HPLC 2 10/96 1

Cromatografía de alta presión: esquema

Reservoriodesolventes

Bomba

Medidor depresión

Inyector

ColumnaDetector

Desecho

Registrador

Sistema de datoso integrador

HPLC 2 10/96 2

PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL

• Disuelve la muestra

• k' de 2-10

• Alta pureza

• Costo, viscosidad, toxicidad, punto de ebullición

HPLC 2 10/96 3

SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS

•FASE NORMAL – hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo

•FASE REVERSA - metanol/agua,acetonitrilo/agua

•INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso

•PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano,tolueno, cloroformo

HPLC 2 10/96 4

FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL

A VACÍO

DISOLVENTE

FILTRO DE 2m

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RAZONES PARA FILTRAR

FUGAPARTÍCULA

VÁLVULA CHECK

PARTÍCULA

ARAÑAZOS

PISTÓN

BOMBA

• Filtrar el disolvente es esencial en HPLC!

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FILTRACIÓN DE LA MUESTRA

Filtro

Émbolo

10ml jeringa

0.5 m Filtro

Malla desoporte

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REQUISITOS DE LAS BOMBAS

1. Químicamente inerte

2. Alta presión (5,000 PSI)

3. Flujos (0.5 - 10 ml/min)

4. Libre de pulsos o amortiguada

5. Reproducibilidad de flujo <1.0%

6. Gradiente, cambio rápido de disolvente

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Materiales de construcción /compatibilidad con disolventes• Completamente resistentes:

Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez, Fluoraz

• Resistencia limitada:Acero Inox. 316 – Cloruros acuosos ácidosPEEK – Ácidos nítrico o sulfúrico conc.Kel-F – disoluciones de THF, hidrocarburoshalogenados Acetal – Ácidos o bases fuertes

HPLC 2 10/96 9

TIPOS DE BOMBAS

• Pistón reciprocante (las más comunes)

• Pistón reciprocante de doble cabeza

• Bombas de jeringa (más empleadas en SFC y micro HPLC)

HPLC 2 10/96 10

Bombas de pistón reciprocante

Reservorioexterno

Motor

ValvulasCheck

Pistón

Cámarahidráulica

Cam

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Bombas de pistón reciprocante de doble cabeza

• Mejor estabilidad de flujo que las de una cabeza...• ...produce una línea base más estable

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VALVULAS CHECK DE HPLC

Válvula de bola de salida

Válvula de bola de entrada

Pistón

A la columna

Del reservorio

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BOMBAS DE PISTÓN RECIPROCANTE

VENTAJAS

• Baratas

• 6000 psi

• Reservorio externo

• Diseño mecánico simple

LIMITACIONES

• Ruído de pulso

• Mantenimiento, sello de las válvulas

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BOMBAS DE JERINGA

MOTOR

PISTÓN

GUÍA Y ENGRANE

SELLOS

DISOLVENTE

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20

16

12

8

4

0

0 1 2 3 4 5 6 7

20

16

12

8

4

0

0 1 2 3 4 5 6 7

% S

olve

nte

B

% S

olve

nte

BTIEMPOTIEMPO

ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE

• En HPLC Isocrático, la composición de la fase móvil permanece igual durante el análisis

• En HPLC Gradiente, la fuerza de la fase móvil se incrementa con el tiempo de análisis.

HPLC 2 10/96 16

1

2

34 5

6

7

0 20 40 60 80 min 0 20 40 60 80 min

1

2

3

4 5

6

7

COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICAY GRADIENTE

ELUCIÓN ISOCRÁTICA ELUCIÓN GRADIENTE

BIFENILOS CLORADOS

50% Metanol50% Agua

20% MeOH / 80% H2Oa

75% MeOH / 25% H2O

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FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA PRESIÓN

Bomba

Bomba

Programador

A

BBomba

Programador

Bomba40:60 90:10

0.4 ml/min

0.6 ml/min

0.9 ml/min

0.1 ml/min

CámaraMezclado

De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B

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FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA PRESIÓN

A B C

Reservorios de disolventes

Programador Válvula Multipuertos

Cámara deMezclado

A LA BOMBA DE HPLC

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OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN

CARGA INYECCIÓN

DE LA BOMBA

A LA COLUMNA

RIZO DEMUESTRA

JERINGA

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ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y GUARDA-COLUMNA

VÁLVULADE

MUESTREO

GUARDA-COLUMNA

COLUMNAANALÍTICA

DETECTOR

PRECOLUMNA

BOMBA

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CONEXIONES PARA HPLC

UPCHURCHWATERS

SWAGELOK

PARKER

VALCO

RHEODYNE

"X"

Distance "X" is critical i n obtaininga low-volume, leak-free seal...

...and varies greatly from onemanufacturer to another.

1. "X" is too long: leaks inevitable2. "X" is too short: adds to extracolumn volume

1. 2.

.130

.090

.090

.090

.080

.170

WATERS UPCHURCH PARKER

WATERS UPCHURCH PARKER

SWAGELOK VALCO RHEODYNE

.320 .250 .210

HPLC 2 10/96 22

CONSTRUCCIÓN DE COLUMNASDEL

INYECTOR2 m FRITADO

POROSO

• LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm• I.D.: 4 or 4.6 mm• ACERO INOXIDABLE• partículas 3, 5, 10 m

AL DETECTOR

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COLUMNAS CARTUCHO

CARTUCHO

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LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP

MUESTRA :0.1 mg in 10 µl 50 mg in 2 ml

COLUMNA :4.6 x 150 mm 10 x 250 mm

FLUJO :1 ml/min 10 ml/min

DETECTOR :Alta sensibilidad, PDA Baja sensibilidad, RI

ANALÍTICA SEMI-PREPARATIVA

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CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC

• TERMOSTATADO DE COLUMNA – Áreas de pico y tiempos de retención más reproducibles.

• CALENTAMIENTO DE COLUMNA :

1. Menor viscosidad, menos presión.

2. Menor coleo de pico, desorción más rápida.

3. Usualmente menor selectividad.

HPLC 2 10/96 26

EFECTO DEL CONTROL DE TEMPERATURA EN LA SEPARACIÓN

40°C

65°C

0 5 10 min

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DETECTORES DE HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) • Longitud de onda fija• Longitud de onda variable • Arreglo de diodos

INDICE DE REFRACCIÓN

FLUORESCENCIA

ELECTROQUÍMICA

MS / FTIR / Conductividad/MS

HPLC 2 10/96 28

SISTEMAS DE DATOS

INTEGRADORES. Fácil de usar

. Precio moderado

COMPUTADORA. Flexible, poderosa

. Cara

1.235

1.235

1.235

1.235

1.235

HPLC 2 10/96 29

CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR

RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11 SAMPLE# 2AREA% RT AREA TYPE WIDTH AREA% 1.235 22353 VB .060 .16530 1.679 10700 BB .105 .07913 3.197 1761694 PV .095 13.02755 3.289 821053 VB .077 6.07160 4.315 690054 BB .120 5.10288 5.540 639889 BB .157 4.73191 6.235 31558 BB .196 .23337 11.075 9545536 BB .338 70.58825

TOTAL AREA=1.3523E+07MUL FACTOR=1.0000E+00

* RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11

START

1.2351.679

3.1973.289

4.315

5.5406.235

11.075

STOP

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VALORES TÍPICOS PARA HPLCCOMPONENTE VALOR TÍPICO INTERVALOEMPAQUE

Tamaño partícula 10 y 5 m 3 - 10 mTamaño de poro 80 y 100 Å 60-120 Å, hasta 4,000 Å

COLUMNADiámetro Int. 4.6 mm 2 - 5 mmLargo 15 y 25 cm 3 - 30 cm

BOMBAPresión 1500 psi 800 - 5000 psiFlujo Volumétrico 1 ml/min 0.5 - 2 ml/minFlujo lineal 0.1 cm/sec 0.05 - 0.2 cm/sec

MUESTRAVolumen 20 l 2 - 100 l Concentración 0.1 % 1 ppm - 1 %

DETECTORVolumen de celda 5 l 2-15 l to 200 l Constante de tiempo 50 msec 25 msec - 1 sec