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Página 1 Residencia Profesional Optimización de Variables de un Reactor Biológico Para La Producción De Acido Cítrico Víctor Manuel Muñiz Avalos Ingeniería Bioquímica Asesor: Ing. Laura Erendida Martínez Martínez Villa de Álvarez, Col., Junio de 2016

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Page 1: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 1

Residencia Profesional

Optimización de Variables de un Reactor Biológico Para

La Producción De Acido Cítrico

Víctor Manuel Muñiz Avalos

Ingeniería Bioquímica

Asesor:

Ing. Laura Erendida Martínez Martínez

Villa de Álvarez, Col., Junio de 2016

Page 2: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 2

Tabla de contenido Pág.

1. Introducción………………..…………………………………………………………………………….………… 7

2. Justificación……..……………………………………………………………………………………….………… 9

3. Objetivos…..………………………………………………………………….……………………………………. 10

3.1 Objetivo general........................................................................................... 10

3.2 Objetivo especifico…………………………………………..……………………………………….. 10

4. Empresa sede del proyecto……………………………………………………………………………….…. 11

4.1 Generalidades……………………………………………………………………………………….…... 11

4.2 Misión………………………………………………………………………………………………….……. 11

4.3 Visión………………………………………………………………………………………………….…….. 12

4.4 Logotipo de la empresa………………………………………………………….………….………. 12

5. Problemas a resolver…………………………………………………………………………………………… 13

6. Fundamento teórico..……………………………………………………………………………………….... 14

6.1 Hongos como biotecnología……………………………………………………………….……… 14

6.1.1 Aspergillus niger…………………………………………………………………………. 14

6.1.2 Bioprocesos…………………………………………………………………….………….. 15

6.2 Melaza………………………………………………………………………………………………………. 16

6.2.1 Obtención…………………………………………………………………………………… 16

6.2.2 Clasificación.….…………………………………………………………………………….17

6.2.3 pH de la melaza..………………………………………………………………………….18

6.2.4 Microorganismos de la melaza…..………………………………………………..18

6.2.5 Aprovechamiento de la melaza…………………………………………………….19

6.2.6 Composición..………………………………………………………………………….……19

7. Actividades..……………………………………………………………………………………………….………. 20

7.1 Cronograma..…………………………………………………….…………………………….……….. 20

7.2 Descripción detallada..…………………………………….……………………………….………. 20

8. Metodología..…………………………………………………………………………………….………………….23

8.1 Materia prima para el sustrato………………………………………………………………….. 23

Page 3: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 3

8.2 Melaza como caldo de cultivo…….……………………………………………………………… 24

8.3 Adaptación a la fuente de nutrientes…………………………………………………………. 24

8.4 Curva de crecimiento de Aspergillus niger………………………………………………… 25

8.5 Pruebas de crecimiento en agar y caldo melaza en 5%, 10% y 15%

(p/v) a nivel caja petri ……………………………………………………………………………….…….26

8.6 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar

a nivel de erlenmeyer (etapa inicial)……………….................................................. 25

8.7 Evaluación de la concentración de melaza de caña

de azúcar a nivel fermentador 20 lt……………………………………………………….………. 26

8.8 Titulación para determinar acidez……………………………………………………….…... 27

8.9 Diagrama de proceso para la producción de acido cítrico……………….………. 28

9. Resultados y discusión….…..…………………………………………………………….………….………..29

10. Conclusiones………..…………………………………………………………………………….……….……. 32

11. Competencias desarrolladas………………………..…………………………………………….….…. 33

12. Bibliografía………..…………………………………………………………………………………..….……… 34

13. Anexos……………………………………………………………………………………………….……………… 37

Page 4: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 4

Índice de tablas Pág.

Tabla 1. Disposición de la melaza de caña de azúcar 19

Tabla 2. Composición general de la melaza de caña de azúcar 20

Tabla 3. Composición de la melaza del Ingenio azucarero Grupo Saenz 23

Tabla 4. Cronograma de actividades 34

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Página 5

Índice de figuras Pág.

Figura 1. Estructura química del Acido Cítrico 7

Figura 2. Logotipo de la empresa Newbauer 12

Figura 3. Colonias de Aspergillus niger 15

Figura 4. Proceso de la obtención de melaza 17

Figura 5. Frascos de fermentación 25

Figura 6. Curva de crecimiento de Aspergillus niger 25

Figura 7. Diagrama de proceso 28

Figura 8. Concentración de Acido cítrico por titulación 29

Figura 9. Concentración de Acido cítrico por HPLC 30

Page 6: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 6

Índice de anexos Pág.

Anexo A. Cronograma de actividades 37

Anexo B. Normatividad de los análisis de la melaza 37

Anexo C. Resultados de la titulación 38

Anexo D. Identificación de A. niger por B. M. 39

Page 7: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 7

1. Introducción

El acido cítrico (C6H8O7) es un acidulante

ampliamente usado, inocuo con el medio ambiente

(Figura 1). Es prácticamente inodoro, de sabor acido no

desagradable, soluble en agua, éter y etanol a

temperatura ambiente. Es un sólido incoloro,

traslucido o blanco que se presenta en forma de

cristales, granular o polvo. Es anhidro o contiene una

molécula de agua de hidratación. Químicamente, el

acido cítrico comparte las características de otros ácidos carboxílicos. Cuando se calienta a

mas de 175°C, se descompone produciendo dióxido de carbono y agua.

La primer fermentación de acido cítrico fue observada como producto de un hongo

por Wehmer en 1893 con Penicillium glaucum en un medio de cultivo con carbohidratos.

Despues de algunos años, fueron aisladas nuevas cepas de hongos, con la capacidad de

acumular acido cítrico, cuales fueron designados como Citromyces (Penicillium). Sin

embargo, los ensayos industriales no tuvieron buen resultado en los problemas de

contaminación y larga duración de fermentación (Soccol, 2006).

Fue hasta en un trabajo de Currie cuando abrió un nuevo suceso de producción

industrial de ácido cítrico. En 1916, encontró algunas cepas como Aspérgillus niger que

produce cantidades significantes de ácido cítrico. Lo más importante que se encontró fue

que creció de manera optima en pH alrededor de 2.5-3.5 y altas concentraciones de

azucares favoreció la producción de ácido cítrico (Mattey, 1992).

Es producido mediante fermentación, que puede llevarse a cabo en tanques

profundos (fermentación sumergida, que es el método más común) o en tanques no

profundos (fermentación de superficie) usando carbohidratos naturales, tales como

Figura 1. Estructura química del Acido Cítrico. Fuente: MAKYMAT, Asesoría

Técnica.

Page 8: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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azúcar y dextrosa como sustratos, y como la preparación del sustrato, la fermentación

aeróbica de la sacarosa por el Aspergillus. Es un buen conservador y antioxidante natural

que se añade industrialmente como aditivo. Sus funciones son como agente secuestrante,

dispersante y acidificante (Soccol, 2006).

El Aspergillus es un género que comprende más de 200 especies de hongos, de

tipo filamentoso y que está compuesto de cadenas de células llamadas hifas. Fue

catalogado por primera vez por el científico italiano P Micheli en 1929, reside

habitualmente en sitios de compostaje y en el heno (Al Mussallam, 1980).

Aspergillus niger es el hongo filamentoso predilecto en investigación, sus

aplicaciones van de la producción de ácido cítrico y glucónico, hasta la producción de

enzimas industriales y proteínas, como la quimosina (Andersen, Nielsen, 2008; Karaffa y

Kubicek, 2003).

Los microorganismos capaces de producir y acumular ácido cítrico son las especies

de los géneros Aspergillus, Citromyces, Penicillium, Monilia, Candida y Pichia, aunque para

la producción comercial sólo se utiliza mutantes de Aspergillus niger. Cepas de Aspergillus

producen más acido por unidad de tiempo comparadas con cualquier otro hongo, debido

a que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato deshidrogenasa y aconitasa

hidratasa, y una alta actividad de citrato sintetasa (López et al., 2006).

En cuanto a la producción de ácido cítrico, Grewal y Kalra afirman que el pH inicial

requerido depende de la fuente de carbono utilizada, y Ruijter y sus colegas mencionan

que los hongos filamentosos Aspergillus niger acumulan altas concentraciones de ácido

cítrico a partir de hexosas o disacáridos cuando es cultivado bajo condiciones particulares.

Page 9: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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2. Justificación

En la industria azucarera se generan desechos como la melaza y azúcares no

refinados, los cuales resultan ser un problema para la industria. Una alternativa para la

zona cañera es la producción de acido cítrico a partir de estos desechos.

La producción mundial de ácido cítrico se estima en millones de toneladas por año,

destacando que la producción en su mayoría es llevada a cabo por fermentación, donde se

involucra el uso de sustancias ricas en carbohidratos. El acido cítrico (acido 2-hidroxi-1,2,3-

propanotricarboxilico), es un ácido orgánico que puede ser considerado natural, sin

embargo también puede ser sintetizado vía laboratorio (Muñoz et al., 2014).

La producción de acido cítrico por fermentación es el proceso más económico y

amplio más utilizado en la síntesis para la obtención de este producto. Y tiene sus propias

ventajas; su operación es simple y estable, necesita sistema de control básico al igual que

las habilidades técnicas y bajo consumo de energía en su proceso (Soccol, 2006).

Actualmente el uso de hongos para la elaboración de importantes productos

comerciales ha aumentado rápidamente en los últimos años, instaurando un marco en el

cual el ácido cítrico se ha posicionado como el mayor ácido orgánico producido por

fermentación con Aspergillus niger, a la vez que es ampliamente usado en la industria de

alimentos, bebidas, farmacéutica, química, entre otras (Ates et al., 2002).

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3. Objetivos

Objetivo general

- Optimizar el proceso de un reactor biológico para la producción de acido cítrico a partir

de melaza y azúcares.

Objetivo especifico

-Evaluar diferentes concentraciones del caldo en el proceso del reactor biológico para la

producción de ácido cítrico.

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4. Empresa sede del proyecto

4.1 Generalidades

Newbauer S.A. de C.V. es una empresa del sector industrial ubicada en Jalisco,

100% Mexicana, fundada el 1ro. De abril del año 2011, con la finalidad de satisfacer las

necesidades agroquímicas del campo. Dedicada a la producción y fabricación de

fertilizantes líquidos y biotecnológicos.

Una empresa competente gracias a sus instalaciones industriales, calidad, servicio

al cliente, liderazgo tecnológico y el valor sobresaliente que proporcionan a los clientes y

accionistas.

Inicio como proyecto para satisfacer las necesidades de fertilizante al Ingenio

Azucarero de Grupo Saenz con mayor superficie de riego tecnificado del país situado en el

municipio de Tamazula de Gordiano, Jalisco, lo que actualmente ya también se cubre las

necesidades para los productores de Aguacate, Berrys, Hortalizas, Granos, entre otros, por

su buena aceptación y calidad de los productos.

Se desarrollan productos con formulación adecuada según las necesidades del

cultivo y así aumentar la eficiencia en su aplicación. Por su naturaleza liquida cuentan con

disponibilidad inmediata para los cultivos y a un menor costo de operación, por ello son

eficientes, rentables, manejables y ambientalmente seguros.

4.2 Misión

Ser una empresa química dedicada a la fabricación de productos de nutrición en

base a fertilizantes líquidos y biotecnológicos en busca de constante innovación, con el

propósito de optimizar nuestro entorno agrícola.

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4.3 Visión

Situarnos como la empresa líder en producción de fertilizantes líquidos, dentro de

las 5 comercializadoras más importantes en México, nos distinguiremos de la competencia

gracias a nuestras instalaciones industriales, calidad, servicio al cliente, liderazgo

tecnológico y el valor sobresaliente que proporcionaremos a nuestros clientes y

accionistas.

4.4 Logotipo de la empresa

Figura 2 Logotipo de la empresa Newbauer

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5. Problemas a resolver

Para la obtención de ácido cítrico se requiere el manejo de material biológico, en

este caso el microorganismo capaz de producir mayor acido cítrico como producto de una

fermentación es Aspergillus niger de tipo batch, con una concentración de un caldo rico en

carbohidratos y demás nutrientes, en el que se utiliza la melaza como materia prima, y

que genera un alto rendimiento en la producción de acido cítrico.

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6. Fundamento teórico

6.1 Hongos como biotecnología

Los hongos se alimentan incorporando nutrientes a partir de material orgánico

disponible. Los hongos no poseen estómagos, por lo que tienen que digerir su comida

antes de que pueda pasar a través de la pared de la célula a la hifa. La hifa secreta ácidos y

enzimas que biodegradan el material orgánico en compuestos de menor complejidad y

fáciles de digerir (Whittaker, 1978).

A nivel industrial, el crecimiento de hongos filamentosos en medios líquidos debe

considerar la transferencia de masa en la interface líquido-sólido entre la superficie celular

y el medio y al interior de la madeja formada por las hifas; ya que las resistencias

interfaciales en conjunto con el crecimiento de la biomasa representan un obstáculo para

el transporte del sustrato, así como un aumento de la densidad de la biomasa implica una

reducción de la porosidad lo que contrarresta la penetración de los nutrientes (CUI, et.

al., 1997; Escamilla Silva et. al., 2001).

6.1.1 Aspergillus niger

En la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger (Figura 3) los niveles de los

nutrientes y las condiciones ambientales, como pH, agitación, temperatura, iones

metálicos, concentración de fosfato, fuente de nitrógeno y carbono, alcoholes y aditivos,

son factores importantes que regulan la morfología del microorganismo y el proceso

fermentativo (Hossain et al., 1983, Hossain and Ahmed, 1992).

Su morfología de formas miceliales hialinas en cultivo. Y en vista macroscópica las

colonias blancas con negro, esporas negras. Forman hifas tabicadas ramificadas, cada una

de las cabezas conidiales se compone de conidióforo con una vesícula terminal.

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Específicamente en el crecimiento de A. niger y la producción de ácido cítrico,

algunos iones y minerales tienen un efecto sobre la morfología y su producción. Por

ejemplo, los niveles de zinc y hierro en el medio están relacionados con la conversión de

las fuentes de carbono a biomasa o ácido cítrico (Mattey, 1992).

6.1.2 Bio-procesos

La mayoría de las fermentaciones son procesos discontinuos, cuya cinética propia

permite que los equipos sean operados en intervalos. Al final de dicho tiempo, se procede

a la recuperación de la levadura por centrifugación. Es un sistema que presenta facilidad

en sus operaciones, ya que disminuye los requerimientos para obtener su completa

esterilización, evitando así, el riesgo de pérdidas financieras y facilitando el manejo de

materias primas. Como desventaja de este sistema, se muestra la decreciente

productividad en la fermentación debido al largo tiempo de rotación y retraso en el

crecimiento inicial (Quintero, 1981).

Figura 3 Colonias blancas con micelio aéreo negro. Fuente: Tangarife V.

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Llamados también procesos en Batch o lote, son de gran importancia comercial

para su amplio uso. Las técnicas de instalación de los cultivos discontinuos, van a

depender de si el proceso es aerobio o anaerobio. Puede considerarse como un sistema

cerrado. A tiempo cero (t0), la solución esterilizada de nutrientes se inocula con

microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones optimas de

fermentación (Doran, 1998).

6.2 Melaza

La miel o también llamada melaza, es un líquido denso y viscoso de color oscuro,

es producto final de la fabricación o refinación de la sacarosa procedente de la caña de

azúcar. Este subproducto se usa para alimentos concentrados para animales y como

suplemento alimenticio para el hombre (Leeson y Summers, 2000).

La denominación melaza se aplica al efluente final obtenido en la preparación del

azúcar mediante una cristalización repetida. El proceso de evaporación y cristalización es

usualmente repetido tres veces hasta el punto en el cual el azúcar invertido y la alta

viscosidad de las melazas ya no permitan una cristazación adicional de la sacarosa (Swan y

Karalazos, 1990).

6.2.1 Obtención

La melaza se obtiene como subproducto de la producción de azúcar refinada, la cual se

muestra en la Figura 4.

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6.2.2 Clasificación

La Asociación Americana de Control Oficial de Alimentos (AAFCO), recomienda

diferentes clasificaciones para las melazas, según el azúcar total y el contenido de

humedad, así:

Melaza Superior Blackstrap: Melaza de caña que contiene 23.4% de agua o menos,

y 53.5% o más de azucares totales.

Melaza Blackstrap: Melaza compuesta por 23.5% a 26.4% de agua y 48.5% a 53.5%

de azucares totales (Castro, 1993).

Otra clasificación de las melazas, se da por el porcentaje de materia sólida en peso, o

grados Brix, de la siguiente manera:

Melaza Blackstrap: Es el subproducto de la elaboración del azúcar, cuyo porcentaje

de materia sólida en peso (grados Brix), diluido con igual peso de agua es de 42.5

grados Brix.

Figura 4 Proceso de obtención de melaza (Ariza y Gonzalez, 1997)

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Melaza de Caña Alimenticia: Es la melaza blackstrap diluida con agua, hasta una

concentración en grados Brix, no menor de 39.75; a este producto no se le ha

especificado un valor de concentración de azúcares.

Melaza High Test o Jarabe Invertido: Es el producto obtenido por la concentración

del jugo clarificado, hasta un porcentaje de materia sólida en peso de 85% e

invertido con ácido o con invertasa (Castro, 1993).

6.2.3 pH de la melaza

Las melazas de caña son ligeramente acidas, tienen un pH entre 5.5 y 6.5; un pH

bajo es atribuible a la presencia de ácidos alifáticos y al bajo pH de la clarificación, si es

acida. El pH de las melazas cambia con la temperatura y depende también de la naturaleza

y de la cantidad de material estabilizador del pH que posea (Swan y Karalazos, 1990).

La acción estabilizadora del pH tiene efecto sobre la melaza para resistir la adición

de ácidos o álcalis, sin cambiar su naturaleza acida o básica. En la melaza de acción

estabilizadora depende del contenido de no azucares y de las características de la melaza

(Swan y Karalazos, 1990).

6.2.4 Microorganismos de la melaza

Mediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de melazas, se ha

demostrado que estas, a pesar de su bajo contenido de fosforo, constituyen un buen

medio nutritivo para muchos microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias.

Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos y termófilos dentro

de la melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan bien durante la dilución de las

melazas (Ariza y Gonzales, 1997).

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6.2.5 Aprovechamiento de la melaza

6.2.6 Composición

La melaza es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido, sales y

otros compuestos solubles en álcali que normalmente están presentes en el jugo de caña

localizado, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar. Además

de la sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas

también contienen sustancias reductoras no fermentables (Tabla 2).

Estos compuestos no fermentables reductores del cobre, son principalmente

caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento requerido por el proceso y

las melanoidinas que si contienen nitrógeno derivadas a partir de productos de

condensación de azúcar y aminocompuestos. (Honig, 1974).

Tabla 1. Disposición de la melaza de caña de azúcar

Page 20: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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Tabla 2. Composición de la melaza de caña de azúcar

Page 21: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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7. Actividades

7.1 Cronograma

Se cuenta con un cronograma de las actividades a desarrollar en este proyecto el

cual se podrá encontrar en el anexo A, esto con la finalidad de poder realizar en tiempo y

forma los requerimientos y obtener los resultados deseados.

7.2 Descripción del proceso

Para la obtención de acido cítrico se llevará a cabo un proceso fermentativo el cual

se presenta en un diagrama de bloques.

El proceso de obtención del acido cítrico, no solo engloba la fermentación sobre la

cual se estará trabajando en este trabajo, si no que, conlleva una cadena de procesos

unitarios que logran la generación de este material.

Caldo

•Agua

•Melaza de caña de azucar

Fermentador

•Condiciones controladas

•Aspergillus niger

Caldo con producto

•Mezcla con carbonato de calcio

Separación del ácido citrico

•Precipitación de impurezas con ácido sulfurico

Page 22: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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Remarcando los procesos generales se pueden separar en estas 4 etapas

principales que son las de mayor atención y cuidado para poder generar un producto de

manera óptima y de buena calidad, ya que estamos hablando de un derivado de un

material biológico.

En la preparación del caldo existen dos partes importantes, una es la de

pasterización del caldo, ya que se deben manejar con precisión las temperaturas y

tiempos de retención, para así lograr una completa esterilidad del caldo de cultivo para el

fermentador, y la otra es la concentración a la que se prepara el caldo, el cual se debe de

llegar al optimo para el microorganismo en donde exista una mayor producción de acido

por cada litro de fermento.

En el fermentador donde se colocara el caldo y posteriormente se agregara el

inoculo de Aspergillus niger se debe contar con temperatura constante, inyección de un

poco de oxigeno, agitación homogénea y de bajas rpm, ya que se está trabajando con

microorganismos y no se debe generar un movimiento tan agresivo para que puedan

realizar su trabajo.

Los tratamientos posteriores a la fermentación son para poder desdoblar las

moléculas y generar otras con las cuales se organice solo la separación del acido cítrico

puro, y así llegarlo a cristalizar para su interés de uso.

Page 23: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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8. Metodología

8.1 Materia prima para el sustrato

Una de las materias primas necesarias para el proceso de producción de acido

cítrico es la melaza, la cual es fuente de nutrientes al microorganismo, principalmente

carbohidratos, que es la principal fuente de carbono. La melaza obtenida del Ingenio

Tamazula ¨Grupo Saenz¨, y distribuida por la empresa transportista SILVIC, se le realizaron

análisis de calidad por medio del Centro de Investigaciones y Asistencia en Tecnología y

Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), para así llegar a formular de manera precisa el caldo

nutrimental, los resultados son los que se muestran en la tabla 3, los cuales se realizaron

bajo normas ya establecidas que se muestran en el anexo B.

Determinación Unidad Resultado

Azucares reductores totales (% en peso) 76,98

Grados Brix Bx 80,30

Sólidos totales (% en peso) 74,04

Cenizas (% en peso) 9,07

Calcio (mg/kg) 6275,0

Tabla 3. Resultados del análisis de la melaza utilizada como materia prima

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8.2 Melaza como agar y caldo de cultivo

La melaza de caña como sustrato para la producción de acido cítrico mediante

Aspergillus niger, se obtuvo de manera comercial, ya que es un subproducto de la

industria azucarera que actualmente se comercializa para el engorde de animales.

La concentración de melaza de caña seleccionada se peso y disolvió en agua

destilada, calentando y agitando hasta diluirla totalmente. Posteriormente, se centrifugó

con el fin de retirar gran parte de impurezas y contaminantes; se esterilizó por 15 minutos

a 15 libras de presión. Por último, se adiciono ampicilina a una concentración de (300

mg/L) (Pedroza, 2006) y se procedió a realizar la curva de crecimiento de Aspergillus niger,

lo cual, este microorganismo se mando identificar por técnicas de biología molecular y sus

resultados se muestran en el anexo C.

Las pruebas realizadas a nivel laboratorio se llevaron a cabo en el espacio del

laboratorio de Microbiología del Instituto Tecnológico Superior de Tamazula de Gordiano,

Jalisco, asistido por la encargada de laboratorio la Ingeniera Leticia Betsaida Rios. El

material de laboratorio que se utilizo fue brindado por la empresa Newbauer y algunos

equipos especializados se utilizaron directamente en las instalaciones del Tecnológico.

8.3 Adaptación a la fuente de nutrientes

Se preparo agar melaza, los componentes solamente fueron Agar-agar y melaza al

10% de concentración p/p. Se llevo a cabo su esterilización en autoclave a 121°C, 15 lb de

presión y 15 minutos. Después de este proceso, utilizando una campana de flujo laminar,

se vertió el agar en cajas petri y se dejo gelificar. Se tomo material celular de Aspergillus

niger para colocarse en la caja petri para observar su crecimiento y adaptación a ese tipo

de nutriente, en condiciones de 25°C y 1 atm para su optimo crecimiento.

Page 25: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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8.4 Curva de crecimiento de Aspergillus niger

Se realizo la prueba de crecimiento al

microorganismo para poder conocer el tiempo en el cual

crece de manera optima y tener la producción del acido

cítrico más controlada en la fase logarítmica de Aspergillus

niger. Las muestras fueron tomadas de los frascos de

fermentación que se muestran en la figura 5. Como se

observa en la figura 6 la fase logarítmica se encuentra entre

las 24 y 48 horas en el caldo melaza.

Figura 6 Curva de crecimiento de Aspergillus niger

y = 0.0076x + 0.1388 R² = 0.9495

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 20 40 60 80

Ab

sorb

anci

a (n

m)

Tiempo (hr)

Curva de crecimiento

Series1

Lineal (Series1)

Figura 5 Frascos de fermentación

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Página 26

8.5 Pruebas de crecimiento en agar y caldo melaza en 5%, 10% y 15% (p/v) a nivel caja

petri

Para evidenciar el crecimiento de Aspergillus niger en caldo y agar melaza, se

prepararon tres concentraciones (5%, 10%, 15%, 20% (p/v)). Se realizo una siembra

masiva para cada una de las concentraciones, las cajas fueron incubadas a 25°C durante

24 horas.

Para el caldo melaza se prepararon las tres concentraciones con 20 ml, inoculadas

con células del mismo A. niger. Posteriormente se incubaron a 25°C durante 24 horas.

8.6 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar a nivel de erlenmeyer

(etapa inicial)

Se realizaron fermentaciones discontinuas en erlenmeyer manteniendo la relación

de ¼ del volumen del cultivo y tamaño del recipiente con el fin de favorecer la aireación. El

medio de cultivo utilizado fue la melaza a diferentes concentraciones (5%, 10%, 15%, 20%

(p/v)).

Las condiciones de fermentación manejadas fueron temperatura de 25°C,

agitación de 80 rpm, durante 48 horas adicionando ampicilina (300 mg/lt) con pH inicial

de 5.5. Se realizaron muestreos con intervalos de doce horas desde la hora 0 hasta la hora

12 y cada 12 hasta la hora 48.

8.7 Evaluación de la concentración de melaza de caña de azúcar a nivel fermentador

Se realizo la preparación de cada uno de los caldos a diferentes concentraciones

(5%, 10%, 15%, 20% (p/v)). Se colocaron en el frasco o fermentador de 20 lt, el cual

contaba con medidor de temperatura del liquido, flujo de oxigeno en condiciones de filtro

y agitación aproximada de 50 rpm, la cual fue la que causo mayor problema de control por

Page 27: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 27

su baja potencia de agitación. Se realizaron las pruebas y las muestras (500 ml) de cada

una de las concentraciones se tomaron a las 48 horas de iniciar la fermentación.

Las muestras para su análisis y cuantificación de acido cítrico se mandarían a

CIATEJ para facilitar los resultados, debido a falta de equipo especializado para su

detección. Se les solicito un análisis instrumental, y ellos se encargaron de estructurar una

técnica adecuada para poder facilitar los resultados, del cual definieron que con

cromatografía HPLC obtendrían resultados mas exactos.

El volumen de 500 ml de muestra que se tomo fue por recomendaciones de CIATEJ

para su mejor valoración de ellos y tener muestra de sobra por cualquier problema que

pudiera existir, al igual que solicitaban que la muestra fuera recibida en menos de 24

horas para que los análisis tuvieran validez.

8.8 Titulación para determinar acidez

Una forma analítica para determinar cantidad de acido cítrico en un liquido es

calculando su acidez tomando una propiedad directamente del acido como lo es el peso

equivalente. Se preparo Hidróxido de sodio a 0.1 N, también fenolftaleína como indicador

para la titulación.

Se coloco el hidróxido de sodio en la bureta, en el matraz se colocaron 2 ml del

producto fermentado de cada una de las concentraciones probadas y se agregaron 18 ml

de agua desmineralizada y se agrego un par de gotas del indicador. Se inicio la titulación y

se tomaron los datos del gasto del hidróxido, se realizaron 2 pruebas de cada uno, que se

muestran en el anexo C. Se tomo en cuenta para el cálculo el peso equivalente del acido

cítrico que es 192 gr/mol.

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8.9 Diagrama de proceso para la producción de acido cítrico

Se realizo una simulación del proceso inicial (Figura 7) en el que se prepara el caldo

para el fermento, el cual se lleva a un proceso de pasterización con ayuda de

intercambiadores de calor que elevan a 115°C y disminuyen de inmediato a 4°C el fluido.

Después se manda directo al fermentador con los sensores ya indicados y un flujo de

oxigeno para así cumplir con la fermentación aerobia.

Figura 7 Diagrama de proceso

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Página 29

9. Resultados y discusión

Resultados por titulación con NaOH

Concentración del caldo Tiempo de residencia Cantidad de Acido cítrico

5% 48 horas 47.52 gr/lt

10% 48 horas 54.72 gr/lt

15% 48 horas 51.36 gr/lt

20% 48 horas 47.04 gr/lt

Figura 8 Concentración de Acido cítrico por titulación

Este método es de análisis fácil y rápido pero no es tan exacto para la

determinación de acido cítrico. Solo se toma para calcular la acidez y de ahí un parámetro

como lo es el peso equivalente de la molécula del acido cítrico. Los resultados obtenidos

pueden ser muy acercados a su realidad los cuales sirven como una base experimental. Y

podemos observar la generación de acido en la fermentación aeróbica realizada con

Aspergillus niger.

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

0 5 10 15 20 25

Can

tid

ad d

e A

. ci

tric

o g

r/lt

Concentración %

Concentración optima

Series1

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Resultados por HPLC realizados por CIATEJ

Concentración del caldo Tiempo de residencia Cantidad de Acido cítrico

5 % 48 horas 52.02 gr/lt

10% 48 horas 64.07 gr/lt

15 % 48 horas 58.47 gr/lt

20 % 48 horas 57.82 gr/lt

Figura 9 Concentración de Acido cítrico por HPLC

Los resultados que obtuvieron del contenido de acido cítrico en el fermento a

diferentes concentraciones son mayores a los que se calcularon de forma analítica por

titulación. El cual puede referir a los errores o falta de precisión que se tiene en la

titulación para acido cítrico. Estos datos con la técnica de HPLC son más confiables para la

valoración del punto optimo de la concentración para el proceso fermentativo aeróbico

con Aspergillus niger.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

Can

tid

ad d

e A

. ci

tric

o g

r/lt

Concentración %

Concentración optima

Series1

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Página 31

En el cual se observa que al igual que en la anterior técnica, favorece la

concentración del 10% de melaza en el caldo nutritivo para la fermentación. Esto puede

ser porque en menor concentración faltan nutrientes en el metabolismo del

microorganismo y a una mayor concentración de melaza, satura el caldo de sólidos

disueltos y bloquea la producción en el metabolismo de Aspergillus niger.

La melaza que se está utilizando como materia prima es de una muy buena calidad

tal y como se observo en los análisis de su composición nutritiva, y también cuenta con

una densidad de 1.5, debido a los sólidos disueltos que contiene, esto con lleva a

obscurecer el caldo y también interrumpir las mediciones por titulación.

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Página 32

10. Conclusiones

La cepa Aspergillus niger por seguridad de la empresa, se mando identificar de

nuevo por Biología Molecular al Departamento de Farmacología en el Centro Universitario

de Ciencias Exactas e Ingenierias y así descartar alguna contaminación de la cepa.

Ya instalada y preparada la planta piloto, se probó con líquidos inertes y se

revisaron las variables que no tuvieran ningún problema en su control. Antes de iniciar con

las fermentaciones.

La optima concentración de melaza en el caldo para la producción de acido cítrico

por Aspergillus niger fue del 10%. En los 2 tipos de cuantificaciones que se realizaron

muestran a favor los resultados, tal es el caso en la titulación con 54.72 gr/lt de acido

cítrico y en el método instrumental con 64.07 gr/lt de acido cítrico.

Para obtener un mayor rendimiento de acido cítrico en la fermentación aeróbica

por Aspergillus niger no solo es el optimo de tiempo de residencia y la concentración del

caldo, si no también se debe hacer un análisis sobre una posible modificación en un gen

de la cepa para poder estimular una mejora en su metabolismo y así llegar a un optimo

mayor en su producción.

La melaza es una fuente de carbohidratos ideal para fermentaciones de este tipo,

ya que contiene nutrientes esenciales para la mayoría de los microorganismos.

Para poder realizar el escalamiento industrial primero se debe aumentar la

producción para que sea económicamente viable, ya que los equipos de manejo biológico

tienen un mayor costo y se debe cumplir con normas de sanidad e inocuidad por el tipo de

producto que se estaría produciendo.

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11. Competencias desarrolladas

Integrar diferentes operaciones y procesos

Simular procesos y operaciones industriales

Aplicar herramientas de planificación y optimización

Comparar y seleccionar alternativas tecnológicas

Realizar evaluaciones técnicas, económicas, sociales y ambientales de proyectos

industriales

Seleccionar, adaptar y operar equipos y/o procesos químicos y bio-procesos.

Aplicar conocimiento relacionados con la organización estructural de los

microorganismos, con sus características químicas, metabólicas y antigénicas,

facilitar su clasificación, propagación y conservación, comprender y aplicar su

función en la industria.

Determinar las condiciones de operación de diversos tipos de biorreactores para

satisfacer las necesidades y requerimientos del proceso de producción.

Llevar a cabo el cambio de escala en proceso y equipos utilizando el criterio de

escalamiento más indicado según corresponda al tipo de reactor implicado en el

proceso.

Page 34: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 34

12. Bibliografía

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doctoral. Universidad de Utrech, Utrech.

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levaduras y melaza de caña de azúcar como sustrato. Tesis de pregrado

Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.

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citric acid production by inmobilized and freely suspended Aspergillus niger

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4. Castro, M. 1993. Estudio de la melaza de caña como sustrato de la

fermentación Acetobutílica. Tesis Pregrado Ingeniería Química. Universidad

Nacional de Colombia. Facultad de Ingeniería. Bogotá, Colombia. 3-35p.

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6. Doran, P. 1998. Principios de Ingeniería de los bioprocesos. Editorial Acribia.

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dynamic oxygen into mycelial pellets in submerged cultures. Biotechnology

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Page 35: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

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11. Leeson, S. y Summers, J. 2000. Nutrición Aviar Comercial. Editorial Le Print Club

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12. Lopez, C.A., Zuluaga, A., Herrera, S.N., Ruiz, A.A. y Medina, V. I. (2006).

Producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 2270 a partir de suero

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13. Muñoz V. Alejandra, Saenz G. Aidé, López L. Lluvia, Cantú S. Liliana y Barajas B.

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14. Mattey M. (1992). The production of organic acids. Critical Review in

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15. Pedroza, A. 2006. Tratamiento de aguas residuales en la industria papelera

mediante un sistema secuencial: Hongos lignilolíticos y un proceso

fotocatalítico nanoestructurado de TiO2/RuXSeY. Tesis de doctorado. Centro

de investigación y de estudios avanzados del Instituto Politécnico Nacional.

Unidad Zacatecno. México D.F. 217p.

16. Quintero, R. 1981. Ingeniería Bioquímica. Primera Edición. Editorial Alambra.

México. 33-37p.

17. Soccol R. Carlos, Vandenbergue S. Luciana P., Rodrigues Cristine, Pandey

Ashok. (2006). New Perspectives for Citric Acid Production and Application.

Bioprocess Engineering and Biotechnology Division, Department of Chemical

Engineering. Federal University of Paraná. 44 141-149.

18. Swan, H. y Karalazos, A. 1990. Las melazas y sus derivados. Revista Tecnología.

Geplacea. No. 19. España. 78-82p.

19. Tellez, D. 2004. Caracterización de las melazas empleadas en el proceso

fermentativo de la destilería San Martín-Industria de Licores del Valle.

Universidad del valle. Tesis pregrado Bacteriología. Facultad de salud. Escuela

de Bacteriología y laboratorio clínico. Santiago de Cali. Cali, Colombia. 79p.

20. Yepez, Y. 1995. Selección de una cepa de Saccharomyces cerevisiae con alta

productividad de etanol y que tolere mayores niveles de azúcar que los usados

Page 36: Residencia Profesional Optimización de Variables de un

Página 36

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Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia. 34-48p.

21. Whittaker, R, (1978). ¨five kingdom¨.

http://home.manhattan.edu/frances.cardillo/plants/intro/plntlist.html Fécha

de acceso (04/04/2016).

22. Pontificia Universidad Catolica de Ecuador, Departamento de Bioquímica,

consultado en la siguiente pagina electrónica.

http://books.google.com.ec/books?id=d_8WL8l-

5ooC&pg=PA104&dq=acido+citrico&hl=es&sa=X&ei=IeeCUdboAYe08QSmqoFQ

&ved=0CC0Q6AEwAA#v=onepage&q=acido%20citrico&f=false 2

http://books.google.com.ec/books?id=d_8WL8l-

5ooC&pg=PA104&dq=ACIDO+CITRICO&hl=es&sa=X&ei=eOqCUY3fFJTo8wSO24

HwAw&ved

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Página 37

13. Anexos

ANEXO A

Actividad

Enero Febrero Marzo Abril Mayo

4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3

Revisión bibliografica

Analisis del proceso

Determinación de variables

Estudio del caldo

Pruebas de concentración

Prueba piloto en producción

Evaluación de rendimiento

Análisis de resultados

Escritura de reporte

ANEXO B

Los análisis analíticos fueron realizados bajo las normas:

NOM-086-SSA1-1994 (Apéndice Normativo C, Numeral 2) Bienes y servicios.

Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición,

Determinación de azucares.

NMX-F-103-NORMEX-2009 Determinación de Grados Brix en Alimentos y Bebidas

Método de ensayo.

NMX-F-607-NORMEX-2013 Determinación de Cenizas en alimentos – Método de

prueba.

NMX-F-083-1986 Alimentos - Determinación de humedad en productos

alimenticios.

EPA 6010B INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-ATOMIC EMISSION SPECTROMETRY.

Norma Oficial Mexicana NOM-117-SSA1-1994, Método para la determinación de

cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en alimentos, agua

potable y purificada por espectrofotometría de absorción atómica.

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ANEXO C

Pruebas para 5% de concentración Volumen gastado NaOH

1 25 ml

2 24.5 ml

Pruebas para 10% de concentración Volumen gastado NaOH

1 28 ml

2 29 ml

Pruebas para 15% de concentración Volumen gastado NaOH

1 27 ml

2 26.5 ml

Pruebas para 20% de concentración Volumen gastado NaOH

1 25 ml

2 24 ml

Indicador utilizado: Fenolftaleína

Concentración de acidez:

(Volumen gastado de NaOH*peso equivalente de acido cítrico) / 100

Concentración 5%

48 + 47.04 = 47.52 gr/lt

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Concentración 10%

53.76 + 55.68 = 54.72 gr/lt

Concentración 15%

51.84 + 50.88 = 51.36 gr/lt

Concentración 20%

48 + 46.08 = 47.04 gr/lt

ANEXO D