Acta bioi. Colomb., Vol. 12 No.2, 2007 135 - 142

REPARACION DEL ADN:UNA POSIBLE RELACION ENTRE LA DEFICIENCIA

DE FOLATO Y LA MUERTE NEURONAL

DNA Repair: A Link Between Folate Deficiencyand Neuronal Cell Death

NELSONj. RAMiREZ', B.5c.; GONZALO ARBOLEDA', MD., Ph. D.;HUMBERTO ARBOLEDA', MD., M.5c.

'Grupo de Neurociencias. Universidad Nacional de Colombia.Sede Bogota, ciudad universitaria, Carrera 30 No, 45-03.AA. 14490. Bogota, Colombia.Autar Correspondencia: njramirezs@unal.edu.co'Departamento de Patologfa - Grupo de Neurociencias,Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia.Sede Bogota, ciudad universitaria, Carrera 30 No. 45-03.AA. 14490. Bogota, Colombia.'Departamento de Pediatrfa - Grupo de Neurociencias,Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia.Sede Bogota, ciudad universitaria, Carrera 30 No, 45-03.AA. 14490. Bogota, Colombia.Telefono: 316 50 DO, ext.11613. Fax: 316 55 26

Presentado 6 de diciembre de 2006, aceptado 28 de marzo 2007, correcciones22 de mayo de 2007.

RESUMEN

EIpresence articulo explora el papel que desempefta el folate como conocido merabo-lito del cic!o de un carbona (OeM, del Ingles one-carbon metabolism) en la altera-ci6n de la integridad de las celulas nerviosas. Aquf se discute evidencia recience de laliteratura que muestra la reparaci6n del ADN como un proeeso relacionado can laapoptosis neuronal inducida por ausencia de folate.

Palabras clave: apoptosis, metabotismo, ADN glicosilasas, deficieneia de acido folico,reparaci6n del ADN.

ABSTRACf

This essay explores the role of folate in disruption of neural cell integrity. Here, it isdiscussed recent evidence which shows DNA reparation as a process related toneuronal apoptosis induced by folate depletion.

Key words: Apoptosis, metabolism, DNA glycosylases, Folic Acid, DNA Repair.

136 Nota de reflexi6n - Reparaci6n del ADN: una posible retacicn entre la deficiencia de folatoy ta muerte neuronal. Ramtrer, er al.

INTRODUCCION

EI folate es la materia prima en el metabolismo de un carbo no (OeM, del ingles one-carbon metabolism), proceso implicado en la sfntesis y reparaci6n del ADN y diversasreacciones de metilacion.

EI folate adquirido en la dieta es la unica Fuente para los requerimientos del OCM, por10tanto variaciones en su ingesta afectan el balance de productos intermediaries, entreellos el aminoacido hornocistema conocido por sus efectos t6xicos en las celulas a altasconcenrraciones. Se cree que las alteraciones en el OCM conducen a apoptosis neu-ronal por diferentes vfas: (i) incrementando los niveles de homocistefna extracelular(Lipton, 1997; Ho et 01., 2002); (ii) alterando el proceso de metilaci6n (Ulrey et at.,2005) y (iii) influenciando la sintesis de ADN a traves de un desequilibrio en la pro-porcion de los precursores (Fenech, 2001). Los dos primeros representan procesospatologicos bien documenrados en disfunci6n neuronal y muerte celular. Sin embargo,en un estudio reciente (Krumann et al., 2004) es reportado el papel del desequilibrioen los precursores del ADN que ocurre en la alteracion del OCM y su relaci6n conapoptosis. Este desajuste consiste en el bloqueo de la sfntesis de purinas y timidina, 10cual conduce a la acumulaci6n de dUTP y al mismo tiempo a un incremento en laincorporaci6n errada de dUMP durante la replicaci6n y reparaci6n. EIestudio examinasi la supresi6n especifica de una glicosilasa de ADN (Uracil-DNA glicosilasa, UNG EC3.2.2.3) que corrige estos errores en el ADN, induce apoptosis neuronal.

En el primer conjunto de experimentos se muestra como el knockdown para laexpresi6n de UNG induce muerte celular en neuronas hipocampales embrionarias derata. Es interesante como despues del usa de Oligonucleotidos Antisentido (ASO, delingles anti-sense oligonucleotide) para disminuir la expresi6n de la UNG humana porpocas horas (3-9 h), el numero de neuronas continua disminuyendo aun cuando losniveles de proteina (immunoblot) y mRNA (RT-PCR) fueron recuperados despues de12 h. Esto quizas indica que las caspasas fueron inducidas y asf la muerte celularocasionada fue un proceso irreversible. EI uso de la tecnica de ARN de interferencia(RNAi) como una aproximaci6n alterna a la tecnica ASO deberfa ser considerada. Apesar de que no hay diferencias significativas entre metodologfas para la regulaci6n ala baja de un gen (Scherer y Rossi, 2003; Tachikawa et al., 2006), el RNAi presu-miblemente toma ventaja de la maquinaria celular espedficamente disefiada para unainhibicion selecriva del proceso de trascripci6n del gen escogido; en contraste, ASOactua por difusi6n hacia su blanco 10que implica un incremento en la sonda a usarseyen la probabilidad de efectos inespedficos.

EI segundo conjunto de experimenros investiga la validez de la siguiente hip6tesis: "lainhibici6n de la expresi6n de la UNG causa muerte celular del tipo apoptosis en estosmismos cultivos neuronales". De los experimentos con el inhibidor de caspasas deamplio espectro z-VAD-fluorometil cetona (zVAD), es posible verificar la implicaci6nde estas protefnas efectoras del proceso apopt6tico ya que el inhibidor produce unaatenuaci6n considerable en los efectos t6xicos de los antisentidos (AS) para UNG.

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Estes resultados sugieren que la apoptosis es el mayor evento involucrado en neu-ronas UNG-suprimidas. Adicionalmente, Ia roxicidad de los AS debido a union conblancos inespecfficos no es apreciable cuando las caspasas son inhibidas a al men osesa toxicidad esta bajo el control de caspasas.

La evaluaci6n de la acumulaci6n de p53 en neuronas despues de la inhibici6n de laexpresi6n de UNG fue el objetivo en el siguienre grupo de experimentos. Modifi-caciones post-trasduccionales son responsables de la estabilizaci6n de p53, que juegaun papel crftico en la mediaci6n del arresto del cic!o celular, la reparaci6n del ADN yel proceso apopt6tico. La fosforilaci6n de p53 en la serine 15 es el evento de esrabifi-zaci6n analizado en este conjunto de experimentos, mostrando que la apoptosisinducida por AS para UNG es inducida por un mecanismo dependiente de pS3. A esterespecto un anal isis complernentario ace rca de las diferenres form as de regulaci6n depS3 (metilaci6n, acetilacion, sumoilaci6n 0 fosforilaci6n en otros residuos) podrfa serinteresante (Appella y Anderson, 2001). Por ejemplo la metilaci6n de p53 es un buencandidate, resaltando que la adici6n de grupos metilo es un proceso que se encuentraalterada cuando hay anornahas en el OeM. La actividad de metiltransferases sabrepS3 afectando de manera positiva su estabilidad fue reportada recientemente(Chuikov et al., 2004). Un knockout transgenico para pS3 confirrno que la protefna esnecesaria para inducir apoptosis neuronal bajo la supresi6n de UNG; pero sin em-bargo el knockout y los experimentos de inhibici6n de pS3 no evaluan la estabilizacionadicianal de pS3 previameme discutida. Adicionalmente, existe controversia al res-pecto de la efectividad de la inhibicion de p53 par Pifithrin (Kamarova et at., 2003;Murphy et al., 2004; Walton et aI., 2005), compuesto utilizado en los experimentos deinhibici6n. A pesar de estas observaciones es claramente demostrada la mediaci6n dep53 en la apoptosis producida por regulaci6n a la baja de UNG.

EI ensayo del cometa y el ensayo de inhibici6n de la poliADP-ribosa polimerasa (PARP,EC2.4.2.30) fueron las tecnicas usadas para la evaluacion en el dana del ADN comauna causa de la apoptosis neuronal en neuronas reguladas a la baja para UNG. EIdana en el ADN es evidente al microscopio debido a la apariencia similar a un cornecadel ADN en neuronas expuestas a AS. En otro articulo (Kruman et at., 2000), el mismogrupo de investigacion habra reporrado previamente una secuencia de evemas cuandoocurre activaci6n de las vras apapt6ticas par homocisteina; esta progresi6n tienediferentes eta pas comenzando con dana en el ADN, activaci6n de PARP,activaci6n decaspasas y activaci6n de p53 siguiendo can una disminuci6n en el potencial de mem-brana mitocondrial y terminando can desintegraci6n nuclear. Alii es reportado unincremento en la muerte por necrosis, cuanda hay inhibici6n de caspasas, en neuronashipocampales tratadas con homocistefna. Este hecho fue explicado par un incrementoen la activaci6n de PARP, enzima que es clivada por caspasas en la muerte celularapopt6tica, produciendo depleci6n de ATP y necrosis. Sin embargo, no se puedeexcluir que la hamacisteina puede causar la muerte de las neuronas por un mecanismoapopt6tico independiente de caspasas. En neuronas suprimidas para UNG la sobre~vida no estuvo afectada significativamente por el misma inhibidor de caspasas (zVAD),la cual es acorde con un papel neurotoxico de la homocisterna.

'38 Nota de reflexion - Reparadon de/ ADN: una posible reiacion entre /0 defiaenoa de totatoy /0 muerte neuronal. Ramree, et al.

La demostraci6n de como la alteracion del OCM afecra la expresion de UNG in vivofue Ilevada a cabo usando un knockout para la Cistarionina-Beta-Sinrasa (CBS, EC4.2.1.22), un modele de hiperhomocisteinemia asociado con incremento enincorporaci6n anornala de dUMP en el ADN via disminuci6n de las reservas de dlTP.Cam bios en la expresi6n de la UNG en cerebro y timo comparando ratones CBSsilvestres y knockouts representan las observaciones mas inreresanres. La UNG, que esnormalmente expresada a altos niveles en timo debido a su alto potencial prelife-rativo, fue indetectable en el knockout para CBS. En contraste, la expresi6n de la UNGen el cerebro fue alta en el rnutante e indetectable en el silvestre. En celulas mitoticas,la interpretacion de 105 resultados es que la hiperhomocisteinemia severa y laalteracion del OeM bloquean la sfntesis de precursores de ADN, 10 cual resulta en lainhibici6n de la actividad de proliferaci6n en los tejidos del raton knockout. Ya que laexpresion de la UNG esta bajo el control del ciclo celular y esta asociada con lamaquinaria de replicacion del ADN la supresi6n de esta maquinaria puede regular ala baja la expresi6n de la UNG. En el caso de las celulas post-rnitoticas, entre elias lasneuronas, la regulaci6n a la alta de la UNG en estos knockouts es posible si esteproceso sirve como un mecanismo compensatorio en el cual las celulas intentanactivar un mecanismo de reparacion especffico cuando la incorporaci6n anomata deuracilo es elevada. Otro esrudio en neuronas embrionarias de rata (Vinson y Hales,2002) mostr6 que la exposicion de esras a metotrexato, una sustancia que inhibe elOCM e incrementa los niveles de homocisteina, incrementa los transcriptos de UNG(30-40%) despues de 6h de cultivo con 0,5 IJM de metotrexato; sin embargo, la expre-sion y la actividad de la protefna no fue afectada. Con esta evidencia, 105 experi-mentos deben ser probados en otros modeJos can alteraci6n del oeM (Ernest et al.,2002), con el fin de verificar si existe un cambia real en el nivel de la prcrefna UNG 0

en su actividad. La exposicion a metotrexato de celulas pragenitoras neurales C17.2rnostro eJ impacto sobre el OCM y sabre el balance de los precursores del ADN, yadicionalmente muestra una conexion entre alteraci6n del OCM e inhibicion de laactividad proliferativa de las celulas in vitro. EI resultado puede ser un poco confusodebido a que el metotrexato incrementa los niveles de homocisteina y desencadenavias apopt6ticas y no apopt6ticas en las celulas como fue previamente discutido,enmascarando asi el efecto sabre la sintesis de.ADN y la proliferaci6n.

La importancia de la UNG en la sobrevida neuronal es demostrada por al menos otrosdos estudios (Endres et 01., 2004; Imam et 01., 2006), pero hay algunas pregumas aunsin responder relacionadas al papel de la UNG y otras glicosilasas en el cerebro. EIknockout para UNG sobrevive hasta la adultez y no exhibe un incremento desmesuradoen la frecuencia de mutaciones espontaneas (Nilsen et al., 2000); esto podrfa serexplicado par la presencia de SMUGl (del ingles, single-strand selective monofunctionaluracil DNA glycosylase EC 3.2.2.-) otra uracilo ADN glicosilasa que substituye la aeti-vidad en ratones deficientes en la UNG (Nilsen etal., 2001; An etal., 2005). Entonces,2Que ocurre con SMUGl en neuronas hipocampales?, 2Existe otra ADN glicosilasa,aparte de aquellas idemificadas hasta ahora (Lindahl y Wood, 1999) que puedansustituir la actividad de UNG en el cerebro?, 2Estan las demas uracil-DNA glicosiJasareguladas a la baja en neuronas?

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Los estudios acerca de la UNG complementan el punta de vista de los autores canrespecto a la asociacion entre la neuradegeneraci6n y la activacion de la maquinariadel ciclo celular en neuronas post-rnitoticas (Kruman et al., 2004). Una de las pre-misas sobre la cua! esta tesis esta basada, es la interacci6n entre los facto resinvolucrados en la reparaci6n del ADN y las protefnas que se conoce estan asociadascan la maquinara de replicacion del ADN. Esra teorfa y otras, tales como la queplantea neurogenesis en el cerebra (Scott y Hansen, 1997), han comenzado a des-cubrir un nuevo campo de investigacicn cuyo estudio explora e! ciclo celular en elsistema nervioso central adulto.

La importancia del estudio de la alreracion en el OCM esta sustentada por la aparici6nde des6rdenes neurologicos en humanos tales como defectos del tubo neural (Wald,2005; Blom et al., 2006; Dunlevy et al., 2007), enfermedad de Alzheimer (Luchsinger yMayeux, 2004; Meeks et al., 2006), y aquellos relacionados con e! sfndrome de Down(Filion-Emery, 2004; Gueant et at., 2005); asf, el ciclo ceiular y I. reparacidn del ADNpodrfan estar mas asociadas de 10 anreriorrnenre pensado a parolcgtas neurodegene-rativas y/o del neurodesarrollo.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la International Brain Research Organization y a! VenezuelaNeuroscience Course 2005: "Brain-Environment Interactions" por brindar el contexteacadernico para desarrollar las ideas aca plasm ad as.

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