ReproducciReproduccióón Asistida en Bovino n Asistida en Bovino usando usando OvumOvum PickPick--Up (OPU) y Up (OPU) y

FecundaciFecundacióón n In VitroIn Vitro

Dpto. de Reproduccion Animal y ConservaciDpto. de Reproduccion Animal y Conservacióón n de Recursos Zoogende Recursos Zoogenééticosticos

INIA INIA -- MadridMadrid

INDICEINDICE

•• IntroducciIntroduccióónn•• AplicaciAplicacióón del n del OvumOvum PickPick--UpUp•• Problemas asociadosProblemas asociados

–– Intervalo de sesiIntervalo de sesióónn–– PrePre--estimulaciestimulacióónn–– Equipo para el OPU Equipo para el OPU –– TTéécnica de recogida de ovocitoscnica de recogida de ovocitos

ImpactoImpacto de de laslas TecnologTecnologííasas de de ReproducciReproduccióónn AsistidaAsistida

MejoraMejora ReproductivaReproductiva

I.A.I.A.

FIVFIV

TransgTransgéénesisnesis

ClonaciClonacióónn

MOETMOET

SexajeSexaje OPUOPU

5 transferable embryos/ flush= 50 freezable embryos/donor/year=30 calves born after ET

2 OPU/week=150 embryos/year=70 calvesCan be used different bull @ each batch of oocytesEmbryos can be produced during 2nd and 3rd month of pregnancy

FIV/Ovum pick up• Obtención de ovocitos de ovarios de animales

vivos.

• Se puede acceder a animales de alta calidad.– Podemos colectar ovocitos repetidamente, incluso en

estado de preñez.

• Cuando la alta calidad genética del donante estáunida a un buen laboratorio de FIV – podemos producir alta cantidad de embriones de alta calidad.è Eficaz en mejora genética.

vOPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal. Cuando se usa conjuntamente con técnicas de FIV, se acorta el intervalo generacional y aumenta la mejora genética maternal produciendo más progenie que por métodos convencionales.

vEl éxito del OPU se mide mediante la tasa de recuperación de ovocitos expresando el porcentaje sobre el total de folículos aspirados.

Ø La tasa de recuperación está influenciada por:

üAspiración al vacío

üPre-tratamiento hormonal de animales

üFrecuencia de punción

üEstado del ciclo: estro

üExperiencia del operador

Ovum Pick Up

Etapas del Ovum Pick Up

Anestesia localTécnico con equipo de

OPU Colecta OPU

TE el día 7Aisla y clasifica ovocitos y embriones

FIV

OPUObtención de ovocitos

Diagrama de OPU

Grado 1-2 Grado 3-4

Adaptado de Rizos, 2007

Los complejos cúmulos-ovocito (COCs) se clasificaron en 4 categorías morfológicas:

Ø (1) Rodeados de numerosas capas de células del cúmulo compactas

Ø (2) Rodeados de 2 a 3 capas de células del cúmulo compactas

Ø (3) Ovocitos denudados

Ø (4) Capas celulares expandidas

RecuperaciRecuperacióón de ovocitos n de ovocitos y clasificaciy clasificacióónn

Adaptado de Rizos, 2007

División %Blastocistos %

80

20

0

40

60

Ward et al. (1999)

Morfología de los ovocitos

Adaptado de Rizos, 2007

maduración

Desarrollo embrionario

fecundación

DivisiónBlastocisto

Producción de Embriones In Vitro

¿?

Adaptado de Rizos, 2007

Maduración (MIV)• Espontánea in vitro• Maduración nuclear

– Reanudación de la meiosis– Profase I - Metafase II (=ovulación)

• Maduración citoplásmica– Migración de gránulos corticales (bloquean la

poliespermia)– Redistribución de orgánulos

• 24 h en 5% CO2 en aire, 39° C

Adaptado de Rizos, 2007

Grado 1 y 2

Grado 3 y 4

Antes de la maduración Después de la maduraci ón

1er corpúsculo polar

MIV durante 24 h

39o C, 5% CO2

Adaptado de Rizos, 2007

Fecundación (FIV)

• Descongelar el semen• Capacitación - heparina• Selección espermática

– Swim-up– Gradiente de densidad de Percoll

• 0.5-1 millón spz/ml• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire

Adaptado de Rizos, 2007

con Swim-up

0.25 ml semen+

1 ml medio

Con Percoll

Antes de centrifugar Después de centrifugar

Separación espermática

Adaptado de Rizos, 2007

Zigoto

FIV durante 24h

39o C, 5% CO2

Adaptado de Rizos, 2007

Cultivo (CIV)Determina la calidad embrionaria:

• Atmósfera de humedad saturada • Medio definido vs co-cultivo vs cultivo in vivo• Suero • 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2• Período más largo in vitro (~7 días)

Adaptado de Rizos, 2007

Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

Día 6 Día 7 Día 8 - 9

Adaptado de Rizos, 2007

El origen de los ovocitos en OPU-IVF

• Ovocitos de folículos de tamaño >2mm– Intervalo de sesión de OPU

• Ovocitos más homogéneos que con MOET o FIV, debido a las sesiones repetidas se eliminan los folículos dominantes y atrésicos– Los ovocitos de FIV se recogen de folículos en cada

fase del desarrollo.– Los ovocitos de MOET han sufrido una fase dominante

y un desarrollo preovulatorio final.

SOV

OPU

Matadero2

3

4

5

6

7

8

15

Tamaño del folículo (mm)

Fase folicular

Folículo preovulatorio

Procesos que afectan a OPU-IVF

• Intervalo de sesión• Pre-estimulación con FSH• Equipo de OPU • Técnica de recogida de ovocitos

Intervalo de sesionesEfecto del intervalo entre las sesiones de OPU en la calidad del ovocito y la posterior

tasa de producción in vitro de embriones (Merton et al. 2003).

10.5b0.97b4.02595

14.1a1.29a3.925922-5

13.5c0.09.1a4877

17.1b0.306.6b5024

19.7a0.667.2a51633-4

Embriones/ ovocitos (%)

Índice calidad ovocito

Ovocitos/ sesión (n)

Sesiones1

(n)Intervalo

(días)Esquema

Pre-estimulación con FSHEfecto de la pre-estimulación con FSH en los resultados de OPU-IVP (Merton 2003)

1.0c16.3b58.55.9cNo2 veces/semanaLunes-Jueves

3.3b26.0a65.613.2b+1 vez/2 semanas

1.5a19.960.47.8aNo2 veces/semanaLunes-Jueves

Embriones por

sesión (n)

Embriones/Ovocitos

(%)

División(%)

Ovocitos/Sesión (n)

Trata.FSH1Periodo

Colectas ultrasonogr áficas sobre vacas gestantes SOV(P<0.001)

Tratamiento % Colectados Ovocitos/vaca % División

+40 mg FSH 43 10.8+5.3 67 a

+20 mg FSH 28 1.7+0.7 40 b

Control 19 0.3+0.2 0 c

Equipo de OPU

• La técnica de OPU es realizada por una o dos personas.– Técnico – manipula el ovario– Asistente – realiza la punción folicular

• Ambas personas afectan significativamente a la cantidad de COCs recogidos

Técnica de recogida de ovocitos

• El número de ovocitos recogidos por animal dependen del técnico y la ruta utilizada.

– mediante aspiración: 32 ovocitos GI y II– mediante OPU: 8 ovocitos GI y II

• Estas diferencias son principalmente debidas a la baja resolución del ecógrafo para OPU comparado con el ojo humano.

20.843.1721-2Ex vivo por aspiración

37.582.5402-10In vivo por OPU

Obtención de blastocistos %

Tasa de división %

Numero total de ovocitos

Tamaño del Folículo (mm)

Método de colecta de

ovocitos (n=6)

Efecto del tamaño folicular en la tasa de producción in vitro de embriones usando OPU seguida de la aspiración de los ovocitos restantes después de morir el donante

(Merton, 2003).

Observaciones finales

1.53OPU después de pre-estimulación (FSH)a 2-semanas de intervalo

31 OPU (2/semana) a intervalos de 2 y 3 días

21OPU (2/semana) a intervalos de 3 y 4 días

1.15.5MOET, superovulación retirando el Fol Dominante

15MOET, superovulación normal

0.230.7Ciclo natural, IA y flushing el Día 7

Por semanaPor sesión

Número de embrionesTratamiento antes de la colecta de ovocitos

Diámetro folicular y tasa de recuperación de ovocitos después de repetidas sesiones de OPU en vacas lecheras (Rizos et al. Datos no publicados)

1265.251.623.874.63010.00.00.00.716.383.1

873.6310.337.951.71960.00.00.511.225.562.8

1184.92022.977.12900.00.30.34.533.861.0

622.586.4543.5501841.10.54.313.034.846.2

TotalPor novillaZV*3-41-2n Total>1714-1611-138-105-72-4

Número de Ovocitos .

Grado Ovocitario(%)

Diámetro Folicular (mm), (%)

* zona pelúcida vacía

La aspiración al vacío se expresa nor malmente en milímetros de mercurio y varia ent re 40 y 400 mm Hg.

La aspiración exacta en la punta de la aguja depende de:

v la construcción del dispositivo de OPU

v la longitud y el di ámetro del sistema de tubos

v el diámetro de la aguja

Diseño Experimental

• Seleccionamos cuatro presiones al vacío diferentes

• Como control tomamos la aspiración manual con una aguja y una jeringa

• Los parámetros registrados para evaluar la capacidad de desarrollo de los ovocitos fueron: – Tasa de recuperación– Grado de ovocitos recuperados– Nº de blastocistos obtenidos

El aumento de presión al vacío baja la tasa de recuperación

0

10

20

30

40

50

60

70

%

% Recovered 69.4 68.2 60.3 52.2 65.4

30 50 70 90 Manual

a ab

c

a

5/22/2009

La producción de blastocistos decrece con el grado de los ovocitos

0

5

10

15

20

25

%

Bl. Yield 21.73 10.32 0.5 0.2

Class 1 Class 2 Class 3 Class 4

5/22/2009

Ovocitos de Grado 1

0

10

20

30

40

50

60

70

% of total recovered.

Class 1 61 42.3 27.1 17.7 57.5

30 50 70 90 Manual

a

b

c

a

d

Ovocitos de Grado 2

0

10

20

30

40

50

60

70

% of total recovered.

Class 2 25.4 35.5 31.3 29.1 26.3

30 50 70 90 Manual

ab ab a a

Ovocitos de Grado 3

0

10

20

30

40

50

60

70

% of total recovered.

Class 3 5.9 12.6 32.7 45.9 9.3

30 50 70 90 Manual

ab

c

d

b

Ovocitos de Grado 4

0

10

20

30

40

50

60

70

% of total recovered.

Class 4 7.7 9.6 8.9 7.3 6.9

30 50 70 90 Manual

a aa a a

Nº Blastocistos/Ovario decrece con la presión excepto a 50mm Hg

0

0.5

1

1.5

2

Blastocysts /ovary

Day 8 bl/ovary 1.33 1.88 0.67 0.37 1.44

30 50 70 90 Manual

a

a

b

a

b

Resumen

• Presión de 30-50mm Hg:n Aumenta la calidad del ovocito

n Aumenta la producción de blastocistos

• Presión de 70-90mm Hg:nDisminuye la tasa de recuperación

nDisminuye la producción de blastocistos

Conclusiones• Intervalo de sesiones: 3 – 4 días

• Pre estimulación con FSH: incrementa el numero de embriones obtenidos por sesión.

• Pre estimulación en gestantes: + 40 mg de FSH

• Técnico y técnica: incrementa la colecta de ovocitos

• Tamaño folicular mas adecuado: de 2 a 10 mm de diámetro

• Presión de aspiración óptima: de 30 – 50 mm Hg