptomicina, ajustar el pH a 4.8 con acido láctico al 50%.

10.2. PHYLUM Ascomycetes

Los hongos que pertenecen a este phylum se reproducen por medio de ascas

o sacos, es un grupo muy amplio y heterogéneo más conocido como hongos

superiores. Este phylum incluye especies saprófitas o parásitas y habitan en

ambientes acuáticos y terrestres. Se caracterizan por la producción de 8

esporas de origen sexual llamadas ascosporas. Estas se producen dentro de

sacos llamados ascos los cuales se desarrollan internamente en cuerpos

fructíferos denominados ascocarpos. El micelio está conformado por hifas

ramificadas gruesas septadas. Estos hongos presentan dos tipos de

reproducción: Sexual y asexual o imperfecta. Presenta un ciclo de vida donde

la fase sexual es la más relevante, ya que en esta fase se genera la producción

de ascas y ascosporas. Se muestran también dos gametangios conocidos

como anteridio y ascogonio, los cuales llevan consigo uno o varios núcleos los

cuales se fusionan para formar un cuerpo fructífero. Este cuerpo fructífero está

conformado por pequeños sacos los cuales tienen en su interior las ascosporas

que caracterizan este phylum. Las formas más comunes de los cuerpos

fructíferos son cleistotecio el cual se caracteriza por ser totalmente cerrado,

peritecio con forma de pera y un pequeños orificio en la parte superior, por

ultimo encontramos el apotecio el cual viene abierto en forma de copa.

(Alexopoulos, J. 1996.)

AGAR LEONIAN


Peptona 0.625 g

53

Maltosa 6.25 g


KH2PO4 1.25 g

MgSO4.7 H2O 0.625 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Botryotinia

MEDIO DE CRECIMIENTO Botryotinia fuckeliana


Arveja Verde 160 g

Sacarosa 5 g

Agar-agar 15g

Disolver los componentes en 1 L de Agua Destilada.

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Hilber, Maja, 1998)

GENERO: Chalara (Ceratostomella)

MEDIO DE CRECIMIENTO Thielaviopsis basicola Medio para el crecimiento de Thielaviopsis basicola COMPOSICION CANTIDAD Jugo de Zanahoria 50 ml Agar-agar 18g Agua Destilada 1 L Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar de 22 a 26°C bajo condiciones de oscuridad. (Hoo, Shew, 1997)

GENERO: Cylindrocladium

AGAR GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA

54


Glucosa 15 g

KNO3 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

KH2PO4 1.0 g


Tergitol 1.0 ml

Tiabendazol 1.0 g

Cloranfenicol 100.0 mg

Clorotetraciclina 40.0 mg

Agar-agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: disolver la glucosa, extracto de levadura, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, dejar enfriar (50°C-45°C), y añadir el tergitol, el tiabendazol, el cloranfenicol y la clorotetraciclina (Phytophatology, 66, 1255).

GENERO: Ceratocystis

AGAR MALTOSA–ACIDO CASAMINO

Para cultivar e inducir la esporulación de Ceratocystis fagacearum (anamorfo, Chalara quercina).


Maltosa 5.0 g

Acido casamino 1.0 g

KH2PO4 1.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

FeSO4 0.2 mg

MnSO4 0.2 mg

ZnSO4 0.2 mg

Biotina 0.5 µg

Agua 1 L

55

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR RB-M2


Glucosa 10.0 g


KH2PO4 0.5 g

Peptona 0.5 g

K2HPO4 0.5 g

MgSO4.7 H2O 0.5 g


Quintozene 500.0 mg

Nistatina 30.0 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la peptona, la glucosa, el extracto de levadura, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, luego añadir el sulfato de estreptomicina, el quintozene y la nistatina, ajustar el pH 7.4 y servir.

AGAR DUTCH ELM

Utilizado para el aislamiento de Ceratocystis spp. a partir de material vegetal.


Cicloheximida 200 ppm

Sulfato de estreptomicina 10 ppm

PDA 20 g

Agar-agar 10 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Agregar todos los componentes a excepción de los antibióticos en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre

56

5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibióticos y servir.

GENERO: Diaporthe

MEDIO DE AISLAMIENTO

COMPOSICIÓN CANTIDAD

Malta 1 %

Cloranfenicol 0,1 %

Agar-agar 1,5 %

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. ( Lesage, et.al, 2002).

GENERO: Glomerella

AGAR MODIFICADO MATHURS


Extracto de Levadura 0,1%

Bactopeptona 0,1%

Sucrosa 1%

MgSO4 .7H2O 0,25%

KH2PO4 0,27%

Ampicilina 25 mg

Agar-Agar 2%

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar el hongo en condiciones de oscuridad. (Kim, 2002)

GENERO: Sclerotium

AGAR BROWN´S


Glucosa 2.0 g

G-Asparagina 2.0 g

K2HPO4 1.25g

57

Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0.75g

Agar 20.0 g

Água destilada 1000 ml


GENERO: Nectria

AGAR GLUCOSA–ISOLEUCINA


Glucosa 10 g

L-isoleucina 20 g

KH2PO4 5 g

MgSO4 .7H2O 0.75 g

Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la glucosa, el agar y las sales en un litro de agua destilada. Mezclar bien, ajustar el pH a 5.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Venturia

AGAR INFUSIÓN DE MANZANA


Dextrosa 5 g

Papa 40 g

Tallos de manzana al vapor 450 ml

Agar-agar 17 g


Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada calentando hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar a una temperatura entre 16–26°C por espacio de 10 a 14 días, posteriormente pasar a refrigerar a 8 °C, hasta que los peritecios maduren (generalmente cerca de 3-4 meses).

58

10.3. PHYLUM Deuteromycetes

En este grupo no se presenta la reproducción sexual porque han perdido esta

capacidad con la evolución, porque no se conoce por lo cual se han

denominado hongos imperfectos. Se identifican por poseer micelio septado y

producir esporas asexuales llamadas conidios, que se forman en el extremo

apical o lateral de una célula esporogenica localizada en el conidióforo. Tanto

el conidio como el conidióforo son variables según forma, tamaño, color,

ramificación y en la forma en que se producen por lo cual son claves en la

identificación de este grupo de hongos. (Marchin, 1991)

Los deuteromycetes se clasifican en 4 órdenes:

ORDEN Moniliales

Esta conformado por mas de 7000 especies y son de gran importancia por ser

patógenos y algunos de interés industrial, dentro de las familias más

representativas de este orden se encuentran la Moniliaceae , Demiaceae ,

Tuberculariaceae , Stilbelaceae sp. . (Marchin, 1991)

GENERO: Acroclylindrium

Medio de crecimiento Acrocylindrium


Pectina 5 g

Extracto de Levadura 5 g

NH4NO3 0,2g

KH2PO4 1g

MgSO4.7H2O 0,5g

CaCl2.2H2O 0,01g

59

Agar-Agar 10 g

pH 5.6

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar a 30°C por 72 Horas. (H. Kimura et.al, 1973)

GENERO: Alternaria

AGAR ALPHACEL O CELULOSA


Alphacel O Celulosa 20.0 g

Sulfato de magnesio (MgSO4) 1.0 g

Fosfato de potasio (KH2PO4) 1.5 g

Nitrito de sodio (NaNO3) 1.0 g

Sulfato de hierro pentahidratado (FeSO4.7 H2O) 0.005 g

Leche de coco 50.0 g

Agar-agar 12.0 g



GENERO: Cercospora

AGAR HOJA DE MAIZ


Hojas senescentes de maíz 35.0 g

Carbonato de calcio (CaCO3) 4.0 g

Agar-agar 12 g

Agua Destilada 1 L

Preparación: Cocinar a fuego lento las hojas en 1.5 litros de agua corriente, durante 20 minutos. Filtrar a través de dos capas de gasa; por litro filtrado agregar el carbonato de calcio y el agar, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir (Xue, 2006)

AGAR HOJA DE ZANAHORIA

60

INDREDIENTES CANTIDAD

Hojas de zanahoria 300 g

Agar 12 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Triturar finamente las hojas, mezclar con medio litro de agua destilada, hervir por una hora y filtrar a través de gasa, adicionar el filtrado al otro medio litro agua, junto con el agar disuelto; ajustar volumen a 1 L autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Xue, 2006)

AGAR HOJA DE MANI–HARINA DE AVENA


Hojas de maní 50 g

Harina de avena 15 g

Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Triturar las hojas de maní en 500 ml de agua durante 10 o 15 segundos calentando, filtrar a través de gasa. Hervir la harina de avena en 500 ml de agua por 15 minutos y filtrar a través de gasa. Combinar cantidades iguales de ambos filtrados, para posteriormente añadir el agar, pasar por autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Botrytis

AGAR DIFERENCIACION DE BOTRYTIS


KCI 1,0 g

KH2PO4 1.5 g

NaNO3 3.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

Caseína hidrolizada 5.0 g

Glicerol 5.0 g

L-sorbitol 2.5 g


Agar 20.0 g

61

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la caseína hidrolizada, el extracto de levadura, glicerol, el sorbitol, las sales y el agar en un litro de agua destilada calentando constantemente. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR EAST Y HAMLEY’S X y Y.

Medio X


KH2PO4 1.52 g

MgSO4.7 H2O 0.52 g

NaNO3 6.00 g

KCI 0.52 g

Dextrosa 10.00 g

Peptona 2.00 g


Levadura 0.50 g

Agar 20.00 g

Agua destilada 1 L

Medio Y

KH2PO4 5.00 g

MgSO4.7 H2O 1.00 g

FeCl3.6H2O 0.20 g

KNO3 2.00 g

CaCl2 0.01 g

Dextrosa 20.00 g

Peptona 5.00 g

Agar 30.00 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Preparar cada uno de los medios por separado.

62

Medio X: Disolver en un litro de agua las sales, la dextrosa, la peptona, la caseína hidrolizada, la levadura y el agar-agar; mezclar y hervir hasta disolver completamente, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión.

Medio Y: Disolver en un litro de agua las sales, la dextrosa, la peptona y el agar-agar; mezclar y hervir hasta disolver completamente, pasar por autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión.

AGAR-BOTRYTIS





Sodio 0,01 g

Microelementos * 1.00 ml

Caldo Czapec-Dox 35.0 g

Agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

*Solución de Microelementos:

Fe(NO3).9H2O 723.5 mg

ZnSO4.4H2O 203.0 mg

H3BO3 2.0 mg

H3MoO3 2.0 mg

Sulfato de cobre (CuSO4) 2.0 mg

Agua destilada 1 L

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente agregar por ultimo la solución de micronutirentes, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR EB


Salvado de arroz 20 g

Sucrosa 5 g

Agar-agar 20 g

63

Agua destilada 1 L


GENERO: Cladosporium

AGAR Sabouraud Dextrosa + Glucosa

COMPOSICION CANTIDAD Dextrosa 40 g Glucosa 40 g Peptona de Caseína 5 g Digerido Pancreático de Tejido Animal 5 g Agar Bacteriológico 15 g Preparación: Agregar los componentes al agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C, servir.

GENERO: Cylindrocladium

AGAR GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA


Glucosa 15 g

KNO3 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

KH2PO4 1.0 g


Tergitol 1.0 ml

Tiabendazol 1.0 g

Cloranfenicol 100.0 mg

Clorotetraciclina 40.0 mg

Agar-agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: disolver la glucosa, extracto de levadura, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, dejar enfriar (50°C-45°C), y añadir el tergitol, el tiabendazol, el cloranfenicol y la clorotetraciclina (Phytophatology, 66, 1255).

64

GENERO: Fusarium sp.

AGAR NASH & SYNDER PCNB


Peptona 15 g

KH2PO4 1 g


Quintozene (PCNB) 1 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver todos los componentes y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR VERDE DE MALAQUITA–CAPTAN


NaNO3 20.0 g

MgSO4.7H2O 0.50 g

FeSO4 0,01 g

K2HPO4 1.00 g

KCI 0,5 g

Sucrosa 30,0 g

Agar 20.0 g

Preparación: Disolver los compoenentes en agua destilada autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, dejar enfriar entre 45-50°C y adicionar:

Verde de malaquita 50 mg


Captan 100 mg

Dicristina 75 mg

AGAR JOFFE


65

KH2PO4 1.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

KNO3 1.0 g

KCI 0.5 g

Almidón en polvo 0.2 g

Sucrosa 0.2 g

Glucosa 0.2 g

Agar 15.0 g

Agua 1 L

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada calentando hasta disolverlos completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y luego servir.

AGAR AZIDE-ROSE BENGALA


Caldo TS 30 g

K2HPO4 1.5 g

NaN3 25 mg

Rosa de bengala 30 mg

Quintozene 100 mg


Clorotetraciclina HCl 100 mg

Neomicina 100 mg

Agar-agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver el caldo TS, rosa de bengala, las sales y el agar en el agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión. Ajustar el pH a 6, dejar enfriar y adicionar: el quintozene, el sulfato de estreptomicina, la clorotetracilina HCl y la neomicina.

AGAR NITRATO-GALACTOSA


66

NaNO3 2 g

KH2PO4 1 g

MgSO4.7 H2O 0.5 g K2S2O5 0.3 g

Galactosa 10 g

Agar-agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la galactosa, sales y agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR ACIDO CASAMINO


Glucosa 15.0 g


Acido casamino 1.5 g

KH2PO4 1.5 g

MgSO4.7 H2O 1.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la glucosa, el extracto de levadura, la, las sales y el agar en el agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR CLAVEL-DEXTROSA


Tejidos de clavel 200 g

Dextrosa 20 g

Agar 20 g

Preparación: Preparar un extracto de tejido de clavel cortado en agua caliente, llevar el volumen a 1 litro, agregar la dextrosa o glucosa y el agar. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Ajustar el pH 7.4 ± 0.2.

AGAR KOMADA


67

K2HPO4 1.0 g

KCL 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

F3Na EDTA 0.01g

L-asparagina 2.0 g

D-galactosa 20.0 g

Agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Diluir los COMPOSICION en agua, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y dejar enfriar entre 45 y 50 °C. Añadir los siguientes COMPOSICION:

PCNB (75%) 1 g

Bilis de bovino (Oxgall) 0.5 g

Na2B4O7.10H2O 1.0 g

Sulfato de estreptomicina 0.3 g

Ajustar el pH a 3,8 con una solución de ácido fosfórico al 10%.

GENERO: Helminthosporium sp. (Dreschlera)

AGAR LACTOSA – CASEINA HIDROLIZADA

Medio empleado para inducir la esporulación en Helminthosporium spp.


Lactosa 37.5 g


MgSO4.7H2O 0.5 g

Microelementos* 2.0 ml

Agar-agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

* Solución común

68


ZnSO4.7H2O 439.8 mg

Fe(NO3).9H2O 723.5 mg

MnSO4 x 4H2O 203.0 mg

Preparación: Antes de añadir los microelementos ajustar el pH a 6.0. Disolver cada una de las sales en forma individual en el agua, agregar la lactosa, la caseína hidrolizada, 2 ml de la solución de microelementos y finalmente el agar-agar. Autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión. Para que la solución se aclare, agregar H2SO4, gota por gota, mientras se disuelve la solución.

CALDO LUKENS–SISLER

Para inducir la esporulación de Helminthosporium vagans y Alternaria solani.


Glucosa 20.0 g

Sulfato de amonio 3.0 g

Sulfato de Magnesio 0.25 g

Fosfato monobásico de potasio 3.0 g

Glicina 1.0 g

Biotina 1.0 mg

Piridoxin 10.0 mg

Acido fólico 10.0 mg

Boro 0.01 ppm

Mn 0.01 ppm

Zn 0.07 ppm

Cu 0.001 ppm

Mo 0.001 ppm

Fe 0.05 ppm

Agua destilada 1 L


69

GENERO: Phialophora

MEDIO EXTRACTO DE FRIJOL VERDE


Vainas de Frijol 35 g

Agar- Agar 20 g

Ampicilina 50 mg

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. La incubación se debe realizar de 21 a 25°C en condiciones de oscuridad. (Adee, et.al, 1997)

MEDIO MENGISTU PGM


Frijol Verde 129 g

Bacto-Agar 20 g

CuSO4 0,8 g

Pentacloronitrobenceno 10 mg

Preparación: Disolver el frijol verde y el bacto agar en 1 L de Agua destilada, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, luego de atuoclavado agregar el sulfato de cobre y el pentacloronitrobenceno, ajustar pH a 5,5 con ácido láctico. (Mengistu, et.al, 1991)

MEDIO SM


Glucosa 5 g

Peptona 5 g

NaH2PO4 1 g

MgSO4 0,5 g

PCNB 0,5 g

Na2B4O7·10H2O 0,5 g

Estreptomicina 0,2 g

Tetraciclina 0,5 g

70

Agar- Agar 20 g

Preparación: Disolver los componentes en 1 L de agua autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión a excepción de los antibióticos y el PCNB los cuales se deben agregar después del autoclavado. ( Harrington, et.al 2003)

GENERO: Stemphyllium sp.

AGAR FITONA–DEXTROSA


Fitona (BBL) 15.0 g


Dextrosa 15.0 g

Agar-agar 17.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver los compuestos y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, hervir, esterilizar en autoclave a a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Hernandez, 2006)

ORDEN Melanconiales

La producción de conidios en acervulo es característico de este orden, el cual

consiste en una estructura en forma de cojinete ubicada bajo la epidermis o la

cutícula de la planta hospedera, el cual se fragmenta cuando los conidios

maduran y así diseminarse. (Marchin, 1991)

GENERO: Colletotrichum

AGAR NEOPEPTONA–GLUCOSA


Glucosa 2.80 g

Neopeptona 2.00 g

KH2PO4 2.72 g

71

MgSO4.7H2O 1.23 g

Agar 20.00 g

Agua 1 L

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, La glucosa puede ser reemplazada por galactosa, sucrosa o xilosa, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Sugar, 2006)

AGAR ALFALFA


Hojas de alfalfa 150.0 g

Dextrosa 10.0 g

Agar-agar 12.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Hervir las hojas de alfalfa, colar, agregar los demás componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Moral, 2009)

AGAR EXTRACTO CASCARAS DE MANI


Cascaras de maní 180 g

Agar 20 g

Agua 1 L

Preparación: Calentar las cascaras de maní por 10 minutos en 1700 ml de agua potable, filtrar a través de una gasa, llevar el volumen a un litro de agua, agregar el agar, mezclar y hervir, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR FRIJOL VERDE


Frijol verde 400 g

Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver los frijoles en 500 ml de agua destilada, cocinar hasta obtener un extracto, filtrar en varias capas de gasa; obtener el filtrado y agregar

72

el agar, llevar el volumen a un litro con agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Moral, 2009)

AGAR JUGO DE ZANAHORIA


Jugo de zanahoria 125-750 ml

Estreptomicina o penicilina 100 mg

Agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver en el jugo de zanahoria y el Agar-agar en el litro de agua. Ajustar el pH entre 5.1 ± 5.5. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar la penicilina disolverla y servir

AGAR GLUCOSA–PEPTONA


Glucosa 10.0 g

Bacto peptona 2.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

KH2PO4 0.5 g

Agar 15.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la glucosa, la peptona bacteriológica, las sales y el agar en el agua destilada, mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

ORDEN Sphaeropsidales

Los conidios en el órden Sphaeropsidales son producidos en picnidios, que son

cuerpos semicerrados de forma variada, generalmente esférica o piriforme, con

un ostiolo en la parate superior. Los conidiofóros son muy cortos y cubren la

pared interna del picnidio, produciendo los conidios en el ápice. (Marchin, 1991)

GENERO: Ascochyta

73

Medio para Crecimiento de Ascochyta lentis


Harina de Lenteja 2 g

Dextrosa 2g

Agar-Agar 2g

Agua Destilada 1L

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar a 30°C por 72 Horas.

MEDIO PARA CRECIMIENTO DE Ascochyta fabae


Harina de frijol 2 g

Dextrosa 2g

Agar-Agar 2g

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Botryodiplodia MEDIO PARA ESPORULACION DE Botryodiplodia theobromae

Medio para la esporulación de Botryodiplodia theobromae


Glucosa 55,5 mM

KNO3 9,8 mM

MgSO4.7H2O 2,03 mM

NaCl 1,7mM

KH2PO4 3,7mM

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Knight, et.al 1976)

MEDIO PARA ESPORULACION DE Botryodiplodia theobromae

74

Medio para la esporulación de Botryodiplodia theobromae


Sucrosa 20 g/l

K2HPO4 1g/l

NaNO3 3g/l

MgSO4.7H2O 0,5 g/l

Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Ekundayo, 1973)

GENERO: Cytospora

MEDIO SINTETICO

COMPOSICION CANTIDADES

Dextrosa 10 g

L-asparagine, 2 g

KH2PO4 1g

MgSO4.7H20 0.5 g

FeCl3 0.2 mg

ZnSO4 0.2mg

Mn2+ 0.1 mg

Biotina 5 µg

Tiamina 100 µg

Agar 20 g

Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 20 min 10 lbs de presión y servir.( Helton, Konicek, 1962)

GENERO: Phoma

AGAR Phoma betae


K2HPO4 4 g

KH2PO4 1.5 g

Extracto de suelo 25 ml

75

Sucrosa 10 g

Acido bórico 100 mg


Clorotetraciclina 100 mg

Benomyl 100 mg

Agar-agar 20 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver el extracto de suelo, la sucrosa, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, ajustar el pH usando HCl a 6,5 y esterilizar en autoclave. Añadir después de enfriar el acido bórico, la estreptomicicna, la clorotetraciclina y el benomyl (Phytophatology 64, 706).

GENERO: Pyrenochaeta

AGAR VERDE DE MALAQUITA–CAPTAN


NaNO3 20.0 g

MgSO4.7H2O 0.50 g

FeSO4 0,01 g

K2HPO4 1.00 g

KCI 0,5 g

Sucrosa 30,0 g

Agar 20.0 g

Pasar por autoclave, dejar enfriar entre 45-50°C y adicionar:

Verde de malaquita 50 mg


Penicilina G 5 mg

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada calentando hasta disolverlos a excepción del verde malaquita y los antibióticos, autoclavar esterilizar en autoclave a 121°C 15lbs de presión por 15 minutos agrgar los demás componentes, disolver y servir. (Plant Dis. Rep. 49:114; Phytopathology 56:908).

76

GENERO: Septoria

AGAR ESN


Sucrosa 20 g

MgSO4.7 H2O 0.5 g

Zn 0.2 mg

Mn 0.1 mg

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L


GENERO: Sordaria

AGAR EXTRACTO DE LEVADURA–PAPEL DE FILTRO



Agar-agar 24 g

Papel de filtro 12 g

Agua 1 L

Preparación: Disolver el papel de filtro en agua potable, el extracto de levadura y el agar-agar. Mezclar y hervir hasta disolver completamente los componentes, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

GENERO: Stigmina

AGAR MELOCOTÓN


Melocotón 200 g

Agar 40 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Homogenizar el melocotón (Prunus persica), adicionar el agua destilada, el agar-agar, mezclar bien y esterilizar en autoclave a 121°C 15lbs de presión por 15 minutos y servir.

77

GENERO: Verticillium

AGAR ALCOHOL


Etanol Absoluto 0,5 ml

Estreptomicina 100 ppm

Agar-agar 7.5 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Autoclavar a 15 lbs de presión, 15 minutos a 121°C el agua destilada con el agar- agar disuelto, después de autoclavar a una temperatura de 40°C agregar 0.5 ml de etanol absoluto y la estreptomicina, servir. Ajustar el pH 7.4.

AGAR GLUCOSA–SAL MINERAL


Glucosa 60.0 g

KH2PO4 1.0 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

MnSO4.H2O 0,5 mg

Na2MoO4.2H2O 10.0 µg

KNO3 2.00 g

K2HPO4 0.90 g

ZnSO4.7H2O 0.5 g

CuSO4.5H2O 0.16 g

Agar-agar 20.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Disolver la glucosa, las sales y el agar en el agua destilada, mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min y 15 Lbs de presión y servir (Can. J. Bot. 50:2097).

ORDEN Agonomycetales

Este orden se caracteriza por la no producción de conidios, se consideran

“mycelia steril”, su reproducción se da por fragmentación de las hifas. Los

géneros de este orden más conocidos son Rhizoctonia sp. y Sclerotium sp., los

78

cuales tienen amplia distribución. Rhizoctonia sp. es comúnmente encontrado

en el suelo, causando el mal de semilleros (damping off) y pudrición radical de

varias plantas hospederas. Rhizoctonia solani es el estado imperfecto de

Thanatephorus cucumeris, Scierotium cepivorum causa la pudrición blanda de

la cebolla y el ajo. Sclerotium rolfsii es un polífago y destructivo parásito de

muchas especies de plantas. (Marchin, 1991)

GENERO: Rhizoctonia

AGAR RHIZOCTONIA


K2HPO4 1 g

KCl 0.5 g

NaNO2 0.2 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

FeSO4 .7H2O 10 mg

Fenaminoulf 90 mg

Cloranfenicol 50 mg


Acido gálico 0.4 g

Agua destilada 1 L

Agar-agar 20 g

Preparación: Disolver las sales y el acido gálico y el agar en el litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a a 121°C 15 min 15 lbs de presión, dejar enfriar y añadir el fenaminoulf, el cloranfenicol y la estreptomicina.

AGAR EXTRACTO DE SUELO DE FLENTZE


Sucrosa 1.0 g

KH2PO4 0.2 g

79

Levadura 0.1 g

Suelo 1 lb

Agar-agar 25.0 g

Agua destilada 1 L

Preparación: Mezclar el suelo con un litro de agua potable y mantenerla en agitación por uno o dos días; filtrar a través de varias capas de gasa y llevar el volumen a un litro de agua. Agregar la sucrosa, la levadura, el KH2PO4 y el agar–agar. Mezclar y hervir hasta disolver completamente, pasar por autoclave a a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.

AGAR LUTZ



Nitrato de amonio 1.0 g

Fosfato de amonio 1.0 g

Sulfato de magnesio 0.5 g

Sulfato férrico 0.1 g

Sulfato de manganeso 0.025 g

Agar-Agar 25.0 g

Agua 1 L


11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

Mediante la descripción de los componentes de los medios de cultivo y

de los procedimientos que se siguen para su elaboración, se reducen las

posibilidades de obtener resultados no deseados, contaminaciones y se

logra confiabilidad en el aislamiento de los hongos patógenos.

80

• Las revisiones de los medios encontrados en las referencia

internacionales, junto con las escasas existentes en el país permiten

compilar en un solo documento, las diferentes posibilidades de

aislamientos de microorganismos de acción patogénica sobre especies

vegetales.

• La recopilación de medios de cultivo que se presentan en este trabajo

hacen referencia a los hongos que con mayor frecuencia se encuentran

en las especies vegetales cultivadas en el país.

• La mayoría de los medios de cultivo recopilados se obtuvo de

informacion extraída de manuales no actualizados; en el país no existe

un texto en que se encuentre la información actualizada.

• Gran parte de los medios de cultivo recopilados hacen referencia al

aislamiento de deuteromicetos, grupo de microorganismos que tienen

mayor relevancia bajo las condiciones de la zona tropical.; sin embargo

no es lo suficiente para la cantidad de hongos que se reporten en el

país, sobre especies vegetales cultivadas.

• En la mayoria de los medios clasificados como especificos, las fuentes

de carbono son sucrosa y celulosa y las fuentes de nitrógeno son las

sales de amonio y nitratos.

RECOMENDACIONES

Elaborar un manual realizando revisiones de los medios de cultivo que

actualmente existen en la literatura internacional y consultando fuentes

81

provenientes de trabajos de investigación provenientes de universidades

y Centros de Investigación en Colombia

Continuar con consultando nuevos medios de cultivos que reemplazan,

cuando sea del caso, los medios antiguos por nuevos sustratos.

Matener actualizada la información que se recopile, mediante revisiones

permanentes sobre los trabajos de investigación que se realicen en el

país. En próximos trabajos incluir medios de cultivo especificos para el

aislamiento de basidiomicetos que atacan especies de ciclo largo y

forestales.

12. BIBLIOGRAFIA

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13. ANEXOS

LISTA DE HONGOS DE IMPORTANCIA EN COLOMBIA

1. Acrocylindrium

2. Alternaria

3. Armillaria

4. Armillariella

5. Ascochyta

6. Asperisporium

7. Athelia

8. Bipolaris (Helminthosporium, Dreshlera)

9. Botryodiplodia

10. Botryosphaeria

11. Botryotinia

12. Botrytis

13. Ceratocystis

14. Ceratostomella (Thielaviopsis)

15. Cercospora

16. Chalara (Ceratostomela)

17. Cladosporium

18. Colletotrichum

19. Coniothyrium

20. Corticium

21. Corynespora

22. Coryneum

23. Crinipellis

24. Cytospora

25. Dematophora

26. Diapleella

27. Diaporthe

http://www.slideshare.net/jloveuas/manual-micologia

85

28. Didymella (Mycosphaerella)

29. Diothiorella

30. Diplodia

31. Diplotheca

32. Drechslera (Helminthosporium)

33. Elsinoe

34. Endothia

35. Entosmosporium

36. Fusarium

37. Fusicladium

38. Ganoderma

39. Geotrichum

40. Gibberella

41. Gloeosporium (Colletotrichum)

42. Glomerella

43. Helminthosporium (Dresclalera, Bipolaris)

44. Heterosporium (Cladosporium)

45. Irene

46. Isariopsis

47. Leptosphaeria

48. Leptosphaerulina

49. Macrophoma

50. Macrophomina

51. Magnaporthe

52. Marasmius

53. Microcyclus

54. Microdochium

55. Monilia

56. Monilinia

57. Moniliophthora

58. Mycena

59. Nectria

60. Paracercospora

61. Paraphaeosphaeria

62. Pellicularia (Thanetephorus-Corticium)

63. Phaeoisariopsis

64. Phialophora

65. Phoma

66. Phomopsis

67. Phyllachora

68. Phyllosticta (Phoma)

69. Phytophthora

70. Pseudocercospora (Cercospora)

71. Pythium

72. Ramularia

73. Rhizoctonia

74. Rosellinia

75. Sordaria

86

76. Sclerotinia

77. Sclerotium

78. Sphaceloma

79. Sphaeropsis

80. Spilocaea (Fusicladium)

81. Stevensea

82. Thielaviopsis (Ceratocystis)

83. Venturia (Ramularia-Fusicladium)

revision preliminar de medios de cultivo empleados en

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