Tecnolgico de MonterreyCampus Guadalajara

PCR en tiempo real con sonda TaqMan

Claudia Del Toro Runzer A01222071Sebastin Patio Valenzuela A01222331Francisco Andrs Robles Escoto A01133410Ricardo Hernndez Medina A01226072Vicente Pal Armenta Prez A01112119Ingeniera GenticaGrupo 1Dra. Clara Patricia Ros IbarraIntroduccinEl mtodo de PCR fue desarrollado por Kary Mullis en 1980. Esta tcnica permite generar millones de copias de un segmento especfico de DNA. Lo cual facilita la manipulacin del DNA tanto en prcticas comunes como la clonacin como en esfuerzos ambiciosos, como el Proyecto Genoma Humano. (Valasek y Repa, 2005). En 1992, Higuchi y sus colaboradores de Roche Molecular Systems y Chiron hicieron la primera demostracin de la PCR en tiempo real. Incluyeron un colorante fluorescente, bromuro de etidio (BrEt), en la PCR realizada bajo luz UV. Desde 1966 se saba que la fluorescencia del BrEt aumentaba al unirse a los cidos nucleicos, por lo que su adicin permiti a los investigadores video grabar y visualizar por primera vez la amplificacin en tiempo real. (Valasek y Repa, 2005; De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).En la PCR convencional es necesaria la preparacin de geles de agarosa para visualizar los amplicones a travs de una electroforesis y saber si la reaccin transcurri eficientemente. La PCR en tiempo real no solo omite este paso sino que permite una deteccin y cuantificacin ms sensible de los cidos nucleicos. (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013). Los agentes intercalantes fueron sustituidos por nuevos mtodos como las sondas TaqMan ya que detectaban acumulacin tanto de productos de PCR especficos como no especficos, adems de poseer un gran poder mutagnico y posiblemente ser cancergenos o teratgenos.As pues, la PCR en tiempo real con sondas TaqMan proporcionan una alternativa altamente especfica, rpida, sencilla y segura para cuantificar la cantidad de material gentico amplificado. El mtodo y fundamento de esta tcnica se explica a detalle ms adelante.

Diagrama de flujo

Diagrama 1. Proceso de PCR en tiempo real mediante sonda TaqMan

Glosario

apagador o quenchercolorante que se une al extremo 3' de la sonda y absorbe la seal del reportero cuando se sitan prximos entre s (Valasek y Repa, 2005)

Amplicnsegmento corto de DNA que resulta de la amplificacin

cebador o primersecuencia de oligonucletidos complementaria a la secuencia que se va a amplificar (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)

molde o templadocadena de DNA o cDNA que funciona como molde para la polimerasa (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)

PCRreaccin en cadena en la que se aprovecha una polimerasa de DNA para amplificar durante varios ciclos una secuencia especfica de DNA (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)

PCR en tiempo real (qPCR)variante de la tcnica de PCR en la que se detecta y cuantifica en tiempo real la amplificacin de cidos nucleicos gracias a la incorporacin de fluorforos en la reaccin (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)

Reporterocolorante que se une al extremo 5' de la sonda y emite una seal de fluorescencia cuando se separa del aceptor (Valasek y Repa, 2005)

sonda de hidrlisiscebador de DNA unido covalentemente a un fluorforo en cada uno de sus extremos (Bookout y Mangelsdorf, 2003)

Taq polimerasapolimerasa de DNA proveniente del microorganismo Thermusaquaticus, es una enzima termoestable que posee actividad exonucleasa de 5' a 3' (Holland et al, 1991)

transferencia de Frster (FRET)proceso de deslocalizacin de un estado de excitacin localizado entre una molcula reportera o donadora y un aceptor (Knox, 2012)

DiscusinEl principio se basa en la misma tcnica que una PCR convencional solo que la forma en detectar y analizar los productos es diferente. TaqMan cuenta con una sonda, la cual tiene dos tipos de fluorforos, cada uno colocado en un extremo de la misma. En el extremo 5 se encuentra el reportero (usualmente un compuesto de onda larga, como verde) y en el extremo 3, el apagador (usualmente un compuesto de longitud de onda corta, como rojo). El apagador reduce la fluorescencia del reportero mientras sigan los dos en la sonda. Esto lo logra gracias al fenmeno FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), el cual es una inhibicin de un tinte por otro sin emisin de un protn (Pierce, 2003).La sonda TaqMan est diseada para unirse a su seccin complementaria del DNA desnaturalizado. Una vez que la sonda se ha unido, el reportero contina sin fluorescencia ya que sigue unido al apagador. Ya que comienza la fase de alineamiento, los primers dan paso a la actividad de la Taq polimerasa. La enzima comienza a sintetizar DNA en direccin 5 3 hasta llegar al reportero, al cual corta gracias a la actividad exonucleasa 5 3 de la polimerasa Taq. Esto separa al reportero del apagador, por lo que el primero automticamente emite fluorescencia, la cual es cuantificada por una computadora (Pierce, 2003).Una vez que terminan los ciclos de la PCR de tiempo real y se obtienen las curvas de fluorescencia correspondientes a cada uno de los ciclos se debe proceder a interpretar los resultados obtenidos.En la curva de resultados se observa cada uno de los ciclos de PCR asociado a un valor correspondiente de fluorescencia. Se observa una lnea de base donde los valores por debajo de esa lnea no emiten fluorescencia significativa y por lo tanto corresponden a los valores basales. La lnea del umbral delimita los puntos en donde los valores de fluorescencia son significativos y corresponde al crecimiento exponencial de la grfica. El umbral es indispensable para calcular el ciclo umbral, el cual corresponde al primer punto donde se supera el umbral. Este valor es el que se utiliza para llevar a cabo la cuantificacin de material gnico. Normalmente la estimacin del ciclo umbral (CT) se realiza por los equipos de PCR-TR. Existen dos mtodos principales para realizar la cuantificacin de material gentico a partir de los valores de los CT: El primero de ellos consiste en realizar una curva de calibracin a partir de muestras estndar de concentracin conocida y una vez construida la curva de calibracin se extrapola el valor de CT experimental. El segundo mtodo de cuantificacin es el de CT en donde se comparan los CT del gen testado y el de referencia para cada muestra y posteriormente se comparan los CT de una muestra experimental y una muestra control (SGIker, 2014).Algunas de las ventajas de este mtodo es que es altamente especfico, ya que la seal fluorescente se genera slo cuando la sonda complementaria se une con su secuencia blanco para despus liberar el colorante reportero por la actividad exonucleasa. As mismo esta tcnica tiene capacidad de multiplexacin, las sondas pueden etiquetarse con diferentes colorantes (con distintos espectros) en la seccin reportera 5, por lo que es posible la amplificacin y deteccin de diferentes secuencias en un mismo tubo de reaccin. Otra ventaja es su alta capacidad de reproducibilidad ya que en la pgina de la empresa creadora y distribuidora de este producto, hay una amplia base de productos TaqMan especficos para diferentes experimentos. Los niveles de cuantificacin son altos y precisos adems no hay necesidad de llevar acabo procesos pos-PCR lo cual reduce costos y tiempo. No obstante, la sntesis de distintas sondas para diferentes secuencias hace que el diseo de las mismas sea complejo y con un costo algo elevado (Life Technologies, 2014).Existen mltiples aplicaciones de esta tcnica, puede ser til para la investigacin del cncer, para el descubrimiento y desarrollo de nuevos medicamentos, para estudios epigenticos, ciencia vegetal, por mencionar slo unas cuantas; sin embargo este mtodo es una herramienta directa para realizar estudios sobre: cmo, dnde y bajo qu condiciones ocurre la expresin gentica, qu la desencadena y qu la detiene; permite realizar cuantificacin de DNA; realizar estudios CHIP (inmunoprecipitacin de cromatina) los cuales son mtodos para el anlisis de las modificaciones epigenticas y secuencias de DNA genmico unido a protenas reguladoras especficas; permite cuantificar la cantidad de SNPs (polimorfismos de un solo nucletido) por discriminacin allica; proporciona una herramienta para la rpida deteccin de mutaciones, para el anlisis de protenas y es una novedosa tecnologa para el estudio de microRNA y ncRNA (no codificante), la cual es una nueva rea en la biologa molecular en la cual recientes experimentos demuestran su papel fundamental en la regulacin del genoma, y cmo los rasgos se pasan o se eliminan de generacin en generacin por factores ambientales (Life Technologies, 2014).

ReferenciasBookout, A. L. y Mangelsdorf, D. J. (2003). Quantitative real-time PCR protocol for analysis of nuclear receptor signaling pathways. Nuclear Receptor Signaling, 1. doi: 10.1621/nrs.01012De Dios, T., Ibarra, C. y Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigacin en discapacidad, 2(2): 70-78.Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson R. y Gelfand, D. H. (1991). Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizaing the 5' 3' exonuclease activity of Thermusaquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88(16): 7276-7280.INDRE. (2014, mayo 28). Departamento de Biologa Molecular y Validacin de Tcnicas. Recuperado el 3 de septiembre de 2014 e http://www.indre.salud.gob.mx/interior/coordinacion_diagnostico_molecular.htmlKnox, R. S. (2012). Frster's resonance excitation transfer theory: not just a formula. Journal of Biomedical Optics, 17(1). doi: 10.1117/1.JBO.17.1.011003Life Technologies. (2014). TaqMan Chemistry. Recuperado de http://www.lifetechnologies.com/mx/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/taqman-assays-vs-sybr-green-dye-for-qpcr.htmlPierce, D. (2003). Real-Time PCR: the TaqManMethod. Biology Davidson College. Recuperado el 4 de septiembre de 2014 de http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/pierce/realtimepcr.htmSGIker (2014). Anlisis de expresin gnica mediante PCR a tiempo real o q-pcr. Ehu.es. Recuperado el 3 de septiembre de 2014 de http://www.ehu.es/SGIker/es/expresion_geValasek, M. A. y Repa, J. J. (2005). The power of real-time PCR. Advances in Physiology Education, 29(3). doi: 10.1152/advan.00019.2005