26

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se amplificó el gen completo de la NA (1427 pb) de las 14 muestras y

solamente se logró obtener la secuencia completa de HA (1678 pb) para una de

las muestras; sin embargo, se obtuvo la secuencia parcial de 1203 pb para las

13 muestras restantes.

En la figura 6 se muestra un ejemplo de los amplicones que se obtuvieron para

una de las muestras para el gen de la HA y la diferencia de tamaño entre ellos.

El resultado obtenido de la secuencia de nucleótidos del gen NA de las 14

muestras, se tradujo a aminoácidos para su alineación con la secuencia de un

virus susceptible a oseltamivir y con la de un virus resistente a este antiviral,

realizada con el programa Geneious. Este análisis demostró que ninguna de las

muestras presentó la mutación H275Y que es la mutación en NA mayormente

asociada a la resistencia, la posición de la mutación se esquematiza en la

Figura 7. Entre 417 (carril 2) y 825 pb (carril 4). En el carril 1 muestra el

marcador de peso molecular de 100 pb.

A pesar de que no se encontró la mutación H275Y en los virus analizados, la

figura 8 muestra otras mutaciones que se encontraron en la proteína NA de los

virus resistentes.

En la figura 9 se muestras las mutaciones que se encontraron para la proteína

HA de los virus estudiados.

27

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, de los Productos de PCR

correspondientes al gen HA. El tamaño de los fragmentos amplificados varía

1 2 3 4 5

1000

800

600

500

300

100

28

Figura 7. Alineación de aminoácidos de NA, con un virus resistente y un virus

susceptible con las muestras analizadas. La posición 275 está marcada con un

círculo rojo.

29

Figura 8. Alineación de aminoácidos de NA, con un virus resistente y un virus

susceptible con las muestras analizadas. Otras mutaciones encontradas se

encuentran en las posiciones S31P, N386K y P431S.

30

Figura 9. Alineación de aminoácidos de HA, con un virus resistente y un virus

susceptible con las muestras analizadas.

31

Existen otras mutaciones que se asocian con la resistencia a los inhibidores de

la NA, como las que Le y col. en 2008, reportaron en la posición 117 en la que

se cambia una isoleucina por una valina (I117V), y que confiere una reducción

en la susceptibilidad al oseltamivir. Otros investigadores también han reportado

la presencia de mutaciones en la posición Q313R y I427T relacionadas con la

resistencia a oseltamivir en ausencia de la mutación H275Y (Gubareva y col.,

2010). Así mismo, Rousset y col. en 2010 reportaron la presencia de un cambio

de una isoleucina por una arginina en la posición 223 de la proteína NA (I223R),

confiriendo resistencia tanto a oseltamivir como a zanamivir. De igual manera,

otras dos mutaciones reportadas que han sido asociadas a la resistencia a

oseltamivir son la D151V y la D197E (Okomo y col., 2010).

A pesar de que al analizar las secuencias de aminoácidos de NA, no se detectó

en ninguna de las muestras la mutación H275Y; sin embargo, se detectaron las

mutaciones que se muestran en la tabla III, las mutaciones encontradas al

analizar las secuencias de aminoácidos de HA aparecen en la Tabla IV.

32

Tabla III. Mutaciones detectadas en el gen de la NA de las muestras

analizadas.

Muestra S31P V106I N248D H275Y N386K P431S I443V

Susceptible - - - - - - -

2438 - + + - + + -

2439 - + + - - - +

2440 + + + - + + -

2441 - + + - + + -

33

Tabla IV. Mutaciones detectadas en el gen de la HA de las muestras

analizadas.

Muestra K39R N101S N146D S220T V410I N498D

Susceptible - - - - - -

2438 - - - + - +

2439 + + - + - +

2440 - - - + - +

2441 - - + + + +

34

Es importante mencionar que el análisis fenotípico utilizando el sustrato MU-

NANA o el ensayo quimioluminiscente, que se realizó previamente en las

muestras, indicó que aquellas identificadas como 2438, 2440 y 2441 tenían

valores de concentración inhibitoria del 50% (IC50) hasta 4 veces el valor del

IC50 del virus susceptible. Considerándolas así como virus con susceptibilidad

reducida al antiviral, mientras que la muestra 2439 no presento susceptibilidad

reducida al antiviral, esta muestra fue incluida en el estudio ya que pertenece a

un individuo, que forma parte de una familia en la que los otros 3 miembros

presentaron muestras resistentes.

En el análisis del gen completo de NA de todas las muestras, no se encontró

ninguna de las mutaciones previamente reportadas que se han asociado con la

resistencia a oseltamivir; sin embargo se logró identificar otras mutaciones

como la N386K, que se encuentra solo en las muestras resistentes. Así mismo,

la mutación P431S, en la cavidad 430, que es una región altamente conservada

de la NA de los virus influenza A, y que aunque no forma parte del sitio activo,

entra en contacto con el sitio activo modificando el tamaño de la cavidad en la

que se inserta el carboxilato de oseltamivir, estas dos mutaciones son las que

consideramos como principales candidatas a ser responsables de la resistencia

al antiviral.

Otros autores (Rousset y col., 2010; Gubareva y col., 2010), han reportado que

algunas muestras presentan el cambio de una isoleucina por algún otro

aminoácido en las posiciones 117, 223 y 427, esto se pudo observar al analizar

el gen de NA. Lo que pareciese indicar que el aminoácido isoleucina es

fácilmente intercambiable en la secuencia de aminoácidos del gen de la NA.

Para resumir lo antes descrito, en la tabla V se señalan las mutaciones

diferentes a H275Y que se han reportado en otros trabajos asociadas a la

resistencia y las mutaciones que se encontraron en este análisis.

35

Tabla V. Listado de mutaciones asociadas a la resistencia que se detectaron en

este estudio y los reportados previamente.

Mutaciones encontradas en la NA, en el presente análisis que podrían estar

relacionadas con la resistencia.

S31P

V106I

N248D

N386 K

P431S

I443V

Mutaciones reportadas que se han asociado a la resistencia

I117V (Le y col., 2008)

I223R (Okomo y col., 2010)

Q313R (Rousset y col., 2010)

I427T (Rousset y col., 2010)

36

En la Tabla VI, se presentan las mutaciones encontradas al analizar las

secuencias de HA, al igual que las mutaciones asociadas con el cambio de

afinidad de la hemaglutinina por el receptor de ácido siálico encontradas en

otros trabajos, es de interés la mutación S220T, ya que se encuentra formando

parte de la cavidad 220, una cavidad que se encuentra en el sitio activo de esta

enzima, por lo que la mutación S220T podría ser una mutación compensatoria

que se esté presentando en estas cepas resistentes.

El sitio catalítico de la enzima neuraminidasa está conformado por los residuos

R118, D151, R152, R224, E276, R292, R371, Y406, y la interacción con el

sustrato está determinado por los residuos E119, R156, W178, S179, D/N198,

I222, E227, H274, E277, N294, E425, como se muestra en la Figura 10, por lo

que algunas de las mutaciones encontradas como la mutación P431S presente

solo en los virus con susceptibilidad reducida, aunque no se encuentran en el

sitio activo se encuentran en las cercanías de este pudiendo ser responsables

de un cambio conformacional (Yen y col., 2006).

El sitio catalítico de la enzima hemaglutinina está conformado por los residuos

Y95, G134, N185, E189, Q225, G227 (Blessia y col., 2010). La especificidad por

el tipo de receptor que contiene ácido siálico se determina por tres regiones de

la proteina, que son la región 130, 190 y 220, esto se observa en la Figura 11,

por lo que probablemente la mutación encontrada en la posición 220 de una

serina por una treonina puede estar siendo responsable de un cambio en la

afinidad de la HA por los receptores que contienen ácido siálico, esto por leves

cambios en la estructura de los aminoácidos(Bradley y col., 2011).

37

Tabla VI. Listado de mutaciones que se asocian al cambio de afinidad por el

receptor de ácido siálico, que se detectaron en este estudio y las reportadas

previamente.

Mutaciones encontradas en la HA, en el presente estudio que podrían estar

asociadas con un cambio de afinidad.

K39R

N101S

N146D

S220T

V410I

N498D

Mutaciones reportadas que se han asociado al cambio de afinidad por el

receptor de ácido siálico

L226Q (Suzuki, 2005)

S228G (Suzuki, 2005)

R229S (Abed y col., 2002)

38

Figura 10. Sitio activo de la neuraminidasa (NA). En esta imagen se observan

los aminoácidos que se encuentran en el sitio activo interaccionando con el

sustrato.

Fuente: Yen y col., 2006.

39

Figura 11. Sitio activo de la hemaglutinina (HA). En esta imagen se observan

los aminoácidos que se encuentran en el sitio activo interaccionando con el

sustrato.

Fuente: Bradley y col., 2011.

40

Mediante el ensayo de hemaglutinación se logro determinar el porcentaje de

unión de HA a los receptores que contienen ácido siálico tanto en conformación

α2,6 Gal como α2,3 Gal de cada uno de los cuatro aislamientos virales, así

como de los controles de susceptibilidad y resistencia. En la Figura 12a

podemos ver el comportamiento de los virus al utilizar la conformación α2,6 Gal

del ácido siálico, en esa grafica podemos observar que el virus susceptible tiene

una mayor afinidad por el ácido siálico que el virus resistente, y que tanto los

aislamientos virales 2438, y 2439 tienen un comportamiento similar al que se

presenta en el virus susceptible, mientras que 2440 y 2441 tienen un

comportamiento más semejante al presentado por el virus resistente.

Se realizó un análisis en el cual se comprobó si la unión a los receptores que

contienen ácido siálico en conformación α2,3 Gal se veía afectada en estos

virus con susceptibilidad reducida al oseltamivir, los resultados se muestran en

la Figura 12b, en la cual se muestra que el virus susceptible presenta una

afinidad del 100% por el receptor aun en la cuarta dilución, mientras que el virus

resistente solo tiene afinidad en las primeras dos diluciones, en esta gráfica se

logra observar que la capacidad de unirse a este tipo de receptores se ve

afectada en cada uno de los cuatro virus analizados, pero en el caso de 2440 y

2441 esta tendencia llega a ser mayor incluso que la presentada por el virus

resistente.

En las Figura 13 se muestra una comparación entre la unión a los receptores

que contienen ácido siálico en conformación α2,6 Gal y α2,3 Gal, para cada uno

de los virus.

41

A)

B)

Figura 12. Comparación del porcentaje de unión al receptor que contiene ácido

siálico en su conformación (A) α2, 6 Gal y (B) α2, 3 Gal por parte de HA,

utilizando un virus susceptible, un virus resistente y los aislados clínicos 2438,

2439, 2440 y 2441, las mediciones se realizaron a diferentes diluciones virales.

45

Figura 13. Comparación del porcentaje de unión de HA al receptor que contiene ácido siálico en su conformación α2, 3 Gal y α2, 6 Gal por parte de los virus analizados en este estudio.

42

43

Los aislamientos virales a excepción del virus susceptible presentan una

preferente afinidad por la conformación α2, 6 Gal del ácido siálico, aunque esta

no llega a ser tan buena como la que presenta el virus susceptible y podemos

observar una baja afinidad por la conformación α2, 3 Gal del ácido siálico, tanto

en el virus resistente como en los virus que presentan una susceptibilidad

reducida al oseltamivir, Xu y colaboradores en 2012, determinaron la afinidad

de el virus influenza A pandémico surgido en 2009, y comentaron que este

inicialmente presentaba una baja afinidad por el receptor, pero que esto fue

cambiando a medida que estuvo en circulación incrementando su afinidad

principalmente por la conformación α2, 6 Gal del ácido siálico del receptor, y

esto fue un mecanismo de adaptación, que consideramos podría jugar un rol

importante en el desplazamiento del virus de influenza estacional que se

encontraba en circulación antes del surgimiento de este virus pandémico.

Se analizó la actividad enzimática de NA para determinar si la resistencia a

oseltamivir conlleva a un cambio en la actividad, en la tabla VII, se muestra que

el valor de Km es menor en el virus susceptible que en el resistente, debido a

que la afinidad del virus susceptible al ser mayor, requiere una menor

concentración de sustrato para alcanzar la velocidad máxima, mientras que en

el caso del virus resistente se requiere una mayor concentración de sustrato

debido a que su actividad se encuentra comprometida, el valor de Km del

aislamiento viral 2439 es similar al del virus susceptible, este virus no presenta

una susceptibilidad reducida a oseltamivir, los valores de Km de los

aislamientos virales 2438, 2440 y 2441 son similares al del virus resistente,

estos virus presentan una susceptibilidad reducida al oseltamivir.

44

Tabla VII. Valores de Km y Vmax de los aislamientos virales 2438, 2439, 2440 y

2441 obtenidos del ensayo de actividad enzimática, así como de un virus

susceptible y un virus resistente.

Muestras Valor de Km (µM) Valor de Vmax (µM/S)

Susceptible 9,42 85,87

Resistente 47,55 101,67

2438 21,16 110,012

2439 6,7 96,54

2440 26,33 87,69

2441 39,22 80,75

45

Para determinar si existe una relación entre la actividad enzimática de la NA

como en la capacidad de unión de la HA por los receptores que contienen ácido

siálico se hizo una grafica en donde se compararon los valores de ambos

parámetros para establecer si existe una compensación entre la actividad de la

NA y la capacidad de unión de la HA, ya que se requiere del balance de estas

dos proteínas para la correcta generación y propagación del virus influenza,

estas graficas podemos observarlas en la Figura 14, en donde se muestra la

comparación de la Km con el porcentaje de unión por los receptores que

contienen ácido sialico en conformación α2, 6 Gal y en la Figura 15, se muestra

la comparación de la Km con el porcentaje de unión al receptor que contiene

ácido siálico en α2, 3 Gal.

Las Figuras 14 y 15 muestran claramente que existe una relación en la que se

observa que a mayor Km, es decir que la actividad enzimática de la NA se

encuentra comprometida, la afinidad por el receptor en la HA, y que la afinidad

es mucho menor cuando el ácido siálico se encuentra en conformación α2, 3

Gal que cuando está en conformación α2, 6 Gal esto nos indica el grado de

compromiso de la HA que debe tener una baja afinidad por su receptor para

poder permitir que se liberen correctamente los nuevos viriones, este balance

entre HA y NA ha sido descrito por muchos investigadores, entre estos esta Xu

y colaboradores quienes aseguran que este balance debe de existir ya que si

ocurren cambios en la NA que comprometan la actividad enzimática y estos

cambios no son compensados por cambios en la afinidad por el receptor la

unión entre HA y el receptor será tan fuerte que la NA no podrá romperla y de

esta manera no podrán generarse viriones con la capacidad de infectar mas

células.

46

Figura 14. Determinación del balance entre la NA y la HA evaluando Km y porcentaje de unión al receptor SAα2, 6 Gal.

47

Figura 15. Determinación del balance entre la NA y la HA evaluando Km y porcentaje de unión al receptor SAα2, 3 Gal.