reflexiones sobre el procesamiento de muestras...
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Reflexiones sobre el procesamiento de
muestras biológicas
Luzia CaputoSupervisora del Sector de Histotecnología
Laboratorio de PatologíaInstituto Oswaldo Cruz - Fiocruz
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Procesamiento
¿Qué es procesamiento de una
muestra biológica?
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Objetivo del Procesamiento
• Muestra de tejido Rígida, dura.
1720 (Leeuwenhoek) - Secado de los tejidos
Ebullición (evaporación del agua)
Uso de ceras (carnauba, abeja) - períodos posteriores
1842 Benedict Stilling - Congelado
1869 - Albrecht Theodor Edwin Klebs - Parafina (sin
impregnación) – evaporación (sin clarificación)
Paul Mayer – lo perfeccionó a lo que es hoy.
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Diversidad de Muestras x Protocolos
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I. Diversidad de formas de obtención de muestras.
II. Diversidad de profesionales recogiendo;
III. Diversidad de líquidos fijadores;
IV. No existe estandarización de protocolo de recojo y
fijación en diversos contextos hospitalarios, mucho
menos cuando se tratad de tiempo de fijación, intervalo
entre el recojo y la fijación y apertura o corte de las
muestras para penetración de la fijación.
Variables preanalíticas
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Errores de Fijación/Procesamiento en el 2003-2004
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La naturaleza del Procesamiento está
directamente relacionada a:
Al tipo de medio de inclusión utilizado.
A la especie animal en cuestión.
Al tipo de tejido, tamaño y consistencia,
Al tipo de fijador y descalcificador empleado
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I - Medios de inclusión de tejidos:
¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?
Morfología - HE
Biomoléculas – CE, HQ, IHQ , ISH,
CISH
Elementos inorgánicos
Microorganismos
Ultraestrutura
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• Microscopía de Luz (fluorescencia común, fluorescencia
confocal, campo claro, contraste de fase, microscopía
de interferencia de Nomarski, polarización)
• Microscopía Electrónica¿C
óm
o?
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La naturaleza del Procesamiento está
directamente relacionada a:
Al tipo de medio de inclusión utilizado.
A la especie animal en cuestión.
Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.
Al tipo de fijador y descalcificador empleado.
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II- Origen de la muestra
¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?
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A natureza do Procesamiento está
diretamente relacionada:
Al tipo de medio de inclusión utilizado.
A la especie animal en cuestión.
Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.
Al tipo de fijador y descalcificador empleado.
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III- Tipo de tejido
• Densidad/Consistencia (Espacios intersticiales / permeabilidad)
• Tamaño
¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?
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Difusión:
Es el movimiento de los liquidos a través de lostejidos, a veces más rápido en unas direcciones queen otras.
La velocidad de difusión
dependerá de la consistencia
del tejido, de los espacios
intersticiales y del tamaño de
la muestra.
Naturaleza diferente
tamaño diferente
forma diferente
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La naturaleza del Procesamiento está
directamente relacionada a:
Al tipo de medio de inclusión utilizado.
A la especie animal en cuestión.
Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.
Al tipo de fijador y descalcificador empleado.
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Fijadores que necesitan del tratamiento post Fijación:
Zenker, B-5, Orth, Helly –cloreto de mercurio
Carnoy, Metacarn, Clarke.
Bouin, Rosman :
Fijadores tamponados con sales de fosfato – Lavar en agua
corriente por 1 hora e iniciar la deshidratación a partir de
Etanol al 65% - precipitación de las sales de fosfato.
Fijador utilizado
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Etapas del Procesamiento Histológico
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Características de los reactivos empleados
en el Procesamiento histológico
1. Miscibilidad:
2. Viscosidad:
3. Polaridad
4. Concentración de los reactivos
5. Tasa de evaporación.
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Medios de Inclusión
• Procesamiento Resinas hidrofóbicas – ME (Spurr, LR-White,Epon....);
• Procesamiento con Resinas Hidrofílicas – semi-finos 0,5µ -3µ (Historesinas, JB-4, Metacrilato, GMC);
• Nitrocelulosa;
• Celoidina (nitrocelulosa de baja viscosidad)
• OCT (sustancia crioprotectora);
• Gelatina;
• PEG 200 a 4000 o carbowax;
• Parafina.
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Parafina
No es miscible en agua ni en lamayoría de Fijadores acuosos yalcohólicos;
Necesita procedimientos previosa la infiltración.
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Etapas del Procesamiento
I- Deshidratación
1. Por difusión. (Aumento de las concentraciones)
2. Por deshidratación química: Ej.: Dimetoxipropano y
dietoxipropano. (El Deshidratante es hidrolizado por
el agua de los tejidos que forman acetona y metanol
en una reacción endotérmica).
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Características de un deshidratante ideal:
• Ser rápido,
• No endurecer el tejido,
• No evaporarse rápidamente,
• No remover los colorantes de los márgenes,
• No ser tóxico,
• Riesgo reducido de inflamabilidad y explosión.
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Deshidratación
Excesiva
Endurecimiento exagerado del
tejido
Incompleta
Perjudica la penetración del
clarificador
Biopsias x Piezas quirúrgicas
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La deshidratación de los tejidos es la etapa más importante durante el
Procesamiento, ya que si el agua no fuera removida de forma adecuada,
el resto del Procesamiento, se impedirá la difusión completa del
clarificador (xilol) hacia el interior de los tejidos y con esto se perjudica la
impregnación de la parafina no permitiendo la completa infiltración de la
parafina hacia el interior de las muestras.
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Etapas del Procesamiento Histológico
II- Clarificación o Diafanización:
• Ocurre entre la deshidratación y la infiltración por la parafina.
• Se utilizan reactivos solventes a los agentes deshidratantes y a los
medios de inclusión.
• Recibe este nombre debido a que el tejido está translúcido debido
al alto índice de refracción de los solventes utilizados,
aproximándose del índice de refracción de las proteínas del tejido.
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Elección del Reactivo Clarificador:
Rapidez en la remoción del agente deshidratante;
Provocar el menor daño posible al tejido;
Riesgos ofrecidos;
Costo ($);
Fácil remoción de la parafina, caso fuera necesario;
Viscosidad.
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III- Infiltración
• Los tejidos son saturados u ocupados por el
medio de inclusión.
• Debe garantizarse que no haya más agua ni
alcohol en el tejido.
Etapas del Procesamiento Histológico
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Propiedad de la parafina:
- Varía de acuerdo con la cantidad de polímeros y punto de fusión;
Punto de fusión de acuerdo con la densidad del tejido;
Aditivos que aumentan o disminuyen el punto de fusión
de la parafina. (cera de abeja, estearina, cera de
carnauba...)
Naturaleza de la Parafina
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Condiciones de Procesamiento
•
Agitación
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Calentamiento
Condiciones de Procesamiento
• Temperatura Baja: ¡POCO UTILIZADO!
• Temperatura ambiente: Depende del país. ¡Normalmentefunciona muy bien en Brasil y en países tropicales!
• Temperatura Alta: Disminuye la viscosidad de los reactivos.
• OBS.: En temperaturas de aproximadamente 65°C ocurreretracción de las fibras de colágeno, y el consecuenteendurecimiento excesivo de tejidos fibrosos.
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Vacuo (Presión Negativa)
Condiciones de Procesamiento
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Tiempo
Condiciones de Procesamiento
Los protocolos varían según:
• El tamaño del espécimen;
• Tipo de reactivo utilizado;
• Especie (humana, ratón de laboratorio, molusco, insecto,vegetal);
• Propiedades de los tejidos (ojo, diente, uña, cuerno, pico);
• Presencia de vacuo;
• Temperatura durante el Procesamiento.
Calidad X Urgencia
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Paso Etapa Reactivo Tiempo
1 Deshidratación Etanol 60% 1 h
2 Deshidratación Etanol 70 % 1 h
3 Deshidratación Etanol 80 % 1 h
4 Deshidratación Etanol 90 % 1 h
5 Deshidratación Etanol 95 % 1 h
6 Deshidratación Etanol 100% 1 h
7 Deshidratación Etanol 100% 1 h
8 Deshidratación Etanol 100% 1 h
9 Clarificación Xilol I 1 h
10 Clarificación Xilol II 1 h
11 Impregnación Parafina I 1 h
12 Impregnación Parafina II 2 h
Protocolo de Procesamiento Estándar
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Tejido Nervioso
ESQUEMAS DE PROCESAMIENTO
Laboratorio de neuropatologí de la AFIP
ReactivosENCÉFALO
(BEBÉ)
ENCÉFALO
(ADULTO)
CORTES
MONTADOS
ENTEROS
FRAGMENTOS
DE NERVIOS Y
MÚSCULOS
Etanol a 70% 24h --- 24h 30min
Etanol 80% 24h 24h 24h 30min
Etanol 95%
(3x)2h cada 2h cada 8h cada 15min cada
Etanol
Absoluto (3x)2h cada 2h cada 8h cada 15min cada
Etanol-Xilol 2h 2h 8h 15min
Xilol (2x) 2h cada 2h cada 8h cada 15min cada
Parafina b
(3x)c
2h cada 3h cada 8h cada 15min cada
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Hueso temporal
ESQUEMA DE PROCESAMIENTO MANUAL PARA EL HUESO
TEMPORAL
1. Etanol etílico 80%, 3 cambios, 24 horas cada.
2. Etanol etílico 95%, 2 cambios, 24 horas cada.
3. Etanol etílico 100%, 2 cambios, 24 horas cada.
4. Etanol etílico 100% + éter etílico 100% (1:1), 2 cambios, 24
horas cada a.
5. Nitrocelulosa (celoidina) 6%, tiempo mínimo, 3 semanas.
6. Nitrocelulosa (celoidina) 12%, tiempo mínimo, 3 semanas.
7. Nitrocelulosa (celoidina) 20%, tiempo mínimo, 3 semanas.
8. Nitrocelulosa (celoidina) 30%, tiempo mínimo, 3 semanas.
9. Nitrocelulosa (celoidina) 35%, hasta volverse firme b.
Procesar especímenes en celoidina involucra el uso de
ingredientes altamente explosivos.
Asegúrese de que los equipos eléctricos y otras instalaciones
cuenten con cable a tierra, no hayan chispas, llamas prendidas,
etc. Prepare bajo capilla.
b La consistencia es similar a la de una gelatina firme.
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Ojo
Reactivo Tiempo
Etanol 70% - Fenol 4% 1 hora
Etanol 95% - Fenol 4% 1 hora
Etanol 95% 1 hora
Etanol 95% 1 hora
Etanol Absoluto 1 hora
Etanol Absoluto 1 hora
Etanol Absoluto 1 hora
Etanol Absoluto /Xilol 2 horas
Xilol 2 horas
Xilol 2 horas
Parafina I 2 horas
Parafina II 3 horas
Posee ≠s densidades / Algunos autores recomiendan descalcificar y/o procesar para inclusión de resinas.
Clorofomo
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Diente
• Descalcificar y procesar normalmente de acuerdo a los
protocolos específicos...
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Piel, pelo y uña
• Piel muy queratinizada = ablandar con Fenol al 4%.
• Procesar = ojo
Uña
• Formol al 10%, conteniendo ácido tricloroacético al 5%.
• Fijado pelo formol 10% e amolecer pelo ácido nítrico 5%
• KOH al 20%, calentado a 56°C por 15 minutos
• Solución acuosa al 10% de Tween 40 por 24 horasantes de la Fijación
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Cuernos, cascos de patas y picos de aves
Sustancias ablandadoras:
• Hidróxido de Amonio;
• Ácido Sulfúrico;
• Ácido Nítrico;
• Formol al 10%, conteniendo ácido tricloroacético al 5%;
• Fijar con formol al 10% y ablandar con ácido nítrico al 5%;
• KOH al 20%, calentado a 56°C por 15 minutos;
• Solución acuosa al 10% de Tween 40 por 24 horas antes de la Fijación.
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Insectos - Quitina
Remover quitina.
• Ácido acético en soluciones Fijadoras (10%);
• Fenol al 4% en Etanol absoluto por 24 horas
• Ácido nítrico…
Enzima (quitinasa) diluida de un hongo (?) a 37o C por 4 semanas (métododescrito por Carlisle (1960)
Procesamiento con alcohol butílico o isobutílico. (Karl A. Stiles, Normal ButylAlcohol Technic for Animal Tissues with Special Reference to Insects 1934,Vol. 9, No. 3 , Pages 97-100 )
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Esponjas de mar- sílica
• Remoción del sílice con ácido
fluorhídrico al 4% por 8 horas.
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Helmintos y moluscos
• Después de la fijación y deshidratación clarificar en
butanol a dos cambios de 6 horas cada uno
(dependiendo del tamaño).
• Infiltrar en parafina (2 x 2 horas).
El butanol deshidrata y clarifica sin endurecer
excesivamente.
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REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO
etanol 70% 1h
etanol 95% 1h
etanol 99% 1h
etanol 99% 1h
etanol 99% 1h
etanol 99% 1h
etanol 99% 1h
REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO
etanol 20% 30 minutos
etanol 30% 30 minutos
etanol 50% 30 minutos
etanol 70% 30 minutos
etanol 95% 30 minutos
Procesamiento
semimanual
COMPARACIÓN DE LOS PROCESAMIENTOS
SEMIMANUAL Y AUTOMÁTICO
DE MOLUSCOS PARA ANÁLISIS HISTOLÓGICO
Luzia de Fátima Gonçalves CaputoEster Maria Mota
Pedro Paulo de Abreu MansoAndréa Natividade da Silva
Procesamiento
Automático convencionall
REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO
Butanol 100% 30 min.
Butanol 100% 40 min.
Butanol 100% 1h
REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO
xilol 100% 1h:30min.
xilol 100% 1h:30 min.
REACTIVO TIEMPO
parafina 30 min.
parafina 1 h
REACTIVO TIEMPO
parafina 1h
parafina 1h
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Procesamiento
semimanual
Procesamiento
convencional
RESULTADOS
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Artefactos de
Procesamiento
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Mala impregnación
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Material quemado
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Contaminación de reactivos
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Deshidratación excesiva
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Errores de Fijación/Procesamiento en el 2003-2004
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