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4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.- CARACTERIZACIÓN IN VIVO DE LAS POSIBLES DIFERENCIAS
ENTRE LAS RATAS SDU Y W EN LOS EFECTOS FARMACOLÓGICOS
DE MORFINA.
Un aspecto relevante para la utilización clínica de analgésicos opioides, es el
optimizar sus efectos analgésicos, minimizando sus efectos no deseados. Para
abordar este punto, se estudiaron las diferencias, en cuanto al efecto de morfina,
sobre los distintos tipos de nocicepción, entre ratas de las cepas SDU y W, y las
diferencias entre las mismas en cuanto al desarrollo de tolerancia, dependencia física
y adicción a este opioide.
4.1.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO.
Los métodos nociceptivos que se han utilizado para el estudio del dolor son
numerosos, presentando cada uno de ellos sus ventajas y desventajas
correspondientes. Estos tests podrían clasificarse en función de distintos parámetros,
como: duración y/o naturaleza del estimulo nociceptivo, tipo de dolor que evalúan,
tipo de respuesta que se considera como señal de dolor, etc., (Le Bars y cols, 2001).
En la evaluación del efecto antinociceptivo de un fármaco concreto, se ha de
considerar que se han descrito diferencias genéticas en la sensibilidad a opioides
dependientes del test nociceptivo utilizado, y se ha sugerido que se deben a los
diferentes procesos implicados en cada uno de ellos (Mogil y cols., 1996). Así, por
ejemplo, la supresión de un receptor opioide puede producir alteraciones en la
respuesta antinociceptiva determinada por un test, sin modificar la respuesta
analizada con otro test diferente (Martin y cols., 2003b). Por este motivo se estudió el
efecto antinociceptivo de morfina con distintos tests nociceptivos, intentando centrar
la búsqueda de la/s causa/s de las diferencias entre estas dos cepas de ratas.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.1.1.- TEST DE TAIL FLICK.
Mediante este test de respuesta predominantemente espinal se ha analizado la
respuesta nociceptiva de retirada de la cola tras aplicar un estímulo térmico en
condiciones basales y tras dosis crecientes de morfina, con el fin de obtener curvas
dosis-efecto antinociceptivo, en ambas cepas de ratas.
En el presente estudio se analizaron los valores de latencia basal, con la
finalidad de determinar posibles diferencias entre cepas en la sensibilidad
nociceptiva en este test. Los valores de latencia basal en ambas cepas no presentaron
diferencias estadísticamente significativas (SDU: 3.9±0.1 s, n = 51 y W: 3.8±0.1 s, n
= 68; p>0.05). Por consiguiente, este resultado no parece apuntar a la existencia de
diferencias entre las cepas SDU y W en los mecanismos moduladores de la
nocicepción basal en este test.
Se realizaron curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina en ambas cepas
de ratas y se observó que las curvas obtenidas son distintas (figura 10). Además, los
valores estimados de DE50 fueron significativamente menores en SDU que en W
(DE50=0.75±0.04 mg/Kg en SDU y 1.45±0.06 mg/Kg en W; p<0.001). Por otra parte,
los valores de %MEP obtenidos con 0.6, 0.85 y 1.2 mg/Kg de morfina fueron
significativamente superiores en la cepa SDU que en la cepa W (SDU vs W:
45.3±13.8 vs 4.8±2.2, 61.4±9.1 vs 19.8±6.5 y 76.4±5.1 vs 38.5±14.9%,
respectivamente, p<0.01 en todos los casos). La dosis de morfina requerida para
obtener el 100% de %MEP fue 3.4 mg/Kg en SDU y 9.6 mg/Kg en W. Todo ello
indica una mayor potencia de morfina en las ratas de la cepa SDU con respecto a las
W.
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0.1 1 100
20
40
60
80
100SDUW**
****
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 10. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-16 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(10, 157)=44.87 p<0.001Cepa F(1, 157)=24.09 p<0.001
Dosis-Cepa F(10, 157)=2.66 p<0.01
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Esta diferencia entre ratas de las cepas SDU y W en la potencia
antinociceptiva de morfina, sin diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en el
test de TF ya había sido descrita previamente (Más y cols., 2000). En dicho trabajo
se descartó que la farmacocinética de morfina explicara las diferencias descritas.
Otros grupos han identificado diferencias entre cepas de roedores en la sensibilidad
al efecto antinociceptivo de agonistas µ, evaluado en el test de TF, con y sin
diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en este test (Morgan y cols., 1999;
Kest y cols., 2002).
Un aspecto a tener en cuenta en la realización de estos tests es la importancia
de la intensidad del estímulo nociceptivo, así como la eficacia del agonista utilizado,
puesto que éstas son más notables al utilizar estímulos dolorosos de elevada
intensidad y agonistas opioides µ de baja eficacia (Morgan et al., 1999). En este
estudio utilizamos un agonista con elevada eficacia, siendo el estimulo nociceptivo
utilizado en el test térmico (TF) de elevada intensidad. A pesar de ello observamos
estas diferencias, por lo que es de esperar que si se utilizaran fármacos con menor
eficacia las diferencias podrían ser más acusadas.
4.1.1.2.- TEST DE HOT PLATE.
Mediante este test, de respuesta predominantemente supraespinal, se ha
analizado la respuesta nociceptiva basal y tras distintas dosis de morfina, con el fin
de obtener curvas dosis-efecto en ambas cepas de ratas.
En este trabajo, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a los
valores de latencia basal entre ambas cepas (SDU: 7.2±0.3 s, n = 28 y W: 7.9±0.3 s,
n = 29; p>0.05). Por ello, se puede descartar la existencia de diferencias en los
mecanismos moduladores de la nocicepción entre ambas cepas de ratas, al menos en
las condiciones experimentales utilizadas.
Se realizaron curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina en cada cepa, y
se observó que las curvas obtenidas son distintas (figura 11). Los valores estimados
de DE50 fueron significativamente menores en SDU que en W (DE50=5.80±0.30 mg/
Kg en SDU y 8.61±0.59 mg/Kg en W; p=0.01). Además, los valores de %MEP
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
obtenidos con 9.6mg/Kg de morfina fueron significativamente mayores en la cepa
SDU que en la cepa W (SDU vs W: 88.9±6.1 vs 43.8±13.5; p<0.01).
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1 100
20
40
60
80
100SDUW
**
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 11. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test HP. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=6-15 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(6, 114)=24.57 p<0.001Cepa F(1, 114)=8.43 P<0.01
Dosis-Cepa F(6, 114)=1.25 n.s.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina, así como los valores de
DE50 son diferentes entre las dos cepas de ratas en estudio, estando dentro del rango
descrito por otros autores para rata (Gilbert y Franklin, 2002; Stoffel y cols., 2003).
De manera similar al presente estudio, otros grupos han identificado diferencias entre
cepas en la sensibilidad al efecto antinociceptivo de agonistas µ en el test de HP,
asociadas o no a diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en este test (Plesan y
cols., 1999; Bulka y cols., 2004).
Los analgésicos opioides ejercen acciones a distintos niveles. En concreto, el
efecto antinociceptivo de estos fármacos puede ejercerse a nivel supraespinal,
espinal, e incluso periférico (ver Yaksh, 1997). En este sentido, las estrategias para
determinar el nivel donde se originan determinadas acciones opioides han sido
varias: administraciones localizadas (i.t. y i.c.v.), y/o utilización de tests de respuesta
predominantemente espinal (TF) o supraespinal (HP) (Ossipov y cols., 1995;
Langerman y cols., 1995; Mogil y cols., 2000). En el presente estudio, los fármacos
se administraron vía sistémica. Por consiguiente, cabe suponer que podrían estar
actuando en todos los niveles donde se ha descrito la existencia de receptores
opioides, tanto a nivel periférico como central (Stein, 1993; Yaksh, 1997). Por ello,
es difícil discernir entre posibles localizaciones de los mecanismos implicados en
estas diferencias, si bien el hecho de que las diferencias entre cepas aparezcan tanto
en un test de respuesta principalmente espinal (TF) como en un test de respuesta
predominantemente supraespinal (HP), podría sugerir la implicación de ambos sitios.
4.1.1.3.- TEST DE LA FORMALINA.
Mediante este test nociceptivo de estímulo químico, en ambas cepas de ratas
se ha analizado la respuesta nociceptiva a diferentes concentraciones de formalina, y
el efecto de distintas dosis de morfina sobre la nocicepción.
La solución de formalina al 1.5% indujo una respuesta similar en ambas
cepas, tanto en la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras la inyección
de formalina; tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada: 296±61 y 346±20 s,
en SDU y W respectivamente, p>0.05) como en la segunda (10-60 min tras la
inyección de formalina; 2160±331 y 2681±59 s, en SDU y W respectivamente,
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
p>0.05). Sin embargo, al utilizar formalina a una concentración de 2.5%, apareció
una respuesta nociceptiva significativamente menor en las ratas de la cepa SDU que
en las de la cepa W, tanto en la primera (257±18 y 452±40 s, respectivamente,
p<0.01) como en la segunda fase (2369±129 y 2722±51 s, respectivamente, p<0.05)
(ver fig 12).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A
Formalina 1.5% Formalina 2.5%0
100
200
300
400
500
SDU
W **
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
B
Formalina 1.5% Formalina 2.5%0
1000
2000
3000 *
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
Figura 12. Efecto nociceptivo en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Las barras representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas para los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada se analizaron con el test de la t de Student: * p<0.05, ** p<0.01. n=6 animales por grupo.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por lo tanto, aunque el efecto nociceptivo inducido por las dos
concentraciones de formalina utilizadas en este estudio fue de similar cuantía al
descrito para rata por otros autores (Abbott y cols., 1995), se observaron diferencias
entre ambas cepas al utilizar la concentración más elevada de formalina. Otros
autores han descrito la existencia de diferencias en la respuesta nociceptiva en el test
de la formalina entre distintas cepas de roedores (Abbott y cols., 1995; Wilson y
cols., 2002). Una posible explicación al hecho de que las diferencias entre cepas en la
respuesta nociceptiva a la inyección de formalina se observen sólo a concentraciones
del 2.5%, y no a concentraciones inferiores, es que la variabilidad en la respuesta
comportamental a la inyección de formalina aumenta al disminuir la concentración
de ésta, y así, al utilizar medidas de nocicepción compuestas (como en el presente
estudio), el poder estadístico para detectar diferencias crece al aumentar la
concentración de formalina (Guy y Abbott, 1992; Franklin y Abbott, 1993; Abbott y
cols., 1995).
En el presente estudio aparecen diferencias entre ambas cepas de ratas en la
sensibilidad nociceptiva basal en un test donde el estímulo nociceptivo es de tipo
químico (test de la formalina), sin que se detecten diferencias en la sensibilidad basal
a los estímulos nociceptivos de tipo térmico (TF y HP). Este hecho podría explicarse
por los hallazgos descritos por Mogil y cols. (1999b), donde se describe la existencia
de tres “tipos” de nocicepción, independientes entre sí desde el punto de vista de la
herencia genética: nocicepción basal a estímulos térmicos, respuesta espontánea a
estímulos nocivos de tipo químico, y nocicepción basal a estímulos mecánicos e
hipersensibilidad cutánea.
Los mecanismos responsables de la diferente sensibilidad a estímulos
químicos no están clarificados, aunque se ha abordado su estudio desde diferentes
aproximaciones. Mediante abordajes genéticos, se han identificado dos locus en los
cromosomas 9 y 10 del ratón, que podrían estar relacionados con la sensibilidad a los
mismos. El primero de ellos parece estar implicado en la respuesta durante la primera
fase del test de la formalina, y por su situación podría tratarse de genes que codifican
la subunidad α2 de la proteina G, el receptor 5-HT-1B, la colecistocinina, los canales
de sodio SNS/PN3 y SNS/NaN, y una proteína que controla el clustering de los
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
mastocitos. El segundo, que parece estar involucrado en la respuesta durante ambas
fases del test de la formalina, podría tratarse de genes que codifican el interferón-γ y
el insulin-like growth factor (Wilson y cols., 2002).
Por otro lado, distintos estudios también han implicado al sistema opioide
endógeno como modulador de la respuesta nociceptiva en el test de la formalina,
aunque con resultados controvertidos. Así, los ratones knockout de proencefalina
presentan una menor nocicepción en la primera fase del test, y los knockout de
prodinorfina, sin presentar diferencias en la primera fase, en la segunda fase se
comportan como hiperalgésicos (König y cols., 1996; Wang y cols., 2001). Otros
estudios, realizados en ratones knockout de los distintos tipos de receptores opioides,
han relacionado al receptor µ con el tono inhibitorio de la nocicepción en las fases
aguda y tónica, así como al δ en la fase tónica (Martin y cols., 2003b; Zhao y cols.,
2003). Por otro lado, estudios farmacológicos combinados con la utilización de
anticuerpos específicos de los distintos ligandos endógenos, sugieren que en el tono
inhibitorio de la nocicepción por formalina estarían implicados la leuencefalina y la
dinorfina a través de receptores δ y κ, así como receptores µ y δ1 espinales, y la β-
endorfina a través de receptores ε y µ supraespinales (Ossipov y cols., 1996; Wu y
cols., 2002). Por consiguiente, resulta complicado discernir el fenómeno implicado
en la diferente sensibilidad a estímulos químicos entre estas cepas.
Un aspecto a tener en cuenta es que en muchos de estos trabajos se realiza
una valoración del total de respuesta nociceptiva en cada una de las dos fases,
impidiendo sacar conclusiones sobre la evolución temporal de la nocicepción, así
como del periodo comprendido entre ambas fases, denominado interfase (König y
cols., 1996; Ossipov y cols., 1996; Wang y cols., 2001; Wilson y cols., 2002). Por lo
tanto, se decidió realizar el estudio temporal de dicha respuesta nociceptiva.
Al analizar las curvas temporales del efecto nociceptivo de formalina al 2.5%
se observó que las curvas son distintas en ambas cepas (figura 13). Al comparar los
valores de respuesta nociceptiva a diferentes tiempos tras la inyección de 2.5% de
formalina se comprobó que eran significativamente menores en SDU que en W a los
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10, 15 y 20 minutos (SDU vs W: 44±24 vs 186±42; p<0.001, 102±51 vs 206±31;
p<0.05 y 104±48 vs 257±18 s; p<0.001, respectivamente).
0 10 20 30 40 50 60 700
100
200
300
400 SDUW
***
***
*
tiempo tras formalina (min)
tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
Figura 13. Evolución temporal del efecto nociceptivo de la inyección de formalina al 2.5%. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: * p<0.05, *** p<0.001 SDU vs W. n=6 animales por grupo.
Factor F (g.l. factor, residual) Valor pTiempo F(11, 120)=15.02 p<0.001
Cepa F(1, 120)=25.70 p<0.001Tiempo-Cepa F(1, 120)=3.70 p<0.001
100
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El curso temporal de respuesta nociceptiva observada tras la inyección de
formalina, tanto al 1.5% como al 2.5%, fue similar a la respuesta típica ampliamente
descrita en la literatura. Tras la aparición brusca de la respuesta nociceptiva (fase
aguda) se produjo una disminución de la respuesta (interfase), para posteriormente
aumentar y mantenerse elevada de manera prolongada (fase tónica) (Abbott y cols.,
1995). En el presente trabajo, se aprecia que los animales de la cepa SDU
presentaron una interfase más acusada y prolongada que los de la cepa W. Se ha
sugerido recientemente que el periodo entre ambas fases corresponde a una
inhibición activa del dolor que no precisa de centros supraespinales, y que el estrés
disminuye la nocicepción en el test de la formalina al prolongar la interfase, aunque
sin disminuir ninguno de los dos picos de respuesta nociceptiva (Abbott y cols.,
1995; Henry y cols., 1999). Por ello, estos resultados apuntan a que los animales de
la cepa SDU presentan un mayor tono inhibitorio de la nocicepción que los de la
cepa W durante la interfase, lo que podría ser debido a un mayor efecto del estrés.
Para la evaluación del efecto antinociceptivo de morfina se utilizó formalina a
una concentración del 1.5%, debido a las diferencias intercepa en la nocicepción
inducida por formalina al 2.5%. De esta manera partimos de una nocicepción basal
semejante en ambas cepas de ratas, que permite la valoración de posibles diferencias,
entre ellas, en el efecto antinociceptivo de este analgésico opioide. Al analizar las
curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina realizadas en animales de ambas
cepas no se encontraron diferencias en la primera fase de respuesta nociceptiva,
mientras que en la segunda fase de respuesta aparecieron diferencias significativas
entre cepas en dichas curvas (figura 14), siendo los valores de DE50 estimados
significativamente menores en SDU que en W (DE50=1.25±0.34 mg/Kg en SDU y
3.15±0.48 mg/Kg en W; p<0.05). Además, los valores de respuesta nociceptiva tras
administrar morfina a dosis de 1.2 y 2.5mg/Kg, fueron significativamente inferiores
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
en la cepa SDU que en la cepa W (SDU vs W: 1029±416 vs 2094±199 s y 856±132
vs 1900±133 s, respectivamente; p<0.01 en ambos casos).
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A
00
100
200
300
400 SDUW
1 10Dosis de morfina (mg/Kg)
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
B
Factor F (g.l. factor, residual) Valor
pDosis F(3, 39)=2.96 p<0.05Cepa F(1, 39)=1.52 n.s.
Dosis-Cepa F(3, 39)=1.02 n.s.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
00
1000
2000
3000
****
1 10Dosis de morfina (mg/Kg)
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
Figura 14. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada, obtenidos con cada dosis de morfina, se compararon entre cepas con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-7 animales por dosis y cepa.
El efecto de morfina en la primera fase de este test, aunque significativo, es
más bien escaso comparado con el obtenido en la segunda fase, lo que concuerda con
lo descrito previamente por otros autores (Jourdan y cols., 1997). Los rangos en los
Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(3, 39)=29.67 p<0.001Cepa F(1, 39)=24.44 p<0.001
Dosis-Cepa F(3, 39)=1.14 n.s.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
que morfina ejerce su efecto antinociceptivo en la segunda fase del test observados
en este estudio son semejantes a los descritos por otros autores (Abbott y cols., 1995;
Watson y cols., 1997; Jourdan y cols., 1997; Gilbert y cols., 2002).
Por otro lado, en el presente estudio aparecieron diferencias entre cepas en la
potencia de morfina para inhibir la respuesta nociceptiva en la segunda fase, sin que
se observaran en la primera. Resultado semejante al obtenido por Lutfy y cols.
(1996) en el modelo de ratones HA y LA.
Estos resultados sugieren que los mecanismos responsables del efecto
antinociceptivo de morfina o de la modulación del mismo difieren entre las dos fases
de este test, y que los involucrados en la segunda fase son diferentes entre las ratas
SDU y W. Así, el sistema opioide endógeno podría estar implicado en las diferencias
observadas en el presente estudio, ya que el mismo ejerce una modulación de la
nocicepción ejercida por formalina, que difiere según la fase (König y cols., 1996;
Wang y cols., 2001; Wu y cols., 2002; Martin y cols., 2003b; Zhao y cols., 2003).
Además, puesto que la interfase, más acusada y prolongada en SDU que en W, está
modulada por el estrés, que es capaz de potenciar el efecto antinociceptivo de
morfina (Appelbaum y Holtzman, 1985; Abbott y cols., 1995; Woolfolk y Holtzman,
1995; Calcagneti y cols., 1990), las diferencias en la interfase también podrían estar
relacionadas con las diferencias en el efecto antinociceptivo de morfina.
Al igual que las ratas SDU, los ratones HA son más sensibles al efecto
antinociceptivo de morfina en los tests térmicos, y en la segunda fase del test de la
formalina, presentando similar sensibilidad en la primera fase (Panocka y cols.,
1986; Kest y cols., 1993; Lutfy y cols., 1996). Ello sugiere la existencia de
diferencias entre, la primera fase de respuesta en el test de la formalina, y la segunda
fase y tests térmicos, en el mecanismo de acción de morfina o en su modulación. A la
vez que apunta la existencia de un gran paralelismo entre los fenómenos
responsables de las características de las ratas SDU y los ratones HA.
4.1.2.- EFECTOS COLATERALES.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la clínica, el tratamiento del dolor con opioides dista de ser ideal debido,
entre otros factores, a sus efectos secundarios y al riesgo de que se desarrolle
tolerancia, dependencia y adicción (McQuay, 2001). En este sentido, distintos grupos
han intentado abordar el problema, con el fin de clarificar la existencia de correlación
en la sensibilidad a los distintos efectos de morfina (Way et al., 1969; Trujillo and
Akil, 1991; Lufty y cols., 1994; Kest y cols., 1998b; Zhu y cols., 1999; Kest y cols.,
2002b; Nitsche et al., 2002). En el presente trabajo se analizaron tres de los efectos
colaterales más importantes de la utilización de estos fármacos: la tolerancia al efecto
antinociceptivo, la dependencia tras una exposición continuada a morfina, y el efecto
adictivo de este agonista. Debido a la diferente sensibilidad a morfina de las cepas
utilizadas en este estudio, para evaluar los efectos derivados de la administración
crónica de morfina (desarrollo de tolerancia y dependencia), se adoptó una estrategia
experimental que consistió en el estudio de estos efectos tras la administración de
dosis equianalgésicas de morfina en ambas cepas, de manera que permitiera
determinar posibles diferencias en estos efectos indeseados al utilizar dosis
equivalentes.
4.1.2.1.- DESARROLLO DE TOLERANCIA AL EFECTO
ANTINOCICEPTIVO.
De manera similar a lo que ocurre con la sensibilidad o resistencia al efecto
analgésico de morfina, se ha comprobado que existe variabilidad interindividual en la
respuesta al tratamiento crónico con opioides. Así, mientras que determinados
pacientes requieren rápidamente incrementos en la dosis de estos fármacos para
aliviar su dolor, otros logran controlarlo durante largo tiempo con una dosis
constante (Foley, 1993). En este sentido, diversos estudios que han comparado
distintas cepas de roedores han encontrado diferencias entre éstas en el desarrollo de
tolerancia a opioides (Oliverio y cols., 1975; Vaccarino y Couret, 1995; Hoffman y
cols., 1998; Mas y cols., 2000; Kest y cols., 2002).
En las cepas de animales utilizadas en este estudio ya se había comprobado
que existian diferencias en el desarrollo de tolerancia. Así, con el tratamiento
continuado durante 9 días de morfina (10 mg/Kg/12h) en los animales SDU no se
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
producía el esperado descenso en el efecto antinociceptivo, dada su mayor
sensibilidad a morfina, aunque las curvas dosis-efecto se desplazaban a la derecha de
manera similar (Más y cols., 2000). En el presente trabajo, se pretendió valorar el
desarrollo de tolerancia en ambas cepas, pero utilizando las dosis mínimas con las
que se conseguía el 100% de MEP. Por ello, la cepa W fue tratada con 9.6 mg/Kg y
la cepa SDU con 3.4 mg/Kg, administrándose la morfina en ambas cepas cada 12
horas durante 9 días. Con esta pauta de tratamiento se evaluó la evolución temporal
del efecto antinociceptivo y se realizaron curvas dosis-efecto los días 1o y 9o de
tratamiento. Esta pauta indujo una disminución significativa del efecto
antinociceptivo en ambas cepas de ratas (figura 15), aunque no se detectaron
diferencias significativas entre cepas en el efecto antinociceptivo obtenido con estas
dosis de morfina a lo largo de dicho tratamiento.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 3 5 7 90
20
40
60
80
100
WSDU
Día de tratamiento
%M
EP
Figura 15. Evolución del efecto antinociceptivo de la DE100 en el test TF (3.4 y 9.6 mg/Kg, en SDU y W respectivamente) inicial de morfina a lo largo del tratamiento crónico administrado cada 12h. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. n=9-16 animales por grupo.
Por lo tanto, si los animales SDU son tratados crónicamente con su DE100 (3.4
mg/Kg) se origina descenso del efecto antinociceptivo a lo largo del tratamiento
similar a los animales W. La discrepancia con los resultados anteriores obtenidos por
Más y cols. (2000) es debida a las diferentes dosis de morfina utilizada (10 mg/Kg),
que son dosis supramáximas para esta cepa y que siguen originando, tras varios días
de tratamiento el 100% de MEP.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Día F(4, 122)=16.45 p<0.001Cepa F(1, 122)=2.29 n.s.
Día-Cepa F(4, 122)=0.34 n.s.
108
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente trabajo, el análisis de las curvas dosis-efecto antinociceptivo de
morfina, obtenidas el día 1o y 9o de tratamiento, reveló que en ambas cepas de ratas
las curvas obtenidas el 9o día fueron significativamente diferentes de las obtenidas el
1er día. Así, los valores de %MEP obtenidos el 1er día fueron significativamente
mayores que los obtenidos el 9º con dosis de 0.6 a 3.4 mg/Kg en la cepa SDU, y al
administrar dosis de 1.7 a 13.5 mg/Kg en la cepa W (figura 16). Además, en ambas
cepas de ratas los valores estimados de DE50 obtenidos el 9o día fueron
significativamente superiores (p<0.001) a los del 1er día, apareciendo un grado de
tolerancia (indice DE50 9o día/ DE50 1er día) similar en ambas cepas (tabla VI). Por lo
tanto, estas pautas de tratamiento indujeron una perdida de la potencia
antinociceptiva de morfina significativa, pero similar en ambas cepas de ratas.
109
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.1 1 10 1000
20
40
60
80
100
*
***
***
***
*** **
*
SDU TolerantesSDU
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(9, 122)=27.85 p<0.001Día F(1, 122)=160.20 p<0.001
Dosis-Día F(9, 122)=8.43 p<0.001
110
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 10 1000
20
40
60
80
100 *
*** **
* *** **
***
***
*
WW Tolerantes
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 16. Curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluada en el test TF, correspondientes a animales que previamente no han recibido morfina y de animales tratados crónicamente durante 8 días (tolerantes) con la correspondiente DE100/12h (3.4 y 9.6 mg/Kg/12h, para SDU y W respectivamente). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las tablas. Las comparaciones entre animales tolerantes y no tolerantes para los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fármaco, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, *** p<0.001 tolerantes vs no tolerantes. n=6-16 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(9, 174)=19.59 p<0.001Día F(1, 174)=161.30 p<0.001
Dosis-Día F(9, 174)=7.78 p<0.001
111
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla VI. DE50 en animales no tratados y tolerantes de las cepas SDU y W, y sus correspondientes índices DE50.
CEPA DE50 Índice DE50NO TRATADAS TOLERANTESSDU 0.75±0.04 3.82±0.25 *** 5.1
W 1.45±0.06 8.53±0.61 *** 5.9
*** p<0.001 vs no tratadas. Índice DE50 = DE50 9o día/ DE50 1er día.
Por otro lado, al comparar las curvas de ambas cepas obtenidas tras este tratamiento
crónico durante 8 días con la correspondiente DE100 de morfina cada 12 horas, se
comprobó que dichas curvas eran distintas. Además, los valores estimados de DE50
son significativamente menores (p<0.001) en las ratas de la cepa SDU, que en las de
la cepa que en W. Así mismo, los valores de %MEP obtenidos con 3.4, 4.8, 6.8 y 9.6
mg/Kg de morfina fueron significativamente mayores en la cepa SDU que en la cepa
W (SDU vs W: 54.6±13.9 vs 12.5±9.8; p<0.05, 67.4±16.9 vs 24.9±6.3; p<0.01,
79.7±14.7 vs 29.6±11.0; p<0.001 y 100±0 vs 62.0±7.1%; p<0.05, respectivamente).
Por lo tanto, sigue apareciendo una mayor potencia antinociceptiva de este fármaco
en las ratas de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W tras el desarrollo de
tolerancia (figura 17).
112
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 10 1000
20
40
60
80
100 *** *
**
*SDU TolerantesW Tolerantes
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 17. Curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF, en animales tolerantes de ambas cepas. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas correspondientes a ambas cepas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Las comparaciones entre cepas para los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fármaco, se realizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 SDU vs W. n=6-16 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(9, 145)=32.94 p<0.001Cepas F(1, 145)=26.44 p<0.001
Dosis-Cepa F(9, 145)=3.84 p<0.001
113
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por consiguiente, con la administración de dosis equianalgésicas de morfina,
ambas cepas desarrollan un grado similar de tolerancia a este fármaco, lo que sugiere
la existencia de una correlación entre efecto antinociceptivo y tolerancia. Sin
embargo, hay que considerar que cuando se utilizan las mismas dosis en ambas cepas
la tolerancia desarrollada también es semejante (Más y cols., 2000), lo que no apoya
dicha correlación, y sugiere que el grado de tolerancia desarrollado en los animales
SDU no depende de la intensidad del tratamiento recibido. En este sentido, distintos
estudios han demostrado que ambos fenómenos no están ligados, y que con distintas
manipulaciones se puede modificar uno sin alterar el otro (Trujillo y Akil, 1991;
Suzuki y cols., 1992; Kest y cols., 1996; Hepburg y cols., 1997; Zhu y cols., 1999;
Tsuji y cols., 2000; Nitsche y cols., 2002). Además, mediante estudios con diferentes
cepas de roedores, se ha confirmado que la sensibilidad al efecto antinociceptivo y la
tolerancia a opioides poseen diferentes bases genéticas (Lutfy y cols., 1994;
Vaccarino y cols., 1995; Kest y cols., 2002). Puesto que las ratas SDU y las W
desarrollan similar tolerancia al ser tratadas con igual dosis (Más y cols., 2000), ello
corroboraría la falta de relación entre ambos efectos.
En los últimos años, se ha descrito ampliamente un fenómeno, estrechamente
relacionado con la tolerancia a estos fármacos, denominado dolor inducido por
opioides (para revisión ver Vanderah y cols., 2001; Ossipov y cols., 2003). Este
fenómeno consiste en la aparición de hiperalgesia tras la administración de opioides.
En este sentido, se ha especulado que los opioides administrados durante un tiempo
prolongado mantienen su nivel de eficacia, pero el concurrente fenómeno de
hiperalgesia se contrapone al efecto antinociceptivo de estos produciendo la
impresión de tolerancia (Colpaert, 1996; Laulin y cols., 1999).
En este estudio, se observa que la administración crónica de dosis
equianalgésicas de morfina en ambas cepas de ratas originó un descenso significativo
de la latencia basal al estímulo nociceptivo térmico, a lo largo del tratamiento, siendo
este descenso similar en ambas cepas de ratas (figura 18).
114
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 3 5 7 93.0
3.5
4.0
4.5
5.0 WSDU
Día de tratamiento
Late
ncia
bas
al (s
eg)
Figura 18. Evolución de la latencia basal en el test TF a lo largo del tratamiento crónico con la DE100%/12h (3.4 y 9.6 mg/Kg/12h, en SDU y W respectivamente). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se representan en la tabla. n=12-16 animales por grupo.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Día F(4, 130)=8.49 p<0.001cepa F(1, 130)=0.01 n.s.
Día-Cepa F(4, 130)=0.19 n.s.
115
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por lo tanto, el tratamiento crónico equianalgésico utilizado en este trabajo
para desarrollar tolerancia desencadena de forma similar en ambas cepas, tanto la
tolerancia como la hiperalgesia. Este resultado concuerda con lo descrito
previamente por otros autores para ratón, en donde se ha observado la existencia de
una correlación entre la magnitud de la tolerancia y la de la hiperalgesia
desencadenada por morfina, lo que apoya la existencia de sustratos genéticos
similares en ambos fenómenos (Kest y cols., 2002).
En conjunto, los resultados de estos experimetos permiten concluir que la
utilización de dosis menores de morfina en SDU con respecto a W no se relacionan
con un menor desarrollo de tolerancia o de hiperalgesia inducida por este opioide,
aunque generan el mismo efecto antinociceptivo.
4.1.2.2.- DESARROLLO DE DEPENDENCIA FÍSICA: SÍNDROME DE
ABSTINENCIA A MORFINA PRECIPITADO POR NALOXONA.
Con el fin de analizar la dependencia física a morfina, se compararon los
signos del síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona en animales de
ambas cepas. En ratas de la cepa SDU se utilizaron dos pautas de tratamiento
diferentes (ver material y métodos), con el fin de comparar el síndrome
desencadenado en W con el que apareciese en SDU con la misma pauta (de 9.6 a 48
mg/Kg/12h) y con una pauta equivalente en respuesta antinociceptiva (de 3.4 a 17
mg/Kg/12h). Se pretendía determinar si la mayor potencia antinociceptiva de morfina
en los animales de la cepa SDU se acompaña de diferencias en la magnitud de la
dependencia física a este opioide.
La administración de naloxona a ratas de ambas cepas, tratadas crónicamente
con la misma pauta de morfina, indujo un síndrome de abstinencia caracterizado por
diversos signos conductuales, hipotermia y pérdida de peso. Estos signos
conductuales y fisiológicos no difirieron de forma relevante de una cepa a otra. Los
animales SDU tratados con con la pauta de dosis bajas (de 3.4 a 17 mg/Kg/12h)
también mostraron signos del síndrome de abstinencia, algunos de los cuales fueron
significativamente menores que los obtenidos en los animales de la misma cepa
tratados con dosis altas, aunque similares a los originados en la cepa W (tabla VII).
116
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla VII. Signos fisiológicos y conductuales del síndrome de abstinencia a morfina desencadenado por naloxona.
SDU SDUe SDUc W WcHipotermia (ºC) 1.2±0.3 *** 0.8±0.3 ** 0.0±0.0 1.8±0.4 *** 0.0±0.0
Pérdida de peso (g) 9.0±1.0 *** 4.4±1.7 * ++ 0.8±0.2 7.4±1.0 *** 1.4±0.4Salivación (periodos) 1.0±0.7 0.1±0.1 0.0±0.0 0.4±0.3 0.0±0.0
Diarrea (periodos) 1.7±0.7 * 1.1±0.6 0.0±0.0 1.7±0.4 ** 0.1±0.1Ptosis (periodos) 5.8±0.2 *** 3.8±0.6 *** ++ 0.0±0.0 4.5±0.6 *** 0.0±0.0Masticación (nº) 13.8±4.0 * 10.0±5.6 * 0.0±0.0 9.8±4.1 0.5±0.5
Castañeteo dientes (nº) 1.7±1.5 12.3±4.0 ** ++ 0.2±0.2 16.2±3.6 ** + 1.0±0.7Salto (nº) 19.0±6.0 *** 0.1±0.1 +++ 0.0±0.0 8.5±4.4 0.0±0.0
SDUc y Wc: controles; SDU y W: dosis crecientes iguales; SDUe: dosis crecientes equianalgésicas. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. control; +
p<0.05, ++ p<0.01, +++ p<0.001 vs SDU. n=6–13 animales por grupo.
Los valores de la Puntuación Global del síndrome de abstinencia fueron
significativamente mayores en los tres grupos de animales tratados con morfina que
en sus correspondientes controles (p<0.01 en SDU con la pauta de dosificación baja,
y p<0.001 en W y SDU con la pauta de dosificación mayor). Los animales SDU
tratados con la pauta de dosificación más baja muestran valores de Puntuación
Global (15.9±4.7) significativamente inferiores (p<0.05), que los tratados con la
pauta mayor de su misma cepa SDU (28.6±4.8). En los animales de la cepa W la
Puntuación Global (25.0±5.7) fue similar a la obtenida en la cepa SDU tratada con la
pauta de dosis equianalgésica (15.9±4.7 y 28.6±4.8, respectivamente; p>0.05) (figura
19).
117
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SDUc SDUe SDU Wc W0
10
20
30
40***
**
***
+
Punt
uaci
ón g
loba
l
Figura 19. Puntuación Global del síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona tras la administración de dosis crecientes morfina durante 6 días (SDU y W de 9.6 a 48 mg/Kg/12h, y SDUe pauta equianalgésica de 3.4 a 17 mg/Kg/12h). Los correspondientes animales control (SDUc y Wc) recibieron salino. Los valores representan los valores medios ± error estándar. ** p<0.01, *** p<0.001 vs control, +
p<0.05 vs SDU. n=6-13 animales por grupo.
Los signos bioquímicos de la abstinencia se analizaron midiendo la actividad
adenilato ciclasa. En los animales SDU tratados con la pauta alta de morfina, la
actividad adenilato ciclasa en membranas de caudado–putamen fue
significativamente mayor que en animales controles y que en animales tratados con
la pauta baja (SDU vs SDUc y SDUe: 57.3±2.2 vs 46.7±3.3 y 41.7±3.8 pmol/mg de
proteína/min; p<0.05), pero no significativamente diferente a la obtenida en W
(46.5±3.5 pmol/mg de proteína/min; p=0.0555).
En este estudio se ha comprobado que la administración de naloxona
desencadenó la aparición de distintos signos característicos del síndrome de
abstinencia en los animales tratados con morfina, sin que apareciesen en los tratados
118
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
con salino. Estos signos fueron similares cualitativa y cuantitativamente a los
descritos previamente por otros autores en rata (Maldonado y cols., 1995). En los
animales de la cepa SDU se han utilizado dos protocolos de dosis crecientes de
morfina para desarrollar dependencia debido a la mayor potencia antinociceptiva en
esta cepa de ratas. De este modo, estos animales han sido tratados con una pauta
estándar y con otra equianalgésica con respecto a la cepa W, lo que ha permitido
realizar comparaciones inter e intracepa más válidas. Con ello se ha podido
comprobar que el síndrome de abstinencia, tanto a nivel conductual, fisiológico (por
signos independientes y puntuación global), y bioquímico, no difiere entre ambas
cepas, y que en los animales SDU la intensidad del síndrome es mayor con pautas de
tratamiento más agresivas. Si bien es cierto que no existe un completo paralelismo
entre los resultados de la actividad adenilato ciclasa y los de la puntuación global, sí
que aparece gran similitud con el salto, que ha sido considerado como un signo
clásico de la abstinencia a morfina. Y en cualquier caso los resultados obtenidos con
la actividad adenilato ciclasa son coherentes con el resto de resultados apoyando la
fiabilidad de estos resultados.
A pesar de que otros autores han demostrado la existencia de diferencias entre
cepas de roedores en los síntomas del síndrome de abstinencia (Hoffmann y cols.,
1998; Kest y cols., 1998b), en el presente trabajo, no se observaron grandes
diferencias entre cepas. Con estos resultados, parece poco probable que el fenómeno
responsable del comportamiento de la cepa SDU esté afectando también el proceso
neurobiológico de la dependencia física a morfina. Esta disociación genética entre
sensibilidad al efecto antinociceptivo opioide y abstinencia, había sido descrita
previamente en ratón por otros autores. En los ratones HA, que son más sensibles al
efecto antinociceptivo opioide, no se encontraron diferencias en el síndrome de
abstinencia (Panocka y cols., 1986; Kest y cols., 1993; Lutfy y cols., 1996; Kest y
cols., 1998b).
En cuanto a la relación entre los efectos derivados de la administración
crónica de opioides, los resultados son contradictorios. Algunos estudios, sugieren
que los fenómenos de tolerancia y dependencia física tendrían una base diferente,
mientras otros apoyan la existencia de una relación entre ambos (Kest y cols., 2002;
119
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Nitsche y cols., 2002). Los resultados del presente trabajo apoyan una base común
aunque independiente de la sensibilidad nociceptiva.
4.1.2.3.- EFECTO ADICTIVO: PREFERENCIA DE PLAZA
CONDICIONADA POR MORFINA.
La capacidad adictiva de los opioides es también otro de los principales
problemas derivados de la utilización de estos fármacos (Schnoll y Weaver, 2003).
Por lo tanto, al igual que con la tolerancia y la dependencia física, se planteó analizar
la posible relación entre la mayor potencia antinociceptiva de morfina en los
animales de la cepa SDU y los efectos recompensantes inducidos por este agonista
opioide. Para ello se utilizó un método comportamental ampliamente extendido que
permite evaluar los efectos de recompensa promovidos por la administración de
morfina, que es el denominado test de la preferencia de plaza condicionada
(Tzschentke, 1998).
En este trabajo, la permanencia en las cajas asociadas a morfina fue similar en
los animales SDU y los W durante la sesión de precondicionamiento (puntuación:
658±42 y 672±25 s, respectivamente; figura 20). Tras el periodo de
condicionamiento, morfina indujo preferencia de plaza en ambas cepas, aunque no se
observaron diferencias significativas entre ellas en las curvas dosis-efecto obtenidas,
estando los incrementos del tiempo de permanencia en el compartimento asociado a
morfina, con respecto a la fase de precondicionamiento, en el rango de los descritos
previamente para rata (Shoaib y cols., 1995).
A pesar de no observarse diferencias significativas en las curvas dosis-
respuesta, la dosis necesaria para inducir esta preferencia fue menor en SDU que en
W. Así, los animales de la cepa SDU, con 5 mg/Kg de morfina ya presentaron un
incremento significativo del valor de puntuación con respecto al de la fase de
precondicionamiento (902±67 vs 658±42 s, p<0.05), mientras que en los animales de
la cepa W la dosis de morfina necesaria fue 10 mg/Kg (911±39 vs 672±25 s, p<0.05)
(figura 20). Por lo tanto, estos resultados parecen apuntar a que, si bien no existen
diferencias importantes entre cepas en el tiempo de permanencia en la caja asociada a
120
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
morfina, las ratas de la cepa SDU presentan una sensibilidad ligeramente mayor al
efecto condicionante de morfina que las de la cepa W.
Precond.500
600
700
800
900
1000 SDUW
1.25 5 10
**
*
Dosis de morfina (mg/Kg)
Punt
uaci
ón (s
eg)
Figura 20. Curva dosis-efecto de la preferencia de plaza condicionada por morfina. Los puntos representan los valores medios ± error estándar de puntuación, en la fase de precondicionamiento (Precond.) y en la fase de test tras el condicionamiento con distintas dosis de morfina (1.25, 5 y 10 mg/Kg). Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(3, 76)=6.46 p<0.001cepa F(1, 76)=0.83 n.s.
Dosis-Cepa F(3, 76)=0.30 n.s.
121
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de dos vía, y los resultados se expresan en la tabla. Las comparaciones de los valores obtenidos en cada cepa con cada una de las dosis de morfina con respecto al precondicionamiento se realizaron con un test de Dunnett: * p<0.05 vs precondicionamiento. n=8-16 animales por grupo.
122
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las diferencias entre cepas de roedores en cuanto a preferencia de plaza
condicionada por morfina han sido descritas por distintos autores (Cunningham y
cols., 1992; Guitart y cols., 1992; Shoaib y cols., 1995; Semenova y cols., 1995). Así,
se han descrito diferencias entre las cepas Sprague-Dawley y Wistar (de otros
proveedores) en el efecto recompensante de morfina, así como en las dosis precisas
de este fármaco para la aparición de preferencia de plaza condicionada. De manera
similar, en el presente estudio se observa que las ratas de la cepa W precisan una
mayor dosis de morfina (10 mg/Kg) que las de la cepa SDU (5 mg/Kg) para
desarrollar preferencia de plaza de forma significativa, aunque, a diferencia del
estudio de Shoaib y cols. (1995), no se detectan diferencias entre cepas en la
magnitud de la preferencia de plaza observada.
En nuestro modelo, la mayor potencia antinociceptiva de morfina en la cepa
SDU y las otras diferencias observadas se acompañan de una mayor sensibilidad al
efecto recompensante de este fármaco. En otros modelos animales se sugiere que la
relación entre antinocicepción y adicción podría ser inversa o no existir. Así, las ratas
de la cepa F344, que son más sensibles a morfina que las ratas Lewis (Morgan y
cols., 1999; Cook y cols., 2000), presentan menor preferencia de plaza condicionada
por este fármaco (Guitart y cols., 1992). Por el contrario, estudios realizados en
distintas cepas de ratones sugieren la ausencia de correlación de cualquier tipo entre
la antinocicepción y la adicción a morfina (Semenova y cols., 1995). Sin embargo,
los resultados de este estudio si que parecen apuntar a que en SDU la sensibilidad a
los efectos antinociceptivos y recompensantes de morfina se deba a un mismo
mecanismo subyacente. Los múltiples factores implicados en estos procesos y/o
características genéticas individuales de las cepas de roedores podrían explicar las
divergencias.
123
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.2.- DISECCIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS RECEPTORES OPIOIDES
IMPLICADOS EN LAS DIFERENCIAS NOCICEPTIVAS.
Se ha realizado un análisis farmacológico, mediante la utilización de
agonistas y antagonistas opioides, para intentar esclarecer el/los receptores
implicados en las diferencias observadas entre estas cepas.
4.2.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE AGONISTAS OPIOIDES.
Se ha evaluado el efecto antinociceptivo de diversos agonistas opioides, que
difieren en la preferencia por los distintos tipos de receptores opioides y en otras
propiedades farmacológicas.
4.2.1.1.- AGONISTAS µ (FENTANILO, METADONA Y 3-d).
En este estudio se han utilizado distintos fármacos agonistas de los receptores
µ, los cuales podrían presentar diferencias farmacológicas entre ellos, en las que
estarían implicadas el subtipo de receptor µ que activan, la posibilidad de
interaccionar además con otros sistemas de neurotransmisión, como los receptores
NMDA, así como el grado de selectividad de la interacción fármaco-receptor, y
desde luego en su farmacocinética (Rossi y cols., 1996; Plesan y cols., 1999;
Jagerovic y cols., 2002).
FENTANILO.
Se decidió comprobar el efecto de fentanilo puesto que resultados previos de
otros grupos apuntaban la posibilidad de diferentes mecanismos receptoriales entre
morfina y otros agonistas µ. Rossi y Cols. (1996) han sugerido que este fármaco
podría actuar a través de un receptor diferente al de morfina, ya que los ratones
CXBK, que son relativamente insensibles a morfina, conservan la sensibilidad al
efecto antinociceptivo de fentanilo, heroína, 6-acetil-morfina, morfina-6β-
glucuronido y etonitazina. Además, el ratón knockout carente del exon-1 del MOR-1,
a pesar de carecer de efecto antinociceptivo inducido por morfina, conserva el
inducido por otros agonistas µ como morfina-6β-glucurónido, heroína y
124
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
[Dmt1]DALDA (Schuller y cols., 1999; Neilan y cols., 2003). Se ha descrito también
la potenciación entre distintos agonistas µ que actuarían a través de subtipos distintos
de este receptor (Bolan y cols., 2002). Por ello, se analizó el efecto antinociceptivo
de fentanilo con el fin de estudiar la posibilidad de que un agonista que actúa sobre
un receptor µ hipotéticamente distinto al de morfina, pudiera no diferir en su
potencia entre las ratas de las cepas SDU y W, lo que sugeriría que en las diferencias
intercepa encontradas con morfina se encuentre implicado sólo un “subtipo” de
receptor µ.
Al analizar las curvas dosis-efecto antinociceptivo de fentanilo de ambas
cepas de ratas se observó que las curvas obtenidas son distintas, estimándose valores
de DE50 significativamente menores en ratas de la cepa SDU que en W
(DE50=4.2±0.1µg/Kg en SDU y 17.2±2.0µg/Kg en W; p<0.001), lo que implica una
mayor potencia de este agonista µ en las ratas de la cepa SDU con respecto a las W
(figura 21). Además, los valores de %MEP obtenidos con 5, 10 y 20µg/Kg de
fentanilo fueron significativamente mayores en la cepa SDU que en la cepa W (SDU
vs W: 63.9±12.8 vs 10.1±3.3, 97.2±2.3 vs 16.5±5.1 y 100±0 vs 61.6±11.6%,
respectivamente; p<0.001 en ambos casos).
125
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 10 1000
20
40
60
80
100SDUW***
******
Dosis de fentanilo (µ g/Kg)
%M
EP
Figura 21. Curva dosis-efecto antinociceptivo de fentanilo evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fentanilo, se analizaron con un test de Bonferroni: *** p<0.001 SDU vs W. n=6-15 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(6, 123)=29.82 p<0.001Cepa F(1, 123)=46.22 p<0.001
Dosis-Cepa F(6, 123)=8.70 p<0.001
126
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El hecho de que fentanilo, a pesar de tratarse de un agonista µ que podría
actuar sobre un receptor distinto del de morfina (Rossi y cols., 1996; Schuller y cols.,
1999; Bolan y cols., 2002; Neilan y cols., 2003), sea también más potente en las ratas
de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W, sugiere que el mecanismo es
independiente de las acciones selectivas de “subtipos” de receptor µ.
METADONA.
La metadona es un opioide activo por vía sistémica que difiere, en algunos
aspectos, de otros opioides clásicos como morfina. Así, si bien se trata de un agonista
opioide con mayor actividad intrínseca que morfina en la activación del receptor µ,
también posee considerable afinidad por el receptor δ, y además se une a los
receptores NMDA con baja afinidad, actuando como un antagonista no competitivo
(Paronis y Holtzman, 1992; Ebert y cols., 1995; Gorman y cols., 1997; Gourlay,
1999).
Se ha descrito la potenciación del efecto antinociceptivo de morfina vía
sistémica con la coadministración de antagonistas no competitivos de receptores de
NMDA como dextrometorfano y MK-801 o con antagonistas competitivos como
CGS-19755, por lo que se ha sugerido que el efecto de metadona podría derivar de
una combinación de su actividad opioide y su actividad como antagonista del
receptor NMDA (Grass y cols., 1996; Hoffmann y Wiesenfeld-Hallin, 1996; Bulka y
cols., 2002). Por ello, se ha insinuado que las diferencias entre algunas cepas de ratas
en la sensibilidad a morfina podrían estar mediadas por diferencias en la actividad
del receptor NMDA, que a su vez modulara el efecto de morfina (Plesan y cols.,
1999). Bulka y cols. (2002) encontraron diferencias en el efecto antinociceptivo de
morfina y metadona entre subcepas de ratas Sprague-Dawley, así como en su
potenciación por dextrometorfano, y por ello sugirieron la participación de los
receptores NMDA en estas diferencias.
Teniendo en cuenta las consideraciones previas, una posible explicación para
la mayor potencia antinociceptiva de morfina en las ratas SDU respecto a las W,
podría ser que esta cepa presente una menor activación de los receptores NMDA que
los animales de la cepa W. Así, al utilizar metadona cabría esperar que disminuyera
127
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
el efecto de la activación de los receptores NMDA, y con ello las diferencias entre
cepas en la potencia antinociceptiva de este fármaco con respecto a las observadas
con morfina.
En el presente estudio, los resultados obtenidos con metadona son semejantes
a los que aparecen con morfina y fentanilo. Las curvas obtenidas son distintas para
cada cepa, estimándose valores de DE50 significativamente inferiores en ratas de la
cepa SDU, que en las de la cepa que en W (DE50=0.82±0.01 mg/Kg en SDU y
1.31±0.19 mg/Kg en W; p<0.05), lo cual implica una mayor potencia también de este
agonista µ en las ratas de la cepa SDU con respecto a las W (figura 22). Además, los
valores de %MEP obtenidos con 0.85, 1.2 y 1.7 mg/Kg de metadona fueron
significativamente superiores en la cepa de ratas SDU que en la W (SDU vs W:
57.1±9.2 vs 15.9±6.3; p<0.01, 94.5±2.9 vs 55.5±11.4; p<0.05 y 95.9±4.1 vs
56.1±10.3%; p<0.01, respectivamente).
1 100
20
40
60
80
100SDUW
**
* **
Dosis de metadona (mg/Kg)
%M
EP
Figura
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(5, 143)=25.80 p<0.001Cepa F(1, 143)=29.96 p<0.001
Dosis-Cepa F(5, 143)=4.30 p<0.01
128
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
obtenidos con cada dosis de metadona, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p<0.01 SDU vs W. n=11-16 animales por dosis y cepa.
Dados los resultados obtenidos, se puede concluir que las diferencias en
la actividad de los receptores NMDA no parece estar implicada en la mayor
potencia antinociceptiva obtenida en SDU, puesto que la metadona presenta
también una mayor potencia en las ratas de esta cepa, a pesar de ser un
antagonista no competitivo de receptores NMDA (Ebert et al., 1995; Gorman
et al., 1997).
3-d.
Recientemente se ha sintetizado un derivado del fentanilo, el 3-d, cuyas
principales características son la mayor duración de su efecto con respecto a los
análogos del fentanilo comercializados hasta la fecha, y una extraordinaria
selectividad por el receptor µ, siendo activo por vía sistémica (Jagerovic y cols.,
2002).
La modulación del efecto antinociceptivo de los agonistas µ con la
coadministración de agonistas δ y/o κ ha sido descrita ampliamente (Heyman y cols.,
1989; Jiang y cols., 1990; Porreca y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1992; Adams y
cols., 1993; Traynor y Elliott, 1993; He y Lee, 1998; para revisión ver Smith y Lee,
2003). Se ha sugerido así mismo que morfina, fentanilo y derivados podrían actuar
sobre los receptores µ y δ conjuntamente potenciándose de esta forma el efecto
(Tiseo y Yaksh, 1993, Baker y cols., 1995; Verborgh y Meert, 1999). Según esta
teoría, podría hipotetizarse que el efecto antinociceptivo observado con los agonistas
µ utilizados hasta ahora en este trabajo, estuviese mediado tanto por los receptores µ
como por los receptores δ y/o κ, mientras que en el caso de 3-d, por su mayor
selectividad µ, su efecto antinociceptivo dependería con mayor exclusividad de la
activación de receptores µ. Por ello, y con el fin de analizar la respuesta tras una
129
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
activación más selectiva del receptor opioide µ, se estudió el efecto antinociceptivo
de éste fármaco.
Los resultados obtenidos con el 3-d son semejantes a los observados en este
estudio para los otros agonistas µ. Las curvas obtenidas en ambas cepas son distintas
(figura 23). Además, los valores estimados de DE50 son significativamente menores
en ratas de la cepa SDU, que en las de la cepa W (DE50=0.190±0.003 mg/Kg en SDU
y 0.380±0.050 mg/Kg en W; p<0.01), lo cual implica una mayor potencia
antinociceptiva de este agonista selectivo µ en las ratas de la cepa SDU con respecto
a las de la cepa W. Por otra parte, los valores de %MEP obtenidos con 0.3 y 0.6 mg/
Kg de 3-d son significativamente mayores en los animales de la cepa SDU que en los
de la cepa W (SDU vs W: 79.7±9.0 vs 35.0±13.8 y 93.6±4.1 vs 58.3±11.2%,
respectivamente; p<0.01 en ambos casos).
130
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.1 10
20
40
60
80
100
WSDU**
**
Dosis de 3-d (mg/Kg)
%M
EP
Figura 23. Curva dosis-efecto antinociceptivo de 3-d evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de 3-d, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-16 animales por dosis y cepa.
El compuesto 3-d había sido estudiado sólo en ratón, mediante el test de
HP y el test de las contracciones abdominales (Jagerovic y cols., 2002). En el
presente trabajo se ha comprobado su efecto en rata con el test de TF,
Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(5, 94)=14.28 p<0.001Cepa F(1, 94)=9.75 p<0.01
Dosis-Cepa F(5, 94)=2.35 P<0.05
131
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
obteniéndose en este caso curvas dosis-efecto similares a las descritas en ratón
para HP (Jagerovic y cols., 2002).
El hecho de que un agonista como el 3-d, con una elevada selectividad por el
receptor µ, también presente una mayor potencia antinociceptiva en las ratas de la
cepa SDU que en las de la cepa W, implica que la coactivación del receptor µ junto
con el δ y/o el κ por el fármaco opioide en cuestión, no es necesaria para originar una
mayor potencia antinociceptiva de los agonistas µ en la cepa SDU. Por consiguiente,
o bien se precisa unicamente la activación del receptor µ, o bien esta coactivación
receptorial de receptores δ y/o κ depende de receptores µ, lo que se analizará más
adelante con el uso de antagonistas selectivos (apartado 4.2.2.1.3.).
Los resultados obtenidos con los agonistas opioides µ, permiten concluir que
las diferencias en la potencia antinociceptiva que originan una mayor sensibilidad en
la cepa de ratas SDU con respecto a la cepa W, es común a todos los agonistas
utilizados en este estudio. Por lo tanto, no parece depender del subtipo de receptor µ
sobre el que actúan, la diferente activación de receptores NMDA o el grado de
selectividad µ. Por otro lado, puesto que encontramos diferencias entre ambas cepas
en estudio en la potencia antinociceptiva de distintos agonistas µ con diferentes
características farmacocinéticas, estos resultados corroboran los previamente
descritos por Más y cols. (2000), que apuntan a causas farmacodinámicas en estas
diferencias.
4.2.1.2.-AGONISTAS SELECTIVOS κ (U50488H).
Con la finalidad de analizar la participación del sistema opioide κ en la mayor
sensibilidad de las ratas de la cepa SDU, se realizaron curvas dosis-efecto
antinociceptivo con el agonista selectivo κ, U50488H, en ambas cepas de ratas.
El fármaco U50488H, que ha sido ampliamente utilizado como agonista
selectivo κ (Ki: 2, 837 y 14500nM por los receptores κ, µ y δ respectivamente;
Mattes y cols 1998), es un derivado de la arilacetamida de naturaleza no peptídica y
activo por vía sistémica (Millan y cols., 1989). La utilización de este derivado de la
132
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
arilacetamida, se debe a que este grupo de agonistas κ es el mejor caracterizado
farmacologicamente, y a que estos fármacos se unen con gran afinidad al receptor κ
recombinante expresado en células heterólogas (Kieffer 1995), mientras que su unión
es nula a membranas de cerebro procedentes de animales carentes del gen que
codifica el receptor κ (Simonin y cols., 1998).
Con las dosis utilizadas de U50488H tan solo encontramos efecto
antinociceptivo en los animales de la cepa SDU. Al comparar las curvas obtenidas en
ambas cepas, se observó que son distintas. Además, los valores de %MEP obtenidos
tras la administración de 19 y 38 mg/Kg de U50488H, son significativamente
superiores en los animales de la cepa SDU que en los de la cepa W (SDU vs W:
50.6±14.1 vs 1.4±1.0; p<0.01 y 87.7±7.7 vs 13.2±7.2; p<0.001, respectivamente).
Todo ello demuestra una mayor potencia antinociceptiva de este agonista selectivo κ
en las ratas de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W (figura 24), siendo el
valor de DE50 en ratas de la cepa SDU de 18.5±2.7 mg/Kg. La curva dosis-efecto
obtenida en los animales SDU, es similar a las descritas previamente por otros
autores con este test nociceptivo (Pick y cols., 1991; Garner y cols., 1997; D´Anci y
cols., 2000; Gullapalli y Ramarao, 2002).
133
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10 1000
20
40
60
80
100WSDU
**
***
Dosis de U50488H (mg/Kg)
%M
EP
Figura 24. Curva dosis-efecto antinociceptivo de U50488H evaluado en el test de TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de U50488H, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01, *** p<0.001 SDU vs W. n=5-6 animales por dosis y cepa.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Dosis F(3, 35)= 9.54 p<0.001Cepas F(1, 35)= 32.91 p<0.001
Dosis-Cepa F(3, 35)= 5.75 p<0.01
134
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la literatura existe controversia sobre la eficacia de los agonistas κ en los
test que utilizan estímulos térmicos (Pick y cols., 1991; Smith y Lee, 2003), pero
también hay que considerar que se han descrito diferencias en la sensibilidad al
U50488H entre ciertas cepas de roedores (Panocka y cols., 1986; Kest y cols., 1993;
Ikeda y cols., 1999). En el presente trabajo, se demuestra que el U50488H
únicamente fue eficaz en la cepa SDU en un test térmico, lo que podría sugerir que
dichas controversias fuesen debidas a diferencias intercepa. Así mismo, en el presente
estudio se ha encontrado una correlación entre el efecto antinociceptivo de los
agonistas µ y el agonista κ, confirmando lo descrito previamente por otros autores
(Wilson y cols., 2003).
Estos resultados obtenidos con el U50488H sugieren que en el mecanismo
subyacente en la mayor sensibilidad antinociceptiva de las ratas SDU estaría
participando de algún modo el sistema opioide κ.
4.2.1.3.-AGONISTAS SELECTIVOS δ (SNC-80).
Con el propósito de estudiar la participación del sistema opioide δ en la
mayor potencia de morfina en las ratas de la cepa SDU, se realizaron curvas dosis-
efecto antinociceptivo del agonista selectivo δ SNC-80 en ambas cepas de ratas.
La utilización de este agonista δ, se debió a que se trata de un agonista
selectivo (Ki: 1.78, 881.5 y 441.8nM para los receptores δ, µ y κ respectivamente) de
naturaleza no peptídica capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, lo que
permite su utilización por vía sistémica (i.p.; Bilsky y cols., 1995). Ello presenta
ventajas en este estudio, puesto que otros agonistas selectivos δ, como el BW-
373U86 que es activo por vía sistémica, presenta el inconveniente de su escasa
selectividad y su toxicidad (Chang y cols., 1993; Comer y cols., 1993; Wild y cols.,
1993), y otros agonistas más clásicos como el DPDPE o la deltorfina no pueden
administrarse por vía sistémica, lo cual impide la valoración de las consecuencias de
la activación sistémica de los receptores δ (Bilsky y cols., 1995), por lo que se podría
135
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
pasar por alto fenómenos que precisen la activación de estos receptores
simultáneamente a distintos niveles.
En las curvas dosis-efecto antinociceptivo obtenidas con SNC-80 no se
observaron diferencias significativas entre cepas (figura 25). Además, los valores
estimados de DE50 son similares en ambas cepas de ratas (14.3±2.7 mg/Kg y
17.4±5.1 mg/Kg SDU y W respectivamente; p>0.05), sugiriendo una potencia
antincocieptiva de este agonista δ semejante en sendas cepas de ratas.
1 10 1000
20
40
60
80
100 SDUW
Dosis de SNC-80 (mg/Kg)
%M
EP
Figura
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor
pDosis F(2, 44)=3.22 p<0.05Cepa F(1, 44)=0.01 n.s.
Dosis-Cepa F(2, 44)=0.08 n.s.
136
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente trabajo, sólo se ha podido llegar a dosis de 13.5 mg/Kg, dosis
que producian un efecto antinociceptivo moderado del 40%, pero importante
agitación e hiperexcitabilidad en los animales, dificultando la medición del propio
efecto antinociceptivo. A pesar de ello, el efecto antinociceptivo obtenido es dosis
dependiente (tabla de la figura 25), y similar al obtenido por otros autores (Baker y
cols., 2002). Se conoce que la eficacia antinociceptiva del SNC-80 es baja
comparado con otros agonistas opioides como morfina y U50488H, y que presenta
efectos convulsivantes y estimulantes de la actividad locomotora (Hong y cols.,
1998; Baker y cols., 2002; Jutkiewicz y cols., 2004), características que pueden haber
sido la causa de los comportamientos observados.
Las peculiaridades del agonista δ empleado y los comportamientos originados
por éste dificultan la comparación con estudios previos, que sugieren una relación
directa entre la potencia de agonistas µ y κ y la de agonistas δ en determinadas cepas
de ratones (Belknap y cols., 1987; Raffa y cols., 1992; Kest y cols., 1993, 1998,
1999). De manera que la disparidad con estudios previos podría deberse a las
alteraciones conductuales originadas, diferencias entre estos modelos, o bien a los
fármacos y/o vías de administración utilizadas, pues en nuestro caso se trata de un
agonista δ no peptídico administrado vía sistémica, mientras que en el caso de los
artículos antes referidos se trata de agonistas peptídicos δ1 y δ2, administrados vía
i.c.v. (Kest y cols., 1998, 1999). Por todo ello se consideró completar el estudio de la
participación del sistema opioide δ, mediante el análisis de las acciones de
antagonistas selectivos y métodos de fijación de radioligando (apartados 4.2.2.1. y
4.3.).
4.2.1.4.- AGONISTAS ENDÓGENOS: ANALGESIA INDUCIDA POR
ESTRÉS.
En situaciones de estrés se produce una inhibición de la respuesta nociceptiva
en animales de laboratorio y en humanos, conociéndose este fenómeno como
analgesia inducida por estrés (AIE) (Akil y cols., 1976; Hayes y cols., 1976; Willer y
cols., 1980). La AIE puede ser de naturaleza opioide o no, en función de la severidad
de los estímulos que la provoquen (Jackson y cols., 1989; Tierney y cols., 1991;
137
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Girardot y cols., 1994; Terman y cols., 1986). En este sentido, se ha descrito que en
roedores, cuando el estimulo utilizado para provocar estrés es un baño en agua a 20-
22º C de una duración de tres minutos, se obtiene una AIE de naturaleza opioide en
su totalidad (Kitchen y Pinker, 1990; Tierney y cols., 1991; Muhammad y Kitchen,
1993), que es debida a la liberación de opioides endógenos (Vaswani y cols., 1988;
Mizoguchi y cols., 1997).
Así mismo, se han descrito diferencias en la AIE en función de la cepa y del
sexo de los animales utilizados, e incluso se han seleccionado cepas de ratones que
presentan grandes diferencias en la magnitud de la AIE (Baran y cols., 1975;
Panocka y cols., 1986; Marek y cols., 1992; ver Mogil y cols., 1996; Mogil y
Belknap, 1997).
En el presente estudio, el análisis de las curvas temporales de AIE reveló que
ésta es máxima en la primera determinación y que este efecto antinociceptivo
disminuía a lo largo del tiempo. Además, este efecto antinociceptivo era mayor en las
ratas de la cepa SDU que en las de la cepa W, apareciendo un %MEP
significativamente mayor en la cepa SDU que en la cepa W en la primera
determinación (60.3±8.7 vs 27.7±4.3%; p<0.001). Estas diferencias entre cepas
desaparecen cuando se administró previamente naloxona (10 mg/Kg) (figura 26). De
manera semejante a lo observado en este estudio, distintos autores han descrito
diferencias en la AIE entre cepas de roedores, así como diferencias en la
potenciación por estrés del efecto antinociceptivo de morfina (Nagase y cols., 1985;
Moskowitz y cols., 1985b; Rosecrans y cols., 1986; Woolfolk y Holtzman, 1995;
Mogil y cols., 1996).
138
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5 10 10
20
40
60
80
100 SDUW
*** SDU NlxW Nlx
Tiempo tras baño (min)
%M
EP
Figura 26. Curva temporal de AIE, evaluada en el test TF en SDU y W con y sin administración de naloxona. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías, y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de %MEP, obtenidos en cada momento tras el baño en ambas cepas, se compararon con un test de Bonferroni: *** p<0.001 SDU vs W. n=5-11 animales por grupo.
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor pES
TRÉS Tiempo F(2 ,53)=22.14 p<0.001
Cepa F(1, 53)=15.28 p<0.001Tiempo-Cepa F(2, 53)=2.24 n.s.
ESTR
.+N
lx Tiempo F(2, 27)=0.05 n.s.Cepa F(1, 27)=1.02 n.s.
Tiempo-Cepa F(2, 27)=0.69 n.s.
139
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Así mismo, se analizó el AUC (de 1 a 10 min) del curso temporal de la
AIE, y se observó que el estímulo estresante indujo un efecto antinociceptivo
significativó en ambas cepas de animales con respecto a los animales que no
habían sido sometidos a estímulo estresante (SDU: 250.2±38.0 vs 30.3±12.6;
p<0.001 y W: 98.0±16.3 vs 22.7±8.9; p<0.01), siendo este efecto
significativamente (p<0.001) mayor en los animales de la cepa SDU que en los
de la cepa W. Tras la administración de naloxona (10 mg/Kg), en ambas cepas
disminuye de forma significativa el efecto antinociceptivo obtenido (SDU:
77.8±20.9 vs 250.2±38.0; p<0.001 y W: 32.8±31.8 vs 98.0±16.3; p<0.05),
desapareciendo las diferencias en el AUC, tanto entre cepas, como con
respecto a los correspondientes controles sin estresar (figura 27).
0
50
100
150
200
250
300
350
***
**
###
+ + - Estrés- 10 - Naloxona (10mg/Kg)
SDUW
AU
C
++++
Figura 27. Área bajo la curva del curso temporal (de 1 a 10 min) de AIE. Las barras representan los valores medios ± error estándar. En cada cepas las comparaciones entre los valores de AUC obtenidos con cada tratamiento se analizaron con un test Newman-Keuls, y las comparaciones entre cepas de los valores obtenidos con cada tratamiento se realizaron con el test de la t de Student. Los resultados se representan como: ** p<0.01, *** p<0.001 vs correspondientes controles no
140
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
estresados; + p<0.05, +++ p<0.001 vs animales estresados; ### p<0.001 SDU estrés vs W estrés. n=5-11 animales por grupo.
Dado que las condiciones del baño para originar estrés son generadoras de un
efecto antinociceptivo de naturaleza opioide (Tierney y cols., 1991; Vanderah y cols.,
1992) y que los resultados obtenidos demuestran que la naloxona suprime la AIE en
ambas cepas, se puede concluir que en la cepa SDU los sistemas opioides endógenos
responsables de la AIE son más efectivos que en W.
Existen trabajos que proponen la participación en este fenómeno de la β-
endorfina y la dinorfina, y otros que descartan la intervención de la proencefalina
(König y cols., 1996; Rubinstein y cols., 1996; McLaughlin y cols., 2003). En cuanto
al papel de los receptores opioides, se ha implicado a los tres tipos en la AIE, e
incluso se ha sugerido que éstos podrían variar en función del protocolo empleado y
de la edad del animal (Hart y cols., 1983; Panerai y cols., 1984; Calcagnetti y cols.,
1990; Kitchen y Piker, 1990; Menendez y cols., 1993). Así, parece que en el animal
adulto y cuando el estímulo es el baño, los receptores implicados serían los δ (Hart y
cols., 1983; Jackson y Kitchen, 1989; Kitchen y Piker, 1990; Vanderah y cols., 1992;
Mizoguchi y cols., 1997; LaBuda y cols., 2000). Por consiguiente, a pesar de no estar
completamente esclarecidos los mecanismos responsables de la AIE de naturaleza
opioide, se podría sugerir la posibilidad de que existiese una mayor actividad δ en la
cepa SDU. Por este motivo se decidió analizar este aspecto mediante la utilización de
un antagonista selectivo (apartado 4.2.2.1.1.).
4.2.2.- ESTUDIO IN VIVO DE LA IMPLICACIÓN DE LA MODULACIÓN
INTERRECEPTORIAL EN EL EFECTO ANTINOCICEPTIVO OPIOIDE.
Las evidencias que apoyan la existencia de una modulación interreceptorial
opioide en muchos de los efectos de estos fármacos, incluido el efecto
antinociceptivo, son numerosas (Vaught y Takemori, 1979; Heyman y cols., 1989;
Porreca y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1992; He y
Lee, 1998; Suzuki y cols., 2001; para revisión ver Smith y Lee 2003).
141
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las modulaciones entre receptores tanto locales en el SNC como
modulaciones entre receptores situados en distintos lugares del SNC, han sido
descritas por varios autores utilizando diferentes aproximaciones experimentales
(Vaught y Takemori, 1979; Yeung y Rudy, 1980; Roerig y Fujimoto, 1989; He y
Lee, 1998).
En el presente trabajo, se ha planteado la realización de estudios in vivo sobre
dicha modulación en ambas cepas de ratas, ya que algunas de las discrepancias entre
los distintos estudios previos, en estas modulaciones, podrían ser consecuencia de
diferencias entre las especies, o cepas de animales empleadas (He y Lee, 1998; Smith
y Lee, 2003).
4.2.2.1.- ANÁLISIS DEL PAPEL DE LOS RECEPTORES δ.
Como se ha comentado previamente, el sistema opioide δ parece estar
participando en fenómenos como la AIE, la respuesta nociceptiva a formalina, y la
potencia de morfina (Hart y cols., 1983; Jackson y Kitchen., 1989; Kitchen y Piker,
1990; Vanderah y cols., 1992, Ossipov y cols., 1996; LaBuda y cols., 2000; Hurley y
Hammond., 2001). Las diferencias detectadas en estos fenómenos en las ratas de la
cepa SDU, con respecto a las controles, justifica el planteamiento del estudio de una
posible hiperactividad δ como responsable, total o parcial, de estas diferencias.
4.2.2.1.1.- ANALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS.
La AIE puede ser de diferentes naturalezas. En el presente trabajo, el
protocolo empleado y los resultados obtenidos sugieren que en la cepa SDU exista
una mayor actividad del sistema δ (Kitchen y Pinker, 1990; Muhammad y Kitchen,
1993). Para analizar este aspecto se planteó el estudio del efecto de un antagonista δ
sobre la AIE.
Tras la administración de 1 mg/Kg de naltrindol los animales de la cepa SDU
presentaron valores de AUC significativamente inferiores a los de los
correspondientes animales que no recibieron antagonista (144±35.8 vs 250.2±38.0;
p<0.001), desapareciendo también con esta dosis de naltrindol las diferencias entre
142
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
cepas en el valor de AUC (SDU vs W: 144.4±35,8 vs 86,8±26,7; p>0.05), aunque los
valores de AUC siguieron siendo significativamente superiores a los controles sin
estresar (SDU: 144±35.8 vs 30.3±12.6; p<0.001 y W: 86.9±26.7 vs 22.7±8.9;
p<0.001). La administración de 2.5 mg/Kg de naltrindol originó valores del AUC en
la cepa SDU (82.9±28.6) y en la cepa W (50.4±13.0) similares entre sí y semejantes
a sus correspondientes controles sin estresar, pero significativamente menores
(p<0.001 y p<0.05, respectivamente) que los obtenidos en los animales controles
estresados (figura 28).
0
50
100
150
200
250
300
350 ###
***
***
******
+ + + - Estrés - 1 2.5 - Naltrindol (mg/Kg)
+++
+
SDUW
AU
C
+++
Figura 28. Área bajo la curva temporal de AIE. Las barras representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas de los valores de AUC se realizaron con el test de la t de Student, y en cada cepa las comparaciones entre cada uno de los tratamientos se realizaron con el test Newman-Kleus: ### p<0.001 SDU vs W; *** p<0.001 vs correspondientes controles no estresados; +++ p<0.001 y + p<0.05 vs estrés sin administración de naltrindol. n=5-11 animales por grupo.
143
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Dado que en este estudio, se ha utilizado naltrindol a dosis bajas, lo que
se asegura en gran medida su selectividad δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov
y cols., 1994, 1996; Suzuki y cols., 1997), se comprueba que la AIE provocada
está mediada por el receptor δ, puesto que es revertida por naltrindol en ambas
cepas de ratas, lo cual concuerda con trabajos previos (Hart y cols., 1983;
Jackson y Kitchen, 1989; Kitchen y Piker, 1990; Vanderah y cols., 1992;
Mizoguchi y cols., 1997; LaBuda y cols., 2000). Dichos resultados indican así
mismo que las diferencias entre estas cepas en la AIE, se deben a una mayor
activación de los receptores δ en SDU, ya que éstas desaparecen con
naltrindol.
4.2.2.1.2.- SENSIBILIDAD NOCICEPTIVA BASAL EN EL TEST DE LA
FORMALINA.
Distintos estudios, tanto farmacológicos como con animales knockout, han
implicado en mayor o menor medida a los receptores opioides δ en el tono
inhibitorio de la nocicepción en el test de la formalina (Ossipov y cols., 1996; Wu y
cols., 2002; Martin y cols., 2003b). Las diferencias detectadas en la respuesta
nociceptiva a formalina al 2.5%, entre las cepas estudiadas, especialmente en la
interfase (apartado 4.1.1.3.), unido a que las ratas SDU presentan una mayor AIE que
las W, que es mediada por receptores δ (apartado 4.2.2.1.1.), justifica la necesidad de
valorar el efecto de naltrindol sobre la nocicepción inducida por formalina.
En este trabajo, los experimentos realizados mostraron que durante la fase de
respuesta aguda, la administración de naltrindol (1 mg/Kg) no modificó el efecto
nociceptivo de formalina (2.5%) con respecto a los controles (formalina 2.5% vs
formalina 2.5% + naltrindol; SDU: 257±18 vs 316±60 s; p>0.05, W: 452±39 vs
508±30 s; p>0.05). Además, las diferencias significativas entre cepas en la respuesta
nociceptiva aguda que aparecían con formalina (2.5%), siguen apareciendo con la
administración de naltrindol (p<0.01) (figura 29).
Sin embargo, durante la fase de respuesta nociceptiva tónica, la
administración de naltrindol (1 mg/Kg) indujo en ambas cepas de animales un
144
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
aumento significativo de la respuesta con respecto a los animales que no recibieron
este fármaco (formalina 2.5% vs formalina 2.5% + naltrindol; SDU: 2369±129 vs
2783±62 s; W: 2722±51 vs 2896±20 s; p<0.05 en ambos casos). Con la
administración de este antagonista desaparecieron las diferencias en la respuesta
entre ambas cepas de ratas (figura 29).
145
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A
F2.5% F2.5%+NTI0
250
500
750SDUW
****
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
B
F2.5% F2.5%+NTI
*#
#
2200
2400
2600
2800
3000
Tiem
po d
e la
mid
o +
elev
ació
n (s
eg)
Figura 29. Acción del antagonista δ naltridol sobre el efecto nociceptivo en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas para los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada se analizaron con el test de la t de Student: * p<0.05, ** p<0.01 SDU vs W, # p<0.05 vs respectivos controles sin naltrindol. n=6 animales por grupo.
146
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por lo tanto, en el presente estudio la administración de naltrindol, a una dosis
selectiva para el receptor δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1994, 1996),
produce en ambas cepas de ratas un incremento de la respuesta nociceptiva a
formalina en la segunda fase, haciendo desaparecer las diferencias entre cepas, sin
que se produzca modificación alguna de la respuesta en la primera fase. Estos
resultados son concordantes con lo previamente descrito por Ossipov y cols. (1996),
en el sentido de que el bloqueo del receptor δ produce un aumento en la respuesta
nociceptiva de las ratas en en la fase tónica. Sin embargo, en el estudio de Wu y cols.
(2002), realizado en ratón, no observan este efecto con naltrindol (tanto tras
administrarlo vía i.c.v. como i.t.), aunque sí que observan este aumento de la
nocicepción con la administración i.t. del antagonista δ1 BNTX (7-benciliden
naltrexamina). Las diferencias entre los resultados presentados aquí y los descritos
por Ossipov y cols. (1996), con respecto a los descritos en el trabajo de Wu y cols.
(2002), podrían ser debidas a la distinta vía de administración utilizada para este
antagonista δ, máxime cuando se ha descrito la posibilidad de que el efecto
antinociceptivo de fármacos opioides como la morfina y la loperamida en este test
pueda estar mediado tanto a nivel periférico y a nivel central (Shannon y Lutz, 2002),
sin olvidar la importancia en estos estudios de la especie de animales utilizada.
Como previamente se ha mencionado, el periodo entre ambas fases
corresponde a una inhibición activa del dolor, y el estrés puede originar una
prolongación en la interfase en este test. De manera que, si la respuesta nociceptiva
se determina en un periodo que se solapa con el periodo de interfase, el nivel de
nocicepción puede parecer menor debido al retraso en la aparición de la segunda fase
(Abbott y cols., 1995; Henry y cols., 1999). Por estos motivos, con el fin de conocer
si el incremento en la nocicepción en la fase tónica originado por naltrindol es debido
a un efecto sobre la interfase fruto de la inhibición del efecto del estrés, como sugiere
Abbott y cols. (1995), se realizó un análisis de la evolución temporal del efecto de
naltrindol sobre la nocicepción en este test.
147
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La administración de naltrindol, tanto en SDU como en W, originó curvas
temporales de nocicepción significativamente diferentes a las correspondientes a los
animales de la misma cepa que no recibieron la administración del antagonista. Así,
se originó un incremento significativo del tiempo de lamido y elevación de la pata en
el periodo de 15 minutos tras la inyección de la formalina en la cepa W (284.3±6.0
vs 205.5±30.6 s; p<0.01) y un incremento significativo de la respuesta nociceptiva a
los 15, 20 y 25 minutos tras la inyección de formalina en SDU (224.7±42.1 vs
101.8±50.8; p<0.01, 283.7±13.2 vs 104.2±48.2; p<0.001 y 291.5±6.5 vs 187.7±39.3
s; p<0.05, respectivamente) (figura 30).
148
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A
0 10 20 30 40 50 60 700
100
200
300
400
W F2.5%W F2.5% + NTI
**
tiempo tras formalina (min)
tiem
po d
e el
evac
ión
yla
mid
o (s
eg)
B
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Tiempo F(11, 120)=4.56 p<0.001Trat. F(1, 120)=12.32 p<0.001
Tiempo-Trat. F(11, 120)=1.11 n.s.
149
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0 10 20 30 40 50 60 700
100
200
300
400 SDU F2.5% + NTISDU F2.5%
****
*
*
tiempo tras formalina (min)
tiem
po d
e el
evac
ión
yla
mid
o (s
eg)
Figura 30. Efecto de la adiministración de naltrindol (1 mg/Kg) sobre la evolución temporal del efecto nociceptivo de formalina al 2.5% en ratas de la cepa W (A) y SDU (B). Los puntos representan valores medios ± error estándar. El análisis de los resultados se realizó con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las correspondientes tablas. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p< 0.01 y *** p<0.001, formalina vs formalina + naltrindol. n=6 animales por grupo.
Al comparar las curvas obtenidas en ambas cepas tras la administración de
naltrindol, se observó que las curvas son distintas en ambas (figura 31). Además, la
cepa SDU presentó una respuesta nociceptiva significativamente menor que la cepa
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Tiempo F(11, 120)=14.01 p<0.001Tratamiento F(1, 120)=19.56 p<0.001Tiempo-Trat. F(11, 120)=2.97 p<0.01
150
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
W a los 10 minutos tras la inyección de formalina (116.2±59.5 vs 240.8±46.7 s;
p<0.001).
0 10 20 30 40 50 60 700
100
200
300
400SDUW**
*
tiempo tras formalina (min)
tiem
po d
e el
evac
ión
yla
mid
o (s
eg)
Figura 31. Efecto nociceptivo de la inyección de formalina al 2.5% tras la adiministración de naltrindol (1 mg/Kg). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. El análisis de los resultados se realizó con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las correspondientes tablas. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la
Factor F (g.l. factor,
residual)
Valor p
Tiempo F(11, 120)=5.63 p<0.001Cepa F(1, 120)=8.10 p<0.01
Tiempo-Cepa F(11, 120)=1.99 p<0.05
151
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: *** p<0.001, SDU vs W. n=6 animales por grupo.
152
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por lo tanto, en las dos cepas de ratas en estudio la administración de
naltrindol produjo una disminución en la duración de la interfase. Esta disminución
fue más acusada en la cepa SDU que en la cepa W, puesto que en la primera se
produjo un incremento significativo de la respuesta nociceptiva en tres periodos de 5
minutos tras la interfase mientras que en la segunda tan solo tuvo lugar en uno de
ellos. De manera que la mayor duración de la interfase de la respuesta nociceptiva a
formalina en SDU, con respecto a W, es revertida por naltrindol.
Se ha sugerido, que el estrés puede originar una prolongación de la interfase
(Abbott y cols., 1995). Así, el hecho de que el naltrindol revierta esta mayor
duración, abre la posibilidad de establecer un cierto paralelismo entre estos
resultados y los resultados de AIE (apartado 4.2.2.1.1.). Por lo tanto, podría
especularse que las ratas al ser expuestas a un lugar nuevo (caja de observación) y/o
al ser sometidas a la sujeción necesaria para posibilitar al operador realizar la
inyección de formalina, experimentasen un estrés que, principalmente a través de
receptores δ, originase un efecto antinociceptivo, más acusado y duradero en los
animales de la cepa SDU que en los de la cepa W.
Como previamente se ha mencionado, la respuesta nociceptiva a la formalina
es bifásica, coincidiendo temporalmente con la actividad de las neuronas
convergentes de la raiz dorsal (Dubuisson y Dennis, 1977; Dickenson y Sullivan,
1987). La inhibición de la nocicepción que supone la interfase, coincide
temporalmente con la liberación segmental de metencefalina en la médula espinal
(Bourgoin y cols, 1990). Teniendo en cuenta que en el test de la formalina, al utilizar
concentraciones de 2.5%, la interfase es mayor y más duradera en SDU que en W, y
que con el antagonista selectivo δ naltrindol se revierte esta mayor duración, se
podría especular que en las ratas SDU la actuación de este opioide endógeno es
mayor que en las ratas W. Apoyando esta hipótesis, recientemente se ha demostrado
mediante técnicas autorradiográficas que las ratas de la cepa SDU poseen niveles
detectables del receptor NPFF1 a nivel cervical, torácico y lumbar de la médula
espinal, mientras que en las ratas de la cepa W estos receptores no son detectables
(Gouardères y cols., 2004). Además, se sabe que el efecto antinociceptivo de la
153
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
administración espinal de (1DMe)NPYF (análogo del neuropéptido FF) está mediado
por la activación de receptores δ, y que la administración i.t. de neuropéptido FF
promueve la liberación espinal de metencefalina, antagonizándose esta liberación por
naltrindol y por nor-BNI (Ballet y cols., 1999; Xu y cols., 2001). Con todo ello se
podría hipotetizar que la mayor activación de los receptores δ en las ratas SDU
durante la interfase se debe a una mayor liberación de metencefalina, que estaría
originada por las mayores densidades de receptor NPFF1, posibilidad que deberá ser
estudiada en un futuro.
4.2.2.1.3.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE MORFINA.
La morfina es un agonista que presenta preferencia por los receptores µ,
frente a los δ y los κ. A pesar de poseer cierta selectividad in vitro (70 y 38 veces
más afín por los receptores µ que por los δ y κ respectivamente), no es un fármaco
selectivo µ in vivo (Matthes y cols., 1998). Mediante estudios con animales knockout
se ha demostrado que el receptor µ es el principal implicado en los efectos
antinociceptivos de morfina, ya que en el knockout del receptor δ y en el del κ no se
modifica su efecto antinociceptivo, pero éste es suprimido en el knockout del
receptor µ (Mattes y clos., 1996; Simonin y cols., 1998; Zhu y cols., 1999). Sin
embargo, mediante estudios farmacológicos, se ha descrito que en determinadas
circunstancias los receptores δ también intervienen en este efecto farmacológico,
abriéndose la posibilidad de que exista una modulación biológica de dicho efecto a
través de estos receptores opioides (Takemori and Portoghese, 1987; Heyman y cols.,
1987; Kiefel y cols., 1993; Tiseo y Yaksh, 1993; Ossipov y cols., 1995b). Por ello, y
considerando el efecto de naltrindol sobre la AIE y sobre la sensibilidad nociceptiva
basal en el test de la formalina obtenidos en este estudio (apartados 4.2.2.1.1. y
4.2.2.1.2.), se planteó el estudio de la posible implicación de la modulación del
efecto antinociceptivo de morfina a través del receptor δ en las diferencias entre estas
cepas.
En la cepa de ratas W la administración de naltrindol, a dosis de 10 mg/Kg,
no modificó la curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina, ni se modificó de
forma significativa el valor estimado de DE50 con la administración del antagonista δ
154
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
(DE50, morfina+naltrindol vs morfina: 1.70±0.03 vs 1.45±0.06; p>0.05). En la cepa
SDU, la administración de este antagonista δ desplazó la curva a la derecha,
apareciendo un efecto significativo del tratamiento. Así, para la cepa SDU la DE50
estimada de morfina tras la coadministración de naltrindol fue significativamente
superior a la estimada sin antagonista (1.40±0.12 vs 0.66±0.04 mg/Kg; p<0.05).
Además, en SDU, los valores de %MEP obtenidos con la administración de 1.2 mg/
Kg de morfina se reducen de forma significativa al administrar naltrindol (44.0±15.0
vs 76.4±5.1%; p<0.05). Con el tratamiento previo de naltrindol desaparecieron las
diferencias significativas (F1, 30 = 0.075; p>0.05) en las curvas dosis-efecto
antinociceptivo de morfina entre los animales de ambas cepas tratados con naltrindol,
así como entre las correspondientes DE50 (figura 32).
155
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Factor F(g.l.factor,
residual)
Valor pSD
U Dosis F(2, 37)=10.61 p<0.001Tratamientos F(1, 37)=5.71 p<0.05Dosis-Tratam. F(2, 37)=1.57 n.s.
W Entre dosis F(2, 36)=30.56 p<0.001Entre tratamientos F(1, 36)=0.20 n.s.In. Tratam.-Dosis F(2, 36)=0.17 n.s.
1 100
20
40
60
80
100
SDUWSDU morfina + NTIW morfina + NTI
*
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 32. Efecto de la administración de naltrindol (10 mg/Kg) sobre las curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05 SDU morfina vs SDU morfina + naltrindol. n=5-11 animales por dosis y cepa.
156
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estos resultados demuestran que en la cepa de ratas SDU, pero no en la cepa
W, los receptores δ juegan un importante papel en el efecto antinociceptivo del
agonista µ, morfina, puesto que el naltrindol a una dosis selectiva sobre el receptor δ
(Portoguese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1995b; Ossipov y cols., 1996), produce
una disminución del efecto antinociceptivo de este opioide. Además, el hecho de que
en los animales de la cepa W, esta misma dosis de antagonista no origine
disminución alguna del efecto antinociceptivo de morfina, apoya la idea de que el
antagonismo observado en SDU, es por actuación δ y no es debido a la actuación
directa del naltrindol sobre el receptor µ.
Una posible explicación a estos resultados es que en los animales de la cepa
SDU la morfina, debido a su baja selectividad, además de activar los receptores µ,
estuviese actuando también sobre los δ. Sin embargo, el hecho de que un agonista µ,
como 3-d, que presenta una gran selectividad por el receptor µ (Javerovic y cols.,
2002), presente también una mayor potencia antinociceptiva en la cepa SDU que en
la W hace rechazar esta suposición. Como se verá más adelante (apartado 4.3.2.3.),
basándose en los resultados de los experimentos de unión de radioligando, podría
hipotetizarse que en los animales de la cepa SDU los agonistas µ actúen además de
sobre los receptores µ, mediante la activación de otro sitio que también es reconocido
por el naltrindol.
Otra posible justificación es que en los animales SDU la administración de
morfina, bien por la propia acción del fármaco o por el estrés derivado de la
administración, origine una liberación de agonistas endógenos δ. En este sentido,
distintos autores han descrito, bajo determinadas circunstancias, el antagonismo del
efecto antinociceptivo de morfina con antagonistas δ, así como de otros agonistas µ
como la endomorfina-2, el sufentanilo, o la β-endorfina, habiéndose sugerido en
algunos de estos casos que el agonista µ utilizado promueve la liberación de
encefalinas que colaboran en el efecto antinociceptivo actuando sobre los receptores
δ (Takemori y Portoghese, 1987; Heyman y cols., 1987; Kiefel y cols., 1993; Tiseo y
Yaksh, 1993; Tseng y Collins, 1994; Ossipov y cols., 1995b; Verborgh y Meert.,
1999; Sakurada y cols., 2001; Ohsawa y cols., 2000). Así, por ejemplo se ha
157
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
demostrado que la β-endorfina, y la endomorfina-2 actúan a nivel supraespinal
estimulando la liberación espinal de metencefalina, que a su vez actuando sobre los
receptores δ contribuye al efecto antinociceptivo de estos fármacos (Tseng y Collins,
1994; Ohsawa y cols., 2000; Sakurada y cols., 2001). Si bien en el caso de morfina
no ha sido demostrado que promueva la liberación de encefalinas o dinorfina a nivel
espinal, se ha observado la modulación de la liberación de encefalinas por morfina,
en tejidos como el íleon, y en un área implicada en la nocicepción como el pallidum
(Tseng y cols., 1985; Xu y cols., 1989; Anagnostakis y cols., 1992; Tseng y Collins,
1993; Olive y cols., 1995).
4.2.2.1.4.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE U50488H.
El U50488H es un agonista selectivo κ, el cual carece de efecto
antinociceptivo en los ratones knockout del receptor κ, pero sí lo produce en los
carentes del receptor δ o µ, lo que apoyaría que tan solo el receptor κ estuviese
implicado en su efecto (Von Voigtlander y cols., 1983; Simonin y cols., 1998;
Matthes y cols., 1998; Zhu y cols., 1999). Sin embargo, en otros estudios se ha
descrito la modulación del efecto antinociceptivo de agonistas κ por la
coadministración de agonistas δ (Miaskowski y cols., 1990). Por ello, también se
podría suponer que en la cepa de ratas SDU existiese una mayor activación δ que
modulase y explicase la mayor sensibilidad al efecto antinociceptivo de este agonista
κ. Con el siguiente experimento se pretendió analizar esta posibilidad, determinando
el efecto de la administración de un antagonista selectivo δ sobre la antinocicepción
producida por este agonista κ en los animales de la cepa SDU.
En los animales de la cepa SDU, la administración de 10 mg/Kg de naltrindol,
produjo un descenso significativo del efecto antinociceptivo de 19 mg/Kg de
U50488H (15.9±6.9 vs 50.6±14.1%; p<0.05) (figura 33). Este experimento no se
realizó en animales de la cepa W debido a que el agonista κ, a las dosis utilizadas, no
produjo efecto antinociceptivo en esta cepa (apartado 4.2.1.2).
158
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
U50 U50+NTI0
20
40
60
80
100
*
%M
EP
Figura 33. Efecto de la administración de naltrindol (10 mg/Kg) sobre el efecto antinociceptivo de U50488H (19 mg/Kg) en SDU evaluado en el test TF. Las barras representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones de los valores de %MEP, se analizaron con el test de la t de Student: *p<0.05 SDU U50488H vs SDU U50488H + naltrindol. n=7-8 animales por tratamiento.
Puesto que en la cepa de ratas SDU el naltrindol, a una dosis selectiva sobre
el receptor δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1996), antagonizó de forma
significativa el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H, los resultados
obtenidos en este experimento sugieren que en estas ratas el receptor δ juega un
papel relevante en el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H. Si bien
diversos estudios realizados en ratón no han encontrado modificación del efecto
antinociceptivo de U50488H al administrar naltrindol, oligodesoxinucleótidos contra
el RNAm del receptor δ, o al escindir este receptor, otros estudios farmacológicos en
rata muestran que el efecto antinociceptivo de este agonista κ es antagonizado en
parte por la administración de naltrindol (Portoghese y cols., 1988; Tseng y Collins,
1994; Endoh y cols., 1999; Zhu y cols., 1999; Craft y cols., 2001).
159
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Una posibilidad para explicar los resultados de este experimento, es que el
U50488H a la dosis utilizada (19 mg/Kg), haya perdido su selectividad y actúe
directamente sobre el receptor δ, sin embargo el antagonista selectivo κ nor-BNI a
dosis selectivas de este receptor bloquea completamente su efecto antinociceptivo
(apartado 4.2.2.2.1.). Otra posible explicación, basada en los resultados de los
experimentos de unión de radioligando (apartado 4.3.2.3.), sería que en los animales
de la cepa SDU el U50488H además de sobre el receptor κ, estuviese actuando sobre
otro estado de este receptor (dímero δ-κ), que fuese también reconocido por el
naltrindol.
Teniendo en cuenta que la coadministración de dosis subefectivas de un
agonista δ potencia el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H (Miaskowki y
cols., 1990), una tercera hipótesis sería que en la cepa de ratas SDU la administración
de este opioide promoviera una liberación de ligandos endógenos, que al actuar sobre
el receptor δ cooperaran al efecto antinociceptivo de este fármaco. Se ha descrito que
los agonistas κ bremazocina y U50488H promueven la liberación espinal de
dinorfina que contribuye a su efecto antinociceptivo, pero tan solo se ha demostrado
liberación de metencefalina con bremazocina (Tseng y Collins, 1993). Como se ha
comentado anteriormente, el estrés promueve la liberación de opioides endógenos, y
se ha comprobado que en las ratas SDU, como consecuencia del estrés, se produce
una mayor analgesia mediada por receptores opioides δ que en las W (apartado
4.2.2.1.1.). Por ello, también podría especularse la posibilidad de que la liberación de
estos opioides endógenos fuese debida al efecto del estrés originado en el animal por
su manipulación, y por consiguiente la mayor actividad δ, debida al estrés en las
ratas SDU, originase una mayor potenciación del efecto antinociceptivo del agonista
κ.
4.2.2.2.- ANÁLISIS DEL PAPEL DE LOS RECEPTORES κ.
Como ya se ha comentado, en las ratas SDU el efecto antinociceptivo de
U50488H fue revertido por naltrindol, sugiriendo la posibilidad de que éste fuese
producido por la activación de los receptores δ (apartado 4.2.2.1.4.). Además,
también se ha comentado con anterioridad, la modulación del efecto antinociceptivo
160
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de agonistas µ por agonistas κ (Miaskowski y cols., 1992). Estos hechos justifican el
estudio del papel de los receptores κ en el efecto antinociceptivo de U50488H y de
morfina, mediante el uso del antagonista selectivo nor-BNI.
4.2.2.2.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE U50488H.
Como se ha descrito en el apartado 4.2.2.1.4., en la cepa de ratas SDU el
efecto antinociceptivo del agonista κ fue revertido con la administración de un
antagonista δ. Ello podría deberse a que el U50488H estuviese actuando sobre el
receptor δ. Con el fin de comprobar esta posibilidad, se determinó el efecto de la
administración del antagonista κ nor-BNI sobre la antinocicepción inducida por
U50488H.
La administración del antagonista selectivo κ nor-BNI, a una dosis selectiva
sobre el receptor κ (Takemori y cols., 1988), originó en la cepa de ratas SDU un
descenso significativo del efecto antinociceptivo de este fármaco (8.8±8.8 vs
50.6±6.9%; p>0.05) (figura 34). Al igual que en el apartado 4.2.2.1.4., este
experimento no se realizó en ratas W debido a que en esta cepa de animales no se
obtuvo efecto antinociceptivo con las dosis utilizadas de agonista κ.
161
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
U50 U50+nor-BNI0
20
40
60
80
100
*
%M
EP
Figura 34. Efecto de la administración de nor-BNI (9.04 mg/Kg) sobre el efecto antinociceptivo de U50488H (19 mg/Kg) en SDU evaluado en el test TF. Las barras representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones de los valores de %MEP, se analizaron con el test de la t de Student: SDU U50488H vs SDU U50488H + nor-BNI *p<0.05. n=6-7 animales por tratamiento.
Por consiguiente, estos resultados confirman que la activación de los
receptores opioides κ es precisa para que el U50488H ejerza su efecto
antinociceptivo en las ratas SDU, con independencia de que también sea necesaria la
activación de los δ, como se desprende de los resultados del apartado 4.2.2.1.4.
4.2.2.2.2.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE MORFINA.
La morfina es un fármaco opioide que interactúa con los tres receptores
aunque con diferente afinidad. Se ha demostrado que el receptor µ es el principal
responsable de su efecto antinociceptivo, aunque también se ha sugerido que los
receptores κ también podrían intervenir en este efecto en determinadas circunstancias
(Kest y cols., 1993; Mattes y clos., 1996; Simonin y cols., 1998; Zhu y cols., 1999;
162
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Omiya y cols., 2000), y que a través del receptor κ se puede modular el efecto
antinociceptivo de los agonistas µ (Miaskowski y cols., 1992). Con el fin de
determinar la participación de la actividad del sistema κ en la mayor potencia
antinociceptiva de morfina en la cepa SDU, se analizó el efecto la nor-BNI sobre la
antinocicepción inducida por morfina en ambas cepas de ratas.
En la cepa de ratas W la administración de nor-BNI, a dosis de 9.04 mg/Kg,
no modificó la curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina, ni la DE50 estimada
(DE50, morfina+nor-BNI vs morfina: 1.57±0.10 vs 1.45±0.06; p>0.05). En la cepa
SDU, la administración de este antagonista κ desplazó significativamente la curva a
la derecha. Así, para la cepa SDU la DE50 estimada de morfina tras la
coadministración de nor-BNI fue significativamente superior que la estimada sin el
antagonista (DE50=1.26±0.21 mg/Kg con nor-BNI y 0.66±0.04 mg/Kg sin nor-BNI;
p<0.05). Además, en SDU, los valores de %MEP obtenidos con la administración de
1.2 mg/Kg de morfina se reducen de forma significativa al administrar nor-BNI
(32.6±10.2 vs 76.4±5.1%; p<0.001). Con el tratamiento previo con nor-BNI
desaparecieron las diferencias significativas entre ambas cepas (F1, 42 = 1.21; p>0.05)
en las curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina, así como entre las
correspondientes DE50 estimadas (figura 35).
163
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Factor F(g.l.factor,
residual)
Valor pSD
U Dosis F(3, 54)=19.27 p<0.001Tratamientos F(1, 54)=11.34 p<0.01Dosis-Tratam. F(3, 54)=2.09 n.s.
W Entre dosis F(2, 44)=18.70 p<0.001Entre tratamientos F(1, 44)=0.00 n.s.In. Tratam.-Dosis F(2, 44)=0.61 n.s.
1 50
20
40
60
80
100SDU morfina+nor-BNIW morfina +nor-BNISDUW
***
Dosis de morfina (mg/Kg)
%M
EP
Figura 35. Efecto de la administración de nor-BNI (9.04 mg/Kg) sobre las curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ***p<0.001 SDU morfina vs SDU morfina + nor-BNI. n= 5-12 animales por dosis y cepa.
164
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de este experimento demuestran que los receptores κ también
están involucrados en la mayor potencia antinociceptiva del agonista µ morfina,
puesto que la nor-BNI, a una dosis selectiva sobre el receptor κ (Takemori y cols.,
1988) produce una disminución del efecto antinociceptivo de este opioide en SDU
sin modificarlo en las ratas W. Además, el hecho de que en los animales de la cepa
W esta dosis de nor-BNI no origine disminución alguna del efecto antinociceptivo
de morfina, sugiere que el antagonismo observado en SDU, es por actuación κ y no
es debido a la actuación directa del naltrindol sobre el receptor µ.
Una posible explicación a estos resultados, podría ser que en la cepa SDU se
produjese una mayor activación endógena del receptor κ, que potenciase el efecto de
morfina. A este respecto, se ha apuntado que determinados agonistas µ, como
endomorfina-2 y [Dmt(1)]DALDA, promueven la liberación espinal de dinorfina,
que participa en el efecto antinociceptivo (Ohsawa y cols., 2000; Ohsawa y cols.,
2001; Sakurada y cols., 2001; Szeto y cols., 2003). Si bien no se ha podido demostrar
que morfina promueva la liberación de este péptido endógeno a nivel espinal (Tseng
y Collins, 1993; Szeto y cols., 2003), sí se ha demostrado en otros lugares del SNC
como la substancia nigra (You y cols., 1996), que es un área encefálica implicada en
la nocicepción (Baumeister y cols., 1987). Sin embargo, se ha descrito que las
dinorfinas presentan efectos antinociceptivos y efectos pronociceptivos (Herman y
Goldstein, 1985; Fujimoto y cols., 1990; Tseng y Collins, 1993), resultando difícil
interpretar esta posibilidad. En cualquier caso, estos resultados muestran que la
activación de los receptores κ colabora con el efecto antinociceptivo de morfina en la
cepa de ratas SDU, originando una mayor potencia antinociceptiva de este fármaco
en esta cepa con respecto a la W.
Una interacción δ-κ, parecida a la encontrada en este proyecto, se ha descrito
en ratas hembra durante el periodo de gestación o al recibir continuadamente 17-β-
estradiol y progesterona. En estas circunstancias, se produce una hipoalgesia que
puede ser revertida por antagonistas δ o κ vía i.t., por lo que los autores sugieren que
para que tenga lugar este efecto antinociceptivo, se precisa una activación conjunta
por agonistas endógenos de ambos receptores (Dawson-Basoa y Gintzler, 1998). Sin
165
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
embargo, en trabajos previos de estos autores, si bien se observa que dicho fenómeno
produce una potenciación del efecto antinociceptivo de un agonista κ por vía i.t., no
se origina modificación alguna del efecto de un agonista µ (Dawson-Basoa y
Gintzler, 1996).
Globalmente, los resultados obtenidos en el presente estudio, presentan una
similitud sorprendente con los descritos previamente en el modelo de ratones HA y
LA. Los ratones HA, muestran una mayor sensibilidad al efecto antinociceptivo de
U50488H en tests térmicos, y al de morfina tanto en test térmicos, como en la
segunda fase del test de la formalina, aunque no en la primera. Además, esta cepa
posee una mayor AIE que la LA, y la nor-BNI revierte su mayor sensibilidad a la
antinocicepción de morfina (Panocka y cols., 1986; Marek y cols., 1992; Kest y cols.,
1993; Lutfy y cols., 1996). Por otro lado, también se ha comprobado que estos
ratones no difieren entre sí en la dependencia física a morfina (Kest y cols., 1998b).
Por lo tanto, esta gran similitud sugiere la existencia de una correlación inter-especie
entre los fenómenos observados y la/s causa/s de éstos. En este sentido, en el estudio
realizado por Mogil y cols. (1995) se propone que las acciones de 1 ó 2 locus
genéticos son capaces de aportar a los ratones HA una elevada sensibilidad a la AIE,
y a la originada por agonistas µ y κ. Por lo tanto, esta similitud entre modelos de
especies diferentes podría sugerir que este/os locus genético/s se conservan entre
estas dos especies proporcionando también esta sensibilidad a las ratas de la cepa
SDU.
En cualquier caso, la cooperación interreceptorial de receptores κ y δ con los
receptores µ, encontrada en las ratas SDU, es la base de la variabilidad a las
respuesta antinociceptiva de morfina observada en este estudio. Si bien, en estos
animales el receptor δ también parece estar implicado en las diferencias detectadas
en otras respuestas como AIE y nocicepción basal a la formalina.
166
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.- CARACTERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES OPIOIDES MEDIANTE
ESTUDIOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDO.
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo, permitían plantear la
hipótesis de que los mismos pudieran deberse a diferencias en la densidad de los
distintos tipos de receptores opioides o en la afinidad de los ligandos por éstos. Por
ello se planteó inicialmente el estudio de las densidades de los distintos tipos de
receptores, así como su afinidad por distintos agonistas y antagonistas, mediante
estudios de unión de radioligando. Para ello, se utilizó los agonistas [3H]DAMGO y
[3H]U69593 y el antagonista [3H]naltrindol, como radioligandos µ, κ y δ
respectivamente.
Con el fin de determinar el rango de concentración de proteínas a utilizar, en
experimentos previos se determinó la relación entre fijación específica de
radioligando y la concentración de proteína. Se obtuvo una relación lineal (r2>0.95)
hasta valores de proteína de 3000, 1500 y 700µg/ml para [3H]DAMGO, [3H]U69593
y [3H]naltrindol, respectivamente.
4.3.1.- DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE LOS RADIOLIGANDOS Y
DE LA DENSIDAD DE RECEPTORES: ESTUDIOS DE SATURACIÓN.
Desde hace años se ha sugerido la posibilidad de que exista una relación entre
la densidad de receptores opioides y la sensibilidad al efecto antinociceptivo de estos
fármacos (Robson y cols., 1985). Por lo tanto, con el fin de analizar en nuestro
modelo si la diferente potencia antinociceptiva de los agonistas µ y κ se debe a
diferencias en la densidad o afinidad de estos receptores, se procedió a determinar
ambos parámetros mediante estudios de unión de radioligando en membranas
cerebro de ambas cepas de ratas, tal y como se describe en el apartado 3.2.3.3.
Además, se estudio la densidad y afinidad de los receptores δ con el fin de
comprobar si las posibles diferencias en la densidad o afinidad de estos receptores
pudieran estar modulando los efectos mediados por los receptores µ y κ.
167
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1.1.- SATURACIÓN DE [3H]DAMGO.
El [3H]DAMGO, en un rango de 0.03 a 10nM, se unió de modo creciente a
las membranas de cerebro utilizadas. La fijación inespecífica fue lineal en el rango
de concentraciones utilizadas (r = 0.99), constituyendo entre un 6 y un 25%. A las
concentraciones utilizadas, el [3H]DAMGO muestra una unión específica que se
satura a concentraciones de aproximadamente 3.5nM (figura 36).
En ambas cepas de ratas los datos experimentales ajustaron
significativamente a un modelo de un sitio de unión, siendo los valores de Kd y de
Bmax obtenidos similares en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas
(tabla VIII). Por lo tanto no aparecieron diferencias entre los animales de las cepas
SDU y W en la densidad de receptores µ en membranas de cerebro, ni en la afinidad
del radioligando por este receptor (figura 36 y tabla VIII).
168
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0 2 4 6 8 100
50
100
150
200
250
300
Concentración [3H]DAMGO (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
0 2 4 6 8 100
50
100
150
200
250
300
Concentración [3H]DAMGO (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
Figura 36. Saturación de la unión de [3H]DAMGO en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.
169
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1.2.- SATURACIÓN DE [3H]U69593.
En la figura 37 se muestra la unión de concentraciones crecientes de
[3H]U69593, en un rango de 0.1 a 17nM, con membranas de cerebro de ratas de
ambas cepas. La fijación inespecífica fue lineal en el rango de concentraciones
utilizadas (r = 0.99), constituyendo aproximadamente entre un 25 y un 60% de la
unión total. A las concentraciones utilizadas, el [3H]U69593 muestran una unión
específica que se satura a concentraciones de aproximadamente 5nM.
En las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas los datos
experimentales ajustaron significativamente a un modelo de un sitio de unión. Los
valores de Kd y de Bmax obtenidos fueron similares en las membranas de cerebro
correspondientes a ambas cepas de ratas (tabla VIII). Por consiguiente, como en el
caso anterior, no se observan diferencias entre las membranas de cerebro de los
animales de las cepas SDU y W, ni en la densidad de receptores κ, ni en la afinidad
del radioligando por este receptor (figura 37 y tabla VIII).
170
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1 3 5 7 9 11 13 150
25
50
75
Concentración [3H]U69593 (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
0 5 10 15 200
102030
B (fmol/mg)
B/F
1 3 5 7 9 11 13 150
25
50
75
Concentración [3H]U69593 (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
0 5 10 15 200
102030
B (fmol/mg)
B/F
Figura 37. Saturación de la unión de [3H]U69593 en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.
171
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1.3.- SATURACIÓN DE [3H]NALTRINDOL.
La incubación de membranas de cerebro de ambas cepas de ratas con
concentraciones crecientes de [3H]naltrindol, desde 0.02 a 0.8nM, originó la unión
específica de este radioligando. La fijación inespecífica fue lineal en el rango de
concentraciones utilizadas (r = 0.99), constituyendo aproximadamente entre un 20 y
un 60% de la unión total. A las concentraciones utilizadas, la unión específica de
[3H]naltrindol se saturó a concentraciones de aproximadamente 0.2nM.
En ambas cepas de ratas los datos experimentales se ajustaron a un modelo de
un sitio de unión. Los valores de Kd y de Bmax obtenidos fueron similares en las
membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (tabla VIII), sugiriendo que no
existen diferencias, entre ambas cepas, ni en la densidad de receptores δ, ni en la
afinidad del radioligando por este receptor (figura 38 y tabla VIII).
172
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
100
200
300
400
Concentración [3H]NTI (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
0 20 40 60 800
10002000
B (fmol/mg)B/
F
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
100
200
300
400
Concentración [3H]NTI (nM)
Uni
ón (f
mol
/mg)
0 20 40 60 800
10002000
B (fmol/mg)
B/F
Figura 38. Saturación de la unión de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.
173
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla VIII. Valores de Kd de los tres radioligandos utilizados y densidad de receptores en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.
[3H]Ligando Cepa Kd (nM) Bmax (fmol/mg proteína)
[3H]DAMGO SDU 0.65±0.06 138.0±3.1W 0.58±0.07 133.4±3.9
[3H]naltrindol SDU 0.034±0.008 73.1±3.1W 0.031±0.007 75.2±3.8
[3H]U69593 SDU 0.92±0.21 16.3±4.5W 0.88±0.13 19.6±2.8
Los resultados de estos experimentos muestran valores de afinidad y densidad
de receptores µ, κ y δ semejantes en las membranas de cerebro de ambas cepas, y
similares a los descritos previamente por otros autores en cerebro de rata, y en
receptores clonados de rata expresados en células de mamíferos (Nock y cols., 1990;
Yamamura y cols., 1992; Wang y cols., 1993; Meng y cols., 1993; Albrecht y cols.,
1997; Clark y cols., 1997). En el presente trabajo, las densidades de los receptores µ,
κ y δ, y las afinidades de los distintos radioligandos son similares en ambas cepas,
por lo que no explican la diferencia en la potencia antinociceptiva de los agonistas µ
y κ observada in vivo. Por el contrario, utilizando técnicas similares a las de este
estudio, otros autores han detectado diferencias entre cepas de roedores en la
densidad de receptores o en la afinidad de radioligandos selectivos, que podrían estar
relacionadas con la variabilidad genética en el efecto de los opioides (Mogil y cols.,
1994; Kest y cols., 1998; Herradón y cols., 2003). Estos resultados, no excluyen la
posibilidad de que estas diferencias existan en áreas discretas del cerebro, y no se
puedan detectar mediante la aproximación utilizada en el presente trabajo.
174
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.2.- ANÁLISIS DE LA AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS:
ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO.
Aunque los resultados de los experimentos de saturación descritos
anteriormente no expliquen las diferencias observadas in vivo, no se puede descartar
que existan interacciones de ligandos selectivos de un tipo de receptor con otro tipo,
para el que no son selectivos, que justifiquen la variabilidad en el efecto biológico.
Por ello, con el fin de intentar determinar si existen diferencias en la afinidad
por los receptores opioides de ligandos que poseen una distinta potencia
antinociceptiva en estas cepas de ratas, se planteó la realización de estudios de
desplazamiento de los tres radioligandos.
4.3.2.1.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR µ:
ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]DAMGO.
En los estudios de desplazamiento de la unión específica de [3H]DAMGO se
empleó morfina y DAMGO como ligandos µ, U50488H como ligando κ, y pCl-
DPDPE y naltrindol como ligandos δ. Además, se realizaron experimentos de
desplazamiento de este radioligando con concentraciones crecientes GTP-γ-S, puesto
que los análogos no hidrolizables del GTP son capaces de desplazar los receptores
acoplados a proteína G a su estado de baja afinidad (Frances y cols., 1985;
Richardson y cols., 1992). De esta manera se pretende hacer una aproximación al
estudio de posibles diferencias entre cepas en cuanto a la afinidad de las proteínas G
por los análogos del GTP.
a) Ligandos µ.
Los resultados obtenidos revelan que en las membranas de cerebro de ambas
cepas de ratas, los agonistas µ, DAMGO y morfina, desplazaron la unión específica
de [3H]DAMGO de un modo dependiente de concentración, llegando a inhibirla
totalmente a concentraciones de 100nM. En ambos casos, el desplazamiento se ajustó
175
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose una afinidad similar en las
membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y tabla IX).
Por otra parte, los valores de Ki obtenidos en el desplazamiento con DAMGO
frío fueron similares a los de Kd obtenidos en los experimentos de saturación con
este radioligando. Además, los valores de Ki obtenidos al desplazar este radioligando
con morfina son similares a los descritos previamente por otros autores en cerebro de
rata y en el receptor µ clonado de rata expresado en células COS (Wang y cols.,
1990; Chen y cols., 1991).
b) Ligando κ.
Los resultados obtenidos en los experimentos de desplazamiento de
[3H]DAMGO por el agonista κ U50488H, pusieron de manifiesto que en las
membranas de cerebro de ambas cepas de ratas, este agonista κ inhibe la unión del
radioligando selectivo µ de forma concentración dependiente, inhibiendo totalmente
la unión específica de éste a concentraciones de 10µM (figura 39). El desplazamiento
del radioligando µ se ajustó a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose una
afinidad similar en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y
tabla IX), hallándose los valores obtenidos en el rango de los obtenidos por otros
autores en el receptor µ clonado de rata expresado en células COS (Wang y cols.,
1993).
c) Ligandos δ.
Los resultados mostraron que en las membranas de cerebro de ambas cepas
de ratas los ligandos δ, p-Cl-DPDPE y naltrindol produjeron el desplazamiento de la
unión específica de [3H]DAMGO de forma dependiente de concentración, llegando a
inhibirla totalmente a concentraciones en el intervalo µM. Ambos ligandos
desplazaron este radioligando µ según un modelo de un solo sitio de unión, con una
afinidad similar en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y
tabla IX), estando los valores de Ki obtenidos en el caso de naltrindol en el rango de
los descritos por otros autores en el receptor µ clonado de rata expresado en células
COS-1 (Bonner y cols., 2000).
176
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
d) GTP-γ-S
El GTP-γ-S inhibió la unión de [3H]DAMGO de forma concentración
dependiente, aunque la inhibición de la fijación no fue completa. Así, al aumentar la
concentración de GTP-γ-S se tendió a un porcentaje mínimo de receptores ocupados
por el radioligando a la concentración usada, similar en ambas cepas (28.1±2.4% en
SDU y 25.7±2.8% en W) (figura 39). Además, el valor de IC50 obtenido en estos
deplazamientos también fue similar en ambas cepas (324.6±65.6nM y 337.0±73.5nM
en SDU y W respectivamente).
Distintos autores han descrito la inhibición de la unión de [3H]DAMGO con
análogos del GTP (Childers y Snyder, 1980; Raynor y cols., 1995). Así, se ha
demostrado que el GTP-γ-S, a una concentración 100µM, reduce la unión específica
de este radioligando en receptor µ clonado de rata hasta un 45±7%, llegando a un
35±1.5% en el receptor µ clonado humano expresados en células COS-7 (Raynor y
cols., 1995), valores que son similares a los encontrados en el presente estudio.
177
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
00
20
40
60
80
100
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5log[DAMGO]
%U
nión
esp
ecífi
ca
00
20
40
60
80
100
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[Morfina]
%U
nión
esp
ecífi
ca
00
20
40
60
80
100
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[U50488H]
%U
nión
esp
ecífi
ca
00
20
40
60
80
100
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]
%U
nión
esp
ecífi
ca
00
20
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-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[Naltrindol]
%U
nión
esp
ecífi
ca
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20
40
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-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[GTP-γ-S]
%U
nión
esp
ecífi
ca
Figura 39. Inhibición de la unión específica de [3H]DAMGO (1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por DAMGO, morfina, U50488H, p-Cl-DPDPE, naltrindol y GTP-γ-S. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en dos o tres lotes de membranas diferentes. Los resultados corresponden a la media de experimentos realizados por duplicado con 2-3 lotes diferentes de membranas.
178
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla IX. Valores de Ki obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]DAMGO en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.
Ligando Cepa Ki (nM) Hill
DAMGO SDU 0.92±0.03 0.90±0.03W 0.84±0.03 0.90±0.05
Morfina SDU 2.92±0.37 0.95±0.11W 2.09±0.12 0.83±0.06
U50488H SDU 317.3±16.4 1.19±0.06W 301.3±14.9 0.98±0.04
p-Cl-DPDPE SDU 24.2±1.4 0.95±0.05W 21.7±1.4 0.86±0.05
Naltrindol SDU 8.95±1.06 0.92±0.09W 7.46±0.73 0.92±0.07
Por consiguiente, se puede descartar que las diferencias entre cepas
observadas in vivo se deban a diferencias en la afinidad por el receptor µ en el
cerebro completo o en amplias zonas de éste que puedan ser detectadas mediante este
tipo de estudios.
Además, puesto que el desplazamiento por GTP-γ-S fue similar en ambas
cepas, se puede sugerir que los agonistas µ discriminan entre poblaciones
receptoriales acopladas y desacopladas de la proteína G de manera similar en ambas
cepas.
4.3.2.2.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR κ:
ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]U69593.
En los estudios de desplazamiento de la unión específica de [3H]U69593 se
empleó morfina y DAMGO como ligandos µ, U50488H como ligando κ, y pCl-
179
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
DPDPE, SNC-80 y naltrindol como ligandos δ. Asimismo, se realizaron
experimentos de desplazamiento de [3H]U69593, con concentraciones crecientes
GTP-γ-S, con el fin de abordar el estudio de posibles diferencias entre cepas en la
unión de las proteínas G con los análogos del GTP.
a) Ligando κ.
En los resultados obtenidos, el U50488H desplazó, de manera dependiente de
concentración, la unión específica del radioligando [3H]U69593, consiguiendo
desplazarlo totalmente a concentraciones en el intervalo de 10-8M. Estos
desplazamientos se ajustaron a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose en
ambas cepas un valor similar de Ki (figura 40 y tabla X), y que concuerda con los
descritos previamente por otros autores para el receptor κ de cerebro de rata y el
clonado de este animal expresado en celulas COS-1 (Nock y cols., 1990; Meng y
cols., 1993).
b) Ligandos µ.
Los resultados obtenidos en los desplazamientos de la unión específica de
[3H]U69593 a las membranas de cerebro de animales de ambas cepas por DAMGO y
morfina, revelan que ambos ligandos desplazaron al radioligando de un modo
dependiente de concentración, consiguiendo desplazarlo totalmente a
concentraciones en el rango de 1 y 10µM en el caso de morfina y DAMGO,
respectivamente. Estos desplazamientos se ajustaron mejor a un modelo de un solo
sitio de unión en ambas cepas de ratas, obteniéndose también en ambas cepas un
valor similar de Ki (figura 40 y tabla X).
La afinidad de los agonistas µ por la población de receptores marcados con
[3H]U69593 obtenida en estos experimentos es similar a la descrita previamente por
otros autores para el receptor κ en membranas de cerebro de rata, y esta en el rango
de los valores descritos en el receptor clonado de rata expresado en células COS-1
(Nock y cols., 1990; Meng y cols., 1993).
180
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
c) Ligandos δ.
Los resultados obtenidos en los experimentos de inhibición de la unión
específica del radioligando [3H]U69593 por SNC-80 y naltrindol, en las membranas
de cerebro de animales de ambas cepas, revelan que ambos fármacos desplazaron al
radioligando de forma dependiente de concentración, consiguiendo desplazar
totalmente su unión específica a concentraciones de 10µM y 100nM para SNC-80 y
naltrindol, respectivamente (figura 40). Los valores de Ki obtenidos en ambas cepas
fueron similares, tal y como se aprecia en la tabla X. Por el contrario, el pCl-DPDPE
a concentraciones de 10µM no desplazó este radioligando más que un 20%
aproximadamente, lo que impidió calcular la Ki del mismo.
Los valores de Ki obtenidos en el desplazamiento de la unión de [3H]U69593
por SNC-80 y naltrindol están en el rango de los descritos previamente por otros
autores (Izenwasser y cols., 1999; Thomas y cols., 1999).
d) GTP-γ-S.
El análogo del GTP inhibió de forma dosis dependiente la unión específica de
este radioligando, alcanzándose un porcentaje mínimo de receptores ocupados por el
[3H]U69593 de un 10.4±6.1 y un 16.9±8.5% en las membranas de SDU y de W,
respectivamente, siendo las IC50 similares en ambas cepas (2.28±0.68µM y
1.14±0.41µM en SDU y W respectivamente) (figura 40). Esto demuestra que las
membranas de cerebro de ambas cepas mostraron un comportamiento similar en el
desplazamiento de la unión de [3H]U69593 por GTP-γ-S
Estos resultados apoyan lo ampliamente descrito por otros autores sobre la
asociación de estos receptores a las proteínas G (Childers y Snyder, 1980; Raynor y
cols., 1995; Rusovici y cols., 2004), y coinciden en los valores de inhibición maxima
de la unión de [3H]U69593 con los descritos por otros autores en membranas de
células CHO expresando el receptor κ humano (Rusovici y cols., 2004). Aunque, los
valores de IC50 del presente estudio aparecen en un rango superior al descrito por
181
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Rusovici y cols. (2004), dichas diferencias pueden deberse a la diferente
concentración de radioligando empleada.
00
20406080
100
-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6log[U50488H]
%U
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-14-13-12-11-10-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[DAMGO]
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-12-11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[Morfina]
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20406080
100
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[SNC-80]
%U
nión
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20406080
100
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[NTI]
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80
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-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[GTP-γ-S]
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ca
Figura 40. Inhibición de la unión específica de [3H]U69593 (1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por U50488H, DAMGO, morfina, SNC-80, pCl-DPDPE, naltrindol y GTP-γ-S. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan
182
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
valores promedio de experimentos realizados por duplicado en dos o tres lotes de membranas diferentes.
183
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla X. Valores de Ki obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]U69593 en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.
Ligando Cepa Ki (nM) Hill
U50488H SDU 0.61±0.10 0.99±0.13W 0.57±0.11 0.96±0.15
DAMGO SDU 249.8±37.4 0.90±0.11W 350.4±43.2 0.97±0.10
Morfina SDU 56.3±7.8 1.25±0.19W 61.2±3.8 1.03±0.06
p-Cl-DPDPE SDU >10000 -W >10000 -
SNC-80 SDU 1332.9±284.5 1.78±0.61W 1010.6±161.4 1.77±0.41
Naltrindol SDU 7.23±1.36 0.84±0.12W 7.50±1.13 1.21±0.20
Teniendo en cuenta que todos los ligandos utilizados en la inhibición de la
unión del radioligando [3H]U69593 mostraron similar afinidad en las membranas de
cerebro de ambas cepas de ratas, estos resultados apuntan a que las diferencias entre
éstas cepas observadas in vivo no son debidas a diferencias en la afinidad por el
receptor κ en el cerebro completo o en amplias zonas de éste, que puedan detectarse
con una aproximación de este tipo.
Además, la ausencia de diferencias entre cepas en los valores de IC50 así
como en el porcentaje del desplazamiento máximo de la unión de este radioligando
por GTP-γ-S, sugiere que la fijación de análogos del GTP a la proteína G, y por tanto
en la activación del receptor κ, son similares en ambas cepas.
184
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.2.3.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR δ:
ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]NALTRINDOL.
Por idénticos motivos que en los dos casos anteriores se planteó la realización
de experimentos de desplazamiento de la unión específica de [3H]naltrindol con los
agonistas de los recptores δ1 p-Cl-DPDPE, δ2 deltorfina II, κ U50488H y µ
DAMGO.
Además, dado que el [3H]naltrindol es un antagonista, y por tanto presenta
igual afinidad por el receptor acoplado y por el receptor desacoplado de la proteína
G, es posible estudiar el equilibrio entre estas dos poblaciones receptoriales. Para
ello, se realizaron experimentos de desplazamiento del equilibrio receptorial con
análogos no hidrolizables del GTP, que son capaces de desplazar los receptores
acoplados a proteína G a su estado de baja afinidad (Fang y cols., 1994). De esta
manera se pretende hacer una primera aproximación al estudio de posibles
diferencias entre cepas en la activación de las proteínas G.
a) Ligandos δ.
En los experimentos realizados en membranas de cerebro de ambas cepas de
ratas, el naltrindol frío inhibió la fijación específica del tritiado de manera
dependiente de concentración, consiguiendo desplazar la totalidad de la unión
específica a concentraciones en el rango de 10 nM. Esta inhibición siguió un modelo
de un solo sitio de unión, con una afinidad similar en las membranas de cerebro de
ambas cepas de ratas (0.122±0.018 y 0.149±0.019nM en SDU y W, respectivamente)
(figura 41).
En todos los desplazamientos con agonistas selectivos δ, los datos
experimentales ajustaron mejor a un modelo de dos sitios de unión, no apreciándose
diferencias entre las membranas de cerebro procedentes de ambas cepas de ratas en
los valores de afinidad tanto en el caso del agonista selectivo δ1 p-Cl-DPDPE, como
en el del agonista δ2 deltorfina II. En los experimentos realizados en ausencia, así
185
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
como los realizados en presencia Na+ y Gpp(NH)p, el porcentaje de receptores en
cada uno de los estados fue también semejante. (figura 41, y tabla XI).
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-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
SDUW
log[NTI]
% U
nión
esp
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ca
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100
WW Gpp(NH)p
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]
%U
nión
esp
ecífi
ca
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20
40
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SDUSDU Gpp(NH)p
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]
%U
nión
esp
ecífi
ca
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20
40
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100
WW Gpp(NH)p
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[II-Deltorfina]
%U
nión
esp
ecífi
ca
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20
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100
SDUSDU Gpp(NH)p
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[II-Deltorfina]
%U
nión
esp
ecífi
ca
Figura 41. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por naltrindol, p-Cl-DPDPE y deltorfina II en estos dos últimos casos en condiciones estándar y con Na+ y Gpp(NH)p en el medio. Los puntos representan valores
186
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
promedio de experimentos realizados por duplicado en tres lotes de membranas diferentes.
187
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla XI. Valores de Ki de pCl-DPDPE y deltorfina II obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.
Cepa Ki(1) (nM)
R(1) (%)
Ki(2) (nM)
Liga
ndo
pCl-D
PDPE Control SDU 1.14±0.22 66.8±4.8 308.0±145.4
W 1.17±0.23 62.6±4.4 103.6±32.1Gpp(NH)p
+ NaClSDU 1.07±0.35 30.5±2.0 702.7±125.8
W 0.77±0.31 30.5±2.4 408.9±76.9
Del
torf
ina
II
Control SDU 0.53±0.06 60.9±6.4 40.9±17.9W 0.41±0.05 57.6±2.8 130.4±54.0
Gpp(NH)p + NaCl
SDU 1.00±0.30 31.1±3.7 210.2±23.9W 0.60±0.13 38.3±2.6 198.3±20.8
Los valores de Ki de naltrindol obtenidos en estos experimentos, están en el
rango de los descritos previamente para cerebro de rata y para el receptor δ de rata
clonado y expresado en células de glioma C6 (Yamamura y cols., 1992; Contreras y
cols., 1993; Clark y cols., 1997). Estos valores tampoco difieren significativamente
de los valores de Kd obtenidos en los experimentos de saturación (0.03nM, apartado
4.3.1.3.).
De igual manera, en el caso de los agonistas δ1 y δ2, los valores de afinidad
por los receptores en alta y en baja afinidad obtenidos son semejantes a los descritos
por otros autores en cerebro de roedores (Vaughn y cols., 1989; 1.9nM, Buzas y
cols., 1992; Fang y cols., 1994). El presente estudio muestra que, para ambos
agonistas, el porcentaje de receptores de alta afinidad se encuentra en torno al 60%
cuando el equilibrio esta desplazado hacia el estado de alta afinidad, mientras que en
el estudio de Fang y cols. (1994) el porcentaje de sitios en alta difiere entre el 89%
en el caso de p-Cl-DPDPE y el 33% en el caso de deltorfina II, hecho que le sirve a
188
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
los autores para apoyar la hipótesis de la existencia de poblaciones heterogéneas de
receptores δ. Además, en el presente estudio el porcentaje de receptores en estado de
alta afinidad fue de un 30% en todos los casos cuando el equilibrio esta desplazado
hacia el estado de baja afinidad, mientras que en el estudio de Fang y cols. (1994) fue
del 50% también en todos los casos. Esta diferencia puede deberse a la especie
estudiada, puesto que Fang y cols. (1994) utilizan membranas de cerebro de ratón.
Se ha descrito la posibilidad de una modulación a través de los receptores δ
del efecto mediado por receptores µ y κ (para revisión ver Smith y Lee, 2003). Por lo
tanto, una posible explicación de los resultados de los experimentos in vivo es que los
ligandos endógenos poseyeran una mayor afinidad por el receptor δ de los animales
de la cepa SDU que por el de los animales de la cepa W, de manera que la mayor
potencia antinociceptiva de los agonistas µ y κ fuera debida a una modulación de
ésta a través de receptores δ. Los resultados obtenidos no apoyan esta hipótesis
puesto que los tres ligandos estudiados presentan una afinidad similar por este
receptor y, además, el efecto antinociceptivo del agonista δ SNC-80 es similar en
ambas cepas de ratas (apartado 4.2.1.3.).
Por otro lado, no parece haber diferencias en el equilibrio entre la población
receptorial δ acoplada y desacoplada a proteína G, ya que en las membranas de
cerebro de ambas cepas de ratas los porcentajes de receptores en estado de alta y baja
afinidad reconocidos por los agonistas δ, en ausencia y en presencia de 50µM de
Gpp(NH)p y 100mM de Na+, son similares.
b) Ligandos κ.
En cuanto a la inhibición con ligandos κ, la unión específica de [3H]naltrindol
fue desplazada, de manera dependiente de concentración, por el U50488H,
inhibiendo completamente la fijación específica de este radioligando a
concentraciones en el rango de mM. Los datos experimentales obtenidos en
membranas de cerebro de ratas de la cepa W, se ajustaron mejor a un modelo de un
solo sitio de unión, mientras que en el caso de las membranas de la cepa SDU, los
189
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
datos experimentales se ajustaron mejor a un modelo de dos sitios de unión (p<0.01)
(figura 42 y tabla XII).
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-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2log[U50488H]
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-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2log[U50488H]
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esp
ecíf
ica
Figura 42. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por U50488H. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en tres y cuatro lotes de membranas diferentes.
190
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla XII. Valores de IC50, coeficiente de Hill y Ki, de U50488H y DAMGO, obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.
Ligando Cepa
IC50
(µM)Hill Ki(1)
(nM)R(1) (%)
Ki(2) (nM)
U50488H
SDU 27,0±6.2 0.76±0.09 42.7±18.0 12.6±2.6 9846.4±743.0W 27.7±4.9 0.80±0.08 - - 5339.6±783.3
DAMGO SDU 3.4±0.8 0.73±0.09 23.9±5.6 21.3±3.8 1813.9±109.1W 4.0±0.3 0.97±0.07 - - 946.5±64.0
Con respecto a los valores de afinidad obtenidos, en el caso de W el valor de
Ki es de un rango similar al descrito previamente por otros autores en cerebro de rata
y en membranas de células COS transfectadas con el receptor δ clonado de este
animal (Kieffer y cols., 1992; Contreras y cols., 1993). Así mismo, el valor de Ki2
obtenido en las membranas de SDU también se encuentra en este rango. El hecho de
que en las membranas de cerebro de los animales de la cepa SDU, además de este
sitio, aparezca otro de alta afinidad podría guardar relación con los resultados de
Yamamura y cols. (1992), que obtienen un valor de coeficiente de Hill inferior a la
unidad al desplazar [3H]naltrindol con U69593. Por el contrario diversos estudios
encuentran valores de coeficiente de Hill no diferentes de la unidad al desplazar
[3H]naltrindol con agonistas κ, resultados que han sido similares al utilizar otros
radioligandos selectivos δ (Cotton y cols., 1985; Knapp y cols., 1991; Contreras y
cols., 1993; Fang y cols., 1994). El hecho de que en W no aparezca este sitio de alta
afinidad no permite descartar la existencia del mismo en estos animales, puesto que
podrían encontrarse en un porcentaje muy bajo, y por consiguiente no detectable con
la metodología utilizada.
191
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estos resultados podrían deberse a una falta de selectividad del radioligando,
a que el U50488H reconozca con distinta afinidad los receptores δ acoplados y
desacoplados de la proteína G, o que el sitio reconocido por U50488H con alta
afinidad corresponda al receptor κ2.
La primera posibilidad, es decir, que el sitio de alta afinidad corresponda a
receptores µ o κ a los que se ha unido el radioligando por falta de selectividad, puede
ser descartada si tenemos en cuenta los valores de afinidad y de densidades
receptoriales obtenidos. Además esta suposición no explica el hecho de que este sitio
de alta afinidad tan solo sea detectable en la cepa de animales SDU.
La segunda posibilidad es que, al igual que ocurre con los propios agonistas
δ, en la cepa SDU el agonista κ U50488H reconozca una población de receptores δ
con alta afinidad que correspondan a receptores acoplados a la proteína G, mientras
que a los no acoplados los reconozca con baja afinidad. Esta posibilidad se puede
descartar inicialmente por el hecho de que los sitios de fijación de alta afinidad de
U50488H son un 13% del total, mientras que los reconocidos por los agonistas
selectivos δ empleados suponen un 60%. De todas formas es posible que el
U50488H reconozca con alta afinidad sólo una subpoblación de receptores δ.
Por otro lado, considerando la tercera hipótesis, el sitio de alta afinidad de
U50488H podría corresponder a receptores κ2, ya que se ha sugerido la existencia de
múltiples receptores opioides κ (Attali y cols., 1982; Morre y cols., 1983; Ver
Wollemann y cols., 1993), estando el valor de Ki de alta afinidad de U50488H
desplazando [3H]naltrindol en las ratas SDU en el rango de los valores descritos por
otros autores para el receptor κ2 (Tiberi y Magnan, 1990; Butelman y cols., 1998).
Recientemente, se ha sugerido que el receptor κ2 podría corresponder en realidad con
un dímero κ-δ, debido a la similitud de la farmacología de este dímero con la descrita
para el receptor κ2 (Jordan y Devi, 1999). En cualquier caso, se precisan más
experimentos para esclarecer a qué corresponde el sitio de alta afinidad de U50488H
encontrado en SDU pero no en W, y que implicación tiene en las peculiaridades
observadas in vivo.
192
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
c) Ligandos µ.
El DAMGO desplazó de manera dosis dependiente la unión específica de
[3H]naltrindol, inhibiendo completamente la fijación específica del mismo a
concentraciones en el rango de 100µM. De forma semejante a lo observado en el
apartado anterior, los resultados de los experimentos de inhibición con DAMGO en
membranas de cerebro obtenidas de ratas de la cepa W se ajustaron mejor a un
modelo de un solo sitio de unión, mientras que en el caso de las membranas
obtenidas de animales de la cepa SDU los datos experimentales se ajustaron mejor a
un modelo de dos sitios de unión (p<0.01) (figura 43 y tabla XII).
193
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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Figura 43. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) por DAMGO en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en tres lotes de membranas diferentes.
194
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El valor de Ki obtenido en el caso de W es de un rango similar al descrito
previamente por otros autores en cerebro de rata y en el receptor δ clonado de este
animal expresado en células COS y células NG 108-15 (Kieffer y cols., 1992;
Contreras y cols., 1993). Así mismo, en las membranas de cerebro de SDU el valor
de Ki2 obtenido también se encuentra en este rango. De manera semejante a lo
ocurrido en el caso de U50488H, en las membranas de cerebro de los animales SDU
el DAMGO además de reconocer un sitio con similar afinidad al reconocido en W,
reconoce otro sitio diferente con alta afinidad. En la literatura encontramos casos en
los que, en roedores, un ligando µ desplaza a un radioligando δ con un coeficiente de
Hill no diferente de la unidad o ajustándo a un modelo de un solo sitio de unión y
casos en los que el desplazamiento ajusta a un modelo de dos sitios de unión. (Cotton
y cols., 1985; Traynor y cols., 1990; Knapp y cols., 1991; Yammamura y cols., 1992;
Contreras y cols., 1993; Fang y cols., 1994; Fraser y cols., 1999).
De igual manera y por los mismos motivos que en el apartado anterior, puede
descartarse la posibilidad de que el sitio de alta afinidad encontrado en SDU se deba
a la unión inespecífica del radioligando.
Así mismo, la diferencia en la proporción de receptores en alta afinidad
reconocidos por DAMGO y por los agonistas δ, se opone a la posibilidad de que
estos resultados se deban a que el DAMGO reconozca con diferente afinidad los
receptores δ acoplados y desacoplados de la proteína G. No obstante es posible que
el DAMGO esté reconociendo con alta afinidad una subpoblación de receptores δ.
Por otro lado, considerando que la interacción entre los receptores δ y µ ha
sido extensamente documentada (Rothman y cols., 1989 y 1992; Cha y cols., 1995;
para revisión ver Traynor y Elliott, 1993), una tercera posibilidad sería que el sitio de
alta afinidad podría ser causa de una interacción entre los receptores δ y µ, como han
sugerido previamente otros autores (Cotton y cols., 1985; Traynor y cols., 1990). En
esta línea, recientemente se ha descrito la interacción física entre los receptores µ y δ
formando dímeros que, al ser coexpresados en células COS presentan un perfil
farmacológico nuevo (George y cols., 2000; Gomes y cols., 2000). En este trabajo, al
desplazar el [3H]naltrindol con DAMGO encontramos, en las membranas de las ratas
195
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SDU, una Ki para el sitio de alta afinidad similar a la descrita para los dímeros µ-δ
(George y cols., 2000; Martin y Prather, 2001). Por lo tanto, una posible explicación
a la aparición de este sitio de alta afinidad en las membranas de los animales SDU y
no en las de las ratas W podría ser que en SDU existe un mayor porcentaje de
receptores δ formando dímeros con los receptores µ que en W, permitiendo su
detección por estos procedimientos. No obstante, se precisan más experimentos para
demostrar si realmente este sitio corresponde a dímeros µ-δ, y el papel que juegan en
las diferencias observadas in vivo.
4.4.- ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS RECEPTORES
OPIOIDES MEDIANTE ESTUDIOS DE UNIÓN DE GTP-γ-[35S].
La medida de unión de radioligandos a los receptores opioides no se
correlaciona necesariamente con el acoplamiento funcional a los sistemas de
transducción intracelulares (Nijssen y cols., 1992; Maher y cols., 2000). Por ello, los
resultados obtenidos en los estudios de unión de radioligandos no dan cuenta de lo
que ocurre en los estadíos transduccionales. Por lo tanto, a pesar de que las dos cepas
de ratas en estudio no presentan diferencias en la afinidad de los distintos ligandos
opioides por sus correspondientes receptores ni en la densidad de los mismos, las
diferencias observadas in vivo podrían ser consecuencia de diferencias en la
activación receptorial.
En los estudios de unión de radioligando se analizó superficialmente la
interacción del receptor con las proteínas G, midiendo el desplazamiento de los
receptores hacia los estados de alta y baja afinidad, es decir acoplados o
desacoplados de la proteína G. Sin embargo, esta aproximación unicamente permite
determinar diferencias grandes en la activación de las proteínas G, por lo que se
realizó una aproximación más fina con ensayos de unión de GTP-γ-[35S], que
permiten determinar el nivel de activación de la proteína G tras la ocupación por
agonistas de los receptores opioides (Harrison y Traynor, 2003).
196
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.4.1.- ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES POR DISTINTOS
AGONISTAS: CURVAS DE ESTIMULACIÓN DE LA UNIÓN DE GTP-γ-
[35S].
Los estudios de fijación de GTP-γ-[35S] permiten cuantificar la activación de
receptores acoplados a proteína G, habiendo sido utilizados para estudiar la
activación de receptores opioides (Traynor y Nahorski, 1995). Estos ensayos
permiten la obtención de curvas concentración – efecto y, por consiguiente, la
medida de la potencia (CE50) y la eficacia relativa (Emax) (Harrison y Traynor,
2003). Por ello, han sido utilizados por distintos autores para la detección de
diferencias en la activación de proteínas G por agonistas opioides entre distintas
cepas de roedores (Selley y cols., 2003; Narita y cols., 2003).
En el presente trabajo, se utilizó esta técnica para estudiar la activación
receptorial opioide por distintos agonistas en ambas cepas de ratas, con el fin de
determinar si las diferencias observadas in vivo son debidas a diferencias en la
capacidad de activación receptorial opioide.
Por otro lado, a pesar de que los resultados del estudio in vivo del efecto
antinociceptivo de morfina con distintos tests nociceptivos no sugieren una
localización restringida a nivel espinal o supraespinal de las diferencias intercepa
(apartados 4.1.1.1. y 4.1.1.2.), se estudió la activación receptorial por este agonista µ
también en membranas de médula con el fin de estudiar la posibilidad de que existan
diferencias en la activación receptorial a este nivel.
4.4.1.1.- AGONISTAS µ (MORFINA Y DAMGO).
Cuando se incubaron concentraciones crecientes de morfina o de DAMGO
con GTP-γ-[35S] se originó un incremento de la fijación del mismo a membranas de
cerebro de ambas cepas de ratas, que alcanzó un máximo a la concentración de 10-5M
(figura 44). Al analizar las curvas de estimulación obtenidas, se obtuvieron valores
de potencia de morfina y DAMGO similares en ambas cepas, así como una similar
eficacia de estos dos fármacos (tabla XIII).
197
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla XIII. Valores de CE50 y Emax para morfina, DAMGO, SNC-80, deltorfina II y pCl-DPDPE estimados de las curvas concentración – fijación de GTP-γ-[35S], en membranas de cerebro y de médula de ratas SDU y W.
Fármaco Memb. Cepa CE50 o CE50(1)/(2) (nM) Emax o Emax(1)/(2) (%)
MorfinaCerebro SDU 387.6±136.0 135.2±2.2
W 276.4±69.6 130.4±1.5
Médula SDU 310.6±71.9 115.2±7.4W 472.4±171.6 117.6±2.5
DAMGO Cerebro SDU 120.0±23.4 139.3±2.5W 109.2±28.8 136.6±3.6
SNC-80 Cerebro SDU 54.5±26.8 113.8±1.1W 82.0±45.6 114.6±1.3
Deltorfina II
Cerebro SDU 474.1±105.9 114.6±1.0W 862.4±393.0 113.8±1.8
pCl-DPDPE
Cerebro SDU (1)12.4±6.0/(2)1260±266 (1)110.0±1.8/(2)140.7±0.8W (1)15.3±5.5/(2)1269±326 (1)113.1±2.4/(2)138.7±1.3
198
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0100
110
120
130
140
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
SDUW
log[Morfina]
%U
nión
de
GTP
- γ-[
35S]
0100
110
120
130
140
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
SDUW
log[DAMGO]
%U
nión
GTP
- γ-[
35S]
Figura 44. Curvas concentración – respuesta de morfina y DAMGO sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3-5 lotes de membranas distintos.
199
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La potencia de la morfina en membranas de médula fue similar en ambas
cepas y semejante a la obtenida en membranas de cerebro, siendo la eficacia menor
que en membranas de cerebro, aunque no se detectaron diferencias entre ambas cepas
(tabla 45 y tabla XIII).
090
100
110
120
130SDUW
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[Morfina]
% U
nión
GTP
- γ-[
35S]
Figura 45. Curvas concentración – respuesta de morfina y DAMGO sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de médula espinal de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 2 lotes de membranas distintos.
Los valores de CE50 obtenidos en este estudio para DAMGO y para morfina
están en el rango de los previamente descritos por otros autores para membranas de
cerebro entero y de distintos núcleos cerebrales de rata (Selley y cols., 1996; Márki y
cols., 1999; Selley y cols., 2003). Sin embargo, en el presente trabajo la eficacia de
morfina es ligeramente inferior a la encontrada en estos estudios (Márki y cols.,
1999; Selley y cols., 2003), pudiendo deberse al diferente método de obtención de
200
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
membranas y a que este parámetro depende del área cerebral utilizada (Tsuji y cols.,
1999; Maher y cols., 2000).
4.4.1.2.- AGONISTAS δ (SNC-80, DELTORFINA II Y pCl-DPDPE).
Tanto el SNC-80, como la deltorfina II y el pCl-DPDPE produjeron de forma
concentración dependiente la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S], no
observándose diferencias entre las dos cepas de ratas en estudio, en la potencia o en
la eficacia de estos fármacos (figura 46, tabla XIII).
En el caso de pCl-DPDPE la curva concentración - respuesta fue bifásica,
ajustando significativamente mejor a un modelo de dos sitios de unión en las
membranas de cerebro de ambas cepas (p<0.001). Los valores de CE50 para ambos
sitios fueron similares en las dos cepas de ratas estudiadas. No se observaron
tampoco diferencias entre cepas en los valores de unión máxima en cada una de las
fases (figura 46, tabla XIII).
201
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0
100
105
110
115
120
WSDU
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[SNC-80]
%U
nión
GTP
- γ-[35
S]
0
100
105
110
115
120
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log [II-Deltorfina]
% U
nión
GTP
- γ-[
35S]
0
100
110
120
130
140
150
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log [p-Cl-DPDPE]
% U
nión
de
GTP
- γ-[
35S]
Figura 46. Curvas concentración – respuesta de SNC-80, deltorfina II y pCl-DPDPE sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3 - 6 lotes de membranas distintos.
202
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los valores obtenidos de CE50 para SNC-80 y deltorfina II en este estudio
están en el rango de los descritos por otros autores en membranas de células
trasfectadas con cDNA del receptor δ de rata, en membranas de cerebro de ratón y en
membranas de corteza cerebral de mono (Clark y cols., 1997; Hosohata y cols., 2000;
Ko y cols., 2003). La eficacia encontrada en el caso de deltorfina II fue similar a la
descrita en membranas de médula espinal de ratón y en membranas de corteza
cerebral de mono (Wang y cols., 2001; Ko y cols., 2003), aunque Hosohata y cols.
(2000) describen una eficacia unas tres veces superior a la determinada en el presente
estudio en membranas de cerebro de ratón, fenómeno que puede deberse al distinto
origen de las membranas empleadas.
Por otro lado, la curva bifásica de pCl-DPDPE obtenida en este estudio puede
ser debida a una menor selectividad de éste, uniéndose a concentraciones bajas al
receptor δ y a concentraciones elevadas al µ (Hosohata y cols., 2000). Por este
motivo, en el presente estudio se procedió al análisis de los receptores implicados en
cada una de las fases mediante la utilización de antagonistas selectivos. Así, en
membranas de ambas cepas, la unión de GTP-γ-[35S] inducida por una concentración
de 10-7M de pCl-DPDPE, que corresponde a la fase de alta potencia, es antagonizada
totalmente por naltrindol 10-8M (figura 47), confirmando que la primera fase se
produce por la estimulación de receptores δ. Además, el antagonista µ CTAP, a una
concentración 0.2µM revierte parcialmente el efecto de una concentración 10-5M de
pCl-DPDPE, quedando la unión de GTP-γ-[35S] en los niveles correspondientes a la
fase de alta afinidad (figura 47), sugiriendo por tanto que la segunda fase
corresponde a la activación de receptores µ. Estos resultados demuestran que la
segunda fase de estimulación de la unión GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE es debida a
una pérdida de selectividad, probablemente por la unión de este agonista a receptores
µ, lo que había sido sugerido anteriormente por Hosohata y cols. (2000).
203
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SDU 10-5W 10-5SDU 10-5 + CTAPW 10-5 + CTAPSDU 10-7W 10-7SDU 10-7 +NTIW 10-7 + NTI
100
110
120
130
140
150
****
*** **
SDU W SDU W SDU W SDU W
% U
nión
GTP
-γ-[
35S]
- 2·10-7 - - CTAP (µM) - - - 10-8 NTI (M) 10-5 10-5 10-7 10-7 pCl-DPDPE
Figura 47. Efecto de CTAP (2·10-7M) sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE (10-5M) y de naltrindol (10-8M) sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE (10-7M). Los datos representan los valores medios ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3 lotes de membranas distintos. Los valores de % de unión se compararon con el test de la t de Student, y los resultados se expresan como: ** p<0.01 y *** p<0.001 vs el correspondiente control sin antagonista.
4.4.1.3.- AGONISTAS κ (U69593).
En el caso de la activación de los receptores κ, el U69593 produjo un
incremento de la unión de GTP-γ-[35S] a concentraciones en el rango de µM en las
membranas de cerebro de ambas cepas de ratas, no apreciándose diferencias entre
ellas en los valores de estimulación obtenidos (figura 48). No fue posible determinar
el valor de CE50 ni del efecto máximo, debido a que a la máxima concentración
estudiada (10µM) no se alcanzó la saturación.
204
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
095
100
105
110
115
120SDUW
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[U69593]
%U
nión
GTP
- γ-[
35S]
Figura 48. Curvas concentración – respuesta de U69593 sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 2 lotes de membranas distintos.
La estimulación obtenida con la concentración máxima utilizada (10µM), fue
del mismo rango a la descrita en membranas de médula espinal y de determinadas
regiones cerebrales de ratón, si bien es ligeramente inferior a la encontrada en las de
otras (Wang y cols., 2001; Mizoguchi y cols., 2004), pudiendo deberse a que la
activación por agonistas κ depende de la región del sistema nervioso considerada
(Mizoguchi y cols., 2004), y a que se trata de dos especies distintas.
En cuanto a la potencia, al contrario que con los agonistas µ y δ, en el caso de
U69593 la activación receptorial aparece a rangos elevados de concentración, tal
como se ha descrito por otros autores (Wang y cols., 2001; Mizoguchi y cols., 2004).
Sin embargo, otros estudios describen esta activación a concentraciones inferiores,
en membranas de células que expresan el receptor κ clonado de rata o el humano, y
en membranas de corteza cerebral y tálamo de mono (Remmers y cols., 1999; Kohno
y cols., 2000; Ko y cols., 2003). Teniendo en cuenta que la estimulación de proteínas
205
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
G por los agonistas es proporcional a la densidad de receptores (Selley y cols., 1998;
Ko y cols., 2003), una posible explicación de lo observado en estos experimentos es
que debido a la baja densidad de receptores κ en estas membranas (apartado
4.3.1.2.), la fijación observada a concentraciones elevadas de U69593 sea debida a la
activación de receptores µ o δ.
En resumen, se puede afirmar que en este estudio no aparecen diferencias en
la potencia o eficacia de los agonistas utilizados para activar los receptores µ, δ o κ
que permitan explicar las diferencias observadas entre las cepas SDU y W en los
experimentos in vivo. Esta técnica ha sido empleada previamente por otros autores
que sí han encontrado una correlación entre el efecto in vivo de los opioides y la
capacidad de estimular la fijación de GTP-γ-[35S] (Matthes y cols., 1998; Hosohata y
cols., 2000; Narita y cols., 2003; Ozaki y cols., 2003; Selley y cols., 2003). Así, se ha
utilizado para correlacionar la activación receptorial con las diferencias observadas
in vivo entre cepas de roedores, habiéndose encontrado en algunos casos diferencias
al utilizar membranas de cerebro entero, mientras que en otros casos éstas han
aparecido al utilizar membranas de determinadas áreas cerebrales (Narita y cols.,
2003; Selley y cols., 2003). Por consiguiente, puesto que en el presente estudio los
experimentos han sido realizados en membranas de cerebro entero o de médula
espinal, cabe la posibilidad de que las diferencias en la activación receptorial entre
estas cepas esté restringida a zonas más concretas, imposibilitando su observación
mediante esta aproximación.
Otra posibilidad es que la cantidad de la proteínas G que se activan no sea
diferente entre cepas, sino que lo sea la proporción de los distintos tipos de proteína
G. Se ha sugerido que los dímeros µ-δ, al contrario que ambos receptores por
separado, se acoplan a una proteína G insensible a la toxina pertusis (George y cols.,
2000). En el presente estudio cabría la posibilidad de que en la cepa SDU estos
dímeros sean más abundantes que en las ratas W (apartado 4.3.3.2.c), lo que estaría
en concordancia con esta hipótesis.
206
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por otro lado, también podría darse el caso de que las diferencias entre cepas
observadas in vivo, tengan su origen en los pasos de la transducción posteriores a la
activación de la proteína G.
4.4.2.- ESTUDIO DE LA POSIBLE SINERGIA INTERRECEPTORIAL
OPIOIDE: ACTIVACIÓN CONJUNTA DE LOS DISTINTOS RECEPTORES
OPIOIDES.
Los resultados del efecto de naltrindol y nor-BNI sobre la antinocicepción de
morfina y U50488H en estas cepas de ratas, sugieren que las diferencias observadas
in vivo son debidas a la activación de distintos receptores opioides más que a la
activación de alguno de ellos (apartados 4.2.2.1.3, 4.2.2.1.4 y 4.2.2.2). Por ello, dado
que se ha descrito que el efecto conjunto de ligandos opioides selectivos de distintos
tipos de receptores origina una sinergia en la fijación de GTP-γ-[35S] (Childers y
cols., 1998; Gomes y cols., 2004), cabe la posibilidad de que las diferencias
observadas entre ambas cepas se deban al sinergismo derivado de la coactivación de
distintos receptores opioides. Para estudiar este aspecto, se procedió al análisis de las
posibles diferencias entre cepas en la fijación de GTP-γ-[35S] tras la coactivación
interreceptorial.
Estos experimentos revelaron que la incubación de membranas de cerebro
con combinaciones de agonistas selectivos de los distintos receptores opioides,
originó en ambas cepas incrementos similares en la fijación de GTP-γ-[35S] (figura
49).
207
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
W SDU W SDU W SDU100
110
120
130
100 - 100 p-Cl-DPDPE (nM) 10 10 - U69593 (µM) - 100 100 DAMGO (nM)
% U
nión
GTP
-γ-[
35S]
Figura 49. Efecto de la acción conjunta de la combinación de un agonista δ y uno κ, un agonista κ y uno µ, y un agonista δ y uno µ, sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan los valores medios ± error estándar de distintos experimentos por triplicado en 3 - 7 lotes de membranas distintos.
Por consiguiente, en el presente estudio no aparecen diferencias en la
activación receptorial por combinaciones de agonistas opioides en las membranas de
cerebro de ratas SDU y W, que expliquen los resultados de los experimentos in vivo.
De manera similar a lo expuesto en el apartado anterior, cabe la posibilidad de que
estas diferencias estén restringidas a zonas más concretas del sistema nervioso, o que
difiera la proporción de los distintos tipos de proteínas G activadas en lugar de su
cantidad, impidiendo en ambos casos su observación mediante esta aproximación.
Se ha descrito que la presencia de dímeros µ-δ en la médula espinal de ratón,
está correlacionada con la sinergia de ligandos µ y δ para estimular la fijación de
208
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
GTP-γ-[35S], y con la potenciación de la analgesia de morfina i.t. por la
coadministración i.t. del antagonista δ TIPPψ (Gomes y cols., 2004). En el presente
trabajo, en el desplazamiento de [3H]naltrindol con DAMGO y con U50488H en
membranas de cerebro de la cepa SDU se observaba un sitio de alta afinidad, que
podría corresponder a dímeros µ-δ y κ-δ. Sin embargo este sitio no se correlaciona
funcionalmente con la fijación de GTP-γ-[35S]. Ello puede deberse al distinto origen
de las membranas estudiadas, los distintos fármacos y vías empleadas o a que la
mayor potencia antinociceptiva de morfina en SDU no ocurre a nivel molecular. En
el presente estudio, a diferencia de Gomes y cols., (2004), la coadministración de un
antagonista δ vía sistémica revierte la mayor potencia antinociceptiva de morfina s.c.
en las ratas SDU, en lugar de potenciarla, lo que sugiere que la mayor potencia de
morfina sería debida a interacciones más complejas a nivel de sistemas.
Conjuntamente, los resultados obtenidos en este estudio, sugieren que en los
animales de la cepa SDU existe una mayor actividad endógena de los receptores δ,
originando una mayor AIE, una menor sensibilidad nociceptiva a la formalina y una
mayor potencia antinociceptiva de morfina. Así, en la cepa SDU, además de la
analgesia debida al efecto directo sobre el receptor µ, común con la cepa W, existe
también una cooperación de los receptores κ y δ, que potencia el efecto directo de µ.
Este “sistema complementario” estaría organizado en serie, de manera que el
bloqueo a nivel de κ antagonizaría el efecto de µ en este “sistema”, y el bloqueo de δ
antagonizaría en este “sistema” tanto el efecto de la activación µ como κ (figura 50).
Para conocer el origen concreto de esta modulación se precisaría seguir
profundizando tanto en procesos prerreceptoriales como transduccionales.
209
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
µ Morfina
Nor-BNI
κ U50488H
Naltrindol
δ SNC-80
ANALGESIA
Figura 50. Diagrama simplificado de las diferencias entre las cepas de ratas SDU y W, en la cooperación interreceptorial opioide involucrada en el efecto antinociceptivo de estos fármacos. Las flechas en color negro se darían en ambas cepas, mientras que las cepas en color azul se darían sólo en la cepa SDU. Las flechas rojas continuas representan activación, y las discontinuas inhibición.
210
5.- CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
1.- En los test nociceptivos utilizados, tanto térmicos como químicos, a excepción de
en la fase de respuesta aguda a formalina, la morfina presenta una mayor potencia en
SDU que en W. Ello sugiere la existencia de diferencias en el mecanismo de acción o
en la modulación del efecto de morfina.
2.- La mayor potencia antinociceptiva de morfina en SDU se correlaciona con una
mayor sensibilidad, de esta cepa, a los efectos recompensantes del fármaco, pero no
con el desarrollo de tolerancia y dependencia física. Por consiguiente, ello apunta a
que los mecanismos subyacentes a las diferencias entre cepas afecten la nocicepción
y la recompensa, pero no la tolerancia y dependencia física.
3.- Otros agonistas selectivos µ y κ también originan un mayor efecto
antinociceptivo en esta cepa. La mayor potencia de morfina es revertida por
antagonistas κ y δ. Todo ello sugiere que en la mayor sensibilidad de las SDU al
efecto antinociceptivo participan los sistemas µ, κ y δ.
4.- Las ratas SDU son menos sensibles al efecto nociceptivo de formalina en ambas
fases de este test, estando implicados los receptores δ en la respuesta tónica de la
segunda fase.
5.- El estrés induce un mayor efecto antinociceptivo en las ratas SDU que en las W.
Estas diferencias encontradas entre ambas cepas de ratas en la AIE son de naturaleza
opioide, participando en ellas el sistema δ.
6.- El comportamiento detectado en la cepa SDU no se debe a modificaciones en el
número de receptores µ, κ o δ, ni en la afinidad de diferentes radioligandos por los
mismos en membranas de cerebro.
7.- En membranas de cerebro de ratas SDU, pero no en W, los agonistas κ y µ se
unen a un sitio de alta afinidad al desplazar el radioligando selectivo δ. Esto sugiere
que interacciones µ-δ y κ-δ pueden estar participando en las respuestas observadas
in vivo.
200
CONCLUSIONES
8.- La activación de las proteínas G por distintos agonistas opioides o combinaciones
de estos en cerebro entero no parecen estar participando en las diferencias en las
respuestas observadas in vivo entre ambas cepas de ratas.
9.- Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral demuestran en su conjunto que la
variabilidad en las respuestas a opioides puede deberse a diferencias en la
cooperación interreceptorial opioide.
201