UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PANAMÁ

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

LICENCIATURA EN INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Microbiología de Alimentos

Informe #4

“Recuento de aerobios mesófilos y coliformes en queso fresco molido”

PROF. DE TEORÍA

PROF. ASISTENTE DE LABORATORIO

PREPARADO POR:

Introducción

El queso es el producto resultante de la concentración de los nutrientes solidos de la leche, para lograrlo es necesario separar los compuestos sólido, esto se obtiene “cuajando” la leche con sustancias acidas o con otras conocidas como cuajo, producido en el estómago del ternero lactante o generado por algunos microorganismos.

La composición de la leche es definitiva para fabricación de queso, por esta razón es muy importante evitar las contaminaciones con microbios que disminuyen los nutrientes naturales.

Para elaborar queso de buena calidad es requisito fundamental que la leche cruda sea de buena calidad, se debe dejar reposar dos horas antes de iniciar el proceso, para que adquiera la capacidad de acidificarse y permitir un buen “desuerado”, y además garantice que no hay residuos de antibióticos y pesticidas.

El queso al igual que todos los productos lácteos deben ser protegidos de la acción de la luz, aire, microorganismos e insectos por ese se recomienda que sean empaquetados en materiales plástico como láminas de polietileno.

En esta práctica se usará el método de recuento en placa por vaciado, usando como medio selectivo diferencial el agar bilis rojo violeta (ABRV) para realizar el recuento en queso fresco molido y el agar plate count (APC) es recomendado para la determinación y recuento de microorganismos en alimentos, aguas y aguas residuales. Esto son procesos de rutina dentro de la industria para la detección de este tipo de microorganismos.

Objetivos específicos

Evaluar la calidad higiénica de una marca de queso fresco molido en cuanto a Recuentos totales de Aerobios y Coliformes totales.

Evaluar la temperatura de refrigeración de la nevera del súper mercado de donde se trajo la muestra, la cual debe ser transportada en hielo.

Identificando el tiempo en que sí mantuvo la cadena de frío y el tiempo en que fue suspendida.

Aplicar el método de vertido en placa en ABRV y la siembra en placas de Petri film para aerobios.

Antecedentes

Un Queso fresco prensado es un producto lácteo obtenido por la coagulación de la leche pasterizada por la acción del cuajo y la eliminación parcial de lacto suero. El producto debe ser empacado en bolsa plástica grado alimentario. El rotulado debe cumplir con los requisitos establecidos en el RTE INEN 022 y el etiquetado debe cumplir con las norma de la FDA.

La Norma NTE INEN 1528:2012 establecida para los quesos frescos es la que usaremos de referencia. La carga microbiológica del queso fresco prensado no podrá contener microorganismos en número mayor a lo especificado en la tabla 1:

Microorganismos n(1)

c(2)

m(3) M(4)

Staphylococcus aureus, UFC/cm3

5 1 102 103

Coliformes totales, UFC/cm3

5 2 200 500

Coliformes fecales, UFC/cm3

5 1 10 10

Escherichia coli, UFC/cm3 5 0 0 0Salmonella en 25 gramos 5 0 0 0

Enterobacteriaceas, UFC/g

5 1 2x102 103

Listeria monocytogenes /25 g

5 0 0 0

Tabla 1. Características microbiológicas

n = Número de muestras que deben analizarsec = Número de muestras que se permite que tengan un recuento mayor que m pero no mayor que

m = Recuento máximo recomendadoM = Recuento máximo permitido

Los aditivos alimentarios deberán cumplir con las normas relacionadas o en su ausencia, con las normas del Codex Alimentarius.

Reguladores del pH. Se podrán emplear como reguladores del pH los ácidos o álcalis indicados en la tabla 2:

Reguladores del pH Dosis máxima en el producto final

Ácido cítrico 40 grs/kg

Ácido fosfórico 9 grs/kgÁcido acético 40 grs/kgÁcido láctico 40 grs/kg

Tabla 2. Reguladores del pH

El límite máximo permitido debe ser el que establece el Codex alimentarius de contaminantes CODEX STAN 193-1995, en su última edición.

El Agar Violeta Rojo y Bilis es un medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada. Para la detección de Enterobacterias mesófilas, incubar a 30ºC durante 24 horas. Se puede aumentar la selectividad incubando a 42 ºC. Se espera observar microorganismo Enterobacterias fermentadoras de lactosa (su colonia son rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo), Enterobacterias no fermentadoras de lactosa (Incoloras) y Enterococcus spp (rosadas como punta de alfiler (puntiformes)).

El Agar Plate Count es recomendado para la determinación y recuento de microorganismos en alimentos, aguas y aguas residuales. La caseína enzimática hidrolizada provee aminoácidos y otros complejos de sustancias nitrogenadas. Extracto de levadura, provee complejo de vitamina B. las muestras son diluidas y diluciones apropiadas son adicionadas en las cajas de petri. El agar fundido estéril es adicionado a las cajas de petri y son rotadas suavemente para asegurar una mezcla uniforme de la muestra con el agar. El método del agar vertido sobre las cajas de petri es preferido al método de inoculación en superficie desde que este de muy buenos resultados. El agar Plate Count es también adecuado para la enumeración y recuento bacteriano en cuartos estériles. Características del cultivo observadas, después de 18 a 48 horas de incubación a 35 – 37ºC. Los posibles microorganismo donde se obtiene un buen resultado Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, E. coli, Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

El queso que se utilizó para el laboratorio es productor artesanal y sus característica son las siguientes

Tipo de queso Queso blanco prensado con sal

Ingredientes Leche ºA semidescremada, sal, cuajoInformación nutricional (28g) Grasa 6.5g, proteína 5.5g, carbohidratos

menos 1.0g Tabla 3. Características del queso fresco

Se espera crecimiento en el agar plate count ya que hay un máximo en la carga microbiana del queso fresco y en el agar violeta rojo y bilis también se espera crecimiento por los fermentadoras o no fermentadoras de lactosa.

Metodología

Preparación de las diluciones

Prepare diluciones decimales de la leche (queso blanco prensado con sal Rimith) desde 10-1 hasta 10-5 utilizando agua peptonada como diluyente. La primera partirá de 1 gramo de queso en 10 mL de agua.

Preparación de los medios de cultivo

Se Transfiera 1 ml de las diluciones 10-4 y 10-5 (en nuestro caso se asignó 10-2 y 10-3) para ambos medios de cultivo, a cada una de las placas Petri estériles y previamente identificadas. Agregar a cada placa 15-20 ml de ABRV a 45°C. Prepare 1 placa de control de medio por cada botella utilizada.

Mezcle minuciosamente los contenidos de las placas. Permita que la mezcla se solidifique (5-10 min) y entonces distribuya 3-4 ml adicionales del medio, como una segunda capa que cubra completamente la superficie del medio, inhibiendo así la formación de colonias en la superficie.

Para observar las características típicas de los coliformes en ABRV, investigue y traiga el día de la lectura una foto de las colonias esperadas para compararla con los resultados obtenidos.

Invierta e incube las placas por 24 horas a 36°C. Se consideran coliformes las colonias rojo oscuro que midan 0.5 mm o más de diámetro.

Cuente únicamente tales colonias, las que preferiblemente estén entre 35 a 350 por placa, y anote los resultados.

Cabe mencionar que el otro medio de cultivo a utilizar es el APC, en el que se repetirá los mismos procedimiento, excepto añadir una segunda capa del mismo.

Materiales

Tabla 4. Materiales utilizados en el laboratorio

Métodos

Recuento de aerobios y coliformes

Preparación de la Muestra

Se corta un pedazo de nuestra muestra de Queso Rimith y obtenemos un valor de 10.13g de la muestra. Se vierten 100 mL del caldo y los gramos de la muestra en una bolsa ziploc y se mezcla hasta que se homogenice.

Antes de las diluciones Se rotulan los platos Petri y los tubos de ensayo. Se introduce a la cámara el APC, se apaga la luz de esta y se enciende la luz UV.

Preparación de las dilucionesSe agarra 1 mL de la dilución 10−2, se agrega al plato Petri, agregamos el APC, tapamos el plato Petri y luego revolvemos. Se repite el mismo procedimiento para

Equipo IncubadoraCampana de seguridad biológicaBalanzaPlato calienteBolsas ZiplocPlatos PetriMarcador Permanente

Medios de Cultivos

Agar VRBL (100ml)Agar Nutritivo (100ml)Agar recuento total (100ml)Agua peptonada o caldo nutritivo (100ml)

la muestra 10−3. Después de hacer nuestras muestras de 10−2 y 10−3, se hace el control. Se realiza los mismos procedimientos para el ABVR.

Incubamos los platos Petri por 24 horas a una temperatura de 37°C.

Nota: En ABVR se debe hacer una doble capa

Resultados

Crecimiento de coliformes en el Agar Violeta Rojo y Bilis

Recuento microbiano

(dilución)

C 10-2 10-3

Agar Violeta Rojo y Bilis

No hubo crecimiento

No hubo crecimiento

No hubo crecimiento

Tabla 5. Resultado de coliformes

Figura Nº1: Control Figura Nº2: 10-2 Figura Nº3: 10-3

Análisis de resultados

Posibles causas por las cuales no se observó ningún crecimiento

El Agar Bilis Rojo Violeta es un medio de cultivo utilizado para la detección y recuento de microorganismos coliformes en agua, leche y otros productos de importancia sanitaria. Por lo tanto si en nuestra siembra del queso (agregar el nombre del queso), No se mostró ninguna formación de coliformes es porque las medida de higienes tomadas tanto dentro de la planta de producción, de igual forma durante su transporte hasta el supermercado, la manipulación hasta ser colocado a la venta y finalmente su transporte de manera segura y cuidadosa hasta la UTP, para realización de esta experiencia, garantizaron el

estado inocuo del producto. Otro factor puede deberse por algún tratamiento al cual fue sometido el queso. Algunas investigaciones que realizamos nos indicaron que el crecimiento microbiano puede ser lento si el queso se mantuvo a temperaturas muy bajas. Esto hace que las células sean menos viables en el concentrado congelado.

Recuento en el Agar Plate Count

Al observar los resultados la temperatura de la incubado era de 36.9ºC, desde 24 horas.

Recuento microbiano

(dilución)

C 10-2 10-3

Agar Plate Count No hubo crecimiento

No hubo crecimiento

No hubo crecimiento

Tabla 6. Resultado de recuento total

Figura Nº4: Control Figura Nº5: 10-2 Figura Nº6: 10-3

Se hizo vertido en placa de queso fresco para recuento total de microorganismo y no hubo crecimiento en ninguna de las dos diluciones.

Análisis de resultados

Posibles causas por las cuales no se observó ningún crecimiento

Se esperó observar crecimiento de:

Los Lactobacilos (Lactobacillus casei) que provee sabor, gusto suave y delicado, promueve la cuajada, mejora la digestión y absorción en los quesos son un tipo de microorganismo que crecen óptimamente en el agar acetato talio Sharpe, basado en el medio mejorado

de Briggs para los bacilos acidolácticos, esta puede ser una de las causas por la cual no hubo crecimiento laboratorio ya que se usó el agar plate count.

El Staphylococcus aureus un microorganismo patógeno presente en piel de animales y personas, además de en sus fosas nasales y gargantas. Pese a su amplia distribución y a la facilidad con la que llega a los alimentos y extiende una eventual contaminación, sus efectos son agudos y aparatosos pero remiten de forma rápida. Los manipuladores de alimentos pueden favorecer su rápida extensión. Si se mantienen las normas de calidad y control al manipular el alimento en la fábrica, supermercado y nosotros como consumidores se puede reducir a nulo el crecimiento de este microorganismo patógeno en el alimento, se puede decir que a nuestra muestra se trató con estos cuidados por lo tanto es un factor importante para no haberse dado crecimiento significativo.

No se encontró información específica sobre las normas que tiene la empresa a la hora de elaborar el queso pero se puede asumir que sus estándares son altos en calidad ya sea agregando antimicrobianos para reducir la carga microbiológica, se puede llegar a esta conclusión ya que dos grupo trabajaron con esta marca de queso y en uno el conteo fue bajo casi despreciable y en el otro grupo fue nulo.

Conclusiones

En el supermercado donde se adquirió la muestra, conservaba el producto en óptimas condiciones, separados de productos que podrían afectarlo, temperatura adecuada, envase y producto en sí en buen estado, por ello podemos decir que el supermercado sigue de manera correcta las normas de calidad higiénicas, debido a esto podemos concluir que el fabricante del producto también cumple con dichas normas, también se cuenta con una excelente distribución de alimento esto es una parte fundamental para el cuidado del producto.

Por ello nosotros después de adquirir la muestra debíamos de continuar con el buen cuidado del producto, fue trasladado de Nuevo Arraijan a los campos de la Universidad Tecnológica de Panamá en la tumba muerto, un largo viaje aproximadamente de 1hora, transportado en un envase con hielo, estos aspecto son de suma importancia porque ellos podrían afectar nuestra experiencia, sin embargo los resultados obtenidos fueron pocos esperados, ya que no hubo crecimiento microbiano luego de haber pasado 24 horas en la incubadora, en ninguno de los dos medios de cultivos presento crecimiento; y esto podría ser un excelente manejo de parte del fabricante a la hora de la elaboración de su producto, o que utiliza algún conservante que evita el crecimiento a los microorganismos.

Al realizar la experiencia tuvimos sumo cuidado al mantener la muestra en un ambiente aséptico, al momento de manipular y hacer el vertido en placa esto se respalda con el resultado del control ya que no hubo crecimiento alguno.

Podríamos repetir la prueba para confirmar que no hayamos cometido algún error, o utilizar otros agares que identifiquen los microorganismos que puedan crecer en productos lácteos como el Agar Acetato Talio Sharpe, Agar M17 (cultivo y enumeración de estreptococos lácticos en productos lácteos) o Agar Desoxicolato (identificación de Coliformes en productos lácteos).

Recomendaciones

Si se desea ver una gran cantidad de coliformes, recomendamos utilizar un queso artesanal menos procesado que el que usamos, ya que esta pudo ser una de las razones por la cual no pudimos observar ningún coliforme.

Investigar si el queso artesanal que se va a utilizar tiene algún tipo de tratamiento que elimina la gran mayoría de los coliformes, así sabremos cómo interpretar los resultado (si no le sale ningún coliforme).

Es importante realizar una investigación previa de los componentes que tiene el queso artesanal utilizado, para saber si alguno de estos puede influir en los resultados.

Anexos

Agar de recuento en placa (APC)

Fundamento

La productividad de este medio, está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Cuando se analiza leche y productos lácteos algunos autores recomiendan suplementarla con leche descremada estéril de uso bacteriológico en una proporción de 1 g por litro.

Composición

Tabla N°7 – Composición del APCCompuesto Cantidad (g/L)

Extracto de levadura 2.5Tripteína 5.0Glucosa 1.0

Agar 15.0pH final: 7.0 ± 0.2

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro.

Incubación

Durante 24-48 horas a 32-35 °C en aerobiosis.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35ºC.Medio preparado: a 2-8ºC.

Resultados e interpretación

Efectuar el recuento en las placas que tienen entre 30-300 colonias. Expresar el resultado como UFC/ml (tener en cuenta el factor de dilución).

Microorganismos que pueden crecer en el medio

Agar Violeta Rojo y Billis (AVRB)

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano; las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva; la lactosa es el hidrato de carbono fermentable; y el rojo neutro es el indicador de pH.

Composición

Tabla N°8 – Composición del AVRBCompuesto Cantidad (g/L)

Extracto de levadura 3.0Peptona 7.0

Sales biliares 1.5Lactosa 10.0

Cloruro de sodio 5.0Agar 15.0

Rojo neutro 0.03Cristal violeta 0.002

pH final: 7.4 ± 0.2Características del medio

Medio preparado: púrpura rojizo.

Incubación

Para la detección de Enterobacterias mesófilas, incubar a 30ºC durante 24 horas. Se puede aumentar la selectividad incubando a 42ºC.

Para coliformes se incuba de 32-35°C por 48 horas

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35ºC.

Resultados e interpretación

Los coliformes se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

Imágenes de la experiencia

Cuestionario

1. Cuáles son los géneros bacterianos que incluyen las bacterias Coliformes?El grupo de los Coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, Gram negativos, con las siguientes propiedades bioquímicas: oxidasa negativo y capacidad de fermentar lactosa, con producción de gas en 48 horas a una temperatura de 37 °C.

El grupo Coliformes está formado por los siguientes géneros:

Escherichia Klebsiella Enterobacter

Figura N°9 – Materiales y equipos listos para la siembra dentro de la cámara.

Figura N°7 – Queso utilizado para el análisis.

Figura N°8 – Muestra de queso antes y después de la homogenización.

Figura N°# – Agares, platos y diluciones utilizadas dentro de la cámara de flujo laminar.

Figura N°10 – Diluciones del queso en caldo nutritivo para ser sembradas.

CitrobacterNo todos los autores incluyen al género Citrobacter dentro del grupo Coliformes.

2. ¿Cuáles son las características que permiten que el grupo Coliformes sea un ideal indicador de higiene?

No todos los Coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Los Coliformes fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44,5º C. Aproximadamente el 95% del grupo de los coniformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los coniformes fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal.

Los Coliformes fecales se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes totales y fecales.

La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad…

En aguas tratadas los Coliformes totales actúan funcionan como una alerta de que ocurrió contaminación, sin identificar el origen. Indican que hubo fallas en el tratamiento, en la distribución o en las propias fuentes domiciliarias. Su presencia acciona los mecanismos de control de calidad y de procesamiento dentro de la planta de tratamiento de agua, e intensifica la vigilancia en la red de distribución.

3. ¿Cuáles son las propiedades intrínsecas del queso fresco molido en planta?

4. ¿Por qué se debe colocar una capa de agar encima después de haber realizado el vertido en placa usando el agar Bilis Rojo Violeta?

Para verificar el crecimiento de microorganismo anaerobios facultativos.

5. ¿Cuál es la composición del Agar de Recuento de Aerobios?Agar Plate Count

6. ¿Cuál es la composición del Agar Bilis Rojo Violeta?

Bitácora del 26 de septiembre del 2015

Jaruvy FrancoEstubo a cargo de: Limpia camara de flujo laminar al principio de la experiencia, rotular los platos Petri y tubos de ensayos, prepara disolucion 10-2 y 10-3 , prepara medio de cultivo 10-2 con Agar Nutritivo. Viernes 27 de agosto Conteo de microorganismos.

Liz Marie BartuanoEstubo a cargo de: Rotular los platos Petri y Tubos de ensayos, prepara disolucion 10-2 y 10-3, Prepara medio de cultivo 10-3 y Contro con el Agar Nutritivo. Limpia la Camara de flujo laminar al final de la experiencia. Viernes 27 de agosto Conteo de microorganismos.

Maricarmen GonzalezEstubo a cargo de: Tomar apuntes y fotos de la experiecia.

Onassis De la CruzEstubo a cargo de: Preparacion de la muestra (esteriliza los materiales y pesa la muestra), prepara medio de cultivo 10-2 con Agar Bilis Rojo Violeta.

Lloyd GarnerEstubo a cargo de: Preparacion de la muestra (Limpiar por fuera la muestra antes de sacar del envase y homogenizar la muestra, represetara la disolucion 10-1), prepara medio de cultivo 10-3 y control con Agar Bilis Rojo Violeta, Añadio la segunda capa del ABRV.

Bibliografía

1. Bhunia, A., Ray, B., (2010), Fundamentos de la Microbiología de los Alimentos: Cuarta Edición, Estados Unidos, CRC Press, p.107

2. Instituto Ecuatoriano de Normalización, (2012), Norma General para Quesos No Maduros, Ecuador, consultado el 6 de septiembre del 2015 en el sitio: https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.1528.2012.pdf

3. Laboratorios Britania, (s.f.), Hoja científica: Papa Dextrosa Agar, Argentina, consultado el 6 de septiembre del 2015 en el sitio: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/papadextagar.html

4. Laboratorios Britania, (s.f.), Hoja científica: Recuento en Placa Agar, Argentina, consultado el 6 de septiembre del 2015 en el sitio: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/recplacagar.htm

5. Laboratorios Britania, (s.f.), Hoja científica: Violeta Rojo y Bilis Agar, Argentina, consultado el 4 de septiembre del 2015 en el sitio: http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/violetarojobilisagar.html

6. MCD LAB, (s.f.), Especificaciones: Agar Bilis y Rojo Violeta, México, consultado el 5 de septiembre del 2015 en el sitio: http://electronic-systems.com.mx/pdf/AGAR%20BILIS%20ROJO%20VIOLETA..pdf

7. MDM Científica, (2010), Hoja científica: Agar Plate Count, Colombia, consultado el 5 de septiembre del 2015 en el sitio: es.scribd.com/doc/242905424/O-P-PD-52-INSERTO-Agar-PLATE-COUNT-pdf

8. Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria, (1999), Norma de Quesos Frescos No Madurados, Nicaragua, consultado el 5 de septiembre del 2015 en el sitio: http://www.oirsa.org/aplicaciones/subidoarchivos/marcolegalcria/nton0302299nileche