residencia profesional optimización de variables de un
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Residencia Profesional
Optimización de Variables de un Reactor Biológico Para
La Producción De Acido Cítrico
Víctor Manuel Muñiz Avalos
Ingeniería Bioquímica
Asesor:
Ing. Laura Erendida Martínez Martínez
Villa de Álvarez, Col., Junio de 2016
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Tabla de contenido Pág.
1. Introducción………………..…………………………………………………………………………….………… 7
2. Justificación……..……………………………………………………………………………………….………… 9
3. Objetivos…..………………………………………………………………….……………………………………. 10
3.1 Objetivo general........................................................................................... 10
3.2 Objetivo especifico…………………………………………..……………………………………….. 10
4. Empresa sede del proyecto……………………………………………………………………………….…. 11
4.1 Generalidades……………………………………………………………………………………….…... 11
4.2 Misión………………………………………………………………………………………………….……. 11
4.3 Visión………………………………………………………………………………………………….…….. 12
4.4 Logotipo de la empresa………………………………………………………….………….………. 12
5. Problemas a resolver…………………………………………………………………………………………… 13
6. Fundamento teórico..……………………………………………………………………………………….... 14
6.1 Hongos como biotecnología……………………………………………………………….……… 14
6.1.1 Aspergillus niger…………………………………………………………………………. 14
6.1.2 Bioprocesos…………………………………………………………………….………….. 15
6.2 Melaza………………………………………………………………………………………………………. 16
6.2.1 Obtención…………………………………………………………………………………… 16
6.2.2 Clasificación.….…………………………………………………………………………….17
6.2.3 pH de la melaza..………………………………………………………………………….18
6.2.4 Microorganismos de la melaza…..………………………………………………..18
6.2.5 Aprovechamiento de la melaza…………………………………………………….19
6.2.6 Composición..………………………………………………………………………….……19
7. Actividades..……………………………………………………………………………………………….………. 20
7.1 Cronograma..…………………………………………………….…………………………….……….. 20
7.2 Descripción detallada..…………………………………….……………………………….………. 20
8. Metodología..…………………………………………………………………………………….………………….23
8.1 Materia prima para el sustrato………………………………………………………………….. 23
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8.2 Melaza como caldo de cultivo…….……………………………………………………………… 24
8.3 Adaptación a la fuente de nutrientes…………………………………………………………. 24
8.4 Curva de crecimiento de Aspergillus niger………………………………………………… 25
8.5 Pruebas de crecimiento en agar y caldo melaza en 5%, 10% y 15%
(p/v) a nivel caja petri ……………………………………………………………………………….…….26
8.6 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar
a nivel de erlenmeyer (etapa inicial)……………….................................................. 25
8.7 Evaluación de la concentración de melaza de caña
de azúcar a nivel fermentador 20 lt……………………………………………………….………. 26
8.8 Titulación para determinar acidez……………………………………………………….…... 27
8.9 Diagrama de proceso para la producción de acido cítrico……………….………. 28
9. Resultados y discusión….…..…………………………………………………………….………….………..29
10. Conclusiones………..…………………………………………………………………………….……….……. 32
11. Competencias desarrolladas………………………..…………………………………………….….…. 33
12. Bibliografía………..…………………………………………………………………………………..….……… 34
13. Anexos……………………………………………………………………………………………….……………… 37
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Índice de tablas Pág.
Tabla 1. Disposición de la melaza de caña de azúcar 19
Tabla 2. Composición general de la melaza de caña de azúcar 20
Tabla 3. Composición de la melaza del Ingenio azucarero Grupo Saenz 23
Tabla 4. Cronograma de actividades 34
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Índice de figuras Pág.
Figura 1. Estructura química del Acido Cítrico 7
Figura 2. Logotipo de la empresa Newbauer 12
Figura 3. Colonias de Aspergillus niger 15
Figura 4. Proceso de la obtención de melaza 17
Figura 5. Frascos de fermentación 25
Figura 6. Curva de crecimiento de Aspergillus niger 25
Figura 7. Diagrama de proceso 28
Figura 8. Concentración de Acido cítrico por titulación 29
Figura 9. Concentración de Acido cítrico por HPLC 30
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Índice de anexos Pág.
Anexo A. Cronograma de actividades 37
Anexo B. Normatividad de los análisis de la melaza 37
Anexo C. Resultados de la titulación 38
Anexo D. Identificación de A. niger por B. M. 39
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1. Introducción
El acido cítrico (C6H8O7) es un acidulante
ampliamente usado, inocuo con el medio ambiente
(Figura 1). Es prácticamente inodoro, de sabor acido no
desagradable, soluble en agua, éter y etanol a
temperatura ambiente. Es un sólido incoloro,
traslucido o blanco que se presenta en forma de
cristales, granular o polvo. Es anhidro o contiene una
molécula de agua de hidratación. Químicamente, el
acido cítrico comparte las características de otros ácidos carboxílicos. Cuando se calienta a
mas de 175°C, se descompone produciendo dióxido de carbono y agua.
La primer fermentación de acido cítrico fue observada como producto de un hongo
por Wehmer en 1893 con Penicillium glaucum en un medio de cultivo con carbohidratos.
Despues de algunos años, fueron aisladas nuevas cepas de hongos, con la capacidad de
acumular acido cítrico, cuales fueron designados como Citromyces (Penicillium). Sin
embargo, los ensayos industriales no tuvieron buen resultado en los problemas de
contaminación y larga duración de fermentación (Soccol, 2006).
Fue hasta en un trabajo de Currie cuando abrió un nuevo suceso de producción
industrial de ácido cítrico. En 1916, encontró algunas cepas como Aspérgillus niger que
produce cantidades significantes de ácido cítrico. Lo más importante que se encontró fue
que creció de manera optima en pH alrededor de 2.5-3.5 y altas concentraciones de
azucares favoreció la producción de ácido cítrico (Mattey, 1992).
Es producido mediante fermentación, que puede llevarse a cabo en tanques
profundos (fermentación sumergida, que es el método más común) o en tanques no
profundos (fermentación de superficie) usando carbohidratos naturales, tales como
Figura 1. Estructura química del Acido Cítrico. Fuente: MAKYMAT, Asesoría
Técnica.
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azúcar y dextrosa como sustratos, y como la preparación del sustrato, la fermentación
aeróbica de la sacarosa por el Aspergillus. Es un buen conservador y antioxidante natural
que se añade industrialmente como aditivo. Sus funciones son como agente secuestrante,
dispersante y acidificante (Soccol, 2006).
El Aspergillus es un género que comprende más de 200 especies de hongos, de
tipo filamentoso y que está compuesto de cadenas de células llamadas hifas. Fue
catalogado por primera vez por el científico italiano P Micheli en 1929, reside
habitualmente en sitios de compostaje y en el heno (Al Mussallam, 1980).
Aspergillus niger es el hongo filamentoso predilecto en investigación, sus
aplicaciones van de la producción de ácido cítrico y glucónico, hasta la producción de
enzimas industriales y proteínas, como la quimosina (Andersen, Nielsen, 2008; Karaffa y
Kubicek, 2003).
Los microorganismos capaces de producir y acumular ácido cítrico son las especies
de los géneros Aspergillus, Citromyces, Penicillium, Monilia, Candida y Pichia, aunque para
la producción comercial sólo se utiliza mutantes de Aspergillus niger. Cepas de Aspergillus
producen más acido por unidad de tiempo comparadas con cualquier otro hongo, debido
a que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato deshidrogenasa y aconitasa
hidratasa, y una alta actividad de citrato sintetasa (López et al., 2006).
En cuanto a la producción de ácido cítrico, Grewal y Kalra afirman que el pH inicial
requerido depende de la fuente de carbono utilizada, y Ruijter y sus colegas mencionan
que los hongos filamentosos Aspergillus niger acumulan altas concentraciones de ácido
cítrico a partir de hexosas o disacáridos cuando es cultivado bajo condiciones particulares.
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2. Justificación
En la industria azucarera se generan desechos como la melaza y azúcares no
refinados, los cuales resultan ser un problema para la industria. Una alternativa para la
zona cañera es la producción de acido cítrico a partir de estos desechos.
La producción mundial de ácido cítrico se estima en millones de toneladas por año,
destacando que la producción en su mayoría es llevada a cabo por fermentación, donde se
involucra el uso de sustancias ricas en carbohidratos. El acido cítrico (acido 2-hidroxi-1,2,3-
propanotricarboxilico), es un ácido orgánico que puede ser considerado natural, sin
embargo también puede ser sintetizado vía laboratorio (Muñoz et al., 2014).
La producción de acido cítrico por fermentación es el proceso más económico y
amplio más utilizado en la síntesis para la obtención de este producto. Y tiene sus propias
ventajas; su operación es simple y estable, necesita sistema de control básico al igual que
las habilidades técnicas y bajo consumo de energía en su proceso (Soccol, 2006).
Actualmente el uso de hongos para la elaboración de importantes productos
comerciales ha aumentado rápidamente en los últimos años, instaurando un marco en el
cual el ácido cítrico se ha posicionado como el mayor ácido orgánico producido por
fermentación con Aspergillus niger, a la vez que es ampliamente usado en la industria de
alimentos, bebidas, farmacéutica, química, entre otras (Ates et al., 2002).
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3. Objetivos
Objetivo general
- Optimizar el proceso de un reactor biológico para la producción de acido cítrico a partir
de melaza y azúcares.
Objetivo especifico
-Evaluar diferentes concentraciones del caldo en el proceso del reactor biológico para la
producción de ácido cítrico.
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4. Empresa sede del proyecto
4.1 Generalidades
Newbauer S.A. de C.V. es una empresa del sector industrial ubicada en Jalisco,
100% Mexicana, fundada el 1ro. De abril del año 2011, con la finalidad de satisfacer las
necesidades agroquímicas del campo. Dedicada a la producción y fabricación de
fertilizantes líquidos y biotecnológicos.
Una empresa competente gracias a sus instalaciones industriales, calidad, servicio
al cliente, liderazgo tecnológico y el valor sobresaliente que proporcionan a los clientes y
accionistas.
Inicio como proyecto para satisfacer las necesidades de fertilizante al Ingenio
Azucarero de Grupo Saenz con mayor superficie de riego tecnificado del país situado en el
municipio de Tamazula de Gordiano, Jalisco, lo que actualmente ya también se cubre las
necesidades para los productores de Aguacate, Berrys, Hortalizas, Granos, entre otros, por
su buena aceptación y calidad de los productos.
Se desarrollan productos con formulación adecuada según las necesidades del
cultivo y así aumentar la eficiencia en su aplicación. Por su naturaleza liquida cuentan con
disponibilidad inmediata para los cultivos y a un menor costo de operación, por ello son
eficientes, rentables, manejables y ambientalmente seguros.
4.2 Misión
Ser una empresa química dedicada a la fabricación de productos de nutrición en
base a fertilizantes líquidos y biotecnológicos en busca de constante innovación, con el
propósito de optimizar nuestro entorno agrícola.
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4.3 Visión
Situarnos como la empresa líder en producción de fertilizantes líquidos, dentro de
las 5 comercializadoras más importantes en México, nos distinguiremos de la competencia
gracias a nuestras instalaciones industriales, calidad, servicio al cliente, liderazgo
tecnológico y el valor sobresaliente que proporcionaremos a nuestros clientes y
accionistas.
4.4 Logotipo de la empresa
Figura 2 Logotipo de la empresa Newbauer
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5. Problemas a resolver
Para la obtención de ácido cítrico se requiere el manejo de material biológico, en
este caso el microorganismo capaz de producir mayor acido cítrico como producto de una
fermentación es Aspergillus niger de tipo batch, con una concentración de un caldo rico en
carbohidratos y demás nutrientes, en el que se utiliza la melaza como materia prima, y
que genera un alto rendimiento en la producción de acido cítrico.
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6. Fundamento teórico
6.1 Hongos como biotecnología
Los hongos se alimentan incorporando nutrientes a partir de material orgánico
disponible. Los hongos no poseen estómagos, por lo que tienen que digerir su comida
antes de que pueda pasar a través de la pared de la célula a la hifa. La hifa secreta ácidos y
enzimas que biodegradan el material orgánico en compuestos de menor complejidad y
fáciles de digerir (Whittaker, 1978).
A nivel industrial, el crecimiento de hongos filamentosos en medios líquidos debe
considerar la transferencia de masa en la interface líquido-sólido entre la superficie celular
y el medio y al interior de la madeja formada por las hifas; ya que las resistencias
interfaciales en conjunto con el crecimiento de la biomasa representan un obstáculo para
el transporte del sustrato, así como un aumento de la densidad de la biomasa implica una
reducción de la porosidad lo que contrarresta la penetración de los nutrientes (CUI, et.
al., 1997; Escamilla Silva et. al., 2001).
6.1.1 Aspergillus niger
En la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger (Figura 3) los niveles de los
nutrientes y las condiciones ambientales, como pH, agitación, temperatura, iones
metálicos, concentración de fosfato, fuente de nitrógeno y carbono, alcoholes y aditivos,
son factores importantes que regulan la morfología del microorganismo y el proceso
fermentativo (Hossain et al., 1983, Hossain and Ahmed, 1992).
Su morfología de formas miceliales hialinas en cultivo. Y en vista macroscópica las
colonias blancas con negro, esporas negras. Forman hifas tabicadas ramificadas, cada una
de las cabezas conidiales se compone de conidióforo con una vesícula terminal.
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Específicamente en el crecimiento de A. niger y la producción de ácido cítrico,
algunos iones y minerales tienen un efecto sobre la morfología y su producción. Por
ejemplo, los niveles de zinc y hierro en el medio están relacionados con la conversión de
las fuentes de carbono a biomasa o ácido cítrico (Mattey, 1992).
6.1.2 Bio-procesos
La mayoría de las fermentaciones son procesos discontinuos, cuya cinética propia
permite que los equipos sean operados en intervalos. Al final de dicho tiempo, se procede
a la recuperación de la levadura por centrifugación. Es un sistema que presenta facilidad
en sus operaciones, ya que disminuye los requerimientos para obtener su completa
esterilización, evitando así, el riesgo de pérdidas financieras y facilitando el manejo de
materias primas. Como desventaja de este sistema, se muestra la decreciente
productividad en la fermentación debido al largo tiempo de rotación y retraso en el
crecimiento inicial (Quintero, 1981).
Figura 3 Colonias blancas con micelio aéreo negro. Fuente: Tangarife V.
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Llamados también procesos en Batch o lote, son de gran importancia comercial
para su amplio uso. Las técnicas de instalación de los cultivos discontinuos, van a
depender de si el proceso es aerobio o anaerobio. Puede considerarse como un sistema
cerrado. A tiempo cero (t0), la solución esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones optimas de
fermentación (Doran, 1998).
6.2 Melaza
La miel o también llamada melaza, es un líquido denso y viscoso de color oscuro,
es producto final de la fabricación o refinación de la sacarosa procedente de la caña de
azúcar. Este subproducto se usa para alimentos concentrados para animales y como
suplemento alimenticio para el hombre (Leeson y Summers, 2000).
La denominación melaza se aplica al efluente final obtenido en la preparación del
azúcar mediante una cristalización repetida. El proceso de evaporación y cristalización es
usualmente repetido tres veces hasta el punto en el cual el azúcar invertido y la alta
viscosidad de las melazas ya no permitan una cristazación adicional de la sacarosa (Swan y
Karalazos, 1990).
6.2.1 Obtención
La melaza se obtiene como subproducto de la producción de azúcar refinada, la cual se
muestra en la Figura 4.
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6.2.2 Clasificación
La Asociación Americana de Control Oficial de Alimentos (AAFCO), recomienda
diferentes clasificaciones para las melazas, según el azúcar total y el contenido de
humedad, así:
Melaza Superior Blackstrap: Melaza de caña que contiene 23.4% de agua o menos,
y 53.5% o más de azucares totales.
Melaza Blackstrap: Melaza compuesta por 23.5% a 26.4% de agua y 48.5% a 53.5%
de azucares totales (Castro, 1993).
Otra clasificación de las melazas, se da por el porcentaje de materia sólida en peso, o
grados Brix, de la siguiente manera:
Melaza Blackstrap: Es el subproducto de la elaboración del azúcar, cuyo porcentaje
de materia sólida en peso (grados Brix), diluido con igual peso de agua es de 42.5
grados Brix.
Figura 4 Proceso de obtención de melaza (Ariza y Gonzalez, 1997)
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Melaza de Caña Alimenticia: Es la melaza blackstrap diluida con agua, hasta una
concentración en grados Brix, no menor de 39.75; a este producto no se le ha
especificado un valor de concentración de azúcares.
Melaza High Test o Jarabe Invertido: Es el producto obtenido por la concentración
del jugo clarificado, hasta un porcentaje de materia sólida en peso de 85% e
invertido con ácido o con invertasa (Castro, 1993).
6.2.3 pH de la melaza
Las melazas de caña son ligeramente acidas, tienen un pH entre 5.5 y 6.5; un pH
bajo es atribuible a la presencia de ácidos alifáticos y al bajo pH de la clarificación, si es
acida. El pH de las melazas cambia con la temperatura y depende también de la naturaleza
y de la cantidad de material estabilizador del pH que posea (Swan y Karalazos, 1990).
La acción estabilizadora del pH tiene efecto sobre la melaza para resistir la adición
de ácidos o álcalis, sin cambiar su naturaleza acida o básica. En la melaza de acción
estabilizadora depende del contenido de no azucares y de las características de la melaza
(Swan y Karalazos, 1990).
6.2.4 Microorganismos de la melaza
Mediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de melazas, se ha
demostrado que estas, a pesar de su bajo contenido de fosforo, constituyen un buen
medio nutritivo para muchos microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias.
Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos y termófilos dentro
de la melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan bien durante la dilución de las
melazas (Ariza y Gonzales, 1997).
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6.2.5 Aprovechamiento de la melaza
6.2.6 Composición
La melaza es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido, sales y
otros compuestos solubles en álcali que normalmente están presentes en el jugo de caña
localizado, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar. Además
de la sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas
también contienen sustancias reductoras no fermentables (Tabla 2).
Estos compuestos no fermentables reductores del cobre, son principalmente
caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento requerido por el proceso y
las melanoidinas que si contienen nitrógeno derivadas a partir de productos de
condensación de azúcar y aminocompuestos. (Honig, 1974).
Tabla 1. Disposición de la melaza de caña de azúcar
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Tabla 2. Composición de la melaza de caña de azúcar
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7. Actividades
7.1 Cronograma
Se cuenta con un cronograma de las actividades a desarrollar en este proyecto el
cual se podrá encontrar en el anexo A, esto con la finalidad de poder realizar en tiempo y
forma los requerimientos y obtener los resultados deseados.
7.2 Descripción del proceso
Para la obtención de acido cítrico se llevará a cabo un proceso fermentativo el cual
se presenta en un diagrama de bloques.
El proceso de obtención del acido cítrico, no solo engloba la fermentación sobre la
cual se estará trabajando en este trabajo, si no que, conlleva una cadena de procesos
unitarios que logran la generación de este material.
Caldo
•Agua
•Melaza de caña de azucar
Fermentador
•Condiciones controladas
•Aspergillus niger
Caldo con producto
•Mezcla con carbonato de calcio
Separación del ácido citrico
•Precipitación de impurezas con ácido sulfurico
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Remarcando los procesos generales se pueden separar en estas 4 etapas
principales que son las de mayor atención y cuidado para poder generar un producto de
manera óptima y de buena calidad, ya que estamos hablando de un derivado de un
material biológico.
En la preparación del caldo existen dos partes importantes, una es la de
pasterización del caldo, ya que se deben manejar con precisión las temperaturas y
tiempos de retención, para así lograr una completa esterilidad del caldo de cultivo para el
fermentador, y la otra es la concentración a la que se prepara el caldo, el cual se debe de
llegar al optimo para el microorganismo en donde exista una mayor producción de acido
por cada litro de fermento.
En el fermentador donde se colocara el caldo y posteriormente se agregara el
inoculo de Aspergillus niger se debe contar con temperatura constante, inyección de un
poco de oxigeno, agitación homogénea y de bajas rpm, ya que se está trabajando con
microorganismos y no se debe generar un movimiento tan agresivo para que puedan
realizar su trabajo.
Los tratamientos posteriores a la fermentación son para poder desdoblar las
moléculas y generar otras con las cuales se organice solo la separación del acido cítrico
puro, y así llegarlo a cristalizar para su interés de uso.
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8. Metodología
8.1 Materia prima para el sustrato
Una de las materias primas necesarias para el proceso de producción de acido
cítrico es la melaza, la cual es fuente de nutrientes al microorganismo, principalmente
carbohidratos, que es la principal fuente de carbono. La melaza obtenida del Ingenio
Tamazula ¨Grupo Saenz¨, y distribuida por la empresa transportista SILVIC, se le realizaron
análisis de calidad por medio del Centro de Investigaciones y Asistencia en Tecnología y
Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), para así llegar a formular de manera precisa el caldo
nutrimental, los resultados son los que se muestran en la tabla 3, los cuales se realizaron
bajo normas ya establecidas que se muestran en el anexo B.
Determinación Unidad Resultado
Azucares reductores totales (% en peso) 76,98
Grados Brix Bx 80,30
Sólidos totales (% en peso) 74,04
Cenizas (% en peso) 9,07
Calcio (mg/kg) 6275,0
Tabla 3. Resultados del análisis de la melaza utilizada como materia prima
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8.2 Melaza como agar y caldo de cultivo
La melaza de caña como sustrato para la producción de acido cítrico mediante
Aspergillus niger, se obtuvo de manera comercial, ya que es un subproducto de la
industria azucarera que actualmente se comercializa para el engorde de animales.
La concentración de melaza de caña seleccionada se peso y disolvió en agua
destilada, calentando y agitando hasta diluirla totalmente. Posteriormente, se centrifugó
con el fin de retirar gran parte de impurezas y contaminantes; se esterilizó por 15 minutos
a 15 libras de presión. Por último, se adiciono ampicilina a una concentración de (300
mg/L) (Pedroza, 2006) y se procedió a realizar la curva de crecimiento de Aspergillus niger,
lo cual, este microorganismo se mando identificar por técnicas de biología molecular y sus
resultados se muestran en el anexo C.
Las pruebas realizadas a nivel laboratorio se llevaron a cabo en el espacio del
laboratorio de Microbiología del Instituto Tecnológico Superior de Tamazula de Gordiano,
Jalisco, asistido por la encargada de laboratorio la Ingeniera Leticia Betsaida Rios. El
material de laboratorio que se utilizo fue brindado por la empresa Newbauer y algunos
equipos especializados se utilizaron directamente en las instalaciones del Tecnológico.
8.3 Adaptación a la fuente de nutrientes
Se preparo agar melaza, los componentes solamente fueron Agar-agar y melaza al
10% de concentración p/p. Se llevo a cabo su esterilización en autoclave a 121°C, 15 lb de
presión y 15 minutos. Después de este proceso, utilizando una campana de flujo laminar,
se vertió el agar en cajas petri y se dejo gelificar. Se tomo material celular de Aspergillus
niger para colocarse en la caja petri para observar su crecimiento y adaptación a ese tipo
de nutriente, en condiciones de 25°C y 1 atm para su optimo crecimiento.
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8.4 Curva de crecimiento de Aspergillus niger
Se realizo la prueba de crecimiento al
microorganismo para poder conocer el tiempo en el cual
crece de manera optima y tener la producción del acido
cítrico más controlada en la fase logarítmica de Aspergillus
niger. Las muestras fueron tomadas de los frascos de
fermentación que se muestran en la figura 5. Como se
observa en la figura 6 la fase logarítmica se encuentra entre
las 24 y 48 horas en el caldo melaza.
Figura 6 Curva de crecimiento de Aspergillus niger
y = 0.0076x + 0.1388 R² = 0.9495
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 20 40 60 80
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (hr)
Curva de crecimiento
Series1
Lineal (Series1)
Figura 5 Frascos de fermentación
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8.5 Pruebas de crecimiento en agar y caldo melaza en 5%, 10% y 15% (p/v) a nivel caja
petri
Para evidenciar el crecimiento de Aspergillus niger en caldo y agar melaza, se
prepararon tres concentraciones (5%, 10%, 15%, 20% (p/v)). Se realizo una siembra
masiva para cada una de las concentraciones, las cajas fueron incubadas a 25°C durante
24 horas.
Para el caldo melaza se prepararon las tres concentraciones con 20 ml, inoculadas
con células del mismo A. niger. Posteriormente se incubaron a 25°C durante 24 horas.
8.6 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar a nivel de erlenmeyer
(etapa inicial)
Se realizaron fermentaciones discontinuas en erlenmeyer manteniendo la relación
de ¼ del volumen del cultivo y tamaño del recipiente con el fin de favorecer la aireación. El
medio de cultivo utilizado fue la melaza a diferentes concentraciones (5%, 10%, 15%, 20%
(p/v)).
Las condiciones de fermentación manejadas fueron temperatura de 25°C,
agitación de 80 rpm, durante 48 horas adicionando ampicilina (300 mg/lt) con pH inicial
de 5.5. Se realizaron muestreos con intervalos de doce horas desde la hora 0 hasta la hora
12 y cada 12 hasta la hora 48.
8.7 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar a nivel fermentador
Se realizo la preparación de cada uno de los caldos a diferentes concentraciones
(5%, 10%, 15%, 20% (p/v)). Se colocaron en el frasco o fermentador de 20 lt, el cual
contaba con medidor de temperatura del liquido, flujo de oxigeno en condiciones de filtro
y agitación aproximada de 50 rpm, la cual fue la que causo mayor problema de control por
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su baja potencia de agitación. Se realizaron las pruebas y las muestras (500 ml) de cada
una de las concentraciones se tomaron a las 48 horas de iniciar la fermentación.
Las muestras para su análisis y cuantificación de acido cítrico se mandarían a
CIATEJ para facilitar los resultados, debido a falta de equipo especializado para su
detección. Se les solicito un análisis instrumental, y ellos se encargaron de estructurar una
técnica adecuada para poder facilitar los resultados, del cual definieron que con
cromatografía HPLC obtendrían resultados mas exactos.
El volumen de 500 ml de muestra que se tomo fue por recomendaciones de CIATEJ
para su mejor valoración de ellos y tener muestra de sobra por cualquier problema que
pudiera existir, al igual que solicitaban que la muestra fuera recibida en menos de 24
horas para que los análisis tuvieran validez.
8.8 Titulación para determinar acidez
Una forma analítica para determinar cantidad de acido cítrico en un liquido es
calculando su acidez tomando una propiedad directamente del acido como lo es el peso
equivalente. Se preparo Hidróxido de sodio a 0.1 N, también fenolftaleína como indicador
para la titulación.
Se coloco el hidróxido de sodio en la bureta, en el matraz se colocaron 2 ml del
producto fermentado de cada una de las concentraciones probadas y se agregaron 18 ml
de agua desmineralizada y se agrego un par de gotas del indicador. Se inicio la titulación y
se tomaron los datos del gasto del hidróxido, se realizaron 2 pruebas de cada uno, que se
muestran en el anexo C. Se tomo en cuenta para el cálculo el peso equivalente del acido
cítrico que es 192 gr/mol.
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8.9 Diagrama de proceso para la producción de acido cítrico
Se realizo una simulación del proceso inicial (Figura 7) en el que se prepara el caldo
para el fermento, el cual se lleva a un proceso de pasterización con ayuda de
intercambiadores de calor que elevan a 115°C y disminuyen de inmediato a 4°C el fluido.
Después se manda directo al fermentador con los sensores ya indicados y un flujo de
oxigeno para así cumplir con la fermentación aerobia.
Figura 7 Diagrama de proceso
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9. Resultados y discusión
Resultados por titulación con NaOH
Concentración del caldo Tiempo de residencia Cantidad de Acido cítrico
5% 48 horas 47.52 gr/lt
10% 48 horas 54.72 gr/lt
15% 48 horas 51.36 gr/lt
20% 48 horas 47.04 gr/lt
Figura 8 Concentración de Acido cítrico por titulación
Este método es de análisis fácil y rápido pero no es tan exacto para la
determinación de acido cítrico. Solo se toma para calcular la acidez y de ahí un parámetro
como lo es el peso equivalente de la molécula del acido cítrico. Los resultados obtenidos
pueden ser muy acercados a su realidad los cuales sirven como una base experimental. Y
podemos observar la generación de acido en la fermentación aeróbica realizada con
Aspergillus niger.
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
0 5 10 15 20 25
Can
tid
ad d
e A
. ci
tric
o g
r/lt
Concentración %
Concentración optima
Series1
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Resultados por HPLC realizados por CIATEJ
Concentración del caldo Tiempo de residencia Cantidad de Acido cítrico
5 % 48 horas 52.02 gr/lt
10% 48 horas 64.07 gr/lt
15 % 48 horas 58.47 gr/lt
20 % 48 horas 57.82 gr/lt
Figura 9 Concentración de Acido cítrico por HPLC
Los resultados que obtuvieron del contenido de acido cítrico en el fermento a
diferentes concentraciones son mayores a los que se calcularon de forma analítica por
titulación. El cual puede referir a los errores o falta de precisión que se tiene en la
titulación para acido cítrico. Estos datos con la técnica de HPLC son más confiables para la
valoración del punto optimo de la concentración para el proceso fermentativo aeróbico
con Aspergillus niger.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25
Can
tid
ad d
e A
. ci
tric
o g
r/lt
Concentración %
Concentración optima
Series1
Página 31
En el cual se observa que al igual que en la anterior técnica, favorece la
concentración del 10% de melaza en el caldo nutritivo para la fermentación. Esto puede
ser porque en menor concentración faltan nutrientes en el metabolismo del
microorganismo y a una mayor concentración de melaza, satura el caldo de sólidos
disueltos y bloquea la producción en el metabolismo de Aspergillus niger.
La melaza que se está utilizando como materia prima es de una muy buena calidad
tal y como se observo en los análisis de su composición nutritiva, y también cuenta con
una densidad de 1.5, debido a los sólidos disueltos que contiene, esto con lleva a
obscurecer el caldo y también interrumpir las mediciones por titulación.
Página 32
10. Conclusiones
La cepa Aspergillus niger por seguridad de la empresa, se mando identificar de
nuevo por Biología Molecular al Departamento de Farmacología en el Centro Universitario
de Ciencias Exactas e Ingenierias y así descartar alguna contaminación de la cepa.
Ya instalada y preparada la planta piloto, se probó con líquidos inertes y se
revisaron las variables que no tuvieran ningún problema en su control. Antes de iniciar con
las fermentaciones.
La optima concentración de melaza en el caldo para la producción de acido cítrico
por Aspergillus niger fue del 10%. En los 2 tipos de cuantificaciones que se realizaron
muestran a favor los resultados, tal es el caso en la titulación con 54.72 gr/lt de acido
cítrico y en el método instrumental con 64.07 gr/lt de acido cítrico.
Para obtener un mayor rendimiento de acido cítrico en la fermentación aeróbica
por Aspergillus niger no solo es el optimo de tiempo de residencia y la concentración del
caldo, si no también se debe hacer un análisis sobre una posible modificación en un gen
de la cepa para poder estimular una mejora en su metabolismo y así llegar a un optimo
mayor en su producción.
La melaza es una fuente de carbohidratos ideal para fermentaciones de este tipo,
ya que contiene nutrientes esenciales para la mayoría de los microorganismos.
Para poder realizar el escalamiento industrial primero se debe aumentar la
producción para que sea económicamente viable, ya que los equipos de manejo biológico
tienen un mayor costo y se debe cumplir con normas de sanidad e inocuidad por el tipo de
producto que se estaría produciendo.
Página 33
11. Competencias desarrolladas
Integrar diferentes operaciones y procesos
Simular procesos y operaciones industriales
Aplicar herramientas de planificación y optimización
Comparar y seleccionar alternativas tecnológicas
Realizar evaluaciones técnicas, económicas, sociales y ambientales de proyectos
industriales
Seleccionar, adaptar y operar equipos y/o procesos químicos y bio-procesos.
Aplicar conocimiento relacionados con la organización estructural de los
microorganismos, con sus características químicas, metabólicas y antigénicas,
facilitar su clasificación, propagación y conservación, comprender y aplicar su
función en la industria.
Determinar las condiciones de operación de diversos tipos de biorreactores para
satisfacer las necesidades y requerimientos del proceso de producción.
Llevar a cabo el cambio de escala en proceso y equipos utilizando el criterio de
escalamiento más indicado según corresponda al tipo de reactor implicado en el
proceso.
Página 34
12. Bibliografía
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Unidad Zacatecno. México D.F. 217p.
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Universidad del valle. Tesis pregrado Bacteriología. Facultad de salud. Escuela
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21. Whittaker, R, (1978). ¨five kingdom¨.
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de acceso (04/04/2016).
22. Pontificia Universidad Catolica de Ecuador, Departamento de Bioquímica,
consultado en la siguiente pagina electrónica.
http://books.google.com.ec/books?id=d_8WL8l-
5ooC&pg=PA104&dq=acido+citrico&hl=es&sa=X&ei=IeeCUdboAYe08QSmqoFQ
&ved=0CC0Q6AEwAA#v=onepage&q=acido%20citrico&f=false 2
http://books.google.com.ec/books?id=d_8WL8l-
5ooC&pg=PA104&dq=ACIDO+CITRICO&hl=es&sa=X&ei=eOqCUY3fFJTo8wSO24
HwAw&ved
Página 37
13. Anexos
ANEXO A
Actividad
Enero Febrero Marzo Abril Mayo
4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3
Revisión bibliografica
Analisis del proceso
Determinación de variables
Estudio del caldo
Pruebas de concentración
Prueba piloto en producción
Evaluación de rendimiento
Análisis de resultados
Escritura de reporte
ANEXO B
Los análisis analíticos fueron realizados bajo las normas:
NOM-086-SSA1-1994 (Apéndice Normativo C, Numeral 2) Bienes y servicios.
Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición,
Determinación de azucares.
NMX-F-103-NORMEX-2009 Determinación de Grados Brix en Alimentos y Bebidas
Método de ensayo.
NMX-F-607-NORMEX-2013 Determinación de Cenizas en alimentos – Método de
prueba.
NMX-F-083-1986 Alimentos - Determinación de humedad en productos
alimenticios.
EPA 6010B INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-ATOMIC EMISSION SPECTROMETRY.
Norma Oficial Mexicana NOM-117-SSA1-1994, Método para la determinación de
cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en alimentos, agua
potable y purificada por espectrofotometría de absorción atómica.
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ANEXO C
Pruebas para 5% de concentración Volumen gastado NaOH
1 25 ml
2 24.5 ml
Pruebas para 10% de concentración Volumen gastado NaOH
1 28 ml
2 29 ml
Pruebas para 15% de concentración Volumen gastado NaOH
1 27 ml
2 26.5 ml
Pruebas para 20% de concentración Volumen gastado NaOH
1 25 ml
2 24 ml
Indicador utilizado: Fenolftaleína
Concentración de acidez:
(Volumen gastado de NaOH*peso equivalente de acido cítrico) / 100
Concentración 5%
48 + 47.04 = 47.52 gr/lt
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Concentración 10%
53.76 + 55.68 = 54.72 gr/lt
Concentración 15%
51.84 + 50.88 = 51.36 gr/lt
Concentración 20%
48 + 46.08 = 47.04 gr/lt
ANEXO D