respuestas de defensa inducidas por acibenzolars- …
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RESPUESTAS DE DEFENSA INDUCIDAS POR ACIBENZOLAR-S-METIL (ASM) EN PLANTAS DE
UCHUVA (Physalis peruviana)
Presentado por:
CAREL ELIZABETH CARVAJAL ARIAS
Microbióloga Industrial – Microbióloga Agrícola y Veterinaria
Tesis presentada como requisito para optar al título de Magíster en Ciencias Biológicas
Dirigido por:
MARIA XIMENA RODRIGUEZ BOCANEGRA, Ph.D.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá, Colombia
Diciembre de 2013
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Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
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RESPUESTAS DE DEFENSA INDUCIDAS POR ACIBENZOLAR-S-METIL (ASM) EN PLANTAS DE
UCHUVA (Physalis peruviana)
CAREL ELIZABETH CARVAJAL ARIAS
_________________________________ _____________________________
INGRID SCHULER, Ph.D. MANUEL ANTONIO FRANCO, Ph.D.
DECANA DIRECTOR DE POSGRADO
5
DEDICATORIA
A Dios y a la Santísima Virgen María, por regalarme la sabiduría, paciencia, fortaleza y el
amor para hacer cada cosa, por regalarme a la familia más maravillosa del mundo. A mi
papá, mamá y hermano, porque fueron un gran apoyo durante este proceso, por la
comprensión y la fuerza que me dieron en los momentos más difíciles.
6
AGRADECIMIENTOS
A Dios y a la Santísima Virgen María.
A mi familia padres, hermano, abuelos, tíos y primos, quienes comprendieron mi ausencia y dieron
todo su apoyo y consejos durante este proceso.
A Marcela Ramos, Melissa Sánchez, Naydu Rojas, Iván Ávila, Ángela Alvarado, Max Francisco
Martínez, por estar conmigo en los momentos buenos y no tan buenos que se presentaron
durante el camino, y por darme todo su apoyo y mucha parte de su tiempo.
A María Ximena Rodríguez Bocanegra, por orientar mi crecimiento académico, y por la paciencia y
compresión durante este proceso.
A todos los UNIDIANOS (Juan Camilo Rozo, Juan Camilo Galvis, Paola Hernández, Valeria Ocampo,
Tatiana Ortiz, Nicolás Cárdenas, Carolina Ramírez, Carolina Prieto, Vanesa, Alejandra Ferreira,
Laura Jiménez, Alejandra Rengifo), por hacer más ameno el trabajo en el laboratorio.
Al Profesor Ricardo Vera por permitirme trabajar en el Laboratorio de Macromoléculas.
A la Profesora Balkys Quevedo por permitirme trabajar en el Laboratorio de Biotecnología.
A la Profesora Aura Marina Pedroza por permitirme trabajar en el Laboratorio de Microbiología
Ambiental.
A la profesora Sandra Baena y al profesor Alejandro Reyes, por permitirme trabajar en el
laboratorio de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental.
7
Finalmente a todas las personas que en algún momento estuvieron conmigo durante este
proceso, apoyándome.
TABALA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION 11 2. OBJETIVOS
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3. ESTADO DEL ARTE 3.1 El cultivo de uchuva (Physalis preuviana) 3.1.1 Historia y generalidades dela uchuva (Physalis preuviana) 3.1.2 El cultivo de la uchuva en Colombia 3.2 Plagas y enfermedades limitantes del cultivo de la uchuva 3.2.1 Plagas 3.2.2 Enfermedades causadas por bacterias virus, nemátodos y hongos 3.2.3 Marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum 3.3 Alternativas de control
16 16 16 17 19 19 20 22 23
4. Establecimiento del efecto fitotóxico de acibenzolar-S-metil en plantas de uchuva 4.1 Introducción 4.2 Metodología 4.2.1 Material vegetal 4.2.2 Pruebas de fitotoxicidad 4.2.3 Análisis estadístico 4.3 Resultados y discusión
31 31 33 33 33 33 35
5. Respuestas de defensa inducidas por ASM en plantas de uchuva 5.1 Introducción 5.2 Metodología 5.2.1 Determinación de la respuestas de defensa en plantas de uchuva 5.2.2 Extracción de enzimas relacionadas con estrés oxidativo y metabolismo de fenoles 5.2.2.1 Cuantificación de enzimas relacionadas con estrés oxidativo (POX) 5.2.2.2 Cuantificación de fenilalanina amonio liasa (PAL) 5.2.3 Extracción de quitinasas (CHI) y glucanasas (GLU) 5.2.3.1 Cuantificación dela actividad quitinolítica y glucanolítica 5.2.4 Extracción de molécula señalizadoras, ácido salicílico y ácido jasmónico 5.2.4.1 Determinación y cuantificación de ácido salicílico y ácido jasmónico 5.2.5 Análisis estadístico 5.3 Resultados y discusión
45 45 50 50 50 51 51 51 52 52 53 53 54
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5.3.1 Enzimas relacionadas con estrés oxidativo y metabolismo de fenoles 5.3.1.1 Peroxidasa (POX) 5.3.1.2 Fenilalanina amonio liasa (PAL) 5.3.2 Actividad quitinolítica y glucanolítica 5.3.3 Determinación y cuantificación de moléculas señal
54 54 56 58 60
6. DISCUSION GENERAL
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 7.1 Conclusiones 7.2 Recomendaciones
8. ANEXOS 8.1 Curva patrón para cuantificación de proteínas por el método Bradford 8.1.1 Curva patrón para cuantificación de proteínas en los extractos para la cuantificación
de POX 8.1.2 Curva patrón para cuantificación de proteínas en los extractos para la cuantificación
de GLU y CHI 8.2 Curva patrón para la cuantificación de azúcares reductores por el método Somogy-Nelson 8.2.1 Curva patrón para la cuantificación de azúcares reductores-glucosa 8.2.2 Curva patrón para la cuantificación de azúcares reductores-N-acetil glucosamina 8.3 Curva patrón para la cuantificación de ácido cinámico
72 77 77 78 79 79 79 80 81 81 82 83
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LISTA DE TABLAS
Tabla 4.1 ANOVA para la interacción entre los factores concentración y dosis de aplicación evaluados en las pruebas de toxicidad de ASM en plantas de uchuva. 35 Tabla 5.1 Proteínas relacionadas con respuesta a patógenos (PR), inducidas por factores bióticos y abióticos 49 Tabla 5.2 Tiempos de aplicación de ASM y días de muestreo, de tejidos de tallo y raíz con y sin aplicación de ASM a nivel foliar 54
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LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 Características del fruto de la uchuva 17 Figura 3.2 Distribución de cultivos de uchuva en Colombia 18 Figura 4.1 Metodología empleada para la evaluación de la toxicidad de ASM en plantas de uchuva 34 Figura 4.2 Parámetros evaluados para determinar los efectos fitotóxicos en plantas de uchuva 34 Figura 4.3 Efecto de las concentraciones de ASM sobre el crecimiento de las plantas de uchuva 34 Figura 4.4 Número de hojas con textura corácea en plantas de uchuva 39 Figura 4.5 Comparación entre concentraciones y tratamientos con ASM en plantas de uchuva 40 Figura 5.1 Montaje para la inducción de respuestas de defensa en plantas de uchuva con aplicación de ASM 50 Figura 5.2 Actividad peroxidasa (POX) 55 Figura 5.3 Actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) 57 Figura 5.4 Actividad quitinolítica (CHI) 59 Figura 5.5 Actividad glucanolítica (GLU) 60 Figura 5.6 Tiempo de retención de las moléculas señal determinadas 62 Figura 5.7 Determinación de ácido salicílico en plantas de uchuva 63
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1. INTRODUCCION
Colombia es uno de los principales países productores de uchuva para exportación, llegando a
ocupar el primer lugar como el mayor productor seguido por Sudáfrica. El fruto producido en
Colombia (ecotipo Colombia) es uno de los más apetecidos por el mercado internacional, debido a
sus características organolépticas y alto contenido de azúcar y vitaminas (Puente et al. 2011).
Durante su desarrollo el cultivo puede ser afectado por diferentes plagas y enfermedades, dentro
de las cuales se encuentran hongos, bacterias, virus y nematodos. Una de las enfermedades más
limitantes es el marchitamiento vascular producido por Fusarium oxysporum; en los últimos años
este patógeno ha ocasionado pérdidas hasta del 100% de los cultivos (Estupiñan & Ossa 2007),
principalmente en los municipios de Granada y Silvania desde2005 (Forero de La Rotta &
Quevedo, 2005). Para su control se realiza la aplicación de fungicidas que no son efectivos para el
control de la enfermedad. Uno de los problemas que afectan la exportación de la uchuva es el uso
indiscriminado de plaguicidas que generan trazas en el fruto, lo que ha limitado el mercado
internacional. Por esta razón se debe buscar el establecimiento de sistemas de manejo integrado
contra las plagas del cultivo, minimizando la utilización de productos químicos (Puente et al.
2011). En respuesta a esta problemática, se han adoptado alternativas de control como la
aplicación de controladores biológicos y las buenas prácticas agrícolas (BPA) (Angulo, 2003;
Salazar, 2008).
Así como los animales, las plantas también cuentan con un sistema inmune, el cual les permite
responder a estrés causado por agentes abióticos y bióticos. Los mecanismos de defensa en
plantas han sido denominados resistencia sistémica inducida (ISR, Induced Systemic Resistance) y
resistencia sistémica adquirida (SAR, Systemic Acquired Resistance) (Vallad & Goodman, 2004).
Estos mecanismos se pueden diferenciar por el agente inductor y las moléculas señal para
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producir la respuesta de defensa. En el caso de SAR la inducción se da por la exposición de la raíz o
los tejidos foliares a elicitores bióticos (fitopatógenos virulentos y avirulentos o insectos plaga) o
abióticos (condiciones ambientales), y la hormona señalizadora es el ácido salicílico (SA). Por otro
lado, en ISR la respuesta es inducida por la exposición de las raíces a microorganismos como
rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal y está regulada por etileno (ET) y ácido jasmónico
(JA) (Durrant & Dong, 2009; Fujita et al., 2006).
Con el fin de comprobar la inducción de respuestas de defensa en plantas de uchuva, este trabajo
se desarrolló bajo el marco de la inducción de respuesta sistémica para defensa en plantas de
uchuva a partir de la aplicación de un fitoactivador. Los fitoactivadores son moléculas de síntesis
química, análogos de moléculas señal, como el caso del ácido salicílico, compuesto fenólico
sintetizado a partir de corismato o fenilalanina, que se activa cuando hay un ataque a la planta por
parte de patógenos biótrofos y hemibiótrofos, señalizando respuestas localizadas y sistémicas. El
ácido salicílico actúa inhibiendo la catalasa, desempeñando así un papel fundamental en la
respuesta hipersensible y la señalización para producción de proteínas asociadas a respuestas
frente a patógenos (PR) y fitoalexinas (Pieterse & van Loon, 1999; Rangel et al., 2010). Algunos de
los compuestos análogos al ácido salicílico son ácido 2-6 dicloroisonicotinico (INA), Benzo tiadiazol-
7 ácido carbocationico-S-metil ester (BTH) y acibenzolar-S-metil (ASM), los cuales debido a su baja
toxicidad (Herman et al., 2007), se han implementado en la agricultura con el fin de inducir
resistencia sistémica en cultivos de importancia económica, como en el caso del banano para
controlar Sigatoka, en Colombia. El ASM se caracteriza por inducir las mismas respuestas que los
elicitores bióticos, como la producción de fitoalexinas, la acumulación de proteínas PR,
evidenciado en el incremento de la actividad β 1-3 glucanasas, quitinasa, superóxidodismutasa,
lipooxigenasa y peroxidasa y la deposición de calosa y lignina (Lin et al., 2009; Nogueira et al.,
2002).
Durante el desarrollo de este trabajo se estableció el efecto tóxico de diferentes concentraciones
de ASM en aplicación foliar en plantas de uchuva y, posteriormente, se determinaron respuestas
de defensa a nivel de señalización y acumulación de proteínas asociadas con respuesta contra
patógenos en plantas de uchuva tratadas con ASM.
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BIBLIOGRAFIA
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Estupiñan, H., & Ossa, J. (2007). Efecto del agente causal de la marchitez vascular de la uchuva
(Physalis peruviana L) el hongo Fusarium oxysporum, sobre algunas solanáceas y otras especies
cultivadas afectadas por formas especiales del microorganismo. Trabajo de Grado Microbiología
Agrícola. Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias, Bogotá.
Forero de la Rotta MCl. & Quevedo E. (2005) Marchitamiento vascular por Fusarium oxysporum en
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in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity,
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2. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar respuestas de defensa relacionadas con resistencia sistémica, inducidas por acibenzolar-S-
metil, en plantas de uchuva.
Objetivos Específicos:
• Establecer el efecto fitotóxico de diferentes concentraciones y número de aplicaciones de
acibenzolar-S-metil por aplicación foliar en plantas de uchuva.
• Determinar respuestas de defensa, a nivel acumulación de proteínas asociadas con
respuesta contra patógenos y de señalización, en plantas de uchuva tratadas con
acibenzolar-S-metil.
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3. ESTADO DEL ARTE
3.1 El cultivo de uchuva (Physalis peruviana)
La uchuva (Physalis peruviana), es una fruta exótica, tropical andina que pertenece a la familia de
las solanáceas. Se caracteriza por ser una planta perenne y por producir un fruto carnoso,
comestible, el cual se encuentra dentro de un cáliz. A lo largo del tiempo, este cultivo ha cobrado
importancia económica dentro de países de Sur América, siendo uno de los frutales más
importados al continente Europeo, debido a sus propiedades nutracéuticas y medicinales, además
por su potencial para la elaboración de nuevos productos y la aplicación de algunos de sus
componentes en la industria de alimentos (Mohamed, 2011; Fischer & Almanza, 2005).
3.1.1 Historia y generalidades de la uchuva (Physalis peruviana)
La uchuva es un cultivo característico de los Andes en Sur América, es también cultivada en
California, Sudáfrica, India, Nueva Zelanda, Australia y Gran Bretaña. Este cultivo se originó en la
sierra Andina del norte de Sur América, e inicialmente fue realizado por los Incas (Klinac, 1986;
Coiles, 1952; Legge, 1974 a en Klinac, 1986; Morton, 1987; McCain, 1993; Salazar et al., 2008). En
Europa el cultivo inició en la década de 1700, en el Reino Unido (Legge, 1974 b en Klinac 1986),
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posteriormente con los primeros inmigrantes, se extendió hasta Sudáfrica y Nueva Zelanda, donde
el cultivo no se realiza a gran escala, si no como una práctica cultural, por lo tanto no hay
producción a nivel comercial. Los intentos para establecer el cultivo como un frutal de importancia
económica han fracasado, debido a problemas asociados a condiciones ambientales para el
desarrollo y la maduración del fruto (Benson y Sproule, 1963 en Klinac, 1986; Watt 1948 en Klinac,
1986). En Asia, África y Estados Unidos, el cultivo se ha realizado como una práctica cultural, y no
ha cobrado importancia económica, por lo tanto es considerado como un cultivo menor de
frutales (Klinac, 1986).
La uchuva es una baya carnosa, comestible, de color amarillo y naranja, protegida por un
capuchón o cáliz, puede llegar a pesar entre 4 a 10 gramos, y su tamaño oscila entre 1,25 y 2,5 cm
(figura 3.1) (Klinac, 1986; Mayorga, Knapp, Winterhalter, & Duque, 2001; Herrera, 2011). Se
caracteriza por su sabor dulce, además por sus propiedades nutricionales como el alto contenido
de vitamina A, C y K1, hierro, fósforo y algunos minerales, contiene altos niveles de lípidos (ácidos
grasos escenciales), proteínas y pectina, la pectina funciona como un regulador del tracto
gastrointestinal (Mohamed, 2003 y McCain, 1993; Ramadan & Mörsel, 2003 2011; Fischer, 1995
en Salazar, 2008). El fruto contiene un 15% de sólidos solubles, que en su mayoría son azúcares,
como la fructosa, que se encuentra en mayor proporción, y tiene beneficios sobre los pacientes
diabéticos que la consumen. Gracias a su alto contenido de antioxidantes como witanolidos y
compuestos fenólicos, previene el daño oxidativo de los hepatocitos, además la fibra, influye en el
buen funcionamiento del sistema digestivo (Zhao, 2007, Wang, Lin-Shiau, & Lin, 1999). Otro de los
beneficios de la uchuva es el alto contenido de ácido linoleico, que ayuda a prevenir
enfermedades cardiovasculares y reduce niveles de colesterol (Mohamed, 2011); además de esto,
al fruto también se le atribuyen propiedades antiasmáticas, antisépticas, fortalece el nervio óptico,
y elimina la albúmina de los riñones (Arun & Asha, 2007; Mayorga et al., 2011).
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Figura 3.1. Características del fruto de la uchuva. Baya carnosa (1), color naranja, protegida por un cáliz o capuchón (2).Imagen tomada de Mohamed, 2011.
3.1.2 El cultivo de la uchuva (Physalis peruviana) en Colombia
Colombia es el mayor exportador mundial de uchuva, ecotipo Colombia, seguido de Sudáfrica y
Kenia, debido a sus características organolépticas como, sabor dulce, aroma y color brillante,
nutraceuticas y medicinales, lo que la hace atractiva a los mercados internacionales,
especialmente al mercado Europeo (Salazar, 2008; Agronet, 2010; Galvis et al., 2005; Mayorga et
al., 2001). En Colombia, se convirtió en el segundo fruto de exportación después del banano. La
producción nacional de la uchuva, aumentó a una tasa del 42,2% entre 1993-2008, con una
producción de aproximadamente 15.463 toneladas por año, los departamentos con mayor aporte
fueron Boyacá, Cundinamarca y Antioquia (Agronet, 2010; Herrera et al., 2011). Este cultivo pasó
de ser una especie olvidada a ser la fruta exótica más importante para los mercados nacionales e
internacionales, en 2007 las exportaciones dejaron grandes ganancias para la economía del país
(Simbaqueba, 2011). El cultivo se implantó en varias zonas del país debido a la demanda que exige
el mercado internacional, los departamentos que actualmente producen uchuva en Colombia en
óptimas condiciones son Cundinamarca, Boyacá, Antioquia, Cauca, Huila, Magdalena, Nariño y
Tolima (figura 3.2) (Agronet Colombia - 2010 - Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural-Última
actualización: 15 de marzo de 2012).
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Figura 3.2 Distribución de cultivos de uchuva en Colombia.
Por ser una especie herbácea, arbustiva, silvestre y semi-silvestre, la uchuva tiene la capacidad de
adaptarse a diversas condiciones agroecológicas, como variedad de tipos de suelo, capacidad de
campo, humedad relativa y temperatura, esto le permite tener amplia distribución en el país
(Herrera et al., 2011, Mohamed et al., 2003). Las plantas se caracterizan por ser altamente
productivas, requieren bajas concentraciones de fertilizantes y poca agua pero en riego constante
para su desarrollo y crecimiento, y es importante en el proceso de formación y llenado del fruto
(McCain, 1993; National Research Council, 1989-Almanza y Fischer, 2012). Puede crecer en zonas
altas entre los 1500 y 3000 msnm, aunque en reportes realizados por Fisher en el 2000, se
determina que las alturas entre 2900 y 3000 msnm pueden afectar el contenido de azúcares en el
fruto (Salazar 2008; Fischer & Almanza 2012). Bajo condiciones no controladas, la planta tiene un
crecimiento aproximado de 1 a 1.5m de altura, una planta alcanza un rendimiento de 300 frutos y
20 a 33 toneladas por hectárea (Mohamed, 2011). En Colombia, la producción se lleva a cabo por
pequeños agricultores, que mantienen los cultivos en pequeñas parcelas, con mano de obra
familiar, por lo tanto emplean tecnologías que no son suficientes para el aumento de la
producción y para el control de plagas y enfermedades (Angulo, 2003). Para el mercado de
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exportación, Colombia ha avanzado en la implementación de sistemas de calidad, que permiten
cumplir las exigencias de los mercados internacionales, respecto a características fisicoquímicas,
las relacionadas con la presentación del producto, y las de impacto sobre la salud humana (Angulo,
2005).
3.2 Plagas y enfermedades limitantes del cultivo
El cultivo de la uchuva es afectado por diversidad de organismos y microorganismos, durante su
ciclo de crecimiento y productividad, afectando la planta y el fruto. Cuando se afecta directamente
el fruto o el cáliz, el daño es irreversible (Casas, 2006; Perera et al., 2010), por lo tanto estas
enfermedades disminuyen el rendimiento y la calidad del producto, ocasionando grandes
pérdidas económicas a los agricultores. Dentro de los organismos que ocasionan daños en el
cultivo encontramos plagas como insectos y enfermedades causadas por bacterias, virus,
nematodos y hongos, siendo la enfermedad más limitante el marchitamiento vascular causado por
Fusarium oxysporum.
3.2.1 Plagas
Dentro de las plagas que atacan el cultivo de uchuva, se encuentra la mosca blanca (Trialurodes
vaporariorum) y los áfidos o pulgones (Macrosiphum euphorbiae y Myzus persicae), su mecanismo
es tomar los fotoasimilados de la planta lo que interfiere en la actividad fotosintética, además
permiten la colonización por parte de Cladosporium sp., que produce la fumagina, si el cáliz es
afectado el fruto pierde valor comercial (Benavides & Mora, 2005). La pulguilla (Diabotrica sp.) y
los cucarrones (Epitrix cucumeris Harris, Epitrix parvula Fabricius) afectan directamente el follaje y
el cáliz, dejando perforaciones pequeñas, lo que ocasiona también el deterioro del fruto, esto trae
problemas a nivel de la calidad del fruto para exportación (Angulo et al., 2005; Bado et al., 2005;
Angulo et al., 2005; Casas, 2006; Benavides, 2001). Los tierreros y trozadores (Agrotis ipsilon,
Spodoptera sp., y Feltia sp.), atacan directamente brotes nuevos, cuello y raíces, limitando el
crecimiento y desarrollo de la planta (Angulo, 2003, 2005; Benavides y Mora, 2005; Fisher 2005).
Las plagas perforadoras del fruto, Heliothis virescens, inician con la perforación del cáliz para
acceder al fruto, esta plaga causa pérdidas económicas, debido a que baja el rendimiento del
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cultivo y deteriora completamente los frutos en cualquier estado de maduración (Fischer, 2005).
Los minadores del follaje (Liriomyza sp.) producen manchas blancas irregulares en las hojas,
causando la defoliación completa de la planta (Fischer, 2005; Angulo et al., 2005; Benavides &
Mora, 2005). Otra de las plagas que ocasiona grandes pérdidas económicas son los trips
(Frankiniella spp.), que en la etapa adulta producen el mayor daño en las hojas, las flores y el cáliz,
ocasionando raspaduras, decoloración y necrosamiento de tejidos y disminución en la producción
y crecimiento de la planta (Fischer, 2005; Angulo, 2003; Benavides y Mora, 2005). Los ácaros
defoliadores de la uchuva (Aculops lycopersici) son considerados de importancia cuarentenaria, en
la planta producen un herrumbre en las hojas y pueden llegar a dañar el cáliz, a temperaturas
elevadas el ácaro se desarrolla con mayor velocidad y las hojas afectadas se secan rápidamente,
cuando ataca el cáliz los frutos permanecen verdes, a pesar de la apariencia de madurez de este.
Actualmente, el fruto es rechazado para ingresar al mercado europeo por los daños ocasionados
por esta plaga (Benavides & Mora, 2005; Fischer, 2005).
3.2.2 Enfermedades causadas por bacterias, virus, nematodos y hongos
Entre las enfermedades ocasionadas por bacterias, las que presentan mayor incidencia durante el
desarrollo del cultivo son la pudrición vascular (Ralstonia solanacearum) y la mancha grasosa
(Xanthomonas sp.). Ralstonia solanacearum genera marchitez y pudrición de la planta, al inicio de
la enfermedad las hojas no presentan clorosis, sin embargo, después de tres o cuatro días con
altas temperaturas, la planta se torna totalmente amarilla y muere a causa de la pudrición de los
haces vasculares (Angulo et al., 2005). Por otro lado, Xanthomonas sp. coloniza el cáliz, esto le da
una apariencia y textura aceitosa y parafinada, lo que impide la recolección del fruto (Angulo et
al., 2005; Zapata et al., 2002), y por lo tanto grandes pérdidas económicas.
Otro de los agentes etiológicos limitantes para el desarrollo del cultivo de uchuva son los
nematodos, su mecanismo de acción consiste en realizar lesiones y heridas en la raíces de plantas,
dejando así entradas a otros patógenos oportunistas. Los nematodos que están relacionados con
el cultivo son Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, y Meloidogyne hapla, se caracterizan
por inducir la formación de nódulos en los ápices de la raíces, lo que ocasiona la interrupción del
paso de agua y nutrientes al interior de la planta, limitando el crecimiento y desarrollo de la misma
22
(Zapata et al., 2002; Angulo, 2003), por lo tanto hay disminución en el rendimiento del cultivo y
pérdida en la calidad nutricional del fruto, además predispone a las plantas a adquirir otras
enfermedades (Zapata, 2002; Niño, 2007).
Dentro de las enfermedades que afectan el desarrollo del cultivo, se encuentran las producidas
por virus. Las lesiones producidas por este agente se caracterizan por inducir clorosis y necrosis en
hojas, además de formar mosaicos y moteados con presencia de pústulas en las hojas. Además
ocasionan el enrollamiento del tejido foliar y del cáliz, limitan el crecimiento normal de la planta y
deforman los frutos. La uchuva se ve afectada principalmente por el Physalis Mosaic Virus (PMV),
que se caracteriza por producir manchas cloróticas, necróticas y clorosis intervenal (Angulo et al.,
2005; Zapata, 2002).
Los hongos, también tienen un papel importante dentro de las patologías que deterioran el
rendimiento del cultivo, debido a que atacando diversas partes de la planta como hojas, frutos,
sistema radicular y vascular, limitan la producción y la obtención de frutos con la calidad exigida
por los mercados nacionales e internacionales. La enfermedad a nivel foliar más importante es la
mancha gris, causada por Cercospora diffusa, este microorganismo ataca directamente los ápices
de las hojas, formando lesiones redondas de color verde, en el haz de la hoja el borde de la lesión
es clorótica y en el centro presenta color marrón de aspecto seco y quebradizo, a medida que
avanza la enfermedad las lesiones comienzan a tomar un color grisáceo y a formar pústulas. Esta
enfermedad puede ocasionar pérdidas hasta del 100% del cultivo (Angulo et al., 2003, 2005a;
Zapata et al., 2002). Cladosporium sp. y Alternaria sp. también afectan el cáliz y las hojas
respectivamente, produciendo lesiones cloróticas y necróticas. Cladosporium sp. forma
acartonamiento transparente en las hojas, mientras que Alternaria sp. da origen a lesiones negras
en el área afectada (Angulo et al., 2005; Zapata et al., 2002). Las enfermedades relacionadas con el
tallo y los haces vasculares, ocasionan en la planta el marchitamiento completo y por lo tanto la
muerte, debido a la pérdida de turgencia que se produce por la colonización de los haces
vasculares, diferentes agentes etiológicos están relacionados con estos síntomas, dentro de los
cuales se reporta Phoma sp. (Muerte descendente), Pythium sp. (Damping off), Rhizoctonia sp.
(Damping off) y Fusarium sp. (Marchitamiento vascular), entre otros (Zapata et al., 2002), siendo
Fusarium sp. el patógeno más limitante del cultivo de uchuva.
23
3.2.3 Marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum
El marchitamiento causado por Fusarium sp. se caracteriza por un crecimiento pobre en las
plantas. Los primeros síntomas de la enfermedad se manifiestan en un ligero aclaramiento de las
nervaduras de los foliolos jóvenes más externos, después se presenta la epinastia de las hojas
senescentes ocasionada por el debilitamiento de los peciolos (Agrios, 2002). Las hojas viejas
toman una coloración amarilla, al igual que las ramas, aunque no toda la planta se ve clorótica sino
una determinada parte de esta, al interior del tallo cuando se examina la parte externa del tejido
vascular este se ve de color rojizo o marrón debido a la necrosis ocasionada por el progreso del
patógeno en los haces vasculares de la planta (Labate et al., 2007).
El proceso de infección de F. oxysporum es complejo y requiere una serie de mecanismos bien
regulados: (1) reconocimiento de señales aún desconocidas provenientes de las raíces de las
plantas, (2) adhesión a la superficie de la raíz y la diferenciación de las hifas de penetración, (3)
invasión del cortex de la raíz y la degradación de barreras físicas como la endodermis hasta llegar
al tejido vascular, (4) adaptación al entorno adverso al tejido vascular, por ejemplo la tolerancia a
compuestos antifúngicos, (5) proliferación de las hifas y posiblemente la producción de conidios
en los vasos del xilema, (6) secreción de factores de virulencia tales como péptidos o fitotoxinas
(Agrios, 2001; Roncero et al., 2000). La obstrucción de los vasos por el micelio, epropágulos, geles
y tilosas, así como la proliferación de células parenquimatosas, altera las reservas de agua en la
planta. Cuando el volumen de agua disponible para las hojas es inferior al mínimo, los estomas se
cierran y por consiguiente las hojas se marchitan y la planta muere (Agrios, 2002).
En Colombia, esta enfermedad es la más limitante para el cultivo, debido a que genera hasta 100%
de pérdidas en la producción (Bernal et al., 2013). Por lo tanto, para el control no sólo de este
patógeno sino también de las plagas y enfermedades anteriormente descritas, es necesario el
planteamiento de alternativas de control efectivas y de amplio espectro, que refuercen los
controles actuales.
3.3 Alternativas de control para plagas y enfermedades del cultivo de la uchuva
24
Desde las décadas de los 50 y 60, se ha tenido la preocupación de proteger los cultivos que
abastecen la alimentación de la población mundial, por lo tanto el desarrollo y manejo se ha
centrado en el uso de técnicas que favorezcan el rendimiento y la producción, como el empleo de
cultivos modificados genéticamente, arado mecánico de los suelos y el uso de plaguicidas y
fertilizantes químicos (Dayan et al., 2009).
Para cumplir con los requerimientos estipulados para la exportación de la uchuva a mercados
internacionales, el cultivo requiere de un manejo tecnificado, a pesar de esto los problemas
fitosanitarios, nutricionales y fisiológicos no han sido estudiados a profundidad. La falta de
información acerca del cultivo de uchuva se atribuye, a que este es un cultivo relativamente
reciente sin embargo (Niño, 2008). En la actualidad no es suficiente o no se conoce la información
para el manejo del cultivo de uchuva (Herrera, 2011), por lo tanto para el control de plagas, se
implementan actividades culturales, realizadas por la mano de obra familiar (Angulo, 2003;
Salazar, 2008), algunos pequeños agricultores utilizan diversas tecnologías, como la
implementación de buenas prácticas agrícolas (BPA) y uso indiscriminado de plaguicidas y
fungicidas poco eficientes en el momento de control (Angulo, 2003; Salazar, 2008), además se
reporta que los productores de uchuva emplean ingredientes activos como carbendazin y
carboxin, entre otros, y mezclas de fungicidas, los cuales no tienen un fitopatógeno blanco
específico (Díaz, 2012). El mal empleo de controladores químicos ocasiona la acumulación de
residuos de estos en las hojas y los frutos, causando intoxicación de la planta, siendo evidente la
disminución de crecimiento y desarrollo, deteriorando la calidad del fruto, y como consecuencia la
dificultad para la entrada al mercado de exportación. De acuerdo a lo mencionado, el gerente del
ICA en 2001 determinó: “Es importante que los agricultores establezcan sistemas de manejo
integrado contra las plagas de los cultivos, con menor utilización de productos químicos, y en
aquellos en que sean utilizados, se haga de acuerdo con las indicaciones de la etiqueta”, Caicedo
Lince, Gerente ICA, Corporación Colombia Internacional, Sistema de Inteligencia de Mercados,
Perfil producto No.13, septiembre de 2001.
A lo largo de los años, el uso de fertilizantes y plaguicidas químicos ha tenido un impacto negativo
sobre el medio ambiente, es por esta razón que actualmente se plantea la reducción del empleo
25
de estos en los cultivos y se propone sacar provecho del sistema inmune de las plantas, pues es
posible emplearlo para el inicio del establecimiento de una agricultura sostenible. Los mecanismos
de defensa pueden ser activados empleando elicitores, los cuales inducen respuestas como la
producción de enzimas relacionadas con respuesta frente a patógenos, metabolismo de fenoles y
estallido oxidativo, además el fortalecimiento de barreras estructurales y la acumulación de
metabolitos secundarios en toda la planta (García et al., 2013). Las respuestas de defensa pueden
ser inducidas por elicitores bióticos como micoorganismos, glicoproteínas, polisacáridos, o
abióticos como temperatura, fungicidas, antibióticos, metales pesados, pH y diferentes
condiciones de estrés.
La inducción de resistencia es un estado fisiológico de la planta, que consiste en la activación o
aumento en la producción de respuestas de defensa por medio de estímulos ambientales
específicos (van Loon, 2004). Dentro de los mecanismos de defensa adoptados por las plantas está
la resistencia sistémica adquirida (Systemic Acquired Resistance - SAR) y la resistencia sistémica
inducida (Systemic Induced Resistance - SIR). SAR puede inducirse exponiendo la planta a cepas
virulentas, avirulentas y no patogénicas, o a compuestos de síntesis química, que en su mayoría
corresponden a análogos de moléculas señal como INA (ácido 2-6 dicloroisonicotinico) y BTH
(Benzo tiadiazol-7 ácido carbocationico-S-metil ester ) (Stricher, 1997). El periodo de tiempo para
el establecimiento de SAR depende de la planta y el elicitor, que se relaciona directamente con las
vías de señalización intracelular, necesarias para la acumulación de proteínas asociadas con
respuesta a patógenos (Proteinas PR) y de ácido salicílico en toda la planta. Las respuestas de
defensa pueden ser atenuadas, cuando los elicitores son organismos o microorganismos
patógenos, pues interfieren con la acumulación de estos metabolitos a nivel sistémico (Gary et al.,
2004). Otro de los mecanismos anteriormente nombrados y que adopta la planta es la SIR, la cual
es inducida mediante el uso de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (plant growth
promoting rizobacteria - PGPR). A diferencia de SAR, en ISR no hay acumulación de PR (Preterse et
al., 1996) y la señalización está mediada por la producción de ácido jasmónico y etileno (Kroester,
1999; Pieterse, 1998; Man, 2002). Por lo tanto, la inducción de respuestas de defensa por medio
de elicitores bióticos o abióticos, favorece la prevención de enfermedades en plantas,
disminuyendo el uso de plaguicidas químicos, que tiene un impacto negativo en el medio
ambiente.
26
Dentro de los compuestos, análogos de moléculas señal, que pueden inducir resistencia sistémica
en plantas se encuentra el Acibenzolar-S-Metil (ASM). Este compuesto es el primer compuesto de
síntesis química introducido al mercado por Syngenta en varios países, empleado para inducir SAR
en plantas, por lo tanto se clasifica como un fitoactivador, molécula de síntesis química análoga de
moléculas señal. ASM es análogo funcional del ácido salicílico, compuesto fenólico sintetizado a
partir de corismato o fenilalanina que se activa cuando hay ataque a la planta por parte de
patógenos biótrofos y hemibiótrofos, este señaliza respuestas localizadas y sistémicas (Pieterse,
van Loon, 1999; Rangel et al., 2010; Charalampos et al., 2011). El fitoactivador es utilizado para
proteger a la planta frente a un amplio espectro de plagas y enfermedades como bacterias,
hongos, virus y nematodos. ASM puede ser aplicado directamente en los foliolos, en las semillas,
durante el proceso de germinación, directo en la raíz por inmersión o directo en el suelo (drench)
(Ciancio et al., 2008; Csinos et al., 2001 en Charalampos, 2011).
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4. Establecimiento del efecto fitotóxico de acibenzolar-S-metil en plantas de uchuva
4.1 INTRODUCCION Se conocen diversos compuestos que tienen la capacidad de influir en el crecimiento de las plantas
y que confieren protección a los cultivos de interés agroindustrial frente a malezas, plagas y
enfermedades. Estos compuestos se clasifican de acuerdo a su origen, pueden ser productos
naturales (metabolitos secundarios obtenidos a partir de plantas o microrganismos) o compuestos
de síntesis química análogos de moléculas señal. Esta última clase de compuestos se emplea con
mayor frecuencia debido a la efectividad que presentan durante el desarrollo de los cultivos y,
además, se han convertido en una herramienta útil para la protección, control y prevención de
diversas enfermedades. Actualmente se plantea la hipótesis en la que se establece que algunos de
32
los componentes puede tener efectos sobre el crecimiento y desarrollo de la planta,
comportamiento que se relaciona directamente con problemas de toxicidad (Tresch, 2013).
Desde 1990 se reportan estudios en los que se relaciona la aplicación de compuestos de síntesis
química con el bloqueo de diferentes vías de señalización en las plantas (Min et al., 1999;
Armstrong, 2004), por lo tanto, es necesario realizar pruebas para identificar si estos compuestos
tienen algún efecto sobre el fenotipo o las vías de señalización que regulan actividades fisiológicas.
Es importante tener en cuenta el componente activo, el órgano o tejido blanco y el mecanismo de
acción, para evitar confundir los síntomas ocasionados por la toxicidad de la formulación del
producto. Las pruebas de fitotoxicidad son importantes no solo para la agroindustria sino también
para las ciencias básicas, porque permiten identificar cambios fisiológicos en la planta y el
mecanismo de acción directo del componente activo, estas pruebas deben realizarse bajo
condiciones de invernadero o campo para simular las condiciones reales del cultivo (Tresch, 2013).
La fitotoxicidad se define como una interacción recíproca entre la planta y un compuesto de
síntesis química que se emplee sobre ésta (Nash, 1989). Carmona en el 2007, define la
fitotoxicidad como “un efecto detrimental, nocivo o dañino de una sustancia química que se
puede expresar en distintos órganos en la planta. Esta característica no es siempre evitada en el
desarrollo de un nuevo compuesto químico”. La acción fitoncida de los productos está
determinada por la formulación del producto y la solubilidad en agua de este compuesto (Verdu,
1989). Los criterios para determinar la toxicidad de una sustancia sobre las plantas aún no están
definidos, por esta razón se deben diseñar experimentos en los que se prueben dosis,
concentraciones y mecanismos de aplicación, con el fin de evaluar las interacciones biológicas
(Nash, 1981).
El mecanismo de acción de los agroquímicos puede ser localizado o sistémico, es decir, producen
respuestas o realizan la acción en el punto de penetración o pueden translocarse por toda la
planta. El uso indiscriminado de agroquímicos puede causar alteraciones fenológicas y fisiológicas
en la planta como reducción del crecimiento de la planta, necrosis y lesiones en los tejidos,
deformación de las hojas dándoles una textura corácea, manchas, clorosis y necrosis internerval,
caída de flores y frutos y reducción de la producción. Estos efectos se relacionan directamente con
33
la presencia de iones en la composición del agroquímico, también dependen de la disociación
electrolítica de éstos, además se ha determinado que las formulaciones tienen alto contenido de
sales ácidas y minerales, hidrocarburos insaturados y compuestos aromáticos, estos dos últimos
presentes en los aceites minerales empleados como coadyuvantes (Verdu, 1989).
Durante el desarrollo de este trabajo, debido a que se conoce el componente activo (Molécula
análoga de ácido salicílico) y el mecanismo de acción, pero no la formulación del producto, se
estableció el efecto tóxico de diferentes concentraciones de ASM en aplicación foliar en plantas de
uchuva.
4.2 METODOLOGIA
4.2.1 Material vegetal
Se emplearon plantas de uchuva (ecotipo Colombia) de 60 días de desarrollo con cuatro a cinco
pares de hojas verdaderas. Las plantas se sembraron en una mezcla de suelo con arena,
proporción 3:1, y fueron fertilizadas con formulación NPK (15:15:15) a 400ppm cada 15 días. Las
plantas se adquirieron en el Centro Agrícola de Investigación y Desarrollo Tecnológico “Vandré”
(CAIDVANDRE Ltda).
4.2.2 Pruebas de fitotoxicidad
34
Se evaluaron cinco concentraciones (5, 10, 15, 20, 30 mg/L) de ASM (formulación Boost® 50 SC,
Syngenta). Se llevaron a cabo tres tratamientos que variaron de acuerdo al número y frecuencia de
aplicación (T1: una aplicación en el día 0, T2: dos aplicaciones en los días 0 y 7, T3: tres
aplicaciones en los días 0, 7 y 14), como se muestra en la figura 4.1. El ASM se aplicó de acuerdo a
las recomendaciones de Syngenta para plantas de tomate y tabaco, las cuales establecen que la
aplicación debe hacerse a nivel de los foliolos de la planta. Se evaluó el desarrollo de las plantas
durante ocho semanas, teniendo en cuenta longitud de tallo, longitud de raíz, peso seco total,
encopamiento y textura corácea de las hojas, número de hojas basales y número de hojas totales,
(figura 4.2). Se realizaron tres réplicas de 10 plantas, cada una, para cada tratamiento, los ensayos
se repitieron dos veces en tiempos diferentes, empleando un diseño experimental de bloques al
azar (Benelli et al., 2009).
4.2.3 Análisis estadísticos
Para el análisis de los resultados se realizó un ANOVA para determinar la influencia de la interacción entre
los factores concentración y dosis de aplicación sobre los parámetros evaluados en las pruebas de
fitotoxicidad de ASM en plantas de uchuva. Además se realizaron pruebas de Tukey y Scheffe para cada uno
de los tratamientos. Los análisis se llevaron a cabo en el programa SPSS 19 IBM.
35
Figura 4.1. Metodología empleada para la evaluación de la toxicidad de ASM en plantas de uchuva.
Figura 4.2. Parámetros evaluados para determinar efectos fitotóxicos de ASM en pantas de uchuva.
36
4.3 RESULTADOS Y DISCUSION
Posterior al tiempo de evaluación se midieron las variables de respuesta longitud de tallo (cm),
número de hojas basales, número de hojas totales, peso seco total (g) y encopamiento y
textura corácea de las hojas. Se evidenció que los parámetros estadísticamente significativos
fueron longitud de tallo, peso seco total y número de hojas con estructura corácea (Tabla
4.1.).
Tabla 4.1 ANOVA para la interacción entre los factores concentración y dosis de aplicación evaluados en las pruebas de toxicidad de ASM en plantas de uchuva.
Los parámetros longitud de tallo y peso seco total fueron estadísticamente significativos para el
modelo de estudio. El ANOVA muestra que para la interacción de los factores concentración y
tiempos de aplicación de ASM, en la variable longitud de tallo, el Fc fue de 2,932 >Ft (Alfa: 0.05), lo
que indica que hay influencia sobre esta respuesta con una significancia de 0,014. En cuanto al
parámetro peso seco total, el Fc fue de 10,405 >Ft (Alfa: 0.05), por lo cual se establece que
también existe influencia sobre esta respuesta con una significancia de 0,001. Las comparaciones
realizadas por Tukey y Scheffe demuestran que la dosis que no influye sobre el crecimiento y
desarrollo de las plantas, los resultados permiten ver que se presenta mayor longitud de tallo y
peso seco total es la concentración de 15 mg/L, con una frecuencia de aplicación de tres días
(Figura 4.3).
37
De acuerdo a los resultados mencionados anteriormente se determinó que la concentración y los
tiempos de aplicación de ASM tienen un efecto negativo en las plantas, evidenciado en la
disminución de la altura y del peso total, esto se relaciona con lo planteado por Levitt (1980) en
Rodríguez (2006), quien establece que cuando las plantas son sometidas a condiciones de estrés,
definido como cambios en las condiciones ambientales en las que la planta se desarrolla, inducen
en éstas respuestas que involucran amplio gasto energético, debido a que el metabolismo se
centra en la reparación de daños ocasionados, cuyas respuestas se dan a nivel celular o en los
tejidos (Larcher, 200) en Rodríguez 2006). El desvío de la energía para el metabolismo primario,
relacionado con aumento de longitud y biomasa, al igual que el de fuentes nutricionales como
nitrógeno y fósforo, empleados para la síntesis de proteínas relacionadas con respuesta de
defensa (McKey, 1974; Rhoades & Cates, 1976; Herms & Mattson, 1992), influye directamente en
la disminución de la tasa de crecimiento, que en este trabajo se vio reflejado en la disminución de
peso seco y longitud de la planta, por lo tanto la tasa de crecimiento de las plantas de uchuva
sometidas a concentraciones altas de ASM se ve afectada, esto también se relaciona con lo
reportado por Rozo en 2011, quien estableció que a concentraciones mayores de 10 mg/L, el
desarrollo y crecimiento de la planta disminuía completamente. La tasa de crecimiento es el
aumento de biomasa por unidad de tiempo, y esta puede ser mayor cuando lo es también la tasa
respiratoria, por lo tanto la tasa de crecimiento depende de la respiración de la planta y a su vez,
la respiración en las plantas puede ser de crecimiento o de mantenimiento. La planta tiene
respiración de crecimiento durante los procesos de biosíntesis, crecimiento y desarrollo, las
fuentes de carbono son utilizadas para la producción de energía metabólica; mientras que en la
respiración de mantenimiento, la energía se desvía a procesos donde la planta no obtiene biomasa
orgánica (Azcon y Bieto, 2008), esto implica un alto gasto de energía por parte de la planta, lo que
influye en su supervivencia y, por lo tanto, puede llegar a afectar negativamente la productividad
del cultivo, Larcher (2003) en Rodríguez (2006).
38
Figura 4.3. Efecto de las concentraciones de ASM sobre el crecimiento de las plantas de uchuva. Altura promedio en centímetros. Peso seco total en gramos.
39
En las gráficas de la figura 4.3, correspondientes a longitud de tallo y peso seco total, se ve la
tendencia de la disminución de biomasa y disminución en el crecimiento cuando la aplicación del
fitoactivador se realiza una sola vez durante el periodo de evaluación, cuando se realizan dos
aplicaciones no hay una disminución marcada sobre los parámetros de medición relacionados con
la tasa de crecimiento, con respecto al control, cuando se realizan tres aplicación del fitoactivador,
no hay tendencia de disminución. De acuerdo a lo reportado por Nair en 2007, obtuvo que la
aplicación de ASM a plantas de amaranto a concentraciones de 25 mg/L, retarda el crecimiento de
la planta, aunque la aplicación en las plantas de amaranto se realizó a nivel del suelo,
directamente en la raíz. En tomate de árbol, también se reporta disminución de crecimiento y
desarrollo, después de hacer aplicaciones a nivel foliar de ASM con la misma concentración
empleada en las plantas de amaranto (Mejía, 2009), de acuerdo a lo anterior es probable que,
como se emplearon concentraciones menores a las reportadas por autores, los síntomas de
fitotoxicidad relacionados con la tasa de crecimiento, no son tan evidentes en este estudio.
Una de las solanáceas en las cuales se han realizado con mayor frecuencia pruebas de fitotoxicidad
con moléculas de síntesis química, como el acibenzolar-S-metil, es el tabaco (Nicotiana tabacum).
En esta planta la fitotoxicidad aparece como manchas necróticas, clorosis, disminución de tamaño
y reducción de rendimiento (Cole, 1999), síntomas como la clorosis y las manchas necróticas no se
observaron en el periodo de evaluación de las plantas de uchuva durante el desarrollo de este
trabajo.
De acuerdo a los resultados anteriormente descritos y lo citado por algunos autores, se confirma
que el empleo de ciertos productos de síntesis química puede resultar en el retraso de crecimiento
y la disminución del rendimiento de las plantas (Nair et al., 2007), y que estos efectos pueden
atribuirse a la formulación del producto y no al ingrediente activo como tal (Heil et al., 2000). Por
lo tanto, como no se conoce la formulación del ASM comercializado por Syngenta en la
presentación Boost, en Colombia, el retraso de crecimiento y la disminución del rendimiento
podría atribuirse a la formulación del producto, comparando con los datos de aplicación de la
formulación Actigard ampliamente utilizada en solanáceas como tomate, tabaco (Mandal et al,
2008; Blackley et al., 2004; Becker et al., 2003; Cole, 1999).
40
Respecto a la aparición de hojas con textura corácea, de acuerdo a los análisis estadísticos, el
ANOVA muestra que para la interacción de los factores concentración y tiempos de aplicación de
ASM el Fc fue de 28,205 >Ft (Alfa: 0.05), lo que indica que hay influencia sobre esta respuesta con
una significancia de 0,001 (figura 4.4). Los resultados obtenidos se relacionan con lo reportado por
Mejía en 2009, el cual estableció que en pruebas de fitotoxicidad realizadas en plantas de tomate
de árbol, siete días después de aplicar ASM se empezaron a observar síntomas de toxicidad, como
deformación, encrespamiento, ampollas, amarillamiento delas hojas y formación de hojas
redondeadas y con textura corácea en los nuevos brotes. La deformación de la hoja y el retraso
del crecimiento también se observó en plantas de habas, que se expusieron a altas
concentraciones de ASM (Siegrist et al. 1997). La deformación de las hojas está asociada al costo
energético que requiere de la planta para controlar la condición de estrés a la que está siendo
sometida, por lo tanto, durante la formación de nuevos brotes de hojas, la deficiencia de
nitrógeno causada por la desviación de este recurso a la biosíntesis de respuestas de defensa
(McKey, 1974; Rhoades & Cates, 1976; Herms & Mattson, 1992) hace que se genere un cambio en
la morfología de las hojas jóvenes.
Figura 4.4. Número de hojas con textura corácea en plantas de uchuva.
41
Los demás parámetros evaluados, número de hojas basales y totales y longitud de raíz, no fueron
estadísticamente significativos, pero biológicamente se observaron diferencias para las respuestas
de número de hojas totales y basales , (figura 4.5), se esperaba que estadísticamente se
presentaran diferencias significativas, debido a que también están relacionados con tasa y
reguladores de crecimiento, como las auxinas, encargadas del crecimiento apical, las cuales debido
a la condición de estrés a la que está sometida la planta se acumulan en la base del tallo
produciendo brotes basales (Taiz & Zeiger, 2006). Se esperaba que la longitud de raíz disminuyera
en cuanto más aumentaba la concentración de ASM, debido a que en estudios realizados por Rozo
en 2001, concentraciones de 10 mg/L, 30 mg/L y 50 mg/L en aplicación foliar presentaron un
efecto negativo en la variable respecto al control.
Figura 4.5. Comparación entre concentraciones y tratamientos con ASM en plantas de uchuva. El tratamiento 1, corresponde a una aplicación en el día 0. El tratamiento 2, corresponde a dos aplicaciones en el día 0 y 7. El tratamiento 3, corresponde a tres aplicaciones en el día 0, 7 y 14.
42
De acuerdo a las diferencias estadísticamente significativas y a las diferencias biológicas
observadas entre los tratamientos y las concentraciones de ASM aplicados de manera foliar en las
plantas de uchuva, (figura 4.5), descritas anteriormente, durante el transcurso de la evolución de
los síntomas de fitotoxicidad se determinó que el ASM debe ser aplicado a una concentración de
15ppm y dos aplicaciones en diferentes periodos de tiempo, día 0 y día 7. Se seleccionó esta
concentración y esta dosis debido a que no causa efectos tóxicos sobre las plantas de uchuva, esto
se ve evidenciado en parámetros como longitud de tallo y peso seco total y en la formación de
hojas basales, a pesar de que concentraciones como 5 y 10 mg/mL, tampoco evidenciaron
síntomas sobre las plantas de uchuva, los reportes para el control de Fusarium oxysporum,
establecen concentraciones entre 25 mg/L y 50mg/L (Elmer, 2006), al ser las concentraciones de 5
y 10 mg/mL muy bajas, no se tiene la seguridad que funcionen disminuyendo los porcentajes de
severidad del marchitamiento vascular producido por Fusarium oxysporum en plantas de uchuva.
43
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46
5. Respuestas de defensa inducidas por ASM en plantas de uchuva
5.1 INTRODUCCION
Las plantas tienen un sistema inmune que les permite responder a diferentes tipos de estrés
causados por agentes abióticos como cambios de condiciones medioambientales (temperatura,
luz, humedad, disponibilidad de agua) y agentes químicos, y bióticos como ataque de patógenos.
Los dos mecanismos de defensa han sido denominados resistencia sistémica inducida (ISR, Induced
Systemic Resistance) y resistencia sistémica adquirida (SAR, Systemic Acquired Resistance), estos
se pueden diferenciar en cuanto al agente inductor y a las moléculas señal para producir la
respuesta de defensa, en el caso de SAR la inducción responde a la exposición de la raíz o los
tejidos foliares a elicitores bióticos (fitopatógenos virulentos y avirulentos, insectos o herbívoros)
o abióticos (altas concentraciones de sal en el suelo, frio, calor, intensidad lumínica o
agroquímicos), depende de la hormona señalizadora ácido salicílico, y se asocia con la
acumulación de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). SIR es inducida por la exposición
de las raíces a microorganismos como rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal y está
regulada por etileno y ácido jasmónico (Vallad, 2004; Durrant & Dong, 20042; Choudhary, 2007;
Fujita, 2006).
Las plantas también cuentan con barreras físicas, conocidas como estructuras de defensa
preexistentes, para su defensa frente a patógenos y factores ambientales, que cubren la pared
celular de las células epidérmicas de las planta (cutina, suberina y ceras). La cutina es el
componente principal de la cutícula, está formada por cadenas de ácidos grasos que se unen entre
sí por medio de enlaces tipo éster y es secretada por las células de la epidermis; la suberina
también formada por ácidos grasos pero se diferencia de la cutina en que presenta ácidos grasos
dicarboxílicos, mayor número de grupos fenol y además son cadenas más largas, se encuentra en
el corcho (células de la peridérmis) cuando las plantas inician su segunda etapa de crecimiento, y
además es secretada cuando hay producción de heridas; y finalmente las ceras, que se
caracterizan por su carácter hidrofóbico, al igual que la cutina, son sintetizadas por las células de la
epidermis (Agrios, 2005; Taiz & Zeiger, 2006), las ceras presentes en las hojas se encargan de
47
repeler el agua, impidiendo la formación de películas de agua en que los patógenos pueden
depositarse y germinar (hongos) o bien reproducirse (bacterias) (Agrios, 2005). Otro de los
mecanismos de defensa preexistente es la producción de fitoanticipinas. Inicialmente al primer
contacto de la planta con el patógeno y cuando este coloniza la superficie de las células vegetales,
la planta se defiende con la producción de fitoanticipinas que son moléculas constitutivas de bajo
peso molecular con capacidad antimicrobiana que detienen el crecimiento y la extensión del
patógeno (Mert-Türk, 2002).
Las plantas han adoptado mecanismos de defensa localizados y sistémicos, dentro de los
localizados se encuentra la respuesta hipersensible, principalmente, y dentro de los sistémicos e
inducidos se encuentran ISR y SAR. La inducción de los mecanismos de defensa frente a patógenos
como bacterias, hongos, nematodos y virus se da por los patrones moleculares asociados a
patógenos (PAMP´s, Pathogen Associated Molecular Patterns). Después de que la planta reconoce
al patógeno comienza una serie de señalizaciones que van a permitir desencadenar una serie de
respuestas, como la producción de sustancias con actividad antimicrobiana y sustancias que
fortalecen la pared y enzimas contra el patógeno. El reconocimiento específico de estas moléculas,
también denominadas elicitores, por parte de la planta, es el primer paso para desencadenar una
o varias respuestas de defensa (Jones & Dangl, 2006). Inicialmente, cuando los elicitores entran en
contacto con la planta se produce una primera respuesta denominada respuesta localizada
originada por la colonización de los tejidos vegetales, la respuesta más temprana es la muerte
celular programada y controlada (respuesta hipersensible, HR), que está mediada por las especies
reactivas de oxígeno (ROS), las cuales por su propiedad de radicales libres lisan la pared de las
células vegetales en consecuencia (Durrant & Dong, 2004; Aple & Hirt, 2004). Esta respuesta
hipersensible de las células vegetales ocurre aproximadamente 24 horas después que la planta
percibe un patógeno potencial (Vivanco, 2005). La formación de lesiones necróticas observadas en
el sitio de infección en la planta, no solo corresponden a la respuesta hipersensible, también a la
lesión causada por el patógeno; posteriormente a esta respuesta se inicia una cadena de
señalización que tendrá como resultado la síntesis de fitoalexinas, modificación de las barreras
estructurales y acumulación de proteínas relacionadas con la respuesta a patógenos (PR) (Pieterse
& Van Loon, 1999).
48
La producción de fitoalexinas se da cuando el patógeno evade la acción de las fitoanticipinas y
entra a invadir las células vegetales, esta respuesta inicial está mediada por la señalización del
etileno (Broekaert et al., 2006). La señalización para la producción de calosa, lignina y proteínas PR
inicia con la despolarización de la membrana en donde el calcio (Ca2+) se concentra en el
citoplasma y hay liberación al exterior de iones de potasio(K+) y cloro(Cl-), paralelamente la
producción de especies reactivas de oxígeno acidifica el medio debido al ion superoxido (O-), el
cual activa la NADPHoxidasa, esta enzima oxida el NADPH liberando iones de hidrógeno (H+) en el
citoplasma, por lo tanto la acumulación de iones de calcio y la acidificación del citoplasma inducen
las cadenas de fosforilación que señalizan la inducción de genes de defensa y las vías de
señalización de ácido jasmónico (AJ), ácido salicílico(AS) y etileno (ET). Además, la producción de
ROS, como el peróxido de hidrogeno (H2O2), también induce estas vías de respuesta, incluyendo la
producción y acumulación de proteínas PR (Zhao et al., 2005; Desender et al., 2007; Camarena &
De La Torre, 2007). Las respuestas de defensa no solo son inducidas por elicitores bióticos sino
también abióticos, entre estos están las condiciones medioambientales, la aplicación de
agroquímicos y la inyección artificial de peróxido (Camarena & De La Torre, 2007), y la aplicación
de productos químicos caracterizados por ser análogos de las moléculas señal, como el ácido
salicílico, algunos ejemplos de estos compuestos son ácido 2-6 dicloroisonicotinico (INA),
acibenzolar-S-metil (ASM), benzo (1,2,3) tiadiazol-7 ácido carbotiónico S metiléster, los cuales
debido a su baja toxicidad y al ser inductores de respuestas de defensa en plantas contra
patógenos (Friedrich et al., 1996) se han implementado en la agricultura con el fin de inducir
resistencia sistémica en cultivos de importancia económica, como en el caso del banano para
controlar sigatoka. El ASM se caracteriza por inducir las mismas respuestas que inducen los
elicitores bióticos, como la producción de fitoalexinas, la acumulación de proteínas PR evidenciado
en el incremento de la actividad β 1-3 glucanasas, superóxido dismutasa, lipooxigenasa y
peroxidasa entre otras, y la deposición de calosa y lignina (Chun Lin et al., 2009).
En relación a las moléculas señalizadoras, el ácido salicílico es un compuesto fenólico sintetizado a
partir de corismato o fenilalanina, que se activa cuando hay ataque a la planta por parte de
patógenos biótrofos y hemibiótrofos, actúa inhibiendo la catalasa desempeñando así un papel
fundamental en la respuesta hipersensible y producción de proteínas PR (Vlot et al., 2009; Rangel
et al., 2010). El ácido jasmónico y el etileno actúan de manera simultánea, se caracterizan por
49
mediar la señalización en la respuesta al ataque de microorganismos necrótrofos, activar la
expresión de genes que codifican para inhibidores de proteasas producidas por los herbívoros y la
acumulación de proteínas relacionadas con respuesta a patógenos, además el etileno también
está encargado de la señalización para la producción de fitoalexinas (Broekaert et al., 2006;
Browse, 2009).
Después del proceso de señalización se producen las respuestas de defensa como la síntesis de
fitoalexinas, acumulación de PR en toda la planta (Fritig et al., 1998) y modificación de barreras
estructurales. Las fitoalexinas pertenecen a un grupo heterogéneo de metabolitos secundarios de
bajo peso molecular, que tienen capacidad antimicrobiana, pueden ser inducidas por estrés y son
importantes para la defensa de las plantas frente a patógenos (Hammerschmidt, 1999; Pedras et
al., 2011). Las proteínas PR, son proteínas inducidas por el ataque de patógenos y por el
sometimiento de las plantas a estrés abiótico, dentro de estas proteínas se encuentra la enzima
fenilalanina amonio liasa (PAL), peroxidasa y polifenoloxidasa, estas enzimas se encuentran
constitutivamente y aumentan su acumulación en los tejidos durante procesos de infección. El
término “proteínas relacionadas” se emplea debido a que estas enzimas están asociadas con
respuestas de defensa inducidas por la interacción de la panta con microorganismos patógenos,
también porque la mayoría de estas presentan actividad antimicrobiana (Ahuja & Bones, 2012).
Inicialmente, fueron descubiertas en plantas de tabaco infectado con el virus del mosaico del
tabaco, en la tabla 5.1 se muestran las diferentes familias de PR determinadas en plantas
infectadas con patógenos (Tierens et al., 2002; Jahangir et al.,2009; Kurusu et al., 2010). El papel
de la mayoría de PR es detener el crecimiento y la propagación del microorganismo patógeno, por
ejemplo las PR-2, correspondientes a las β-endoglucansas, y las PR3, PR4, PR8 y PR11, a las
endoquitinasas, tienen actividad frente a bacterias, hongos y nematodos (van Loon, 2010). En
cuanto a las barreras estructurales una de las más importantes, es el fortalecimiento de las
paredes celulares por medio de la deposición de calosa, que consiste en la producción de material
fibroso que rodea y atrapa al patógeno deteniendo su colonización y multiplicación. Las papilas de
calosa recubren las hifas e impiden el contacto directo del patógeno con las células, además
debido a la acumulación de material fibroso, la pared celular de la planta se engrosa hasta formar
una barrera rígida e impenetrable (Camarena & De La Torre, 2007).
50
Tabla 5.1 Proteínas relacionadas con respuesta a patógenos (PR), inducidas por factores bióticos o abióticos
Debido a la importancia del ácido salicílico durante la señalización para la síntesis y producción de
respuestas de defensa en la planta, durante el desarrollo de este trabajo, se realizó la
determinación de moléculas señal como ácido salicílico y ácido jasmónico, y de proteínas PR como
PAL, peroxidasa, glucanasas y quitinasas, involucradas en respuestas de defensa y relacionadas
con los mecanismos de defensa ISR y SAR, adoptados por la planta cuando es sometida a
condiciones de estrés biótico o abiótico.
51
5.2 METODOLOGIA
5.2.1 Determinación de respuestas de defensa en plantas de uchuva
Después de establecer la concentración de ASM que generó el menor efecto fitotóxico en las
plantas de uchuva, se determinaron las respuestas de defensa inducidas por el fitoactivador. Para
inducir las respuestas se aplicó ASM a las plantas de uchuva (60 días de desarrollo) a una
concentración de 15 mg/L, dos veces durante un periodo de diez días, las aplicaciones se
efectuaron al día cero y posteriormente la segunda aplicación al día siete (figura 5.1). Luego de la
primera aplicación se colectó material foliar y radicular en los días 0, 1, 2, 3, y los siguientes
muestreos se realizaron posterior a la segunda aplicación, en los días 7, 8, 9 y 10 (Herman et al.,
2007). El material foliar y radicular se congeló en nitrógeno líquido en los tiempos de muestreo y
fue almacenado a -80°C hasta su procesamiento. Los tejidos vegetales se maceraron con nitrógeno
líquido previamente al proceso de extracción. Simultáneamente se tenían plantas sin aspersión de
ASM, tomándolas como el control absoluto.
Figura 5.1. Montaje para la inducción de repuestas de defensa en plantas de uchuva con aplicación de ASM.
5.2.2 Extracción de enzimas relacionadas con estrés oxidativo y metabolismo de fenoles
Las extracciones se realizaron a partir de tejido de tallo y raíz por separado, se tomaron 100 mg de
cada tejido previamente macerado en nitrógeno líquido y se mezcló con PVPP
(polivinilpolipirrolidona) 20% p/p (en relación al tejido vegetal) y 1.5 mL de acetona al 80% v/v,
esta mezcla se homogenizó durante dos minutos, se centrifugó cuatro minutos a 15000 rpm a 4°C
52
(rotor Sorvall 4X Ch. 005613), el sobrenadante se descartó, y el proceso se repitió hasta obtener
lavados incoloros, en el caso del tejido proveniente de tallo. A partir del tejido sin clorofila se hizo
la extracción enzimática con 3 mL de buffer fosfato 100mM pH 7.0 con PVP40 (polivinilpirrolidona)
3.8% p/v, durante 1 hora a 4°C, y finalmente se centrifugó 20 minutos a 8000 rpm (rotor SorvallEq
41198271). Los extractos se almacenaron a -20°C hasta su procesamiento. La concentración de
proteínas totales en los extractos enzimáticos se determinó por el método de Bradford usando
BSA (albumina de suero bovino) como patrón (Rodríguez, 2001).
5.2.2.1 Cuantificación de actividad enzimática relacionada con estrés oxidativo (POX)
La actividad peroxidasa (POX) se cuantificó por la producción de tetraguayacol. La reacción se llevó
a cabo adicionando 750 µL de buffer fosfato 100mM pH 6.8, 100µL de guayacol 2.8%, 100 µL de
extracto enzimático y 50 µL de peróxido de hidrógeno (H2O2) 3% v/v. La lectura
espectrofotométrica se realizó durante tres minutos a una longitud de onda de 470nm. Se tomó
como blanco todos los reactivos de la reacción excepto el extracto enzimático (Dalisay, 2004;
Kireyco, 2006).
5.2.2.2 Cuantificación de actividad enzimática relacionada con metabolismo de fenoles (PAL)
La actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) se cuantificó por la producción de ácido cinámico
generando. Inicialmente se adicionaron 800µL de buffer Tris-HCl 50mM pH 8.5, posteriormente se
adicionaron 100 µL de L-fenilalanina 10mM y 100µL de extracto enzimático. La reacción se incubó
durante 30 minutos a 55°C, la lectura se realizó midiendo absorbancia a 290 nm. Se tomó como
blanco 900 µL de Buffer Tris-HCl 50mM pH 8.5 y 100 µL de extracto enzimático (Ajay, et al., 2010,
Rodríguez, 2001).
5.2.3 Extracción de glucanasas (Glu) y quitinasas (Chi)
Se suspendieron 5g de tejido, previamente macerado en nitrógeno líquido, en 6 mL de buffer
acetato de sodio 50mM pH 5.0, posteriormente se adicionó PVPP 5% p/p (en relación al tejido
vegetal), y durante 1 hora se agitó a 4°C. Pasado el tiempo de extracción se centrifugó a 7000rpm
53
por 10 min a 4°C (rotor SorvallEq 41198271), el sobrenadante se centrifugó nuevamente hasta
eliminar completamente el precipitado. Después del último proceso de centrifugación se tomó
5mL del sobrenadante y se precipitó con sulfato de amonio al 80% de saturación, se dejó a -20°C
durante 18 horas. Posterior al proceso de saturación se centrifugó durante 30 min a 15500 rpm a
4°C (rotor Sorvall 4X Ch. 005613), el precipitado se resuspendió en buffer acetato de sodio 50mM
pH 5.0. Las sales se eliminaron pasando el extracto obtenido por columnas sephadex G25. Los
extractos se almacenaron a -20°C hasta realizar la cuantificación de actividad enzimática. La
concentración de proteínas totales en los extractos enzimáticos se determinó por el método de
Bradford usando BSA (albumina de suero bovino) como patrón (Rodríguez, 2001).
5.2.3.1 Cuantificación de actividad quitinolítica y glucanolítica
La actividad quitinolítica y glucanolítica se cuantificó por liberación de azúcares reductores,
mediante la reacción de Somogyi-Nelson, a partir de una suspensión de 5 mg/mL de quitina
coloidal y laminarina 2 mg/mL, respectivamente (Hernandez y Muñoz, 2009). Inicialmente se
incubaron 200 µL del sustrato con 50 µL de extracto enzimático a 40°C durante 30 min.
Posteriormente se adicionó reactivo Somogyi I 200 µL y Somogyi II 50 µL, esta mezcla se incubó a
90°C durante 30 minutos, posteriormente se adicionó 250 µL de reactivo Nelson y 750 µL de agua
destilada, la reacción se dejó estabilizar durante 24 horas, la lectura se reallizó en
espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm.
5.2.4 Extracción de moléculas señalizadoras, ácido salicílico y ácido jasmónico
La extracción de las moléculas señalizadoras se realizó a partir de 100mg de tejido macerado en
nitrógeno líquido y liofilizado, a los cuales se adicionaron 500µL de 1-propanol-H2O-HCl en una
relación 2:1:0.002, y se agitó durante 30 minutos a 4°C, posteriormente se adicionó 1mL de
diclorometano y se agitó durante 30 minutos, la suspensión obtenida se centrifugó 10 minutos a
5000rpm (rotor SorvallEq 41198271). Posteriormente, las muestras fueron filtradas por lana de
vidrio, con el fin de observar las fases orgánica e inorgánica, se tomó la fase orgánica y se
concentró por rotaevaporación a 35°C. Las muestras fueron reconstituidas en metanol 80% v/v. La
separación de las moléculas señal se realizó en columnas de fase sólida (SPE-500mg-3mL),
54
previamente equilibradas con metanol 80% v/v, la elusión se llevó a cabo con metanol 80% v/v,
luego los extractos se concentraron por evaporación al vacío (Li et al., 2010).
5.2.4.1 Determinación y cuantificación de ácido salicílico y ácido jasmónico
El ácido salicílico y ácido jasmónico se detectaron y cuantificaron por HPLC en una columna C-18
de fase reversa, como solvente se empleó metanol 0.1% v/v y ácido fórmico 0.05%v/v con un flujo
de 0.8 mL/min, a una temperatura de 30°C, el gradiente inicial de metanol fue al 50% por 2
minutos, incrementándolo linealmente hasta 90% hasta los 10 minutos, se mantuvo a esta
concentración por 5 minutos y finalmente descendió a 50% los últimos dos minutos (Li et al., 2011;
Pan et al., 2008).
5.2.5 Análisis estadísticos
Los resultados obtenidos fueron analizados a través de un análisis de varianza ANOVA, realizado
en el programa SPSS 19 IBM. Teniendo en cuenta los tratamientos que consistieron en, tallo con
ASM, tallo sin ASM, raíz con ASM, raíz sin ASM y dos tiempos de aplicación al día 0 y al día 7 de los
10 días totales de evaluación del efecto de ASM sobre las plantas de uchuva.
55
5.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.3.1 Enzimas relacionadas con estrés oxidativo y metabolismo de fenoles
5.3.1.1 Peroxidasa (POX)
A partir del análisis estadístico se determinó que para la actividad peroxidasa hay diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos (tallo con ASM, tallo sin ASM, raíz con ASM,
raíz sin ASM) y los días de muestreo, tabla 5.2. Las comparaciones realizadas por Tukey y Scheffe
evidencian que el tiempo que presentó mayores valores de POX, fue el día 1 para el tejido de tallo
y día 3 para el tejido de raíz. El día 1 corresponde a las 24 horas post aplicación y el día 3 a las 72
horas post aplicación (figura 5.2).
Tabla 5.2 Tiempos de aplicación de ASM y días de muestreo de tejidos de tallo y raíz con y sin aplicación de ASM a nivel foliar.
Los resultados obtenidos, son similares a los encontrados en ensayos realizados con ASM en
aplicación foliar a una concentración de 75 mg/L en plantas de ajo, en los que la enzima
peroxidasa a las 24 horas en tejido de la parte aérea de las plantas se encontraba en altas
56
concentraciones (Jiménez et al., 2012), en las pantas de uchuva, a las 24 horas post aplicación de
ASM a una concentración de 15 mg/L, se notó un aumento de la actividad peroxidasa con respecto
al control en tallo. En el tejido de raíz no se observó la misma tendencia de aumento de la
actividad peroxidasa en las plantas de ajo; posterior a las 24 horas de aplicación del ASM,
comparando con las raíz de las plantas de uchuva asperjadas con ASM, se evidencia que a las 24
hay un aumento considerable de la actividad peroxidasa con respecto al control, figura 5.2. La
mayor actividad peroxidasa presentada, posterior a la primera aspersión de ASM, se observó en el
tejido de raíz, a las 72 horas de aplicación. En cuanto al comportamiento de la enzima después de
la segunda aplicación, la tendencia en las plantas tratadas con ASM en el tejido de tallo, es a
disminuir a lo largo del tiempo de evaluación, lo que también se puede relacionar con los
resultados obtenidos en plantas de ajo, en cuanto al tejido de tallo, se evidencia aumento de la
actividad enzimática, hasta la finalización del ensayo.
Figura 5.2 Actividad peroxidasa (POX) en plantas de uchuva
57
La actividad peroxidasa varía de acuerdo a la especie y tipo de planta en la que se esté realizando
la evaluación, además de la condición de estrés o elicitor que se esté empleando para inducir este
tipo de respuesta (Gill & Tuteja, 2010).
Con respecto a los tratamientos control (Plantas de uchuva sin aplicación de ASM, foliar), se
observa (figura 5.2) la presencia constante de la enzima, esto se debe, a que la enzima es
constitutiva, debido a que la peroxidasa cumple una función a nivel de metabolismo en la síntesis
de precursores de la lignina y metabolismo de fenoles (síntesis de fitoanticipina), tomando como
donador de electrones el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Hatfield & Vermerris, 2001). A nivel de
inducción de respuestas de defensa cuando las plantas son asperjadas con ASM, la enzima
peroxidasa no solo se encarga de sintetizar precursores de lignina, que posteriormente fortalecerá
las barreras estructurales, sino que también permite mantener un equilibrio en la producción y
acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), como el peróxido, involucrado en diferentes
procesos fisiológicos de la planta como la apoptosis, señalización y respuesta de defensa. La
enzima peroxidasa también controla en la planta los niveles de peróxido que son secretados por
los microorganismos fitopatógenos que en altas concentraciones pueden llegar a causar daño en
las células y en los tejidos ocasionando el necrosamiento localizado (Dat et al., 2000; Overmyer et
al., 2003; Mittler et al., 2004).
5.3.1.2 Fenilalanina amonio liasa (PAL) A partir de los análisis estadísticos, se determinó que para la actividad fenilalanina amonio liasa
(PAL) hay diferencias significativas entre los tiempos de muestreo, pero no hay diferencias a nivel
de los tratamientos aplicados (tallo con ASM, tallo sin ASM, raíz con ASM, raíz sin ASM). Las
pruebas post hoc permiten establecer que el tiempo en el que se produce mayor actividad de la
enzima PAL es en el tiempo de muestreo 3, que corresponde a las 72 horas post aplicación de
ASM, esta actividad es mayor en la raíz a pesar de que la aplicación del ASM se haya realizado
directamente sobre los foliolos (figura 5.3), esto se relaciona directamente con la inducción de
respuesta sistémica, debido a que los productos del metabolismo se mueven con mayor facilidad
al interior de toda la planta y no se establecen en el punto donde se realizó la aplicación del
tratamiento.
58
Según Ardila et al. (2011), la actividad de esta enzima se incrementa en la raíz a las 48 horas de
haber inducido la respuesta por medio de elicitores bióticos, mientras que en el caso de la
inducción con ASM, que es un elicitor abiótico, la respuesta en la raíz en este estudio se vio a las
72 horas post aplicación. Comparando los dos resultados obtenidos en cuanto a la diferencia de
tiempo en la expresión de la actividad enzimática, se debe a que los ensayos realizados por Ardila
se realizaron con la inoculación de Fusarium oxysporum en la raíz de la planta de clavel, y por lo
tanto la respuesta inicial es localizada, mientras que la aplicación de ASM, se realizó en las hojas,
induciendo una respuesta sistémica evidenciada a las 72 horas post inoculación. Se esperaba que
la actividad enzimática, tanto en tallo como en raíz, tuviera una tendencia de aumento durante el
tiempo de evaluación, como lo reportado por El-Khallal, 2007, en plantas de tomate tratadas con
ácido salicílico, aplicado directamente en las hojas.
Figura 5.3 Actividad fenilalanina amonio liasa.
La actividad de PAL determinada en este estudio también se relaciona con los resultados
obtenidos por Rozo en 2011, en donde se determinó que la mayor concentración de fitoalexinas
como cumarinas, falvonoides y terpenos, se encontraba acumulada en el tejido de la raíz en
plantas de uchuva tratadas con ASM. El primer paso para la síntesis de fitoalexinas,
fenilpropanoides y compuestos fenólicos relacionados con respuesta frente a patógenos, es la
59
acción catabólica de la enzima fenilalanina amonio liasa, que cataliza la desaminación de la
fenilalanina, convirtiéndola en ácido trans-cinámico, el cual es el primer intermediario para la
biosíntesis de fitoalexinas. A partir de la vía de síntesis de fenilpropanoides se originan las
chalconas, las cuales inician una ruta común para la biosíntesis de metabolitos secundarios como
lignina, ácido hidroxicinámico y cumarina (Wang et al., 2011; MacDonald & D'Cunha 2007; Dixon &
Steele 1999). Al igual que con la enzima peroxidasa en cuanto a los tratamientos control (tallo y
raíz sin aplicación de ASM) se observó la actividad constante de la enzima, pero con mayor
actividad en el tejido de raíz, debido a la composición de este tejido, que son compuestos
fenólicos y lignina (Martinez et al., 2002), por lo tanto como se mencionó anteriormente, la
enzima PAL, juega un papel importante en la biosíntesis de estas moléculas.
5.3.2 Actividad quitinolítica y glucanolítica
Los datos obtenidos en el ANOVA para la actividad correspondiente a quitinasas y glucanasas,
presentaron diferencias estadísticamente significativas, con una significancia de 0,001 para cada
uno de los análisis (figuras 5.4 y 5.5). En el caso de la actividad quitinolítica, se presentó una mayor
producción de esta enzima a las 48 horas post aplicación, en el tejido del tallo. Posterior a la
segunda aplicación realizada en el tiempo 7 (correspondiente a las 172 horas), no se observa
aumento en actividad de la enzima. Se esperaría que durante el tiempo de evaluación aumentara
gradualmente la actividad enzimática, como lo reporta Whan et al., 2009, en plantas de algodón,
tratadas con ASM formulación Bion, a una concentración de 25 mg/L, aplicación foliar. Con
respecto a los datos obtenidos en los tejidos de raíz , tanto en quitinasas como glucanasas, se
esperaba mayor actividad, debido a que estas enzimas, no son detectables en las hojas, pero se
acumulan en altas concentraciones en el tejido de la raíz, esto reportado para plantas de tabaco
(Van loon et al., 2010).
En cuanto a los resultados para quitinasas, figura 5.4, en los tallos control es constante la alta
actividad de esta enzima a pesar de no haberse realizado inducción, esto se debe a que la
expresión de las quitinasas es constitutiva en niveles bajos, es decir no solo se relaciona con
procesos de defensa o estrés biótico o abiótico, sino también están involucradas en los procesos
de crecimiento de la planta (Kasprzewska, 2003). Se esperaba una tendencia de aumento
60
constante en la actividad, tanto en tallo como en raíz, de las plantas tratadas con ASM, debido a
que comparando con estudios realizados por Suo & Leung en 2001, donde reportan que posterior
al tratamiento de plantas de rosa con BTH durante 7 días de evaluación, se evidenció un aumento
gradual y constante de la actividad.
Figura 5.4 Actividad quitinolítica (CHI)
En cuanto a la actividad glucanolítica, se observó que a la hora 0 (día 1 de muestreo) el tejido de
tallo tratado con ASM presentó una mayor actividad en comparación al control y al tejido de raíz,
figura 5.5. Los datos no muestran una tendencia coherente, es decir no hay un comportamiento
constante de la enzima en función del tiempo. En raíz, la expresión de estas proteínas PR es el
último proceso de expresión de respuestas de defensa, debido al proceso de señalización que
debe ocurrir para las síntesis de dichas proteínas (Van Loon et al., 2010).
Se esperaba que en las plantas tratadas con ASM, la tendencia fuera aumentar actividad
enzimática gradualmente en los tiempos de evaluación (Suo & Leung en 2001) En relación a los
otros resultados obtenidos a la hora 196 correspondiente al tiempo 8 post aplicación, de nuevo se
presenta mayor acumulación en glucanasas en el tejido del tallo. El tratamiento de plantas con
análogos funcionales y estructurales de moléculas señal, induce la expresión de genes que
codifican para la síntesis de proteínas relacionadas con respuesta frente a patógenos, se reporta
61
que plantas de rosa tratadas con BTH, inducen la actividad β-1,3-glucanasa y que ésta es mayor en
tejidos aéreos, donde se ha realizado la aplicación del inductor. El nivel de la actividad enzimática
aumenta en el tejido de las hojas después de los 7 días de evaluación (Gondim et al., 2008), en
este estudio se obtuvieron resultados similares, aunque sin una tendencia
constante.
Figura 5.5 Actividad glucanolítica (GLU) en plantas de uchuva
A pesar de que se reporta que ASM es eficiente en la inducción de respuestas como la síntesis de
enzimas relacionadas con metabolismo de fenoles y de estrés oxidativo (PAL, POX, CAT, PPO y
SOD, entre otras), enzimas relacionadas con respuesta a patógenos (GLU y CHI), para ASM
formulación BION, es posible que para la formulación de ACTIGARD, el efecto se produzca en
tiempos diferentes por lo que no se conoce la formulación del producto, solo se tiene
conocimiento del componente activo (Fraize et al., 2004; Rad et al., 2005).
5.3.3 Determinación de moléculas señal A partir de los patrones de ácido salicílico y ácido jasmónico, se determinaron los tiempos de
retención correspondientes a cada molécula señal. El ácido salicílico presentó un tiempo de
retención de 10.035 min y el ácido jasmónico de 11.344 min (figura 5.6). Los resultados obtenidos
se relacionan con lo reportado por Li et al. (2011), Yang et al. (2011) y Pan et al. (2010, 2008), ellos
62
determinan que el menor tiempo de retención siempre corresponde a la molécula de ácido
salicílico y el mayor tiempo a la molécula de ácido jasmónico, esto debido a la diferencia de
polaridades de cada una de las moléculas, la molécula de ácido salicílico es más polar que la
molécula de ácido jasmónico, por lo tanto al ser la fase estacionaria (columna C18)
completamente apolar, el tiempo de interacción del ácido salicílico es menor.
En la figura 5.7 A, se muestran los resultados obtenidos a partir de las áreas bajo la curva
correspondientes a la determinación de ácido salicílico, para ácido jasmónico no se observaron
picos correspondientes al tiempo de retención, por lo tanto se establece que no hay síntesis de
ácido jasmónico por parte de la planta en respuesta a la aplicación de ASM. En los tallos tratados
con ASM de los tiempos de muestreo 1,3, 7 y 8, figura 5.7, correspondientes a la hora 0 de
aplicación, 24 horas post aplicación, 0 horas posterior a la segunda aplicación y 24 horas posterior
a la segunda aplicación, respectivamente, se determinó la presencia en mayor concentración de
ácido salicílico, con una tendencia similar entre los dos tiempos de aplicación.
Posiblemente las altas concentraciones de ácido salicílico en plantas tratadas con ASM, con
respecto al control, puede atribuirse a la presencia de la proteína receptora SABP2 (Salicilyc Acid
Binding Protein 2), que inician el proceso de señalización catalizando la producción de ácido
salicílico, a partir del MeSA (ácido salicílico metilado), y acumulándolo en el citosol de la célula
(Kumar & Klessig, 2003), por lo tanto, al ser una reacción de reconocimiento inmediato, es posible
que tan pronto se realizó la aspersión y 24 horas después, el ácido salicílico proveniente de la
demetilación de ASM se acumuló en altas concentraciones al interior de la célula.
63
Figura 5.6. Tiempo de retención de las moléculas señal determinadas. A. Cronograma general de la corrida de los patrones. B. Ampliación del cronograma general, mostrando los picos y sus respectivos tiempos de retención, correspondientes a las moléculas de ácido salicílico y ácido jasmónico. Ácido salicílico, tiempo retención=10.035min. Ácido jasmónico, tiempo retención=11.34min. Además, Tripathi et al. (2010), también reporta, que en plantas de tabaco tratadas con ASM,
determinaron que la proteína SABP2 cataliza la conversión de ASM en Acibenzolar (ASM,
demetilado); y por medio de HPLC se evidenció que los niveles de acibenzolar demetilado
aumentaban gracias a la presencia de dicha proteína presente en las plantas de tabaco a las que
no se les silenció en gen que codifica para la enzima, mientras que plantas tratadas con ASM a las
que se les silenció el gen, no expresaron respuestas de defensa como proteínas PR-1 y no
presentaron picos de acibenzolar en las determinaciones realizadas por HPLC.
64
Figura 5.7 Determinación de ácido salicílico en plantas de uchuva .A. Diferencias entre áreas bajo la curva. B. Muestra de tejido de tallo con ASM, 24 horas posterior a la segunda aplicación del fitoactivador. Los resultados obtenidos para la detección de ácido jasmónico, en la que la respuesta fue
negativa, existe una relación con el crosstalk que hay entre las moléculas señal (ácido salicílico,
ácido jasmónico y etileno) en plantas. La acumulación de ácido salicílico está asociada
directamente con la inhibición de la biosíntesis de ácido jasmónico y con la disminución de la
expresión de los genes de respuesta asociados a éste (Heil & Bostock, 2002). Entre el ácido
salicílico y el ácido jasmónico hay una relación antagónica, que ocurre a través de la proteína
reguladora NPR1, la cual está asociada a inducción de la síntesis de proteínas PR, además la
expresión de NPR1 inhibe la síntesis de la proteína LOX, esta enzima es la llave para la ruta de los
octadecanoides, los cuales son los precursores para la síntesis de ácido jasmónico (Spoel et al.,
2003; Spoel et al., 2007).
65
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6. Discusión general Acibenzolar-S-metil (ASM) es una molécula de la síntesis química que se caracteriza por inducir
resistencia sistémica adquirida en plantas. La aplicación de ASM influyó en el desarrollo y
crecimiento de las plantas de uchuva, evidenciado en la disminución de la longitud de tallo y peso
seco total y en aparición de textura corácea de las hojas. Esto se relaciona con la teoría de costo
beneficio, que consiste en el gasto energético que le implica a la planta elaborar respuestas de
defensa, los recursos energéticos y nutricionales de la planta son invertidos en resistencia,
afectando así el crecimiento y la diferenciación de ésta (McKey, 1974; Rhoades & Cates, 1976;
Herms & Mattson, 1992). Por ejemplo, la asignación de recursos nutricionales como el nitrógeno
en procesos de síntesis de proteínas relacionadas con respuesta frente a patógenos (PR), no puede
ser empleado en procesos y biosíntesis de moléculas necesarias en el metabolismo primario
(Bergelson, & Purrington, 1996). Por lo tanto, se reporta que el uso de fitoactivadores puede
generar condiciones de estrés en las plantas, y que esta condición también influye en la biosíntesis
y señalización de respuestas de defensa a costa de requisitos de crecimiento, lo que resulta en
manifestaciones fisiológicas y fenológicas en la planta, relacionadas con fitotoxicidad. La
fitotoxicidad producida por ASM ha sido determinada en plantas de pimentón y tabaco, donde se
manifiesta como manchas necróticas dispersas y ligera clorosis, deformación de las hojas y retraso
del crecimiento, estos síntomas también se reportaron para plantas de habichuela tratadas con
concentraciones medias de ASM (Cole, 1999; Siegrist et al., 1997). Este efecto “negativo” de la
inducción de resistencia sistémica, es contrarrestado por el beneficio que recibe la planta, debido
a que, frente al ataque de un patógeno ésta ya cuenta con la acumulación de una serie de
respuestas de defensa como acumulación de proteínas PR, fitoalexinas y modificación de barreras
estructurales, entre otras, que evitará la penetración y daño de tejidos ocasionado por las plagas y
microorganismos patógenos. Otro de los beneficios brindados por la aplicación de fitoactivadores
análogos del ácido salicílico, es darle a la planta una protección de amplio espectro, es decir,
desarrollar mecanismos de defensa frente a varias especies de plagas y patógenos como virus,
bacterias, hongos, nematodos e insectos (Ryals et al., 1996; Sticher & Métraux, 1997; Benhamou &
Bélanger, 1998; Mondal & Allen, 2005; Tuzun & Somanchi, 2006). ASM requiere aproximadamente
cuatro días para la inducción de mecanismos de defensa en plantas, una vez activados tiene un
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tiempo largo de permanencia en las plantas monocotiledóneas, en dicotiledóneas, de acuerdo a
análisis realizados en plantas de tomate, se estima que entre 7 y 14 días hay establecimiento de
estas respuestas. Estos estudios determinan que la inducción de resistencia requiere cambios
fisiológicos y bioquímicos en las plantas (Louws et al., 2001), en los resultados obtenidos para las
actividades de PAL Y POX la mayor actividad se presenta a los 3 días post inoculación, no se realizó
muestreo al día 4, por lo tanto no se puede afirmar que en nuestro caso en este tiempo se da la
expresión completa de estas proteínas. En cuanto a las enzimas GLU y CHI, no hay una tendencia
constante de la actividad, pero si hay acumulación de estas enzimas en el tallo de las plantas
tratadas con ASM, esto se puede relacionar con los resultados obtenidos por Ramos, 2013, en los
que se determinan mayores porcentajes de reducción de severidad del marchitamiento vascular
ocasionado por Fusarium oxysporum en plantas de uchuva, asperjadas con ASM a una
concentración de 15 mg/L y con 2 y 3 frecuencias de aplicación en el tiempo, los valores obtenidos
por Ramos fueron de 76.8 y 79.1%, respectivamente., lo que indica que ASM, induce la síntesis de
proteínas PR, con una concentración baja de ASM. En la parte aérea de la planta las proteínas PR
aparecen tanto en la epidermis y en las células mesofílicas, y en los haces vasculares, posterior a
un estímulo biótico o abiótico (Van loon, 2010).
De acuerdo con los resultados obtenidos y relacionando el proceso de inducción con lo descrito en
la literatura, se puede inferir que, inicialmente, cuando se realizó aspersión foliar de ASM,
inmediatamente se generó una condición de estrés, por lo tanto se activó la producción de ROS en
la mitocondria y el peroxisoma, estos radicales libres inician la señalización generando un cambio
de potencial redox en la membrana, lo que permitió activar rutas de biosíntesis de moléculas señal
como ácido salicílico; simultáneamente el ASM adicionado en la planta es catabolizado por SABP2,
que demetila el ASM y lo deja actuar dentro de la planta, esto se evidencio en la acumulación de
ácido salicílico reportada en los cronogramas resultantes de HPLC, en los que en los tallos tratados
con ASM de los tiempos de muestreo 1,3, 7 y 8, figura 5.8, correspondientes a la hora 0 de
aplicación, 24 horas post aplicación, 0 horas posterior a la segunda aplicación y 24 horas posterior
a la segunda aplicación, respectivamente, se determinó la presencia en mayor concentración de
ácido salicílico, con una tendencia similar entre los dos tiempos de aplicación. La acumulación de
esta molécula en el citosol permite activar los genes npr1 que codifican la proteína polimérica
NPR1, la cual es reducida y convertida en monómeros, gracias al intercambio redox que está
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ocurriendo en el citosol, los monómeros junto con los TGA se unen al DNA en el núcleo, con el fin
de inducir la transcripción de la proteínas PR. Dentro de las proteínas PR, se encuentran la
peroxidasa (POX), quitinasa (CHI) y glucanasa (GLU), entre otras (Van loon, 2010), que no fueron
determinadas durante este trabajo, por lo tanto, en relación con los resultados obtenidos,
relacionando la actividad POX, que al haber altas concentraciones de especies reactivas de oxígeno
(ROS) como el peróxido, lo depura empleándolo como donador de electrones para la biosíntesis
de precursores de la lignina, polifenoles y fitoalexinas (Cordero et al, 1989; Louws et al., 2001), y
relacionando la actividad de PAL, que se relaciona con la síntesis de fitoalexinas y con el aumento
de ácido salicílico en las plantas, la correlación positiva entre la actividad PAL y la acumulación de
SA no es sorprendente porque PAL cataliza la primera etapa de biosíntesis de polifenoles y de
ácido salicílico (Nuss et al., 1996), estas dos actividades enzimáticas, se relacionan directamente
con lo reportado por Rozo en 2011, donde de acuerdo a los resultados en las raíces de plantas
tratadas con ASM, se encontró la mayor concentración de fitoalexinas relacionadas con respuestas
de defensa, estos resultados también se relacionan con estudios realizados por Ramos en 2013 y
Mejía en 2010, donde hay un control efectivo de Fusarium oxysporum, evidenciado en la
disminución de la severidad del marchitamiento vascular en plantas de uchuva tratadas con ASM
previamente a la infección. El ácido jasmónico, es otra de las moléculas señal importantes para
mediar respuestas de defensa en las plantas. Durante este trabajo, para la determinación de ácido
jasmónico por medio de HPLC no se obtuvieron picos correspondientes a esta molécula señal, se
determina que a altas concentraciones de ácido salicílico aportado por ASM y por la actividad PAL,
se inhibe la síntesis de ácido jasmónico y por lo tanto respuestas relacionadas con esta ruta de
señalización (Derksen et al., 2013).
Finalmente, de acuerdo al análisis realizado a los resultados obtenidos, relacionados con
respuestas de defensa, como enzimas relacionadas con defensa y rutas metabólicas, y moléculas
señal, se determina que el ASM, induce resistencia a nivel sistémico en plantas de uchuva, a una
concentración menor a la reportada en literatura (25 mg/L-75 mg/L), y que además es efectiva en
cuanto al control de la enfermedad limitante, marchitamiento vascular, ocasionada por Fusarium
oxysporum (Ramos, 2013).
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7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Conclusiones • El acibenzolar-S-metil a concentraciones bajas (5 mg/L-15 mg/L) no tiene impacto fisiológico
sobre las plantas, de acuerdo a lo observado en los parámetros evaluados como longitud de
tallo, peso seco total y aparición de hojas con textura corácea. Por lo tanto se determinó que
la aplicación del fitoactivador debe realizarse a una concentración de 15 mg/L, en dos periodos
de tiempo.
• Se comprobó que ASM induce respuestas a nivel sistémico, debido a la mayor acumulación de
proteínas de defensa y moléculas señal en la raíz, siendo aplicado en la parte aérea de la
planta.
• Se encontró una relación directa entre la producción de PAL y la producción de POX, estas dos
enzimas están implicadas en el metabolismo de fenoles, y se encargan de abrir rutas para la
síntesis de fitoalexinas, fitoantocipinas y especialmente de lignina, que son parámetros
relacionados directamente con respuestas de defensa en plantas y con la inducción de
resistencia sistémica.
• ASM puede ser empleado para el control no solo del marchitamiento vascular, ocasionado por
Fusarium oxysporum, sino también para las diferentes plagas y enfermedades que atacan este
cultivo, debido a que la inducción de resistencia sistémica se caracteriza por ser de amplio
espectro, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se demostró que se produce la inducción de
respuestas de defensa como proteínas PR (GLU, CHI, POX), enzimas relacionadas con
metabolismo de fenoles (PAL, POX) y de moléculas señal (Ácido salicílico).
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7.2 Recomendaciones
• De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas de fitotoxicidad, se recomienda que
estas deben realizarse con los agroquímicos, para determinar los efectos que puedan llegar a
tener sobre la planta y para conocer su influencia en el desarrollo y crecimiento, y así
relacionarlo con la rentabilidad del cultivo.
• Se recomienda determinar y cuantificar enzimas relacionadas con estrés oxidativo, como
catalasa, polifenol oxidasa y superoxido dismutasa, debido estas enzimas también están
clasificadas como PR y además son importantes en el control de ROS en los procesos de
señalización, además la enzima catalasa, es uno de los indicadores de la producción y
acumulación de ácido salicílico en el citosol, debido a que, esta molécula inhibe la actividad de
esta enzima. Igualmente se recomienda determinar y cuantificar respuestas relacionadas con
la modificación de barreras estructurales, como lignina y deposición de calos, que en el caso
de la lignina se relacionaría directamente con la actividad de la enzima PAL, y en cuanto al
polímero calosa, es determinante para la protección de la planta frente a la entrada de un
patógeno, además, también comprobaría la eficiencia de ASM.
• Para establecer si hay diferencias entre los dos mecanismos adoptados por las plantas para su
defensa, resistencia sistémica adquirida y resistencia sistémica inducida, se recomienda
comparar la inducción de respuestas de defensa por parte de elicitores bióticos y abióticos,
para determinar cuál es más efectivo en la protección de cultivos de interés económico sin
que se afecte el rendimiento y la productividad de este. Además, determinar si por parte de
los elicitores bióticos hay señalización por parte de moléculas como el ácido jasmónico y el
etileno.
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8. Anexos
8.1 Curva patrón para cuantificación de proteínas por el método de Bradford
8.1.1 Curva patrón para cuantificación de proteínas en los extractos para la cuantificación de
POX
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8.1.2 Curva patrón para cuantificación de proteínas en los extractos para la cuantificación de
GLU Y CHI
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8.2 Curva patrón para cuantificación de azúcares reductores por el método Somogy Nelson
8.2.1 Curva patrón para cuantificación de azúcares reductores-glucosa
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8.2.2 Curva patrón para cuantificación de azúcares reductores-N-acetil glucosamina
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8.3 Curva patrón para cuantificación de ácido cinámico