reacciones de deterioro de semillas: aspectos
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Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis Doctoral
Reacciones de deterioro de semillas:Reacciones de deterioro de semillas:aspectos fisiológicos, químicos yaspectos fisiológicos, químicos y
ultraestructuralesultraestructurales
Maroder, Horacio Luis
2008
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Maroder, Horacio Luis. (2008). Reacciones de deterioro de semillas: aspectos fisiológicos,químicos y ultraestructurales. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Maroder, Horacio Luis. "Reacciones de deterioro de semillas: aspectos fisiológicos, químicos yultraestructurales". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.2008.
I
�
UNIVERSIDADDEBUENOSAIRES
FacultaddeCienciasExactasyNaturales
DepartamentodeIndustrias
�
REACCIONES��DE��DETERIORO�DE�SEMILLAS�DE�SAUCE:�ASPECTOS�FISIOLÓGICOS,��QUÍMICOS�Y�
ULTRAESTRUCTURALES��
�
��������������������� ��� ���������������������������������������������
�������������������������
LICENCIADOHORACIOLUISMARODER
Dirección:Dras.MaríadelPilarBueraySaraMaldonado
Lugares�de�trabajo:
DepartamentodeIndustrias&FCEN&UBA
InstitutodeRecursosBiológicos&INTA&Castelar
Año2008
II
II
Agradezcoaquienesdeunauotramanera,hanhechoposibleestetrabajo:
LasDirectorasdelatesisDras.MariadelPilarBueraySaraMaldonado,
ElDirectordelCentrodeRecursosBiológicosDr.RobertoCasas
GonzaloyEster,delLaboratoriodeConservacióndeGermoplasma(IRB&INTA&Castelar).
MaríadelCarmendelDepartamentodeQuímicaBiológica,FCEN&UBA
CarolinaySilviadelLaboratoriodePropiedadesFísico&QuímicasyConservacióndeBiomoléculasdel
DepartamentodeIndustria,FCEN&UBA.
Emilio,MonicayGracieladelaCátedradeFísicadelDepartamentodeFisicomatemática,FFyB&UBA.
DedicoestetrabajoaImelda,porsuapoyodesdeloafectivoysuayudadesdelointelectualparaalcanzar
esteobjetivo.Ellainicióconmigoelcaminodelasinvestigacionessobreconservacióndelassemillas,entre
tantosotroscaminosdelavida,
LodedicotambiénaFlorencia,Fernando,Victoria,Guillermo,SantiagoyValentinaporqueelafectode
todosellos,mealientaacontinuar,yaGustavoyJaviersiemprepresentesenmimemoria.
III
III
Algunavez,enalgúnlugar,JorgeLuisBorgesdijo“Publicaresdejardecorregir”.Recuerdoestaspalabras
cadavezquedecidodarlepuntofinalaunestudio……
IV
IV
ÍNDICE�
RESUMEN……………………………………………………………………………………………..……………1
PALABRASCLAVESYABREVIATURAS...……………………………………………………………………..2
ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………….3
KEYWORDS……………………………………...…………………..………………………................................4
Capítulo1.INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………............5
Capítulo2.MATERIALYMÉTODOS…………………………………………………………………………......10
Capítulo3.RESULTADOSYDISCUSIÓN
3.I.&ELCOMPORTAMIENTODELASSEMILLASDESAUCEENRELACIÓNALSECADO,LA
TEMPERATURAYLAHUMIDIFICACIÓN..................................................................................………..….28
3.II.&ESTUDIOSHISTOQUÍMICOSYSUBCELULARESENSEMILLASDE������������������
����� ��������� �����Y��������� �����……………………………………………………………39
3.III.&REACCIONESQUÍMICASDEDETERIOROENLASSEMILLASSECAS……………………………52
3.IV.&REVERSIONDELDETERIORODURANTELAIMBIBICIÓNDELASSEMILLASENVEJECIDAS..76�
3.V.&CARACTERÍSTICASFÍSICASDELCONTENIDOCELULAR…………………………………...………87
� TRANSICIONES
VÍTREAS……………………………………………………………………………………….88
� MOVILIDADMOLECULAR…………………………………………………………..……...95
� ISOTERMASDESORCIÓNDEAGUAYNITROGENO……………………………..…100
Capítulo4.CONCLUSIONES……………………………………………………………………..…………...…..111
Capítulo5.BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………...113
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RESUMEN
Lassemillasdelasespeciesdesaucetoleranladeshidrataciónacontenidosdeaguasimilaresalosdeuna
semillaortodoxa,peropierdenlaviabilidadenunaspocassemanasatemperaturaambiente.Otracaracterísticaatípica
esqueloscloroplastosdelostejidosembrionariosdelassemillasmadurasconservanelsistemadeendomembranas
(tilacoides)aparentementeintactoyretienenlaclorofila.Enelmarcodelasinvestigacionesqueserealizaronenel
transcursodeestatesissurgieron,juntoalosresultadosmencionados,otrosquemuestranlosmecanismosque
podríanestarinvolucradoseneldeterioroysureparación:
1. Laluz,atravésdelaclorofilainduceunintensodañofotooxidativomediadosporradicaleslibresqueseevaluó
poreldañoaácidosgrasos,proteínas,pigmentosloqueprodujoprincipalmenteladestruccióndelasmembranas
tilacoides.
2. Sepostulaquedichasmembranasquecontienenclorofila,proteínasypigmentosseríaellugarenelquese
iniciaelataquefotooxidativo,elquesepropagaríaaotrasestructuras,loquesecomprobóporevaluaciónde
alteracionesenlapermeabilidaddelamembranaplasmática.
3. Sibienelataquefotooxidativoesimportanteestequedamayormenterestringidoalostejidossuperficialesde
lasemilla,sinafectarsensiblementelayemaapical.
4. Eldañoalostejidossuperficialesdeterminaqueenlaspruebasdegerminación,elporcentajedeplántulas
anormalesseainusitadamenteelevado(disminucióndelagerminaciónnormal),mientrasqueelporcentajedeplántulas
vivasresultósóloligeramentemenorqueelqueocurreenoscuridad.
5. Lassemillasqueoriginanplantasanormalescomoconsecuenciadelataquefotooxidativomuestranuna
notablerecuperacióndelagerminaciónnormalydelosdañosmetabólicosyestructuralesantesmencionados,cuando
sesometenahumidificación.
6. Descartadalapresenciadeclorofilacomocausaimportantedelamortalidad,quedansólodosreaccionesalas
queseconsideranprincipalesresponsablesdeldecaimientodelassemillassecascomosonlasreaccionesdeMaillard
ydeautooxidación.Laprimeranoacompañóeldescensodelagerminacióntotal,perosilasegunda,porloque
quedaríalaautooxidacióncomocausadelrápidodeterioro.
7. Elítem6llevaaconsiderarquelaautooxidaciónenestassemillasdebesermasactivaqueenotrasquecomo
estas,toleranladesecación,perosonmuchomáslongevas.
8. Ellopodríadeberseaqueelestadodelcontenidocelularpresentóunamayormovilidadmolecularyseamás
poroso,loquefacilitaríaladifusióndeloxígeno,unodelosreactantesdelaautooxidación.Lamayorporosidadal
facilitarladifusióndeloxígenoyunamayorsuperficielipídicaatacableporeseagentedebidoaladesdiferenciación
incompletadelasmembranas,seríanlascausasinicialesdelrápidodeteriorodeestassemillas.
- 2 -
��������������:clorofila,cloroplastos,endomembranas,especiesreactivasdeoxigeno(ROS),fotooxidación,
germinaciónanormal,germinaciónnormal,germinacióntotal,isotermasdesorción,longevidad,membranastilacoides,
movilidadmolécular,permeabilidaddemembranaplasmática,peroxidaciónlipídica,porosidad,�������,radicaleslibres,
resonanciadeespínelectrónico(ESR),resonanciamagnéticanuclear(NMR),�����������,����������,������
���������,� �����������,sauce,semillasortodoxas,semillasrecalcitrantes,tilacoides,transiciónvítrea
������������
GN:germinaciónnormal
GT:germinacióntotal
EDX:energíadispersivaderayosX
ESEM:microscopíaelectrónicadebarrido(modoambiental)
MET:microscopíaelectrónicadetransmisión
RL:radicaleslibres
ROS:especiesreactivasdeoxígeno
TMG:tiempomediodegerminación
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ABSTRACT�
Willowseedstoleratedehydrationatwatercontents(WC)equivalenttothoseoforthodoxseeds,buttheylose
viabilityinfewweeksatroomtemperature.Similarlyunusualisthefactthatthechloroplastsofembryonictissuesin
matureseedsconservetheirendomembranesystem(thylakoids)apparentlyintact,inadditiontoretainingchlorophyll.
Duringtheinvestigationscarriedoutinthecourseofthisstudy,thereemergedresults,inadditiontothose
aforementionedthatrevealthemechanismspossiblyinvolvedinthedeteriorationprocessanditsreparation:
1. Lightproduces,bymeansofchlorophyll,intensephotooxidativedamage,asmediatedbyfreeradicals(FR),
whichwasevaluatedfordamagetofattyacids,proteinsandpigments,andlargelyproducedthedestructiontothe
thylakoidmembranes.
2. Thephotooxidativeattackisbelievedtooriginateinthosemembranescontainingchlorophyll,proteinsand
pigments,tolaterspreadtootherstructures.Thishypothesiswasprovenbytheevaluationofalterationsinplasma
membranepermeability.
3. Whileimportant,thephotooxidativeattackismainlyconfinedtothesuperficialtissuesoftheseed,without
sensiblyaffectingtheshootapicalmeristem.
4. Thedamagetosuperficialtissuesisevidentingerminationtests,causingthepercentageofabnormalseedlings
tobeunusuallyhigh(decreaseinnormalgermination(NG)),whilethepercentageofliveseedlings(normal+abnormal=
totalgermination–TG&)turnsouttobeonlyslightlylessthanthatwhichoccursinthedarkness.
5. Theseedsthatoriginateabnormalplants,asconsequenceofphotooxidativeattackexhibitsignificantrecovery
ofNGandofthemetabolicandstructuraldamagesaforementioned,whensubmittedtohumidification.
6. Oncethepresenceofchlorophyllisdiscardedasasignificantcauseofmortality,onlytworeactionsremainas
potentialcausesofthedecayindryseeds,thatis,theMaillardandautooxidationreactions.Astheformerdoesnot
occursimultaneouslywiththedecreaseinTG,autooxidation,whichdoescoincide,ispresumedtobethecauseofthe
rapiddeterioration.
7. Item6leadstotheconsiderationthattheautooxidationthatoccursintheseseedsmustbemoreactivethanin
othersthat,likethese,toleratedesiccationbutlivemuchlonger.
8. Thiscouldbeduetothefactthatthestateofthecellularcontentpresentsagreatermolecularmobilityand/oris
moreporous,whichwouldfacilitatethediffusionofoxygen,oneofthereactantsinautooxidation.Theincreasedporosity
whichfacilitatesdiffusionofoxygenandthegreaterlipidsurfaceattackablebythatagentduetotheincomplete
dedifferentiationofthemembranes,areproposedastheinitialcausesofrapiddeteriorationintheseseeds.
- 4 -
�!�"#�$�%�chlorophyll,chloroplast,freeradicals(FR),electronicspinresonance(ESR),embryomembraneintegrity,
glasstransition,endomembranes,lipidperoxidation,molecularmobility,N2sorptionisotherms,NMR,photooxidation,
�����������,����������,���������������,� �����������,orthodoxseed,porosity,priming,reactiveoxygenspecies
(ROS),recalcitrantseeds,thylakoids,willow�
�
- 5 -
CAPÍTULO�1�
INTRODUCCIÓN�
El �!�� ������ vegetal se conserva fundamentalmente como semilla. Las semillas constituyen
sistemasdeshidratadosyporestarazónmuchasherramientasparasuestudiohansidolasmismasconlas
queseencararon losestudiosrelativosa laestabilidadde losalimentosyotrosbiomateriales.Temastales
como:propiedadesdesorcióndeagua,estadovítreo,pardeamientonoenzimático, reaccionesdeMaillard,
reaccionesdeauto&oxidaciónsehanabordadoparacaracterizarypredecirlaestabilidaddealimentosyson
tambiénrelevantesenlaconservacióndesemillas.Enelcasode losalimentos,elobjetivoesconservarsu
valornutritivo y suscaracterísticasorganolépticas.Enel casode lassemillas, suconservación tienecomo
objetivo principal el mantenimiento de la viabilidad, es decir, que el sistema deshidratado conserve la
capacidad de sustentar vida. Si bien esto implica una exigencia extra con respecto a la conservación de
alimentos, como compensación conlleva la posibilidad de revertir cierto grado de envejecimiento y así
aumentarlacalidaddelasemillaquefueramantenidaenalmacenamiento,porprocedimientos���" #.
Hasta hace poco tiempo la información sobre longevidad de las semillas o de la capacidad de
almacenamiento era escasa y difícilmente cotejable por dos motivos: a. Surgía de trabajos en que las
condicionesdealmacenamientodiferían(locualaúnocurreconfrecuencia)yraravezsehabíanmantenido
constantes y b. Se conocían semillas tolerantes y otras susceptibles a la desecación. Roberts en 1973
introdujo los términosortodoxoyrecalcitranteparadefinirestadicotomía,yenunaprimeraclasificación las
separóendoscategorías:tolerantesa ladeshidratación(u �� � ���$�y�notolerantesaladeshidratación(o
�!#��#������!�$.Lassemillas#��#$#&��sonlasquenaturalmentesedeshidratanhastaalcanzaruncontenido
deaguaenequilibrioconlahumedadambiente(10&12%decontenidodeagua)ypuedentolerarunposterior
secadoartificialhastaaproximadamente5%sinperder laviabilidad.Existenmarcadasdiferenciasentre las
semillasortodoxasdedistintasespeciesencuantoallapsoduranteelcualsemantienenviables,elquevaría
desdealgunosañoshasta,enalgunoscasos,centurias.Lalongevidadresultamayorcuantomenorsontanto
- 6 -
elcontenidodeaguacomola temperaturaen laqueseencuentran.EllisyRoberts (1980ayb;1981)han
establecido una relación que permite predecir la viabilidad al cabo de determinado período de
almacenamiento, siempre que durante el mismo tanto la temperatura como el contenido de agua se
mantenganconstantes(ecuacióndeprediccióndeviabilidad).Enlosbancosdegermoplasmaserecomienda
almacenar lassemillasconuncontenidodeaguade5%yaunatemperaturade–20ºCdadoqueestase
puede mantener con equipo de refrigeración relativamente poco costosos, accesibles a los bancos de
germoplasmaanivelmundial.(Cuadro1).
Las semillas ����������'��� en cambio, pierden la viabilidad antes de que su contenido de agua se
equilibre con la humedad del ambiente.El contenido de agua por debajo del cual pierden la viabilidad se
alcanzarelativamenteenpocotiempo,deahíqueseanmuypocolongevas.Selaspuedemantenerviables
porlapsosrelativamentecortosaaltashumedades,atemperaturasligeramentesuperioresa0ºC,ytratadas
conbiocidas.Lacrioconservación(Cuadro1)eslasoluciónalproblemadeunaconservaciónprolongada.
A medida que mayor número de especies se fueron incorporando a estos estudios, se detectaron
casos en los que el comportamiento se apartaba de aquellas dos categorías iniciales, por lo que, más
recientementese incluyóunaterceracategoría llamada ���!��!���.Estacategoríaabarcaaquellassemillas
que, si bien toleran la deshidratación natural, resultan afectadas en diferente grado por una posterior
deshidrataciónartificialy/omuestranalgunasusceptibilidadalfríoenestadodeshidratado.Tambiénincluyea
semillasquepierdenlaviabilidadconcontenidosdeaguarelativamentebajosaunquenotantocomoelque
alcanzaríandeshidratándosenaturalmente.
La etapa de deshidratación de las semillas ortodoxas, última fase del desarrollo programado de la
semilla, se inicia con la acumulación de reservas en los tejidos del embrión y del endosperma (este es el
tejido de las semillas cuya finalidad es la acumulación de reservas) y continúa con la des&diferenciación
general de la compleja estructura de las células de esos mismos tejidos. La desdiferenciación implica la
desorganización del citoesqueleto y la reducción general de membranas que acompañan la progresiva
deshidratación y conducen a una drástica reducción del metabolismo. En el nivel subcelular, la
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desdiferenciacióndecloroplastosymitocondriassevisualizaporlareduccióndelasmembranasinternas.La
desdiferenciación de los cloroplastos y la consecuente degradación de la clorofila hacen que las semillas
pierdan el color verde (�!��!!����). Las restantes organelas citoplásmicas también se desdiferencian. Se
consideraque ladesdiferenciaciónde lasestructurasocomponentescelularesconstituyeun requisitopara
que se toleren bajos niveles de contenido de agua sin pérdida de la viabilidad. En contraposición, en las
semillas�!#��#������!�lasorganelasnodesdiferencianyelmetabolismonocambia.
La familia de las Salicáceas comprende aproximadamente 350 especies que se agrupan en dos
géneros� �����(losálamos)y�����(lossauces).Enlaprácticaforestal,lasespeciesdesauceyálamose
propaganporestacasdadolafacilidaddeéstasparaenraizar,ynoporsemillas.Obviamente,lapropagación
porestacasacortasensiblementeeltiemporequeridoparaquelaplantaalcanceeltamañoquesedesea.Por
otraparte, lasemillapresentael inconvenientedelarápidapérdidadeviabilidad.Sinembargo, lassemillas
resultanimprescindiblesenlostrabajossobremejoramientogenéticodirigidosamejorarlaaptitudpapeleray
madererade lasSalicáceas,yasídiversificarsuuso,elqueseencontrabarestringidohastanohace tanto
tiempoa la fabricaciónde cajonescomocombustible.Estasactividadescobran relevanciadebidoaque el
paíscuentaconunadelaszonasecológicasmásaptasparaelcultivodeestasespecies,comoeselDelta
del Paraná.Es probable que, al quedar el uso de las semillas limitado almejoramiento, ésta haya sido la
causaporlaquefueranpocoestudiadas,existiendomuyescasainformaciónsobrelasmismasenelnivelde
suspropiedades físicas, químicas y suestructura y fisiología, como tampoco laqueconciernea su rápida
pérdidadeviabilidad.
La corta longevidad de estas semillas determinó que en un principio se las clasificara como
presuntamente �!#��#������!� (King y Roberts, 1979). Esta categorización se mantuvo hasta hace
relativamentepocotiempo(Pence1995).Posteriormenteseconsideróquecorrespondíana lacategoríade
semillasdecomportamientoortodoxoporquetoleranladeshidratación(Hongetal.,1996;Maroderetal.1996)
aunquequedabasinexplicarlacausaporlacualesatolerancianoestabaasociadaaunalongevidaddepor
lomenosalgunosaños,comoocurrecon lasortodoxas típicas.Enestasúltimasseconsideraqueel lento
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envejecimientoestáproducidoprincipalmenteporreaccionesdeautooxidaciónydeMaillardqueporocurrir
en estado deshidratado, donde la movilidad molecular es baja, son precisamente lentas. Dado que estas
semillas también toleran la deshidratación, el proceso de envejecimiento debería ser similar. Cabe
preguntarse,entonces,porqué,siestassemillastoleranladeshidratación,decaenentanbrevetiempo.Para
contestar esta pregunta se encararon estudios sobre los aspectos señalados anteriormente con el fin de
explicaresecomportamientoatípicoytambiénconocersucomportamientogerminativo.
Todo lo que antecede, presenta a las semillas de sauce como un modelo de biomaterial que se
caracterizaporconstituirunsistemadeshidratadoderápidodeterioronodeterminadoporlapérdidadeagua,
loqueconvierteenunmodelodeinteréseneláreadelaConservacióndeBiomateriales.Resultansistemas
adecuadosparaanalizarlarelaciónentrereaccionesdedeterioroylascaracterísticasfísicasdelmedioenlas
quelasmismasocurren.
OBJETIVOS�ESPECÍFICOS�E�HIPÓTESIS�DE�TRABAJO�
Unacaracterísticadeestassemillasquediferenciaestassemillasdelasotrasquetambiéntoleranla
desecaciónperosonlongevas,esquecontienenclorofila.Poresemotivo,sepostulaquelaactivacióndeese
pigmentoporlaluztendríaunpapelimportanteenlarápidapérdidadelaviabilidadyenelcomportamiento
germinativo.
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Cuadro�1.1.-�Estudios�en�Salicáceas�
� ��!����� ��!���!��������!����#!�%�&��� �'(�����������#&#!��$�� ���!�!)���!��� �*�!�
'�$ # � ��!�������������+ ���#�,��*�!��!��!�!�!����!����� �����������!�!���%�����!) ���� #!����!�� ���!�# ��!�)�#�,���#�!���,����� �����!������� �������- ���!�!- ����!�� �!����!��!�.���!�/��#���!�������#����� # ����!���� � *�!� " %� ����!��!#�!���!�����#&#!��� ��!�!�� ����� ��� ����#��� !�� ��������!# � �.����!�� ���!�0�1���!�����!�������&�!�����2 ���!# �,��#���&����������!�#������������������!��#����) ��!�!�����!��!#�!��%�# ������%!�!����% ���3#�! �� ���#� �����!�����#&#!���!�����!�����0�
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�'���� ���(���������$�����#�����'�)�#*��+��$��+�,#��+��'�#�$�������-�����.������������#���'��/'�$����#'����#'��'����#�0'$����$�������+��'�#�)#���'�$�$�$�����+)#1�$�����'����'�$�$1�!��#'��$�)����/'�������'$������������/����1�)�)������!�������$��#2����#�,����#�$���)�#*��+�������������3���$��$�����)�'�#�$���������#��#(��#'/+��#�������*�/'�������+�'���)#����*�$��
- 10 -
CAPÍTULO�2�
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES
Lassemillasde����������L.,�0����������Koidzy�����������L.fueronobtenidasdeárbolescrecidos
enINTA&Delta,queesunaestaciónexperimentaldelINTA&Delta.Lassemillasfueroncoleccionadasentrelos
años 1997 y 2007 en el período del año que va desdemediados de octubre a principio de diciembre. La
colección se realizó según el siguiente protocolo: las ramas cargadas de amentos (espigas péndulas) se
cortaron de los árboles en el tiempo en que las cápsulas (frutos) se tornaban amarillentas y las semillas
comenzabanaliberarsedelfruto.Yaenellaboratorio,atemperaturaambiente,losamentossesepararonde
las ramas y se distribuyeron sobre rejillasmetálicas.Periódicamente, cada 4 horas (aproximadamente) se
recolectaron lassemillas liberadasporexplosiónde lacápsulaysesepararonde lamatrizalgodonosaque
las contiene, usando aire comprimido y se almacenaron a &70º C hasta ser usadas en los diferentes
experimentos.Elcontenidodehumedaddelassemillas,queesaproximadamente40%(basehúmeda)enel
momentodesu liberacióndel fruto,despuésdeaproximadamente3ha temperaturaambientesereducea
11±12%.Todaslasoperacionesseñaladasserealizaronencondicionesdeiluminacióndebajaintensidad.
�
MÉTODOS�
(1)�Determinación�del�contenido�de�agua.�
Elcontenidodeaguadelasmuestrassedeterminógravimétricamenteysecalculóenbasealamasa
antesydespuésdelsecadoenestufa(1ha130ºC±2C),expresándosesobrebasesecaohúmeda,según
losexperimentos(ISTA,1999).
- 11 -
(2)�Pruebas�de�germinación�
Entodos loscasos laspruebasdegerminaciónsehicierondeacuerdoconelsiguienteprotocolo:se
colocaronlassemillassobrepapelhumedecido(3hojas)con3.5cm3deaguadestilada&desionizadaencajas
de Petri de 6&cm de diámetro a 25 ± 1º C y 16 h bajo luz fluorescente /8 h de oscuridad por 6 d. La
germinaciónseconsideranormalsilaplántuladesarrollaloscotiledones,elhipocótiloylaraízyestáerecta;
lasplántulasquenoreúnenestoscriteriossonclasificadascomoanormales.Lagerminaciónnormal(GN)fue
evaluadausandocuatroréplicasde25semillasparacadatratamiento.Enalgunosexperimentostambiénse
estimaronlagerminaciónanormalylagerminacióntotal(semillascongerminaciónnormalmássemillasno&
germinadas).Aunquelassemillasfrescasgerminandentrodelperíodode12a24h(hasta72hparasemillas
convigorbajo),elrecuentodefinitivosellevóacaboelsextodíadesdeelmomentodelasiembra,demodo
de poder reconocer sin dudas las plántulas anormales.En algunos experimentos se determinó además el
tiempomedio de germinación (TMG), que fue calculado según la fórmula:Σ (niti) / Σ ni, en laque niesel
númerodesemillasgerminadaseneltiempotidesdeelcomienzodelaimbibición.
Lagerminacióna24hdesdeelmomentodelasiembraesconsideradacomounindicadordelvigor;en
estecasoelcriteriodegerminaciónfuelaprotrusióndelhipocótilo,teniendoencuentaque(adiferenciade
otrassemillas)elprimersignovisibledelagerminacióndelassemillasdesauceeslaextensióndelhipocótilo
(Pólya,1961).
�
�(3)�Deshidratación�de�las�semillas�y�tratamiento�con�nitrógeno�líquido�
Los lotes de semillas de ������ ���� con 100 y 75% de germinación y 12% de humedad fueron
deshidratadas a diferentes contenidos de agua. Las semillas fueronmantenidas a 5º C durante 24 h en
atmósferas equilibradas con soluciones saturadas de K2CO3 (aproximadamente 43% de humedad relativa,
HR) y LiCl (aproximadamente 15% HR) o con H2SO4 concentrado (aproximadamente 1% HR). Los
contenidos de agua después de la deshidratación fueron 9% (K2CO3), 6.7% (LiCl) y 4.3% (H2SO4). Las
semillas fueron luegopuestasencrio&vialese inmersasennitrógeno líquido(NL)durante1h;unamuestra
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con100%degerminacióny12%decontenidodehumedad fuemantenidaennitrógeno líquidodurante11
meses. Inmediatamente después del tratamiento con nitrógeno líquido los crioviales con semillas fueron
transferidosaunbañodeaguaa36ºCdurante1min.Elefectodelostratamientossobrelagerminaciónfue
evaluado.Un procedimiento similar fue seguido con un lote de semillas de�0���������� que tenía 100%
germinacióny11%decontenidodehumedad.Ladeshidrataciónfuellevadaacabosolamenteensoluciones
saturadasdeLiClyH2SO4concentrado.Loscontenidosdeaguadespuésdeladeshidrataciónfueron6.5%
(LiCl)y4.4%(H2SO4).
(4)�Almacenamiento�a�diferentes�temperaturas�
Unlotedesemillasde����������con75%germinacióny9%decontenidodeaguafuemantenidoa–
20º,5ºy25ºC.Enotroexperimentounlotedesemillasde�0����������con100%degerminacióny10.5%
de contenido de humedad fue puesto a –70º C. Las semillas se colocaron en contenedores sellados y,
muestras de las mismas fueron periódicamente tomadas para evaluar su germinación. Para el lote
almacenadoa–70ºC,lagerminacióna24hdesdeelmomentodelasiembrafueincluidacomounindicador
delvigor.
(5)�Tratamiento�de�humidificación
Se evaluó el efecto de la humidificación sobre la germinación de las semillas de �0� ����� y y �0�
���������. Para ello se usaron tres lotes de semillas de �0� ���� (9% contenido de humedad), dos con
aproximadamente 43% y uno con aproximadamente 16% de germinación y dos lotes de semillas de �0�
���������(10.5%contenidodeagua)con90y46%degerminación.Lassemillassemantuvieronen100%
HR:�0� ���� a 25ºC y�0���������� a 17ºC. Lasmuestras fueron removidas en intervalos de 3 h y su
germinación,evaluada.Enlasmuestrasdesemillasde�0����������,elcontenidodeaguayelporcentajede
germinaciónfuerontambiéndeterminadoscadahoradurantelasprimeras3hdehumidificación.
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(6)�Microscopía�de�campo�claro,�de�fluorescencia�y�microscopía�electrónica�de�transmisión
Semillasenteras(diámetro10x0.5x0.3mm)fueronfijadasenglutaraldehído2.5%en��++!���fosfato
0.1M,pH7,5a4°C,durante2h.Paralosestudiosdemicroscopíadecampoclarolostejidosfijadosfueron
deshidratadosmedianteunaseriedeetanolhastallevarlosaacetona,luegotratadosenunaseriecreciente
de acetona&resina y finalmente embebidos en esta última (resina JB4 (2&butoxiethanolmethacrylate&
Polyscience,Warrington,Pa).Para realizar losestudiossubcelulares, lassemillas fijadasenglutaraldehído
fueronpost&fijadasenOsO41%enelmismobufferdurante1h,deshidratadasenunaserieetanol&acetonay
embebidasenresinaSpurr(Sigma–Aldrich,USA)segúnelprotocolodescritoenMaldonadoyLott (1991).
Los tejidos frescos, los tejidos embebidos en JB4 y en resina Spurr. fueron usados para los análisis
histoquímicos.Lasseccionessemi&finasse tiñeron conácido fucsínicoy toluidinablueO (FederyO´Brien
1968), floroglucinol y azul brillante coomassie (Pearse 1985), fase green FCF (Fulcher et al. 1972), iodo&
iodurodepotasioyácidoperiódico&Schiff(O´BrienyMcCully1981),sudanblackB(Bronner1975)ysulfato
férrico (Leigh y Sanders 1997). Las secciones se montaron sobre grillas cubiertas con Formvar y luego
carbón,teñidasenacetatodeuraniloseguidoporcitratodeCuyanalizadasconmicroscopíaelectrónicade
transmisión(ZeissM109).
�
(7)�Determinación�de�proteínas�
La técnica de cuantificacióndenitrógeno total ómicro&Kjeldahl (Kjeldahl, 1883) fue realizadaconun
analizadorKjeltecAuto1030.(Tecator,Höganäs,Sweden)ensemillasenteras(proteínastotales),lafracción
de extractos solubles (proteínas solubles) y la fracción insoluble (proteínas insolubles). La fracción de
extractossolublesfueronobtenidascomosedescribióanteriormente,exceptoporelagregadodelcombinado
inhibidor deproteasas (yaqueagregaríanitrógenonoprovenientede lassemillas)ycombinando loscinco
extractosporcuadruplicado(LS,HS,E,H),conelobjetivodeobtenereltotaldeproteínasoluble.Lafracción
insoluble fue obtenida a partir de los correspondientes precipitados obtenidos luego de la extracción de
solubles,porcuadruplicado.
- 14 -
Elcontenidodeproteínasfueestimadoporlaecuación(2.5):
( )100
25,61410 3
××××××−
=
−−
m
gml
lNfVV
PHClblankHClHCl
dondePeselcontenidodeproteínas(g/100gsemillas);meslamasademuestradesemilla(g);VHCl,
es el volumen del ácido estándar (mL) (ácido clorhídrico), VHCl&blank, es el volumen del ácido estándar
necesarioparalatitulacióndelreactivoblanco(mL);NHCl,eslanormalidaddelácidoestándar;yf,factorde
normalidaddelácidoestándar;6,25eselfactorutilizadoparatransformarlosvaloresdenitrógenoorgánico
totalenvaloresdeproteínasy14geslamasamolardelnitrógeno.
(8).�Determinación�del�contenido�de�lípidos�por�RMN�
La determinación del contenido de lípidos se realizó por medio de resonancia magnética nuclear
mediante una técnica estandarizada que emplea ecos de espín mediante la aplicación absoluta
correspondiente, provista por el software (absolute\seoi). Para la realización de la curva de calibración se
empleóelmateriallipídicodesemillasdesauceextraídoconhexanoenunextractorsoxhletdurante6h.Se
pesaronenunabalanzaanalítica(±0.00001g)entre0.01gy0.1gdedichomaterialdentrodecapilaresquea
suvezseintrodujeronentubosdeRMNdevidriode10mmdediámetrodemaneradenosuperarlos2.5cm
dealtura.SeempleóunespectrómetroBrukerNMS120(20MHz).Latécnicasebasaenlacuantificaciónde
laseñalderelajacióndelosnúcleosdehidrógenopresentesenaceitealos7msdebidaalaaplicaciónde
pulsoscortosderadiofrecuencia.
Luegosecolocaronsemillasdesauceenlostubosdevidrio(tambiéncuidandodenosuperarlos2.5
cmdealtura)yserealizólalecturacorrespondiente,quearrojóunacantidaddelípidosdel20%sobrebase
seca.
- 15 -
LaFigura2.1muestra lacurvadecalibraciónyelpuntocorrespondientea lamuestradesemillasde
sauce.Comolamuestrarepresentadacorrespondea0,3gdesemillassecas,elcontenidodelípidosen las
mismasseestimóen20,6%,apartirdelacurvadecalibracióndescripta.Losresultadosgravimétricamente
obtenidos,luegodelaextracciónporsoxhletdieronresultadosmenores(15%),loquerevelaríalaextracción
incompletadeloslípidos.Laobtencióndecurvasdefusiónmuymarcadasenlostermogramasobtenidospor
DSC,tambiénindicanunaltocontenidolipídico.
0 1 2 3 40.00
0.02
0.04
0.06
0.08
L = 0.025 s + 0,0002
r2= 0,9992
señal (s)
g de
lípi
dos
(L)
Fig.�2.1.-�Curvadecalibraciónypuntocorrespondientealamuestradesemillasdesauce
�
(9)�Análisis�EDX�
Elestudiodelacomposiciónelementaldeloscristalesgloboidessehizoutilizandoseccionesgruesas
(1mm)detejidofresco.ElmaterialfueexaminadoenelmodoambientaldeunmicroscopioelectrónicoPhilips
XL 30 ESEM.El análisis EDX fue realizado rutinariamente con un voltaje de aceleración de 20 kV, en un
tiempodeanálisisde60s,yunrangodeconteoentre1500y2000.
(10).�Tratamiento�con�luz�
- 16 -
Lassemillasfueronexpuestasadiferentescondicionesdiferentesdeiluminación:oscuridad,140lux,y
1300lux,durante3díasa25ºC.Entodosloscasoslassemillasfueronmantenidasa45%HR,enatmósfera
enequilibrioconsoluciónsaturadadeK2CO3,estabilizandoelcontenidodeaguaa9%.
Lostratamientosserealizaronenun incubador(CooledIncubatorMIR&153SANYO),enatmósferade
aireonitrógeno.
(11)�Análisis�de�resonancia�de�espín�electrónico�(Electron�Spin�Resonance�-ESR)��
Se realizaron cuatro réplicas de 150 mg de semillas para cada tratamiento. Las semillas fueron
transferidasauntubodecuarzoESR.LosespectrosdeESRfueronrealizadosa20ºCenunespectrómetro
ESR (X&band ESR Spectrometer Bruker ECS 106&Brucker Instruments, Inc., Berlin, Germany). Las
condicionesdelespectrómetrofueron:poderdemicroonda1mW,campocentral3445,amplituddebarridode
1000G, tiempo de conversión 5.12 min, constante de tiempo 5.12m, frecuencia de modulación 50 KHz,
amplituddemodulación0.1G,ganancia2.104,yresolución1024puntos.Elnúmeroderegistrosvarióentre
100a400dependiendode la intensidadde laseñal.La intensidadde laseñal radical fuemedidacomo la
altura total del pico de radical libre en la intensidad de la señal del primer espectro derivativo. Todos los
espectrosESRtuvieronformaslinealesyamplitudde líneaequivalentes,conla intensidadde laseñalESR
fueron considerados proporcionales a las concentraciones radicales. Por lo tanto, las concentraciones
radicalesfueronestimadasapartirdelasalturastotalesdelospicosrespectivosyexpresadascomomedidas
relativas, relacionando dentrode cada espectro la interrelación entre la alturadel picode radical libre y la
alturadelpicodecampobajodemanganeso.
�
(12).�Extracción�de�lípidos�y�análisis�de�ácidos�grasos�analizados�por�GLC�
Elanálisisdelosácidosgrasossellevóacabousandosemillasliofilizadas.Elmaterialfuetransferidoa
tubos!��!�� �+de1,5mlyloslípidostotalesfueronextraídosusandolamezclacloroformo–metanolusando
elprocedimientodescritoporFolch!����0(1957).Losextractosde lípidostotalesfueronsecadosypesados,
- 17 -
suspendidosen2mldeunasoluciónfrescade10%KOHenetanolysaponificadosdurante60mina80ºC
usandotubosdevidriocontapaesmerilada.Seagregaron2mldehexanoylosácidosgrasosseextrajeron
por agitación. La fase superior orgánica (no&saponificable) fue descartada. La capa acuosa fue acidificada
+con1.5mldeHClconcentradoylosácidosgrasosseextrajerondosvecescon1.5mlhexano.Losextractos
conteniendolosácidosgrasoslibresfueronsecadosbajounacorrientedenitrógeno,disueltosen1.5mlBF3
(10%enmetanol)y1.5mldebencenoyesterificadosporcalentamientoyagitacióna100ºCdurante1h.Los
ésteresdeácidosgrasos(FattyAcidMethylEsters&FAME)seextrajerondosvecesconhexanoylavadoscon
aguadestilada.Despuésdeun lavado, la faseorgánica fueevaporadabajounacorrientedenitrógeno, re&
disueltaenhexano,yanalizadaporGas&LíquidoCromatografía(GLC).Luego,1`ldelasoluciónFAMEfue
inyectadaenunacolumnacapilar(30mx0.25mm,0.25`mfilm)(OmegawaxX250&SupelcoInc.,Bellefonte,
Pennsylvania)enuncromatógrafoHewlettPackardHP&6890equipadoconundetector flame ionization.La
temperaturadelacolumnafueprogramadaparaun incrementolinearde3ºC/mindesde175a230ºC.Los
picos cromatográficos de FAME fueron identificados por comparación de sus tiempos de retención con
estándaresbajolasmismascondiciones.
�
(13).�Determinación�de�clorofilas�y�carotenos�
Elanálisisdeclorofilasycarotenossehizosegún lossiguientesprotocolos: lassemillaspulverizadas
fueronembebidasencloroformo:metanol(2:1envolumen)(Arnon1949)yLichtenthaler(1987).Lamezclafue
sonicadadurante10minyluegocentrifugadaa8000xg.Laextracciónserepitiótresvecesyelextractofue
secadoencorrientedenitrógeno,re&disueltoenN,N&dimetilformamidaycentrifugadodurante10mina8000x
g. Laabsorbancia fue leídaconunespectrofotómetro.Para la conversiónde las lecturasa contenidosde
clorofilaycarotenos,seutilizaronlasecuaciones(2.3)delestudiodeInskeepyBloom(1985)yLichtenthaler
(1987),quesonlassiguientes:
- 18 -
Chl�(`g/mgdepesoseco)=12.70A664.5–2.79A647
�
Chl��(`g/mgdepesoseco)=20.70A647–4.62A664.5
TotalChl(`g/mgdepesoseco)=17.90A647–8.08A664.5
Carotenostot(`g/mgdepesoseco)=(1000.A470–1,82.Chl�–85,02.Chl�)/198
��5���� ��6�#���
�
(14).�Determinación�de�proteínas�oxidadas�
LamedicióndelasproteínasoxidadasserealizódeacuerdoalatécnicadescritaenReznickyPacker
(1994). Esta técnica cuantifica espectrofotometricamente la formación de dinitrofenilhidrazona unida a
proteínasatravésdelareaccióndel la2,4&dinitrofenilhidrazina(2,4&DNPh)yloscarbonilosdelasproteínas
oxidadas.Estecompuesto tieneunpicodeabsorciónentre355y390nmysu coeficientedeextinciónes
22.000M&1xcm&1.
Lassemillassehomogenizaronenunasolucióndebufferdefosfatodepotasio50mMph7,6EDTA
disódico1mM. Elhomogenatosecentrifugó15.000xgdurante20minutos.Seextrajoel sobrenadanteel
cualseincubó15minutoscon10%desulfatodeestreptomicinaatemperaturaambienteparaeliminarrestos
de DNA los cuales interfieren en el reacción. Nuevamente las muestras fueron centrifugadas 15.000 x g
durante 20minutos. El sobrenadante fue incubado 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad con 2,4&
DNPh 10 mM + HCl 2,5 N. Al cabo de ese tiempo se agregó TCA 20% y se dejó 10 minutos en hielo
permitiendoasí laprecipitaciónde lasproteínas.Secentrifugó lamuestra (15.000xgdurante10minutos)
conservándose esta vez el pellet que es donde se encuentran las proteínas. El pellet se lavó con
Etanol:Acetato de Etilo (1:1) hasta que el sobrenadante perdió el color. Por último se disolvió el pellet en
clohidratodeguanidina6M.Laabsorbanciaseleyóconunespectrofotómetroa370nm.
- 19 -
�
(15).�Determinación�de�productos�de�Maillard�
Previoa ladeterminacióndelospigmentospardos,seprocedióa laeliminacióndeclorofila,segúnla
metodología de Arnon (1949) ya que la presencia de lamisma enmascara la determinación de color. Se
analizó la fluorescencia de las fracciones solubles proteicas obtenidas a partir de semillas de sauce. Las
proteínas fueron fraccionadas utilizando una modificación del procedimiento tradicional de extracción
secuencialdeproteínasdeOsborne(Osborne,1924).�
Aproximadamente30mgdesemillasmolidasfueronincubadascon1,5mLdeunaseriesecuencialde
solucionesdeextracción:50mMTris&HCl(Sigma),200mMNaCl(Merck)��++!�(pH8.3)(LowSalt,LS)por
20 minutos en hielo (dos veces). Los sobrenadantes obtenidos luego de 10 minutos de centrifugación a
15000g (Eppendorf 5424, Hamburg, Alemania) fueron guardados en freezer (&18ºC) hasta su posterior
análisis.Lasproteínasqueseextraensonalbúminas(Aluko,2004).
Lasfraccionessolublesfuerondiluidasdemanerataldeobtenerunaabsorbanciaa380nmmenorque
0,1(Skoogycol.,2001).Estoesparaevitarelefectodefiltrointerno,yaquelospigmentosabsorbenalaλ
deexcitacióndeloscompuestosfluorescentes.
Laintensidadmáximaobtenidadelespectrodeemisión(excitacióna380nm)fuecalculadasiguiendo
lasiguienteecuación(2.4)(MatiacevichyBuera,2006):
gm
bdfUFUF x
⋅−⋅⋅
=
Donde UFx fue lamedida de intensidad de fluorescencia obtenido para cada fracción soluble; f, el
factordesensibilidaddelinstrumento;d,elfactordedilución;b,ordenadaalorigendelacurvadecalibración
realizadadesulfatodequininaen0,1NH2SO4(BDH);m,lapendientedelacurvadecalibración;yg,elpeso
delassemillas(g)utilizadasparalaextraccióndelasproteínas.Todoslosreactivosfuerondegradoanalítico.
- 20 -
Losespectros informadoscorrespondenalbarrido realizadoporelequipoapartirdedosmediciones
pormuestra,yhabiendorealizadoautomáticamentelacorrecciónmatemáticaporlapotenciadela lámpara
encadalongituddeonda.
Las mediciones de emisión de fluorescencia, se realizaron en un espectrofluorímetro Ocean Optics
USB 2000,OceanOptics Co., U.S.A., con tiempo de integración de 30mseg, promedio de 50. Programa
OOibase32.
�
(16).�Determinación�de�malondiadehido�(MDA)�
Estecompuestoseevalúapormediodeunatécnicacolorimétricadondeelácidotiobarbitúrico(TBA)se
unealMDAformandounabasedeSchiffqueabsorbea532nm(Yagi1976).
Conunmorterosehomogenizaronlassemillasenunbufferfosfato30mMph7,4KCl120mMyPVP.
Elhomogenizadosecentrifugóa3000xg10minutosysedescartóelpellet.Paralelamentesepreparaun
blanco el cual contiene buffer en vez demuestra. Se tomó una alícuota del sobrenadante a la cual se le
agregóBHT100mMyTCAal20%p/vloqueluegodeunaincubaciónde20minutosyunacentrifugación
produjo laprecipitaciónde lasproteínas.ElsobrenadantesecolocóentubosherméticoyseadicionóTBA
0.7%.Lostubostapadossepusieronabañomaría100ºCdurante1hora,pasadoesetiempo,seenfriaron
enhieloyserealizólalecturaespectrofotometrica.
(17).�Prueba�de�conductividad�eléctrica
La conductividad del filtrado se determinó según el siguiente protocolo: 300 mg de semillas se
sumergieronen8mldeaguadestilada,durante3ha20°C.Sehicierontresréplicas.Laconductividaddel
medio acuoso semidió con un Conductivímetro AltronixModelo CTX&II. Para la calibración del equipo se
empleóunasolucióndeKCl3M.LosresultadosseexpresaroncomoµSmg&1desemillassecas.Losvalores
correspondieronalosvalorespromedio±DS.
- 21 -
(18).�Estudios�de�sonda�de�espín�(Spin�probe�ESR)�
La detección de los espectros de resonancia de ESR usando la técnica de SpinProbe y un agente
amplificante,conelobjetodeestudiarloscambiosenlaspropiedadesdebarreradelasmembranas,hansido
descriptosenGolovinayTikhonov(1994)yenGolovinaetal.(1997).
Brevemente, lassemillasfuerontratadasconunasolucióndeTEMPONE(4&oxo&2,2,6,6&tetramethyl&1&
piperidyneloxy)(Sigma).TEMPONEesunradicalnitróxidoanfifílicoyestablequepermeabilizalamembrana
plasmática y separa las fases hidrofílica e hidrofóbica del citoplasma, dando a cada fase una señal ESR
específica.El ferrocianuro es soluble en aguay no atraviesa lamembrana plasmática excepto cuando las
áreasdañadasestánpresentesdecreciendolaamplituddelaseñal(amplificante)correspondiendoalafase
hidrofílica,siendoeldecrecimientodelaseñalproporcionalaldañodelamembrana.Larazónentreamplitud
de ambas señales cuantifica el daño de la membrana. Ambas sustancias actúan como sondas
paramagnéticas,permitiendosudetecciónporresonanciadeespínelectrónico.
Paracadatratamiento,tresréplicasde150mgdesemillascadaunafueronembebidasdurante6ha
4°Cen 1mL deagua.Después deeso,O,5mLseextrajeronde aguay se agregó2mL de la solución
TEMPONE,semezclóyluegoseagregaron0,5mldeferrocianurodepotasiohastaunaconcentraciónfinal
de120mMylassemillasincubadasdurante15min.Despuésdeesto,seextrajoelsolventeylassemillasse
secarona20°Cdurante2hahumedadrelativaambiente.Lassemillassecasfueronselladasenuncapilar
de 2 mm de diámetro. Las mediciones de ESR fueron realizadas a temperatura ambiente con el
espectrómetro X&band ESR arriba mencionado. Las condiciones estándar del espectrómetro para los
radicalesnitróxidos fueron:campocentral3483Gauss;amplituddebarrido80Gauss; poderdemicroonda
6,35.10&1mW;frecuenciadelamicro&onda9,62GHz;eltiempodeconversión2,56min;constantedetiempo
2,56min,frecuenciademodulación50KHz;amplituddemodulación9,52.10&2Gauss;yganancia1,12.104.
Seacumularon20espectrosparamejorarlarelaciónseñal/ruido.
�
(19).�Calorimetría�diferencial�de�barrido�(DSC�)-�Transiciones�vítreas�
- 22 -
Latransiciónvítreapuedeserdetectadayestudiadapordistintosmétodos.Elmétodocalorimetríade
barridodiferencial(DSC)eselmásutilizado,yescapazdedetectarlatransiciónvítreaenbasealcambioen
elcalorespecíficocuandoelmaterialpasadelestadosólidoamorfoalíquidosobreenfriado.Acontinuación
semuestrauntermogramatípico(obtenidoporDSC)deunazúcarliofilizadoquemuestrasustransicionesde
fase y cambios de estado (Adaptado de Roos, 1992). El calor específico es otra de las propiedades que
cambianenlascercaníasdelatransiciónvítrea.
Se produce un cambio escalonado en el calor específico a medida que un sistema es calentado y
atraviesalatransiciónvítrea.
Fig.�2.2.-Termogramatípicodeunazúcarliofilizado(AdaptadodeRoos,1992).
Endichotermogramaserepresentaelflujocalóricoenfuncióndelatemperaturaobiendeltiempode
calentamientodelamuestra.Lamuestrasecalientaaunavelocidadconstanteenunacápsulasellada,yen
generalseutilizaunacápsulavacíacomoreferencia.
Temperatura/tiempo
Flu
jo d
e ca
lor
Formación de cristales
Fusión de cristales
Región sobreenfriada
TRANSICIÓN VÍTREA
Región vítrea
- 23 -
Elflujodiferencialdecalorsemonitoreaduranteelcalentamientode lamuestrayde lareferencia.El
cambioenel calor específicodelsólidoque ocurrea la temperaturade transiciónvítreade lamuestra,se
evidenciacomouncambioenlalíneadebasedeltermogramaamedidaquelamuestraescalentadaauna
velocidad constante desde una temperatura inicial menor que Tg hasta temperaturas mayores. A
temperaturas más altas que Tg, el azúcar se transforma en un líquido sobreenfriado. A medida que la
temperaturaylamovilidadaumentan,ylaviscosidaddisminuye,lasmoléculasdeazúcarpuedenreorientarse
hasta alcanzar un estado termodinámicamente más estable como lo es la estructura cristalina. La
cristalizaciónsemanifiestacomounpicoexotérmicoeneltermograma.Alaumentaraunmáslatemperatura,
elazúcarfundeproduciendounpicoendotérmico.Untermogramacomoeldescrito,demuestraelefectodela
temperaturasobreelestadofísicodeunalimentoliofilizadoquecontieneazúcares.
Se utilizó un calorímetro diferencial de barrido (DSC)Mettler 822 con software para análisis térmico
Starev6.0.UnafotografíadelequipamientoutilizadosemuestraenlaFigura2.1.Elbarridodecalentamiento
se realizó en el rango desde &140ºC a 120ºC. El enfriamiento del equipo se obtiene por utilización de
nitrógenolíquidoaunapresióneneltanquede150kPa.
Elequiposecalibróconindio(puntodefusión156,6°C),plomo(puntodefusión327,5°C)yzinc(punto
de fusión 419,6°C). Las muestras se colocaron en cápsulas ó crisoles de aluminio (Mettler, 40 µl)
herméticamentecerradas,sepesaronparadeterminarlamasa(7&15mg/cápsulasegúneltipodematerial)y
se midieron utilizando como referencia una cápsula de aluminio cerrada pinchada y vacía en todas las
mediciones.Unacorrientecontinuadenitrógenogaseosode200mL/minmedidoconuncaudalímetro(Bruno
Shillig,Argentina)fueutilizadaparaevitarcondensacióndeaguasobrelascápsulasysobreelsensor.Todas
lasdeterminacionesserealizaronporduplicadoyseinformóelvalorpromedio.
Sedeterminaronlastemperaturasdetransiciónvítrea(Tg)ylastransicionesentálpicas(cristalizaciones,
fusiones, etc.) de los sistemas estudiados en forma dinámica durante el calentamiento, utilizando una
velocidaddecalentamientode10°C/minapartirdelasdiscontinuidadesdetectadasenlascurvasdeflujode
calorversustemperatura.LaTgseconsiderócomola temperaturaalacualcomienzaelcambioenelcalor
- 24 -
específico (valor“onset”)quesedetectaenel termogramacomouncorrimientoendotérmicoen la líneade
base. Los valores de entalpía (∆H) se obtuvieron calculando el área de la transición exotérmica o
endotérmica,enrelaciónalamasademuestra(J/g).
Fig.�2.2.-�Fotografíadelequipodecalorímetriadiferencialdebarrido(DSC).
�
(20).�Resonancia�nuclear�magnética�(RMN)�
Para distinguir poblaciones de agua con distintamovilidad se empleó resonanciamagnética nuclear
resueltaeneltiempo(1H&NMR).SeutilizóunequipoBrukerMinispecmq20(20MHz)(Figura2.2).
Seanalizaronmuestrasde3mLdecadasistema(glicina&glucosa,glicina&trehalosaóglicina&sacarosa)
enbuffer fosfatopH5, líquidaso liofilizadas equilibradasadistintashumedades (en el rango11&97%HR),
tratadasadistintostiemposdealmacenamientoa70±1°C.Semidióeltiempoderelajacióntransversalespín&
espín(T2)(FiguraI.8)utilizandoelmétododeCarr&Purcell&Meiboom&Gill(CPMG)(MeiboomandGill,1958).
Previamente a lasmediciones lasmuestrasseequilibrarona25ºCenunbañodeagua termostático
(HaakePhoenexIIC35P,Alemania).Losdatosobtenidosfuerondeunpromediodecuatroadquisicionesde
Tanque de N2 (l)
Tanque de N2 (g)
DSC
caudalímetro
- 25 -
256 puntos, con ciclado de fases, usando una ganancia de 68 y un tiempo de interpulso (τ) de 0,5. Se
registraronsuficientesecosdemaneraquea líneadebasefueraceroyqueelT2 fueradeterminadoporel
envolventedeldecaimientodelecoutilizandoelprogramaexponencialprovistoporelproveedordelequipo.
Fig.� 2.3.-� Equipo de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), Minispec 20 (Brucker) y PC
(H.P).Resonancianuclearmagnéticaresueltaeneltiempo.
�
�
(21).�Isoterma�de�adsorción��
(a)�De�agua�
Para la determinación de la isoterma de adsorción se utilizó el método gravimétrico con registro
discontinuodecambiosdepesoyelsistemaestático,elqueconsistióencolocarelmaterialendesecadores
avacíoconteniendosalessaturadas,lascualesproporcionaronunaciertahumedadrelativaenelequilibrio.
Lassolucionessalinassaturadasdehumedadrelativa tabuladaempleadas fueron:LiCl,KH2COOH,MgCl2,
K2CO3, Mg(NO3)2, NaCl, KCl, KSO2 para humedades relativas de 11, 22, 33, 43, 52, 75, 84 y 97%
(Greenspan,1977);ysemantuvierondurantedurante15díasa20°C.
Para obtener la isoterma de adsorción y el valor de humedad residual correspondiente al valor de
monocapa (mo) se ajustaron los datos obtenidos de contenidos de humedad correspondientes a cada
- 26 -
actividaddeagua,alaecuacióndeG.A.ByaladeB.E.T.LasecuacionesdeG.A.B.ydeB.E.T.utilizadasse
presentanenlasexpresiones2.1y2.2,respectivamente:
A
mAw AwW = + +α β ε2 �
Donde:
α = −
Kb
m co
11 β = −
1
12
m co
ε = 1
m K co b
α β ε, , :parámetrosdeajuste
�7�������:actividaddeagua
8���y#:constantesdelaecuacióndeGAB
���:humedadenbaseseca(gH2O/gsemillassecas)
� �������:humedaddelamonocapa(gH2O/gsemillassecas)
Aw
Aw m m c
c
m cAw
o o( )1
1 1
−= + −
Donde:
#: eQ
R Ts
:constantecalóricasuperficialdeBET
9������:calordesorcióndeBET(cal/molH2O)
RyT:constantedegasesytemperaturarespectivamente.
ParaladeterminacióndelaisotermayparámetrosdelaecuacióndeGABseutilizóunaregresiónno
linealdesegundoorden,mientrasqueparalosdelaecuacióndeBET,unaregresiónlineal.
- 27 -
ParaelajustededatosseempleóunsoftwaredelabibliotecaGraphPadPrism.
�
(b)�De�nitrógeno�
Con el fin de evaluar la porosidad del contenido celular de las semillas de sauce en estado
deshidratado,sedeterminólacapacidaddeadsorcióndenitrógenodesemillassecas.Seemplearontambién
semillas de trigo para comparar la porosidad de ambos tipos de semillas demuy distinta longevidad. Las
muestras se congelaron bajo nitrógeno líquido (77k, &196º C). Las isotermas se determinaron a esta
temperaturaempleandounequipoautomáticodeadsorcióndegas(SorptometerGemini2360V2.00)luego
de desgasificar lasmuestras a vacío, en el rango deP/Po de 0.09 a 1 (multipunto). Se realizó también el
cálculodelasáreassuperficialesporpuntoúnicoaP/Po=0.03.Apartirdelosresultadosobtenidossecalculó
eláreaespecíficadeporción(SBET)porelmétodoBrunauer&Emmett&Teller(BET)yelvolumentotaldelporo
(TPV)estimadoapartirdelaecuacióndeBarret&Joyner&Halenda(BJH).
(22).�Análisis�estadístico�
Todos los resultados losvalorescorrespondena lamedia±eldesvíoestándar (DS).Lasdiferencias
entretratamientossedeterminaronusandoeltestdeTukeyconα≤0.05.
- 28 -
CAPÍTULO�3.I�
EL�COMPORTAMIENTO�DE�LAS�SEMILLAS�DE�SAUCE�EN�RELACIÓN�AL�SECADO,�LA�
TEMPERATURA�Y�LA�HUMIDIFICACIÓN�
�
INTRODUCCIÓN�
Lassemillasdesauce(�����sp.)tienencortavidayatemperaturaambientesuviabilidadsepierdeen
pocas semanas (Teng y Yu, 1948; Arya y col., 1988); por ello, no es posible encontrarlas a la venta
(Brinkman,1974). Inicialmenteseconsideróquese tratabadesemillasrecalcitrantes(KingyRoberts,1979;
Pence, 1995). Más recientemente, Hong y col. (1996) clasifican las semillas de 28 especies de sauce
encontrandoque27correspondíanalacategoríaortodoxasylarestante,�0�#���!��aladecomportamiento
intermedio. Estos últimos autores tienen en cuenta que las semillas de aquellas 28 especies se habían
mantenido sin pérdida de la viabilidad por algunos años en condiciones de temperaturas bajo cero y bajo
contenidodehumedad(Crocker,1938;Sato,1955;ZasadayDensmore,1977,1980;Simak,1982;Densmore
yZasada,1983;Bol'shakow,1988).�0�����,�0�����������y�0��������noseincluyenenestare&clasificación.
Amedidaquelassemillasdeunlotevanenvejeciendo,yantesdequepierdanlaviabilidad,losdañosalos
componentescelularesasociadosaeseprocesodeenvejecimientosereflejanenunaprogresivadisminución
de la calidad fisiológica quemostrarán las plántulas generadas de esas semillas. Así resultara afectadas
características comoaltura, desarrollo de la raíz, longituddel hipocótilo, tamaño, color, comoasímismo la
velocidaddegerminación.Estascaracterísticasdefinenelvigor.Porlotantounlotedesemillasquemuestra
germinaciónrápida,uniformeyundesarrollonormalde lasplántulas, tienenaltovigormientrasqueun lote
quecarecedeesascaracterísticastienebajovigor.Cabemencionarqueestaesunadefinicióndevigorde
alcance restringido, o mejor dicho, adaptado al marco experimental de esta tesis, en la que evalúa el
comportamientogerminativoenlasclásicaspruebasdegerminaciónsobrepapelembebidoenagua,loque,
porotraparteesloquecorrespondeaestetipodetrabajo.Unadefiniciónmasampliadelconceptodevigor
- 29 -
incluyeunítemsumamenteimportantecomoeslavelocidaddeemergenciaacampoqueobviamenteaquíno
seconsidera.
Losparámetrosgerminativosqueseconsideranalolargodeestatesissongerminaciónnormal(GN),
germinaciónanormal(GA)ygerminacióntotal(GT)y tiempomediodegeminación(TMG)y,eventualmente
otrosparámetroscuandosehacereferenciaalabibliografía.
Enestecapítuloseconsideralacuestióndelatoleranciaaladesecaciónyla longevidadadiferentes
temperaturas a fin de precisar la información existente, sobre todo teniendo en cuenta que la categoría
ortodoxaasignadaaestassemillasnopareceríacorresponder,almenosestrictamente,conlalongevidadque
seesperadeunasemillapertenecienteaesacategoría.
También este capítulo trata sobre el efecto que tiene la humidificación, sobre todo porque entre los
poquísimostrabajosfisiológicosdedicadosaestassemillasseencuentraaPolyaetal.(1961)quiendetectó
ensemillasdeálamoqueeseprocesomejoraelcomportamientogerminativo.
- 30 -
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
Las semillas de �0� ����, inmediatamente luego de ser expulsadas de la cápsula, exhibieron un
contenidodedeagua(ca)de40%yunporcentajedegerminaciónde100%.La inmersiónde lassemillas
recientemente liberadas en nitrógeno líquido fue letal, ya que la germinabilidad fue nula. Después de tres
horas de permanencia en condiciones ambientales, el contenido de agua descendió a 12% sin que se
registrara reducción del porcentaje de germinación; las semillas deshidratadas de este modo no fueron
afectadas por el tratamiento con nitrógeno líquido (Tabla 3.I.1). Resulta evidente, entonces, que 3 h de
deshidratación natural fueron suficientes para reducir el contenido de agua (ca) por debajo de aquél que
permitelaformacióndehielo,letalparalostejidosvivos(Stanwood,1985).Estelotedesemillascon100%de
germinación toleró una posterior deshidratación artificial a 9 y 6,7% de ca sin que se redujera
significativamente la germinación inicial (Tabla3.I.1).Esta se redujo a la cuartaparte cuando el ca bajó a
4.3%.El lotedesemillascon75%degerminación inicial fuemássusceptiblea ladeshidrataciónyaque,a
diferencia del lote con 100%de germinación inicial, cuando el ca se redujo a 6.7% hubo una disminución
significativaa55%degerminación,yunamásacentuadadeshidratacióna4.3%ca laredujoa33%(Tabla
3.I.1).Seobservoqueenamboslotes,lagerminacióndesemillasconcaentre12y4.3noresultóafectada
poreltratamientoconnitrógenolíquido.
- 31 -
Germinación�inicial�normal�
100%� 75�%�Contenido�de�humedad�
(%�base�húmeda)�-�LN� +�LN� -�LN� +�LN�
12� 100ª 98ª 75ª 70a
9� 94ª 96ª 68ª 66ª
6-7� 89ª 93ª 55b 54b
4-3� 23b 28b 33c 36c
�Tabla� 3.I.1.- Influencia del contenido de agua sobre la germinación (%) de dos lotes de semillas de
Salixalbaquedifierenenlagerminacióninicial,expuestosanitrógenolíquido(+LN)ynoexpuestosnitrógenolíquido (&LN). Los valores seguidos con la mismo letra (superíndice) dentro de la columna son nosignificativamentediferentesen�=0.05poreltestdeTukey
Similaresresultadosconrespectoaladeshidrataciónyalatoleranciaalnitrógenolíquidoseobtuvieron
consemillasde�0���������� (Fig.3.I.1).Semillas reciénexpulsadaspresentaron41%decayentre98y
100%degerminación inicial; deshidratadaspor3h encondicionesambientales redujerona 11%elcasin
afectarlagerminación.Unamayorreduccióndelcaa6,5%,llevólagerminaciónal86%,mientrasqueuna
reducciónaúnmayora4.4%calabajóa16.5%.Comoenelcasode�0�����,elnitrógenolíquidoresultóletal
para lassemillas reciénexpulsadas, peronoafectó lagerminaciónde lassemillasdeshidratadasnatural y
artificialmentealosdiferentesca.Semillasde�0����������con11%ca,almacenadasdurante11mesesen
nitrógeno líquido no mostraron disminución significativa de la germinación (datos no mostrados). Esta
tolerancia al nitrógeno líquido fue observada por Pritchard y Seaton (1993) para semillas de vida
relativamente corta. Además, el tamaño tan pequeño de las semillas de sauce facilita el empleo de este
método.�
- 32 -
0%
20%
40%
60%
80%
100%
A A+NL B B + NL C C + NL D D + LN
Tratamientos
Por
cent
aje
del n
úmer
o to
tal d
e se
mill
as
Germin.normal Germin. anormal No germinadas �
�
Figura�3.I.1.Germinación(%)desemillasde�0����������despuésdeltratamientodedeshidratación,
cada unocon/ y sin inmediata inmersión en nitrógeno líquido (NL)durante 1 h.A,Semillas recientemente
liberadas (control): 40% contenido de humedad;B, 3 h después de liberadas en condiciones ambientales:
11%contenido de humedad;C, desecadasen solución saturadade LiCl: 6.5% contenidode humedad;D,
desecadas en solución saturada de H2SO4 : 4.4% contenido de humedad. Los valores de barra son
promediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.
- 33 -
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 30 60 90 120 150 180
Tiempo (dìas)
Ger
min
ació
n no
rmal
(%
)
25ºC
5ºC
-20ºC
Figura�3.I.2.-Germinación (%)deSalixalbadespuésdeseralmacenadasencondicionesde9%de
contenidoacuosoya25º,5ºy&20ºC.Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillascadauna
±DE.�
Elefectodelatemperaturadealmacenamientosobrelalongevidaddesemillasde�0�����con9%ca
semuestraenlafigura3.I.2;laviabilidadseperdióen2semanasa25ºC.Sinembargo,lasupervivenciade
lassemillasseextendióavariassemanasa5ºCyavariosmesesa–20ºC.Semillasde�0����������con
10.5%caalmacenadasa–70ºCmantuvieronsusnivelesdegerminacióninicialhasta30meses(Tabla3.I.2).
Comoseindicóenlaintroducciónsemillasdealgunasespeciesdesauce,entrelasquenoseencuentranlas
aquí estudiadas, conservaron porcentajes de geminación relativamente altos durante unos pocos años
(Crocker, 1938; Sato, 1955; Zasada y Densmore, 1977, 1980; Simak, 1982; Densmore y Zasada, 1983;
Bol'shakow,1988).
- 34 -
Germinación�(%)�
Meses�de�
almacenamiento�24�h*� Normal�+�Anormal� Normal�
6� 95±1.8 100 98±1.4
18� 96±4.5 100 95±3.9
24� 100 100 97±4.5
3� 89±9.6 99±3.3 97±4.5
*Desdelasiembra
Tabla�3.I.2.-Germinación(%)desemillasde�0����������almacenadasdurantediferentesperíodosa10.5%decontenidodehumedady–70ºC.Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±ds
�
Los resultados aquí obtenidos muestran que la germinación de las semillas de ������ ���� y �0�
���������, recién resultan afectada amuy bajos ca y que la longevidad esmayor cuantomas baja e la
temperaturas.DeacuerdoconelcriterioqueHongyEllis(1996)aplicanalacaracterizacióndelassemillas
ortodoxas(�0!.amenorcaymenor temperaturacorrespondemayor longevidad)esposibleconcluirque las
semillasdelasdosespeciesinvestigadasmuestranuncomportamientoortodoxoduranteelalmacenamiento.
Estaconclusiónconcuerdaconelcomportamientoortodoxoasignadoalassemillasdelasotras28especies
de sauce (Hong y col. 1996). Sin embargo, entre las semillas ortodoxas, aun las menos longevas, se
mantienenviablesdurantealmenosunospocosañosatemperaturaambiente,enlugardedecaertanrápido
comolohacenlasdesauce.Enestesentidomuestranunaatipicidadcuyascausasnohansidoinvestigadas
y este es unos de los ítems que se trata de aclarar en los siguientes capítulos (Capítulos 3.III y V). Un
comportamiento también atípico que detectamos en estas semillas consiste en su respuesta a la
humidificación. Este procedimiento se aplica a aquellas semillas cuya germinación se puede ver afectada
cuando son puestas a germinar directamente sobre papelmojado. Se considera que la rápida entrada de
aguaqueseproducenodatiemposuficienteparaquelamembranaplasmáticapasede lafasegel,propia
delestadodeshidratado,alafasecristal,propiadelestadohidratado,quenoesafectadaporlavelocidadde
- 35 -
hidratación. La lenta hidratación que se produce con la humidificación, en cambio, permite que ocurra la
transicióndefasey,puestaagerminar,lasemillalohacesinqueseveaafectadasugerminación.
Al respecto, ensemillasdeunaespeciedesalicácea,comoel álamo,Polya (1961)detectóquecon
humidificaciónpreviaaumentabaelporcentajedesemillasquemostrabanGN,hechoqueloatribuyóaquese
evitabadañoporimbibición.Esteesunodelospocosantecedentessobreestudiosfisiológicosensemillasde
salicáceasyquisimosconocercualeslarespuestadelassemillasdesaucealahumidificación,dadoqueel
comportamientogerminativoesuntemadeestatesis.
Enlosexperimentosseusaronlotescondiferentesporcentajesdegerminacióninicial,reflejodelgrado
deenvejecimientodelassemillas.Eltratamientodehumidificaciónenloslotesdesemillasdeterioradasde�0�
����(Fig.3.I.3)y�0����������(Fig.3.I.4)dieronporresultadoprimeramenteunareduccióndelporcentajede
GNquefueseguidoporunincremento.Porejemplo,enelloteAde�0����(Fig.3.I.3),lagerminacióninicial
de 42%se redujo a 33% a las tres primeras horas de tratamiento,mientras que a las 6 h la germinación
recuperó, recobrando el porcentaje de germinación inicial (41 %) el que continuó incrementándose hasta
superarel60%.Uncomportamientosimilarseinsinuóenlos lotesByC,aunquelaeventualrecuperación
quedóinconclusadebidoalafaltadesemillas.
- 36 -
0
10
20
30
40
50
60
70
0 3 6 9 12 15
Tiempo (horas)
Ger
min
ació
n no
rmal
(%
)
A
B
C
Figura�3.I.3.-Efectodehumidificacióna100%HRy25ºCsobrelagerminación(%)delotesdesemillas
������ ���� (A&C) con diferente germinación inicial. El contenido inicial de agua fue 9 %. Los valores sonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.
10,5
17,5
25,1
33,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (horas)
Ger
min
ació
n y
cont
enid
o de
hum
edad
(%
)
GT lot A GN lot A caGT lot B GN lot B �
�Figura� 3.I.4.- Efecto de la humidificación a 100% HR y 17ºC sobre la germinación (%) de lotes de
semillasde���������������(AyB)condiferentegerminacióninicial.Elcontenidodeaguainicialfue10.5%.Germinaciónnormal+anormal(G);GerminaciónNormal(GN).Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.
- 37 -
Respectodelassemillashumidificadasde�0����������,loslotesAyB(Fig.3.I.4)siguieronunpatrón
similar.Despuésde3hdehumidificaciónelporcentajedeGNseredujoalaterceraparte:de90%y46%a
30%y15%paraloslotesAyBrespectivamente.Acontinuaciónseprodujounpaulatinoincrementoquellevó
a laGNaaprox.80%paraambos lotesa las 9horasdehumidificación,valor quesuperaampliamenteel
inicialdelaGNdelloteB.Polya(1971),encambio,solodetectaunefectofavorabledelahumidificaciónque
hace aumentar el porcentaje deGN, lo que también sucede en trabajos de otros autores que emplean el
tratamientodehumidificación(BewleyyBlack,1994;Ellisycol.,1990;Pollock,1969).
Enlosexperimentosllevadosacaboenesteestudio,tambiénhubounincrementodelaGN,perofue
posterioraladisminucióninicialquealcanzóelvalormásbajoalas3hdehumidificación.Enesemomento,
elcapromedió25,1%(Fig.3.I.4),unnivelque,deacuerdoaHongyEllis(1996)excluyelaposibilidaddeque
ocurradañoporimbibición.Además,variaspruebasdegerminaciónhechasconlotesdesemillasdeambas
especies con ca entre 9 y 12% mostraron 98&100% germinación normal cuando se hicieron sin previa
humidificación,locualsugierequenosehabíanproducidodañosporimbibición(Tabla3.I.2,Fig.3.I.1).
Porotraparte,llamalaatenciónquelaGTsehayamantenidoprácticamenteen100%alas3horasde
humidificación,momentoenquelaGNdescendióasuvalormasbajo,dadoqueengenerallosvaloresbajos
deGNsecorrespondenconsensiblesdisminucionesdelaGT,noproduciéndosetanaltaproporcióndeGA
comolomuestranlasFiguras3.I.4y3.I.5.EnconsecuenciatantoelinicialdescensodelaGN,comolafalta
decorrespondenciaentreGNyGTdurante lahumidificaciónsonotrosrasgosatípicosquesetratanen los
capítulos3&IIIy3&IV.
- 38 -
Figura�3.I.5�–Plántulasdesemillasde����������������correspondientesal loteB:A,control;B, tres
horasdehumidificación;C,9hdehumidificación.NóteseenBquelasplántulasmuestranmarcadodesarrollo
anormal(reduccióndecotiledones,hipocótiloyraíz,tamañomenorysignificativapérdidadeclorofila).EnC,
lasplántulasmuestranundesarrollonormal,quesuperaencalidadfisiológicaaldelasplántulascontrol.
Los resultados sugieren que algún proceso deteriorativo, diferente a los daños por imbibición,
explicarían ladisminuciónobservadaen lagerminaciónen loscomienzosde lahumidificación,yqueen la
posteriorrecuperaciónestaríainvolucradoalgúnprocesometabólicodereparación.(BurgassyPowell,1984;
Bray y col., 1989; Gray y Drew, 1991; Fujikura y col., 1992). Este comportamiento de las semillas
humidificadas de �0� ���� y �0� ��������� no ha sido previamente reportado para ninguna especie de
Salicaceae.Paraaclararestosaspectos,losestudioscontinuaronenunaterceraespeciedesauce,�0������
L.ylosresultadossemuestranenlossiguientescapítulosdeestatesis.
- 39 -
CAPÍTULO�3.II�
ESTUDIOS�HISTOQUÍMICOS�Y�SUBCELULARES�EN�SEMILLAS�DE����4���1����4�5�����1�
���4�����Y� � ����������
�
INTRODUCCIÓN�
Las semillas maduras de las especies de Salicáceas tienen un embrión de color verde porque sus
tejidos contienen clorofila. La presencia de clorofila en los embriones en desarrollo constituye un carácter
bastantecomúntantoenMonocotiledóneascomoenDicotiledóneas(YakovlevyZhukova,1980);esdecir,en
la mayoría de las especies, la clorofila aparece en los embriones en los estados globular a torpedo y
desaparece cuando las semillas alcanzan la madurez (Klein y Pollock, 1968; Yakovlev y Zhukova, 1980;
BewleyyBlack,1994;Dahlgren,1980;PeriasamyyVivekanadan,1981;Janzen,1982;PretováyVojteková,
1985;VertucciyFarrant,1995).Sinembargo,seha reportadoque lassemillasmadurasdealgunaspocas
especiesmantienenlaclorofilaenlamadurez.Entreestasespeciessepuedenmencionar:�)�#!�����������
(Farrant y col., 1992);�#!����!�� �������� (Pinfield y col., 1973);8 #"��� #"������ (Marin yDengler, 1972),
8 #"��� ����#� (El&Shishiny y Thoday, 1953),���� ��� ) �:!���� y�!��!���� �������� (Negbi y Tamari, 1963).
Existensinembargoalgunasdiferenciasentre ellasen loquese refierealmomentoen quedesarrollanel
sistema de tilacoides: en �)�#!���� ������ la estructura granal desarrolla apenas poco antes de que las
semillasesténmadurasparasudispersión,aunqueloscloroplastossemuestrantotalmenteorganizados24
hdespuésdelaabscisióndelfruto.Losembrionesmadurosde !���� ���#�+!��(ZhukovayYakolev,1966)
también presentan cloroplastos pero en las semillas maduras el sistema de endomembranas no está
organizadoengranos.
Hastael presente,noexistenestudiosmorfológicos,histoquímicosnisubcelularesensemillasde las
especiesdeSalicáceas.Enestecapítuloseinvestiganlascaracterísticasestructuralesyultraestructuralesde
lassemillasmadurasdetresespeciesdesauceyunadeálamo(����������L.y�0����������Koidz.,������
�����Marsh.y� �����������L.)usandomicroscopíadecampoclaroyelectrónicadetransmisión.Asimismo
- 40 -
se determina la naturaleza de las principales sustancias de reserva de estos tejidos usando métodos
químicos, histoquímicas, físicos. Finalmente se analiza comparativamente el contenido de clorofila de las
semillas de ������ ����� y de � ������ �����. Estos estudios tienen el objetivo de identificar aquellas
características que podrían estar relacionadas con el comportamiento atípico de estas semillas durante el
almacenamiento(Cap.3&I).
�
- 41 -
RESULTADOS�
Las semillas contienen lípidos y proteínas como sustancias de reserva. El contenido de lípidos y
proteínastotalesalcanzavaloresaproximadosde20y34.6%,respectivamente.
Las semillas de las especies de sauce aquí estudiadas carecen de endosperma en el estado de
madurez. Por ello, las semillas consisten de un embrión y una cubierta seminal (Fig. 3.II.1 A). No se
encontrarondiferenciasentrelasespeciesestudiadas.Lacubiertaseminalconsistede3&4capasdecélulas
muertas(Fig.3.II.1B).Lacapaexternapresentaengrosamientosdeligninasobrelasparedesradiales(Fig.
3.II.1B). La lignina fue identificadacon floroglucinol. Lascélulasde lascapas subyacentes tienen paredes
delgadasycarecendecitoplasma.
El embrión es recto, y consiste de dos cotiledones y un corto eje (Fig. 3.II.1 A). El eje tiene en sus
extremos los meristemas apicales del brote y de la raíz. El meristema apical del brote es una estructura
cónicaenlacualsediferencia laorganizacióntúnica&cuerpo,típicadelosmeristemasapicalesdelbrotede
lasAngiospermas(3.II.1C).Enestecasolatúnicaestáconstituidaporunaúnicacapadecélulas.Noexisten
primordios foliares diferenciados. En el ápice meristemático de la raíz se pueden identificar las células
inicialesdelacaliptrayprotodermis,delacortezaydelcilindrocentral(3.II.1D).
Enloscotiledonescomoeneleje,sepudieronidentificarlostejidosprecursoresdelaepidermis,delos
tejidos vasculares y del parénquima, es decir, la protodermis, el procambium y elmeristema fundamental.
Esta identificación fue posible hacerla, teniendo en cuenta la forma, tamaño y posición de las células del
embrión(Fig.3.II.2A&E).Laprotodermisformaunacapacontinuaalrededordetodoelcuerpodelaplanta,
salvoenlosmeristemasdondenoestádiferenciada.Unacutículadelgadaseobservasiempresobrelapared
externa. En los cotiledones, el meristema fundamental se diferencia en los tejidos en empalizada y
esponjoso,elprimero,concélulasalargadasenelejeperpendicularalasuperficie;elsegundocomocélulas
isodiamétricas.Eneleje,elmeristemafundamentalconstituyelacorteza,ysuscélulassonisodiamétricas.El
procambiumestáconstituidoporcélulasangostasyalargadas.Enloscotiledones,eltejidoprocambialforma
unhacecillomediodelqueseseparanhaceslaterales.Eneleje,elprocambiumformauncilindrocentral.
- 42 -
Todas las células del embrión tienen paredes primarias. En el citoplasma, pueden identificarse los
cuerposproteicos, loscuerpos lipídicos,mitocondrias,cloroplastos,retículoendoplásmicoyelnúcleo(3.II.2
A&F,3.II.4).Enlascélulasdelmeristemafundamentaldeloscotiledonesydeleje,loscloroplastosestánbien
desarrolladosy,ocasionalmente,contienenalmidón.Enlascélulasdelprocambium,delaprotodermis,yen
lascélulasqueconstituyenlosmeristemasapicales, losplástidosnoestándiferenciadoscomocloroplastos,
esdecir,carecendeendomembranas,yenellosesfrecuenteencontrardepósitosdefitoferritina(Fig.3.II.3D&
F).
- 43 -
Fig.� 3.II.1.- Secciones de semillas maduras de ������ ����. A, Microscopía de campo claro de unasección longitudinal de la semilla. La sección fue teñida con azul de toluidina. Escala = 100 fm. B&CMicroscopíaelectrónicadetransmisión.B,Tegumentodelasemilla.Escala�=10fm.C,Secciónlongitudinalmedia del ápice meristemático del brote. Escala = 10 fm.D, Microscopía de campo claro mostrando laorganización delmeristema apical de la raíz.Escala = 10 fm. Abreviaturas: ar, ápice de la radícula; co,cotiledón; cp, cuerpo del ápice meristemático del brote; cha, chalaza; ej, eje radícula&hipocótilo; en,engrosamientodelaparedcelulardelaexotesta;ic,célulasinicialesdelmeristemafundamental;icc,célulasinicialesdelcilindrocentral;ipr,inicialesdelaprotodermisydelacaliptra;pd,protodermis;r,rafe;spd,unacélulasubprotodérmicadelacorteza,vacuolizada;tu,túnica�va,vacuola.
- 44 -
Fig.� 3.II.2.- Microscopía de campo claro de los tejidos de los cotiledones de �����. Los cuerpos
proteicos(flechas)estánpresentesentodoslostejidos;contienenunoomáscristalesgloboides.Algunosdelosgloboidessehanperdidodurantelafijacióneimbibición,dejandounhuecodentrodelamatrizproteicadeloscuerposproteicos.Loscloroplastos(cabezadeflecha)estánenlostejidosdeempalizadayesponjosoyenalgunascélulasde laprotodermis.Lascélulasvacuolizadasseencuentranen lacapasubprotodérmica.Las secciones fueron teñidas con azul de toluidina.A, Sección longitudinal de uno de los cotiledones delembrión maduro de �0� ���������.Escala: 20 fm.B,C, Secciones longitudinales de los cotiledones deembrionesjóvenesde�0�����.,coleccionado15díaspreviosalmomentodeladispersión(B)ycoleccionado7 días precios al momento de la dispersión (C). Escala: 10 fm. D, Sección longitudinal de uno de loscotiledonesdeunasemillamadurade�0�����;seobservalaprotodermisyeltejidodeempalizada.Escala:10fm.E,Secciónlongitudinaldeunodeloscotiledonesdeunasemillamadurade�0�����.Semuestranlaprotodermisyeltejidoesponjoso.Escala:10fm.(hv,hacecillovascular;�va,vacuola).
- 45 -
Los cuerpos proteicos contienen 2 o más globoides, salvo en las células de la protodermis, en las
cualeslosgloboidesfrecuentementeestánausentes.Enlosgloboides,elusodeenergíadispersivaderayos
XpermitiódetectarP,K,MgyCacomosusprincipalesconstituyentes(Fig.3.II.5A&B).Loscuerposlipídicos
estándispuestosenproximidadesdelamembranaplasmáticaytambiénestándistribuidosalrededordelos
cuerposproteicos (Fig.3.II.3A&D).Lapresenciadeproteínas fuedeterminadapor tinciónconazulbrillante
coomassie, ácido fucsínico y fast green FCF. La presencia de los lípidos fue determinada por tinción con
SudanblackB.
Unacaracterísticapeculiarencontrada enel embriónde sauce fue lapresenciadecélulasconunaamplia
vacuola central, que desplaza el citoplasma y organelas contra la pared; estas células vacuolizadas que,
llamativamentesóloseencuentranenlacapasub&protodérmica,alternandemanerairregularconlascélulas
reservantes (Fig. 3.II.2 A&E). En algunos casos se identificaron taninos y sales de oxalato deCa en esas
vacuolas.
- 46 -
Fig.� 3.II.3.- Micrografías obtenidas con microscopía electrónica de transmisión, de los tejidos
embrionarios de una semilla madura. A, células del tejido de empalizada de �0� ����. Escala:: 2 fm.B,Célulasvacuolizadasdeltejidoesponjosode�0�����.Escala:1fm.C,detalledeunodeloscloroplastosdela figuraA. Uno de los cloroplastos contiene un pequeño grano de almidón (flecha).Escala: 0.5mm.D,Plástidosdeltejidomeristemáticodelápicedelbrotedeunembriónde�0����������.Puedeserobservadoun depósito de fitoferritina en su característico arreglo cristalino. Escala: 0.2 fm.E, Detalle de plástidosmostrando depósitos de fitoferritina. Escala: 0.1 fm. F, Cuerpo proteico de una célula del tejido deempalizadadeunasemillade�0�����.Laimagenmuestrauncuerpoproteicoelcualconsistedelamatrizyde3cristalesgloboides(cabezadeflecha).Escala:1fm.Lasseccionesfueroncoloreadasconacetatodeuranilo seguidas por citrato de plomo (ch, cloroplasto; cl, cuerpo lipídico; ei, espacio intercelular; m,mitocondria;pc,paredcelular;va,vacuola).
- 47 -
Elanálisisdelaclorofiladelembriónde�����������y�� ������������revelólapresenciadeChl�yChl�.
Elestudioquedeterminalaabsorbancialeídaconunespectrofotómetro,permitiódeterminarquelaclorofila
totalfuemayorenlosembrionesdesaucequeenlosdeálamoyencambiolarelaciónChl�;Chl�fuecasiel
dobleenlosembrionesdeálamo,comparadosconlosdesauce(Tabla3.II.1)�
GN� Chl��� Chl��� Chl���6Chl��� Chl�total�
%� Lg/mg�de�peso�seco
����&�'�*��� 94 2.08 1.4 1.48 3.14
#)�����'�*��� 95 0.21 0.08 2.62 0.29
Tabla�3.II.1.-�Concentracionesdeclorofila(`g/mgdepesosecodetejidosseminales)ylarelaciónChl�;��ensemillasde������������y� �����������0�GN:germinaciónnormal
Fig.� 3.II.4.-Micrografía obtenida conmicroscopía electrónica de transmisión de una célula del ápice
meristemático de la raíz del embrión de ������ �����0 En esta parte del citoplasma pueden observarse elretículo endoplásmico rugoso en cisternas apiladas, unamitocondria, y varios cuerpos lipídicos. La flechaindicaundepósitodefitoferritinaenunproplástido.Escala:1fm.
- 48 -
Fig.�3.II.5.-EspectrosdelosanálisisEDXdelosgloboidesencontradosencuerposproteicosdecélulasdeempalizadadecotiledonesde����������(A)y���������������(B)
�
- 49 -
DISCUSIÓN�
Nadaseconocíasobrelascaracterísticassubcelularesdelostejidosembrionariosdelasespeciesde
Salicáceas y en la bibliografía solo aparece reportado que las semillas son verdes, es decir los tejidos
embrionarios contienen clorofila en su madurez. Es cierto que los embriones en desarrollo de muchas
especiesdeplantassonverdesdebidoalapresenciadecloroplastossimilaresaloscloroplastosdelashojas;
sinembargo,estosembrionesclorofílicossevuelvenaclorofílicosenlamadurez.Esdecir,elestadoclorofílico
existe, en la mayoría de los casos, sólo durante el desarrollo del embrión (Dahlgren 1980; Yakovlev y
Zhukova1980;Janzen1982;VertucciyFarrant1995).Cloroplastosyclorofilahansidoencontradosen los
embrionesmaduros demuy pocas especies: !���� � ��#�+!�� (Zhukova y Yakolev 1966),8 #"��� #"������
(MarinandDengler1972),�#!����!�� ��������(Pinfieldycol.1973),�)�#!�����������(Farrantycol.1992,
1997)y1:!�!����� #��!���� (Pammenterycol.1998).Lassemillasde !���� ���#�+!�� tienen larga vida
(Priestley1986)aunquecabe ladudadequeelestudiodeZhukovayYakolev (1966)sebaseensemillas
totalmente maduras. En �#!�� ��!�� ���������� �)�#!����� ������� %� 1:!�!����� #��!����� las semillas son
categorizadas como recalcitrantes (Pinfield y col. 1973; Farrant et al 1992; Pammenter et al 1998). El
comportamientoduranteelalmacenamientode8 #"���#"������esdesconocido.Lassemillasdelasespecies
de���.� que aquí se estudian son ortodoxas con un períodomuy corto de viabilidad (Capitulo 3&I.de esta
tesis)ellaspresentancloroplastoscongranabiendesarrolladayfrecuentementealmidónenelestroma,es
decir cloroplastos similares a los encontrados en las semillas maduras de !���� � ��#�+!��, �#!��
��!�� ��������,�)�#!�������������1:!�!����� #��!����� y8 #"��� #"������. Teniendo en cuenta las especies
mencionadasincluidaslasdeSalicáceas,esposibleinferirquelapresenciadecloroplastosenlosembriones
madurosnopareceríaestarasociadaconelcomportamientodelassemillasduranteelalmacenamiento.
Lapresenciadeclorofilaydecloroplastoscongranasugiereque loscotiledonesdesauce (yde las
otras especies mencionadas con similares características) son capaces de cumplir su rol de órganos
fotosintetizantesmastempranodurantelagerminaciónqueentodasaquellasespecies(quesonlamayoría)
- 50 -
en las cuales debe producirse el desarrollo de la grana y la síntesis de clorofila antes que la fotosíntesis
puedaseractivada,loqueocurredespuésdelaimbibición.
La relación Chl �;Chl �� de aproximadamente 3&4 es reportado para hojas normales de diferentes
especies adaptadas a crecer en altas intensidades de luz. De acuerdo a Palanisamy (1989) y Pretová y
Vojtekova (1985), la relación Chl �;Chl � es más baja en embriones verdes que en hojas normales. Sin
embargo,enembrionesde�0������yde� �����������,convaloresde1.48yde2.62,respectivamente,los
valores resultaronsimilaresa losencontradosenhojasnormalesdeespeciesadaptadasacrecerenbajas
intensidadesdeluz,condiciónenlacuallaactividadfotosintéticaesmásalta(Thornber1975).Estosugiere
quelaclorofilaencontradaenlassemillasdesauceyálamoayudaríaenlaemergenciaycrecimientodelas
diminutasplántulas,probablementeensombrecidasporlavegetaciónquelarodea.
La fitoferritina,proteínaquealmacenaelhierro, juegasu rolenelmetabolismodelhierro (Harrisony
Arosio 1996). La fitoferritina se encuentra especialmente en los plástidos de los tejidos agranales de los
meristemasapicalesdelbroteylaraízy,menosfrecuentemente,enloscloroplastosgranalesdelrestodelos
tejidosembrionarios.Lafitoferritinaentejidosseminaleshasidoreportadaenproplástidosdecotiledonesde
algunosmiembrosdeFabaceae, i.e.����������)��L. (LobreauxyBriat1991),<�#��� +��� L. (Johanssony
Walles1994)y4!�#�������*�������L. (Baldanycol.1995)ydeChenopodiaceae, i.e.4"!� � �����*��� �
Willd. (Pregoycol.1998).También la fitoferritina fueencontradaenelendospermade%����!� ��!�!)��!��
(Oteguiycol.1999).Lapresenciadefitoferritinaenlosproplástidosysucarenciaenloscloroplastos,sugiere
queenelprocesodetransformacióndeunaorganelaenlaotra,elFedelafitoferritinaesusadoenlasíntesis
deproteínasyenzimasdelsistemafotosintéticoquelocontiene.
Ademásdelapresenciadecloroplastosdesarrollados,lascélulasdelostejidosembrionariosdesauce
retienenensumadurezuncomplejosistemademembranas,estoes,elreticuloendoplásmicorugosoylas
mitocondrias con crestas parcialmente desarrolladas. Estas características hasta el momento habían sido
reportadassóloensemillasrecalcitrantes(Farrant,ycol.1989;1992).Enlassemillasortodoxas,encambio,
seproduceunadesdiferenciacióndecloroplastosymitocondriasyunareduccióngeneraldemembranasen
- 51 -
losúltimosestadosdeldesarrollode lassemillas.Esentoncesquelassemillasdesauceseapartandelas
categorías tradicionalmentereconocidasensemillasyconfirman lahipótesisdeque lasmismasconforman
unmodelodiferente.
Encuantoa las reservas,se identificaron lípidos,proteínasyminerales.Loscuerpos lipídicos fueron
detectadosentreloscuerposproteicosyencontactoconlamembranaplasmática.DeacuerdoaVertucciy
Farrant (1995), estos cuerpos lipídicos están presentes en las células de los embriones de semillas
recalcitrantesyortodoxascumpliendo las funcionesde reservaysu funciónseasociacon lanecesidadde
repararyconstruirmembranasaliniciodelaimbibición.
En las semillas típicamente ortodoxas, la vacuola central está ausente en las células de todos los
tejidos embrionarios (Vertucci y Farrant 1995). Vacuolas grandes que ocupan una posición central en las
células, es decir, célulasdiferenciadas, fueronobservadasen todos los tejidosde los cotiledones y eje de
�)�#!����� �������� ���� ��"��� :��:��� y �#�� ���� �!������#!��� (Farrant y col. 1989; Berjak y col. 1992;
Farrant y col. 1992), todas ellas con semillas recalcitrantes. Las semillas de las especies de ����� aquí
estudiadas, tienenvacuolasenalgunasde lascélulasdelacapasub&protodérmicadeejeycotiledones;en
esteaspectoentonces,estassemillassediferenciannosólode lassemillasortodoxassinotambiénde las
semillasrecalcitrantes.Enestepuntopareceríainteresanteabordarenelfuturo,investigacionesorientadasa
investigar lasrazonesporlascualessóloalgunasdelascélulasdelacapasubprotodérmicamantienensus
vacuolas;estehechoestotalmentenovedosoenlabibliografíadesemillas.
- 52 -
CAPITULO�3-III�
REACCIONES�QUÍMICAS�DE�DETERIORO�EN�LAS�SEMILLAS�SECAS�
�
INTRODUCCIÓN
Las semillas típicamente ortodoxas muestran longevidad de varios años (Roberts, 1973). Como se
señaló en el capítulo 1 (Maroder y col., 2000), se considera que las principales reacciones químicas de
deterioro que ocurren durante el almacenamiento de las semillas ortodoxas son lentas reacciones de
oxidaciónydeMaillardqueprocedenabajoscontenidosdeagua(Priestley,1986;WilsonyMcDonald,1986;
McDonald,1999).Debidoaque lassemillasdesaucedecaenenpocassemanasa temperaturaambiente,
esasconsideracionesresultaninsuficientesparaexplicarelrápidodeterioro.Alrespecto,cabemencionarque
sibienel bajo contenidodeagua impide laactividadde laenormemayoríade lasaccionesenzimáticasy
hacennecesariamentelentaslasquenolosson,comoautooxidaciones,Maillard(WilsonyMcDonald,1986;
VertucciyLeopold,1987;Ponquettycol.,1992),estudiosrelativamenterecienteeneláreadelassemillas,
quederivandeinvestigacionessobreconservacióndealimentosmuestranque,enlassemillaslongevas, la
matriz citoplásmica se encuentra en un estado de alta viscosidad o baja porosidad lo que determina una
movilidadmolecularreducidayporendequelasreaccionesdedeterioroseanlentasylassemillas,longevas.
Cabepreguntarseentoncessi,almenosenparte, labrevísima longevidadde lassemillasdesaucenose
debería a que el estado de lamatriz citoplásmica es poco viscoso omuy poroso permitiendo así que las
reaccionesmencionadasno resulten lentasycontribuyanal rápidodeterioro.Porotraparte,elcapitulo3.II
muestraqueotrorasgoatípicodeestassemillasesqueenestadosecoconservancloroplastosconclorofila
loqueinduceapensarquelaluzpodríajugarunrolcomoagentedeteriorante(Capítulo3&II;Maroderycol.,
2003).Entejidosverdesfrescos,sibienelrolfundamentaldelaclorofilaexcitadaporlaluzsecumpleenel
proceso fotosintético, ésta también puede activar el oxígeno molecular ya sea directamente por
transferenciadelaenergíadeexcitaciónformandooxígenosingulete,o indirectamentepor transferenciade
electronesformandoradicalsuperóxido.Ambasespeciesdeoxígenodanlugara lageneraciónderadicales
- 53 -
libres (RL)yespeciesreactivasdeoxígeno(EROs) (Asada,1994;Dalton,1995;Foyer,1996).Laformación
mediada por la luz de estas especies, que son importantes agentes de daños metabólicos en sistemas
biológicos,seconocecomofotooxidación.Entejidosvedessecos,encambio,comoeselcasodelostejidos
de los embriones de las semillas de Salicáceas, aún cuando la activación del oxígeno ha sidomuy poco
estudiada,sedescartaqueseformeradicalsuperóxidodebidoaqueestaespecieradicalariaseoriginaenla
cadenadetransportedeelectronesdelprocesofotosintéticoquenoesoperativaenestadoseco.Endicho
estado, la energía de la clorofila activada puede originar oxígeno singulete, disiparse como luz demayor
longituddeondaocomocalor(TaizyZeiger,1998).�
De lo hasta aquí considerado surge que dos procesos no excluyentes entre sí podrían explicar, al
menos en parte, el rápido deterioro de estas semillas. Uno de ellos sería la existencia de unamovilidad
molecularrelativamentealtayelotrounprocesofotooxidativogeneradordeimportantesdañosoxidativos.En
este capítulo se estudiará el rol que tiene el proceso fotooxidativo y en el capítulo 3.IV el rol que tiene la
movilidadmoleculary/olaporosidadenelatípicocomportamientodeestassemillas.�
Enesteestudioseutilizaronsemillasdeotraespeciedesauce,�����������,enlasqueestudiosprevios
demostraronteneruncomportamientoycaracterísticassimilaresal lasde�0������y�0����������utilizadas
en los capítulos anteriores. Se emplearonmétodos complementarios para estudiar el papel que tendría la
clorofilaenlacortaviabilidadquecaracterizaalassemillasdesauce.SeproponequeRLyEROsgenerados
comoconsecuenciade laacciónde la luzproduciríaprimeramenteuna intensaperoxidación lipídicaen las
membranas tilacoides dado que son particularmente ricas en ácidos grasos poliinsaturados y en ellas se
encuentranloscomplejosfotosintéticosquecontienenclorofila;desdeallíeldañooxidativosepropagaríaa
otroscomponentes,membranasyestructurascelulares(Cuadro3).Debidoalestadodeshidratadoenquese
encuentran las semillas, las defensas moleculares contra esos agentes oxidantes serían insuficientes y/o
pocoeficaces,y lasdefensasenzimáticasestarían inactivaspor lamismarazón(Nandiycol.,1997;Bailly,
2004).
- 54 -
Dado que no existen estudios en semillas que decaigan tan rápidamente, algunos aspectos se
cotejaronconlainformaciónderivadasdeestudiosenespeciesdelíquenes(Seelycol.,1991)porcontener
éstos clorofilayser particularmente tolerantesa ladeshidratación loque, desdeestepuntodevista,haría
semejantesustejidosalosdelasemilladesauce
Para demostrar la propuesta anteriormente delineada, en lotes de semillas envejecidas a diferentes
intensidades de luz y composición de atmósfera, se investigó la producción de RL por espectroscopia de
resonancia de espín electrónico (Electronic Spin Resonance Spectroscopy&ESR) y cuatro indicadores de
daños moleculares fueron monitoreados: peroxidación lipídica, destrucción de pigmentos, oxidación de
proteínasyformacióndeproductosdeMaillardademás,seevaluólaintegridaddelasmembranastilacoides
yplasmáticas.Estas determinaciones fueron acompañadaspor ladeterminación de lagerminaciónnormal
(GN),germinacióntotal(GT)yeltiempomediodegerminación(TMG).
- 55 -
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
�
Lasfiguras3.III.1y3.III.2muestranquehubounaaltacorrelaciónentreGNyTMG(R2=0.97,α≤0.01)
así como también entre cada una de ellas y la producción de radicales libres (RL) (GN/RL R2 = 0.94 y
TMG/RLR2=0.98,α≤0.01).
Los resultados mostrados en la Figura 3.III.1 muestran que la luz y el oxígeno promueven el
decrecimientodelaGNyelincrementodeTMG,manteniéndoselaGTinalterada.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
A B C D E F
Tratamientos
Ger
min
ació
n (%
)
1,00
1,10
1,20
1,30
1,40
1,50
1,60
1,70
1,80
1,90
TM
G (
días
)
Figura�3.III.1.-�Semillasde�����������sometidasa25ºCy45%HRdurantetresdías:A,control.�B-F,diferentestratamientos:B,oscuridadyatmósferaN2;C,oscuridadyaire;D,luz(140lux)yatmósferadeN2;E,luz(140lux)yaire;F,luz(1300lux)yaire.GerminaciónNormal(GN)(■),TiempoMediodeGerminación(TMG) (▲) y Germinación Total (TG) (♦). Tratamientos con la misma letra minúscula son nosignificativamentediferentesaP=0.05poreltestdeTukey.
a h a
g
b
f
ab
e
e
f
d
c
- 56 -
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A B C D E F
Tratamientos
Am
plitu
d de
señ
al E
SR
(1
03 )
Figura�3-III-2.-� I,�EspectrosdeESRcorrespondientesa los tratamientosA&F. II,Laamplitudde lasseñalesESRdesemillasde�����������enlasdiferentescondicionesdealmacenamientodescriptasenfigura1.LostratamientosconlamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesenP=0.05poreltestdeTukey.
Enestassemillasfueevidente lainduccióndeRLpor laluz(Fig.3.III.2 tratamientoEyF),ytambién
fuerondetectadosenlassemillascorrespondientesalosdemástratamientosyenlassemillascontrol.Enlos
líquenes ������������+ ����y��#���!������������� la luztambiéninduceunimportantecantidadderadicales
libres quesuperan ladel control (Seel y col., 1991). Las semillas control de sauceconcasi 100%deGN,
mostraron contener una importante cantidad de RL, aproximadamente la mitad de la encontrada en las
semillas cuya GN había descendido casi a 0% (Fig 3.III.2 A y F). Estos resultados admiten dos
interpretaciones:(i)talcantidaddeRLnoafectalaGN;(ii)elniveldeRLpodríaserreducidoyreparadoel
dañoporelloscausado,comoconsecuenciadelaactividadtantodelasdefensasantioxidantescomodelos
mecanismosdereparación,procesosqueseactivanconlahidratación.EstosRLpudieronhaberseformado
por dos vías: (i) a partir del radical superoxido que se puede formar al pasar los electrones de la cadena
respiratoria directamente al oxígeno, como consecuencia de la desregulación del proceso respiratorio que
ocurre durante la deshidratación de la semilla (Vertucci y Farrant, 1995; Bailly 2004); (ii) debido a la alta
a b
ab
d
c
ab
I II
Tratamiento A
Tratamiento F
- 57 -
sensibilidadalaluzquemuestranestassemillas(vermásadelanteenestemismocapítulo),esprobableque
losRLtambiénhayanpodidoformarseduranteellapsotranscurridodesdequelassemillascomenzaronaser
expulsadas del fruto hasta que se recolectaron, a pesar de que se mantuvo baja la intensidad de la luz
durantedicholapso.
Encuantoalosdiferentestratamientos,elB(Luz&Nitrógeno)nomuestradiferenciassignificativasconel
control(Fig.3.III.1).EldecrecimientodelaGNeneltratamientoCreflejaríaeldañoquesegeneraapartirde
la reaccióndeloxígenocon los radicalespre&existentes (OhlroggeyKernan,1982;JustinyBass,1978)y/o
conlosácidosgrasospoliinsaturados(autooxidación)sobretodoteniendoencuentaquelassemillasfueron
tratadasdurantetresdíasa25ºC,temperaturaquepromueveelenvejecimiento(Capítulo3&I;Maroderycol.,
2000).LadisminucióndelaGNqueseprodujoeneltratamientoD(Luz&Nitrógeno)podríadeberse,segúna
Benson (1990), a la clorofila excitadapor la luz que reaccionaríadirectamente con el sustrato para formar
radicales libressinsereloxígenopartede la reacción.Sinembargo, la formacióndealgunosoxi&radicales
(EROs) no se puede descartar debido a que la remoción del oxígeno por el nitrógeno pudo haber sido
incompleta.EldecrecimientodelaGNporefectodelosRLquedaclaramentemostradaenlostratamientos
conluz&aire(EyF):a140 lux(E)seprodujounincrementodel53%delosRL(de1900a2900UA)yuna
disminución del 81% de laGN (de 97 a 18%) con respecto al control. Esto sugiere que, aún a tan baja
intensidadde luz,ocurrióun fuerteproceso fotooxidativo.Llama laatenciónqueuna intensidadde140 lux
indujeraunadisminucióndel81%delaGNmientrasqueunaintensidadaproximadamentediezvecesmayor
(tratamientoAyFFig.3.III.1y2)noresultarasuficienteparaanularlanitampocollegaraaafectarlaGT.Al
respecto,doshechosmerecenseñalarse:(i)Labajaintensidaddeluzresultóproporcionalmentemáseficaz
quelaaltaendisminuirlaGN,y(ii)SibienelcursodeldecaimientodelaGNsiempreantecedealdelaGT,
durante lamayorpartede esecursoambasgerminacionesdecaensimultáneamente (SivritepeyDourado,
1995;EllisyRoberts,1981;SunyLeopold,1995) (vercuadro3.III.2);encambio,en lassemillasdesauce
que envejecen por la acción de la luz y del oxígeno, la GN y GT no decaen necesariamente en forma
- 58 -
simultáneasinoque laúltimapuedecomenzaradecaerunavezque laprimerayase anuló (Fig.3.III.1 y
3.III.10).
Amboshechos(i)y(ii)podríanexplicarsealanalizarelprocesodefotooxidacióntalcomopareceocurrir
enestassemillas.Elataquedelosradicaleslibresinducidosporlaluzenpresenciadeloxígenocomenzaría
en los tejidossuperficialesdelembrión.Debidoa queestasemillaconsistedeunembrióncubiertoporun
tegumento tenuey transparente (Maroderycol.,2003), los tejidosmássuperficiales,es decir, los del lado
abaxial de los cotiledones, los tejidosmás externos del eje y el ápicede la radícula, son los que resultan
dañadosenestascondiciones.Estedañoqueseproduceenlassemillassecas,durantelagerminaciónse
manifiestaenundesarrolloanormaldelaraízyeneldesarrollodecotiledonesconirregularidadesentamaño
y color, aspectos que son tenidos en cuenta para evaluar la GN. Desde los tejidos superficiales el daño
oxidativosepropagaríahacialosmásinternosdemaneraquehastatantonoalcanceelmeristemaapicaldel
brote,éstequedaríaprotegido,posponiéndoseenconsecuencia,eldescensodelaGT(iniciodelamortalidad
delassemillas).Cuandoeldañoloalcanza,yalaGNsehuboanulado.EstaseríalarazónporlacualGTy
GNnodecaensimultáneamente.Estecomportamientodifieredelquemuestranlassemillasortodoxastípicas,
debido a que en éstas el deterioro no comienza por los tejidos superficiales del embrión sino que ocurre
simultáneamente en todos los tejidos del mismo aunque con diferencias de intensidad entre ellos (Ellis y
Roberts, 1981), lo que determina que las curvas de decaimiento de ambas germinaciones (GN yGT) se
superponganensumayorparte.�
- 59 -
Figura�3.III.3.-�ImágenesdeMETmostrandolosdañosgeneradosporlaluzenloscloroplastosde�����������.A,Enunasemillacontrol,uncloroplastodeunacélulasubprotodermal(ladoabaxial)delcotiledón.B:detalle deA;C yE, Semilla expuesta durante tresdías a 25 ºC y1300 lux.C, cloroplasto de unacélulasubprotodermal (lado abaxial). D, detalle de C. E, Cloroplasto de una célula del mesófilo central de uncotiledón.F,detalledeE.NotelasdiferenciasenelestadodelasmembranastilacoidesentrelasfigurasCyE.Abreviaturas:pc,paredcelular;ei,espaciointercelular;cl,cuerpolipídico;df,depósitodefitoferritina;v,vacuola.Escala=1fm
Esta interpretación de los hechos basada en un proceso oxidativo que se inicia en los tejidos
superficiales y se propaga hacia los más internos permitiría también explicar la razón por la cual una
intensidad de 140 luxdisminuye laGN al 20%,mientras queuna intensidad aproximadamente diez veces
mayornosólonolaanulasinoquetampocollegaaafectar laGT.Enestesentido,1300luxproduciríanun
- 60 -
dañoenlostejidossuperficialeslosuficientementeintensocomoparadestruirclorofilayotrasmoléculas(Ver
Capítulo 3&II de esta tesis) y reducir la penetración de la luz y la capacidad fotoactivable del tejido. En
consecuencia,elefectodelaluzsobrelaGNylapresenciadeRLnoguardaríanrelaciónconsuintensidad.
Esta interpretación de la fotooxidación que ocurre en estas semillas recibe sustento de los estudios de
microscopíaelectrónicadetransmisión(TEM)(Fig3.III.3).Enlassemillasexpuestasa1300luxdurantetres
días,losefectosdetrimentalesdelaluzafectaronespecialmentelostejidossuperficialesdelembrióncomola
epidermisylascapassubyacentesdelparénquimaclorofílico(Fig.3.III.3).Eldañofueclaramentevisibleen
loscloroplastosde lascélulasdeestos tejidos, especialmenteen lasmembranas tilacoides.Enefecto, los
tilacoides granales aparecieron dilatados, formando vesículas intergranales, y las membranas tilacoides
mostraronpérdidadedefinición(Fig.3.III.3A&F).Porelcontrario,fueronobservadassóloligerasalteraciones
enloscloroplastosdelmesófilocentralyladoadaxialdeloscotiledones(Fig.3.III.3CyD)yningúndañoen
loscloroplastosdelostejidoscentralesdelejeydelmeristemaapicaldelbrote.Estoexplicaríalarazónporla
cualalostresdíaslaGTaúnnoresultóafectada(Fig.3.III.1E&F),sibienlasplántulasquegeneraronestas
semillasmostrabansíntomasquehacíandisminuirelporcentajedeGNcomo:(i)Plántulasmáspequeñas,(ii)
Radículaspocodesarrolladas;(iii)Cotiledonesconáreasdecolormarrón&rojizas(enlugardeverdes)ensu
superficiesabaxialesyenlosbordes(Fig.3.III.4).Comoyasemencionara,porserestasdosáreasjuntocon
elmeristemaapicalde la raíz, incluyendo lacaliptra, laspartesmásexternasdelembrión,sontambién las
más expuestas a la acción detrimental de la luz incidente (consecuentemente, lasmás afectadas). Por lo
tanto, lostejidosmásinternos,estoes, losdel ladoadaxialdeloscotiledones(epidermisadaxialymesófilo
subyacente),loscentralesdeleje,yelmeristemaapicaldelbrote,resultaronpocoonadaafectados.Porotro
lado,lassemillasenvejecidasenoscuridadgeneraronplántulasque,encomparaciónconlassemillascontrol,
fuerondetamañoalgomenorysuscotiledonesmostraronuncolorverdepálido(Fig.3.III.4C).Losefectosde
laluzfueronmásdébilesensemillasexpuestasa140lux(datosnomostrados).�
�
- 61 -
Fig.� 3.III.4.-�Plántulas de������ ����� de siete días:A,Plántulas de semillas control.B, Plántulas desemillasexpuestasdurantetresdíasa25ºC,1300lux.C,Plántulasexpuestasdurantetresdíasa25ºCyoscuridad.Abreviaturas:ab,vistaabaxialdeloscotiledones;ad,vistaadaxialdeloscotiledones.;r,radícula;mab,meristemaapicaldelbrote.Escala=2mm
Respectodeldañocausadoporlafotooxidaciónalostejidosunindicadordelmismoeslavariaciónen
lacomposicióndeácidosgrasos.(VanHasselt,1974;DeKokyKuiper,1977).Dadoque losácidosgrasos
poliinsaturadossonfácilmenteoxidados,unamayordisminucióndeestosrespectodelosmono&ydelosno&
saturadosdelafracciónlipídicaproveeunaevidenciadelaperoxidacióndelosmismos(WilsonyMcDonald,
1986).Alrespecto,loscambiosmásimportantesdetectadosenlassemillasde�0������expuestastantoa140
como a 1300 lux, correspondieron a los ácidos grasos poli&insaturados (Tabla 4). Esto concuerda con el
hechodequela fotooxidaciónproduceunaimportanteperoxidaciónlipídicaen lostejidos(Foote,1996).La
pronunciada disminución de los ácidos grasos poli&insaturados (constituyentes de lasmembranas) que se
detectacomoconsecuenciadelaexposiciónadiferentes intensidadesde luzsuponeimportantesdañosen
las membranas, que serían reflejados en el decrecimiento de la GN. Un método sensible de detectar la
peroxidación lipídica consiste en determinar la relación ácidos grasos poli&insaturados/(monoinsaturados +
ácidos grasos saturados) (Priestley y Leopold, 1983). Cambios en la composición de ácidos grasos que
acompañan la disminución de la GT se encuentran en Stewart y Bewley (1980), Pearce y Abdel Samad
(1980),PowellyMatthews(1981).ElgráficodebarrasdelaFig.3.III.5queseelaboróutilizandoesarelación,
muestraquelaintensidadde140luxfuesuficienteparaproducirunmuyaltodecrecimientodeesarelación
- 62 -
demaneraqueunaintensidadmayorsólopermitióunapequeñadisminuciónadicionaldelaGN.Deacuerdo
a Leech y Murphy (1976) la marcada disminución en el contenido de los ácidos grasos poli&insaturados
(Figura13)podríaserexplicadopor lapresenciadecloroplastos,cuyasmembranastilacoidesson ricasen
esosácidos.Estasmembranasconstituyenunblancopotencialparalaperoxidacióndebidoalacontigüidad
entre los ácidos poliinsaturados y la clorofila contenida en los complejos receptores de la luz (Halliwell y
Gutteridge,1999).Enesteaspecto,lasmembranastilacoidesseríanelprimerblancoatacadoporeloxígeno
activadoproduciéndoseunaperoxidación que destruiríaácidosgrasos y tilacoides, generandoRLyEROs
que propagarían el daño oxidativo a otros componentes, membranas y estructuras celulares, como se
compruebaacontinuación.EstasuposiciónrecibiósoportedelasimágenesobtenidasporTEM(Fig.3.III.3),
yadescriptas.
� Porcentaje�de�área�de�ácidos�grasos�
Palmítico� Esteárico� Oleico� Linoleico� Linolénico� Otros�
78%99� 7:%99� 7:%7�";� 7:%<�"8� 7:%=�"=� 4%4�
Control� 25.0±3.5 4.6±0.8 8.5±0.7 41.7±3.5 6.2±1.4 12.9
140�lux� 33.3±5.6 5.0±0.8 8,4±1.6 15.7±5.2 2.7±2.4 24.8
1300�lux� 30.4±1.3 8.2±1.7 11.2±5.2 8.1±1.3 2.4±2.0 39.5
��
Tabla� 3.III.1.-� Porcentaje de área de ácidos grasos saturados e insaturados en semillas control yenvejecidasendosdiferentes intensidadesde luz, a25 ºCdurante tresdías. Losvalorescorrespondenamedias±SD
��
- 63 -
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Control 140 lux 1300 lux
Rel
ació
n ac
idos
gra
sos:
po
liins
atur
ados
/(m
onoi
nsat
urad
os +
sat
urad
os)
�Figure� 3-III.5.-� Relación entre ácidos grasos poli&insaturados/ (ácidos grasos monoinsaturados +
saturados)ensemillascontrolysemillasenvejecidasdurantetresdíasa25ºCy140,y1300lux.
De acuerdo a Smith y Berjak (1995) la MET permite detectar los cambios que se producen en las
membranas de los meristemas radiculares (como la separación de la membrana plasmática de la pared
celular) al embeberse las semillas envejecidas. En este estudio se observó también la ocurrencia de una
incipienteseparacióndelamembranaplasmáticadelasparedescelulares,loqueenestadosecoydebidoal
intenso proceso fotooxidativo podría significar daños en la misma (Fig. 3.III.3). Con el fin de evaluar la
integridaddedichamembranasedeterminólapermeabilidadpormediodeESRypérdidadeelectrolitos.La
Fig. 3.III.6A representa los espectros de resonancia paramagnética de TEMPONE. Las señales del lado
derechodelespectromuestranloscomponentesLyWquecorrespondenalasseñalesdelassondasquese
encuentranen la fasehidrofílicaehidrofóbicadelcitoplasma, respectivamente.La relaciónW/L,queesun
índicedeldañodelamembranaplasmática,decrecea74%con140luxynollegaa100%conunaintensidad
muchomayor(1300lux).Estadiferenciaenlaeficaciadetrimentaldelaluzguardacorrespondenciaconlos
efectossobreRLyGNantesmencionados,esdecir,elaumentodelapermeabilidadnoguardarelacióncon
la intensidad de luz. Los espectros de la figura 3.III&6 A muestran que el agente dispersante penetró la
membranaplasmáticadañadadisipandolaseñalhidrofílica.
- 64 -
EldecrecimientodelarelaciónW/Lcorrelacionócercanamentedeformalineal(R2=0.99,α≤0.01)con
la pérdida de electrolitos resultando ambos métodos igualmente eficaces para medir la integridad de las
membranas(Fig.3.III.6B).Ensemillassometidasaprocesosdesecado,encambio,Leprinceycol.(1999)
encontraronquelaESResunindicadormássensiblequelaconductividadeléctricaparaevaluarlaintegridad
de las membranas. Estos resultados refuerzan la suposición ya mencionada de que el daño por RL
originadosenlasmembranastilacoidessepropagaaotrasestructurasincluyendolamembranaplasmática.
�
��
Figura� 3.III.6.-� ESR y conductividad como medidas de la permeabilidad de membrana en semillasenvejecidasa25ºCportresdías.A,EspectrosESRdelasondaspinTEMPONE;B,&cartadecomparaciónentreESR(&&●&&)yconductividad(__■__).Valorescorrespondenamedia±DS.
Proteínas�Oxidadas�
Una gran variedad de proteínas esenciales para la fotosíntesis se encuentran insertas en las
membranas tilacoides. Estas proteínas se hallan formando junto a la clorofila y otros pigmentos como los
180
220
260
300
340
380
420
Control 140 lux 1300 lux
Con
duct
ivid
ad (�
S/m
g)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
ES
R (W
/L)
Cond.
ESR
B
L
W
Control
A
L
L
W
W
Envejecida 1300 lux
Envejecida140 lux 1X
5X
6X
- 65 -
carotenosloscomplejosreceptoresdelaenergíaluminosa.Sucontigüidadconlaclorofilaactivadayconlos
ácidosgrasospoli&insaturadosdelasmembranastilacoidesindudablementehacendeestasproteínasblanco
de RL y ERO, tanto al inicio del proceso fotooxidativo (formación del oxígeno singulete) como durante la
peroxidacióndeesosácidosgrasos.Otrasproteínascomponentesdedichamembrana,comolasenzimasdel
transporte de electrones de la fotosíntesis y las que protegen dicho sistema del ataque oxidativo, serían
también blancos de los agentes oxidantes como asimismo proteínas que atraviesan las membranas
tilacoides,noligadasalafotosíntesis.
El envejecimiento de las semillas ha sido asociado con la acumulación de proteínas oxidadas. Las
semillas de�0� ����� envejecidas por la luzmostraron un apreciable aumento en la cantidad de proteínas
oxidadas(Fig.3.III.7).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
C0 E0
Car
boni
los
(nm
oles
/mg
prot
)
Fig.�3.III.7.-�Efectosdelafotooxidaciónsobreelcontenidodecarbonilosensemillasenvejecidasa25ºCportresdías
Pigmentos
Si bien en las semillas secas mantenidas en oscuridad se forma oxígeno singulete durante la
peroxidación que acompaña al proceso de auto&oxidación, en condiciones de iluminación, el nivel de ese
5
1
3
2
4
- 66 -
agente se ve aumentado tanto por la transferencia al oxígeno de la energía de excitación de la clorofila
activadaporlaluz,comoelqueseformadurantelaintensaperoxidaciónlipídicaqueocurreenesacondición.
Laclorofilatieneunroldualyaqueesgeneradorayblancodeloxígenosingulete(KnoxyDodge,1985).Un
papel importante de los carotenos que se encuentran en los llamados complejos fotosintéticos junto a la
clorofila, es proteger este pigmento contra el ataque del oxígeno singulete (Halliwell, 1987; Brown y col.,
1991).Losresultadosdelafigura3.III.8muestranqueen lasemillaseca,unaintensidadluminosabajaes
suficiente para producir una marcada disminución de los carotenos, hecho indicador de su rol protector
aunquetambiénseproduceunadisminucióndeclorofilaa.Elaltocontenidodeclorofiladeestassemillas,al
ser excitadas por la luz, seguramente promueve un nivel de oxígeno singulete que parece superar las
defensasrepresentadasporloscarotenosyasíafectarlaclorofila.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
CO E0
clor
ofila
a y
b (µ
g/m
g)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
caro
teno
s (µ
g/m
g)
Clf a
Clf b
carotenos
Fig.�3.III.8.-��Efectodelafotooxidaciónsobreelcontenidodepigmentos�
- 67 -
Comoseviohastaahoralosnivelesderadicaleslibresestablesdetectadosenestassemillasguardan
relaciónconlosdañosproducidosadiferentescomponentescelulares.Estocontrastaconloqueaconteceen
el líquen ������������+ ����� (Seelycol.1991), líquentolerantea ladesecación,yporellocomparablea la
semillade�����.Enel líquen,sibienseformanRLporfotoactivacióndelaclorofila,noseproducendaños
metabólicos.SeespeculaquepodríanocurrirreaccionesradicalariasnodañinasqueacumulanRLestables
y/oexistirenlostejidosdeshidratadosunelevadoniveldedefensasmolecularescomocarotenos,α&tocoferol,
glutationentreotros,quelosanulan.
Respectodesiuna intensaperoxidación lipídicacomolaqueocurreenestassemillasescompatible
conlaexistenciadeunestadodealtaviscosidadquerestringeelmovimientomolecular,cabemencionarque
eseestadoconstituidoporunamatrizdemovimientorestringido,contieneespacioslibresabiertosporlosque
pueden difundir pequeñas moléculas como el oxígeno. Éste, activado por la clorofila excitada por la luz
iniciaríaelprocesodeperoxidación,elqueeventualmentesepropagaríaentrelosácidosgrasosdebidaala
adyacenciaqueexiste entreestos últimosen lamembrana.Desdeestepuntodevistaparecería nohaber
incompatibilidad entre intensa peroxidación lipídica y un estado de alta viscosidad. En cambio, la rápida
propagacióndeldañoaotrossistemasdemembranascomomembranaplasmáticaydeotrasorganelas,no
sería explicable por adyacencia entre ácidos grasos y parecería difícil de conciliar con un estado de alta
viscosidad. De todas maneras, si previo al inicio de estos procesos degradativos existió tal estado, es
probablequeunadisminucióndelaviscosidadhayaacompañadoaquellosprocesos.
Ensíntesis,losresultadosdelostratamientosdeluzmostraronqueelincrementodelaintensidaddela
luzfueacompañadoporlaformacióndeRL,conduciendoaundecrecimientodelosácidospoli&insaturados.
Esto último fue asociado con importantes daños en las membranas tilacoides y con alteraciones en la
estructura y permeabilidad de lamembrana plasmática, todo lo cual conformauna secuencia de procesos
fuertementeligadosquefinalmentesereflejaroneneldecrecimientodelaGN.
�
- 68 -
Reacción�de�Maillard�
La reacción de Maillard consiste en una serie de reacciones que derivan de condensaciones no&
enzimáticasentreunaaldosaocetosaconungrupoaminolibrepertenecienteaproteínasoácidosnucleicos
enlasqueseformaglucosamina.Ésta,porreordenamientomolecularformaproductosdeAmadorilosquea
su vezdan lugara intermediarios congrupos carboniloque por reacciones conotrosgruposamino ypor
subsiguiente reordenamiento originan los llamados productos deMaillard. Los productos intermediarios de
esta reacción compleja se caracterizan por su fluorescencia y con el tiempo llevan a la formación de
pigmentos pardos y/o formación de entrecruzamiento entre proteínas, causando rigidez y pérdida de
funcionalidaddelasmismas(Graham,1996).Eneláreadelacienciadelosalimentoslosproductosdeesta
reacción son considerados como un índice de pérdida de calidad. El aumento de la fluorescencia de las
proteínas a 395/450 nm (excitación/emisión) es usado como una medida de la reacción de Maillard en
numerosos estudios de viabilidad de semilla durante del almacenamiento, aunque los resultados son
contradictorios(SunyLeopold,1995;MurthyySun,2000;Murthyycol.,2002;Matiasevichycol.,2005).Al
respecto, Wettlaufer y Leopold (1991) observan que en condiciones de envejecimiento acelerado, la
germinacióndelassemillasdesojadecreceen lamedidaqueseacumulanproductosdeMaillardeneleje
embrionario;estacorrelaciónnoseproduceencondicionesdeenvejecimientonoacelerado.Encambio,Sun
yLeopold(1995)síencuentranqueenlosembrionesdesoja,losproductosdeMaillardsecorrelacionancon
lapérdidadegerminabilidadencondicionesdeenvejecimientonoacelerado.Porsuparte,Castellionycol.
(en preparación) encuentran en semillas de quinoa que la formación de productos de Maillard esta
estrechamentecorrelacionadaconlapérdidadegerminabilidad.
Las semillas usadas en estas determinaciones que fueronmantenidas 3 años a &70°Cmuestran la
presenciadeproductosdeMaillard (Fig. 3.III.9a).FormacióndeproductosdeMaillarda temperaturasbajo
cerofueronreportadosporSchoebelycol.(1969)yLimyReid(1991).
Por otra parte, cuando las semillas control se mantuvieron a 25° C en oscuridad durante solo tres
meses, el contenido de los productos de Maillard se incrementó aunque es importante señalar que las
- 69 -
semillasyahabíanperdidolaviabilidaddosmesesantes.Independientementededichapérdida,eseaumento
producido en tres meses parece sugerir que el estado de la matriz citoplásmica permite una movilidad
molecularrelativamentealta.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
400 450 500 550 600longitud�de�onda�de�emisión�(nm)
intens
idad
�de�flu
ores
cenc
ia�(U
A
control
envej.3meses(osc)
�
Fig.�3.III.9.a-�Fluorescenciadelostratamientosindicadosenelcuadro.
Lassemillasmantenidasdurantetresdíasa25ºCenoscuridadya1300 lux,nodifirierondelcontrol
respectodelcontenidodeproductosdeMaillard.Sibientresdíasresultaunlapsoexcesivamentebrevecomo
paraquesemanifiestedichareacciónameritaseñalarsequeeneselapsoseprodujounsignificativoaumento
decarbonilos,unodelosprecursoresdelosproductosdeMaillard(Fig.III.9.B).
- 70 -
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
400 450 500 550 600
longitud�de�onda�de�emisión�(nm)
intens
idad
�de�flu
ores
cenc
ia�(U
A
control
envej.3dias(1300lux)
envej.3dias(osc)
Fig.�3.III.9.b-�Fluorescenciadelostratamientosindicadosenelcuadro
LapresenciadeproductosdeMaillardenelcontrol,lomismoqueladelosotrosindicadoresdedaño
evaluadosenestecapítulonoafectósensiblementelaGNyaqueestafuecercanaal100%(Fig.3&III&1.).Al
respectonosedescartaqueuncontrol conmenoscontenidosdeesos indicadorespudierapresentar igual
porcentajedeGNperounmayorvigorqueestaríarepresentadoporunTMGmenora1día(Fig.3&III&1.)
Autooxidación�
En muchas semillas secas se han detectado muy bajos niveles de quimioluminiscencia que se
producen durante el lento proceso de peroxidación lipídica (Boveris y col., 1980). Esto refleja el nivel de
radicales libres reactivos yoxígeno singulete que se producen enese proceso y que pueden generar una
serie de reacciones radicalarias que concluyen en la formación de los radicales libres estables. (Hendry,
1993;Szöcs,2002,Smirnoff,1993).Ladeteccióndeestosagentesdedañometabólicosesunapruebadela
ocurrenciadelprocesodeautooxidaciónuoxidaciónespontánea.
Respectodelprocesodeautooxidaciónquepuedeocurrirenestassemillas, laevaluacióndelmismo
requiereque las semillassemantenganenoscuridada findeevitar la interferenciade la fotooxidación.El
- 71 -
experimentograficadoenlafigura3.III.1muestraqueeltratamientoC,quesehizoenoscuridad,produjoen
sólotresdíasa25°CunasignificativadisminucióndelaGNqueseatribuyóaautooxidaciónyareacciones
deloxígenoconradicales librespre&existentesen lassemillascontrol.Eseprocesonofueacompañadopor
unaumentode radicales libresestables respectodelquemostróelcontrol;al respectonosedescartaque
durantelostresdíasdeduracióndelexperimentonosehubieraproducidoaúnunsignificativoincrementode
losradicaleslibresestable,yaque,comoseindicóprecedentementederivandereaccionesradicalariasque
en estado seco son lentas. Estos resultados son consistentes con los correspondientes a los realizados
tambiénenoscuridadqueilustralafigura3.III.10A.Enlamismaseapreciaelcursoquesigueeldescensode
laGNylaGTduranteunlapsosuficientementeprolongadocomoparaquedecaiganambasgerminaciones
(GNyGT)ynosólodetresdíascomoenelexperimentoilustradoenlafigura9.Lafigura3.III.10Bmuestra
lapresenciademalondialdehído(MDA)tantoenelcontrolcomoasimismoelquesefuegenerandoalolargo
deldescensodeambasgerminaciones.MDAesunodelosproductosquederivandelareacciónespontánea
entreeloxígenoylosácidosgrasosinsaturados(autooxidación)enlaqueseproducenunaseriederadicales
libresreactivosyotroscompuestosentrelosqueseencuentraaquellamolécula.Supresencia,determinada
medianteelácidotiobarbitúrico,seusacomoindicadordelaocurrenciadeprocesosdeautooxidaciónydela
presencia de radicales libres.MDA se forma por la peroxidación de ácidos grasos con tres omás dobles
enlacesy,delosácidosinsaturadosdetectadosenestassemillas,sóloellinoleico,queseencuentraenmuy
baja proporción, cumple esta exigencia quedando la peroxidación de los otros sin ser detectada. En
consecuencia,elMDAresultaunindicadorquesubestimalacuantíadeeseproceso.
Otra conclusión que deriva de la figura 3.III.10 es que el descenso de la GT en oscuridad
(autooxidación) es prácticamente el mismo que ocurre a 140 lux, lo que indica que el intenso proceso
fotooxidativoconel dañometabólicoasociadoqueseproduceen los tejidossuperficialesde lasemilla,no
alcanzaaafectaralmeristemaapicaldelbroteaesaintensidaddeluz,locualreducelarelevanciaqueenun
principio se le adjudicó al proceso fotooxidativo y a la presencia de clorofila como causantes del rápido
deterioro. En cambio estaría fuertemente asociado con la autooxidación y no con la fotooxidación. Sin
- 72 -
embargo, no se descarta que la fotooxidación inducida por la luz tenga algún grado de incidencia,
indudablementemenorenlapérdidadeviabilidad,segúnseconcluyecuandosecomparaneldescensodela
GTala luzyenoscuridad.EnesascircunstanciasseobservaquelaanulacióndelaGTalaluzantecede
aunqueenunospocosdíasalqueocurreenlaoscuridad.
Por otra parte, otra de las reacciones además de la autooxidación que se considera causa de
envejecimientoen lassemillassecases la formaciónde losproductosdeMaillard.Comoseviocuandose
tratóestareacción,elcontenidodeestosproductosenlassemillascontrolnoafectólaGNdadoqueéstafue
de casi 100%. Por otra parte, la figura 3.III.10muestra que las semillasmueren en alrededor de unmes
cuando el contenido deMaillard aumentó sólo una tercera parte del nivel alcanzado a los tresmeses, no
llegandoésteaduplicareldelasemillacontrol.Estosresultadosparecenentoncesseñalaralaautooxidación
comocausaprincipaldeldeterioro,aunquecabepreguntarseentoncesporqueesteprocesoesmuchomás
intensoenestassemillasqueenotrasquetambiéntoleranladeshidratación.
Los resultadoshastaaquíobtenidos rechazan, enconsecuencia lahipótesisoriginalmente formulada
acerca de que la clorofila tendría un rol significativo en la rápida perdía de la viabilidad.
- 73 -
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
- 74 -
�
Cuadro�3.III.1.-�Radicales�libres�y�Especies�reactivas�del�Oxígeno�
Los radicales� libres son especies moleculares que contienen un electrón desapareado (representado
generalmentecomoR�), loque losvuelveunade lasde lasmoléculasquímicamentemasreactivas.Unradical libre
tiene la capacidad de sustraer un segundo electrón de unamolécula vecina debido a la necesidad de aparear su
electrónlibre.Estocausalaformacióndeotroradicallibregenerandounaautopropagaciónencadenadereacciones
sucesivas.
SedenominacolectivamenteEspecies�Reactivas�del�Oxígeno(ERO)tantoalosradicaleslibresquecontienen
oxígeno&comoelaniónsuperóxido(O2�),elradicalperóxido(LOO�),elradicalhidroxilo(HO�)&comoaloscompuestos
noradicalariosymuyreactivosquelocontienen,porej.peróxidodeHidrógeno(H2O2).
Existen sustancias antioxidantes (enzimáticas y no enzimáticas) encargadas de “neutralizar” a los radicales
libresporlasustraccióndelelectróndesapareado.
Los antioxidantes son un conjunto heterogéneo de sustancias formado por vitaminas,minerales, pigmentos
naturales,enzimasyotroscompuestos,quebloqueanelefectonocivodelosradicaleslibres.
Cuandoel aumento del contenido intracelular deEROs sobrepasa las defensas antioxidantes de la célula se
produceelestrés�oxidativo,atravésdelcualseinducedañoamoléculasbiológicascomolípidos,proteínas,ácidos
nucleicos, etc. Los radicales libres son especiesmoleculares que contienenun electrón desapareado (representado
generalmentecomoR�), loque losvuelveunade lasde lasmoléculasquímicamentemasreactivas.Unradical libre
tiene la capacidad de sustraer un segundo electrón de unamolécula vecina debido a la necesidad de aparear su
electrónlibre.Estocausalaformacióndeotroradicallibregenerandounaautopropagaciónencadenadereacciones
sucesivas.�
SedenominacolectivamenteEspecies�Reactivas�del�Oxígeno(ERO)tantoalosradicaleslibresquecontienen
oxígeno&comoelaniónsuperóxido(O2�),elradicalperóxido(LOO�),elradicalhidroxilo(HO�)&comoaloscompuestos
noradicalariosymuyreactivosquelocontienen,porej.peróxidodeHidrógeno(H2O2).
Existen sustancias antioxidantes (enzimáticas y no enzimáticas) encargadas de “neutralizar” a los radicales
libresporlasustraccióndelelectróndesapareado.
Los antioxidantes son un conjunto heterogéneo de sustancias formado por vitaminas,minerales, pigmentos
naturales,enzimasyotroscompuestos,quebloqueanelefectonocivodelosradicaleslibres.
Cuandoel aumento del contenido intracelular deEROs sobrepasa las defensas antioxidantes de la célula se
produceelestrés�oxidativo,atravésdelcualseinducedañoamoléculasbiológicascomolípidos,proteínas,ácidos
nucleicos,etc.
�
�
- 75 -
Cuadro� 3.III.2.-� Tres� ejemplos� tomados� de� la� bibliografía� que� muestran� que� GN� y� GT� ocurren� casi�simultáneamente.��
�
Semillas�ortodoxas��(Ellis�y�Roberts,�1981)�
�
Semillas�de�soja��(Sun�and�Leopold,�1995)�
�
�
�
�
�
�
�
Semillas�de�arveja�(Sivritepe�y�Dourado,�1995)�
�
- 76 -
CAPITULO�3-IV�
�
REVERSION�DEL�DETERIORO�DURANTE�LA�IMBIBICIÓN�DE�LAS�SEMILLAS�ENVEJECIDAS�
INTRODUCCIÓN�
En el capítulo 3&1 se vio que cuando las semillas de �0� ���� y �0� ��������� se sometían a
humidificación y se testeaba la germinación, a medida que aumentaba el contenido de agua, ocurría
inicialmente un descenso de la germinación normal (GN) que era seguido por un ascenso de la misma,
comportamientoqueesdifícildeexplicar,suponiendoqueelefectode lahumidificaciónseaevitarundaño
porimbibición.
Porotraparte, en las semillas secas se determinó queel rápidodescenso de laGNque ocurre por
exposición a la luz, estaba asociado a un intenso proceso de peroxidación lipídica, formación de RL e
importantesdañosacomponentescelulares.Elmáslentodescensoqueocurreenoscuridad,tambiénestaba
asociadoaunprocesoperoxidativoaunqueproducidoespontáneamente.
Cabeseñalarquecuandolassemillasdesaucesesometieronahumidificaciónalcanzaronun33%de
contenidodeaguaenrelativamentepocotiempo(capitulo3&I),porcentajequeseincrementósóloligeramente
durante las 18 horas posteriores al comienzo de la humidificación, sin que se produjera el inicio de la
germinación propiamente dicha (extensión del hipocótilo). En cambio, colocadas sobre papel mojado la
germinaciónseiniciabaenmenortiempo.Estademoraenel iniciodelagerminacióncuandosehumedece,
hace comparable la humidificación a la hidratación parcial a la que se someten las semillas (priming)
(Chojnowskiycol.,1997;Taylorycol.,1998),especialmentelasenvejecidas,afindeaumentarlavelocidad
degerminaciónydereducirlaamplituddelperiododegerminaciónlocualpermiteobtenerlotesdeplántulas
uniformes enmenor tiempo. El fundamento de estemétodo se basa en que durante la imbibición de una
semilla ortodoxa, y hasta tanto no se alcance el valor de contenido de agua que permite la división y la
- 77 -
elongacióncelular(iniciodelaplántula),operanprocesospregerminativosderediferenciacióndelaestructura
celularydereparacióndelosdañosacomponentescelularesquepudieronocurrirporunaparte,durantela
deshidrataciónqueacompañalaúltimaetapadeldesarrollodelasemillayporotra,delosdañospropiosdel
envejecimiento.Evitarquesealcanceesevalordecontenidodeaguaquepermiteeliniciodelagerminación
equivale,entonces,aprolongarellapsoenqueactúanesosmecanismosyasímejorarlacalidadfisiológica
de la semilla (Taylor y col., 1998; Chojnowski y col., 1997). Unmétodo usado para controlar el nivel de
hidrataciónesmantener lassemillasembebidasenunasolucióndeunagenteosmótico (osmopriming).La
figuraFig.3.IV.1muestracomolaGNdesemillasdesauceremovidasatiemposcrecientesdeunasolución
de PEG 6000 al 33%, muestra una fluctuación de la GN similar a la que ocurre por humidificación,
confirmandoasílasimilitudentrehumidificacióny�������(Cap3&I).
Por lo hasta aquí considerado es presumible que la mencionada recuperación de la GN esté
acompañada por una progresiva disminución del daño celular (producidos por RL y por el proceso de
peroxidaciónlipídica,comoantesmencionado)mientrasqueelinicialdescensodeeseparámetrogerminativo
losea,encambio,porunaacentuacióndeldañooxidativo,aspectosqueseinvestiganenestecapítulo.
- 78 -
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 3 6 9 12 15hs
Ger
min
ació
n (%
)
GN
GT
Fig.�3.IV.1.-GyGNenfuncióndeltiempodehidrataciónensolucióndePEG6000al33%.
a 1
d 7
c 8c
9
b 1
d 6
- 79 -
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
���� �!������� # ��� �� ������� !�� !��!� #��.��� � +�!� �� !�)!-!#����� !�� ����������� # ���#� �!�� *�!� ����
�������!��!��4&�0�=>����'?@A�����������!�=��.���%��BCD�4$�
�
Autooxidación�
Las semillas sometidas a humidificación muestran al inicio de este proceso un aumento de la
luminiscencia.Eseaumentoinicialytransitorioes,segúnBoverisetal. (1984),unodelosprimeroseventos
bioquímicosdelagerminación.Dichoautorconsideraqueelloesdebidoaqueaumentalaactividadoxidativa
comoconsecuenciadeque:(i)losradicalesperoxilos(ROO�)producidosenellentoprocesodeautooxidación
colisionancon lasmoléculasblancopor lamayormovilidaddebidoa lahidratación; (ii) loshidroperóxidos
experimentan rupturas homolíticas (ROOH→RO�� HO�); y (iii) se forma oxígeno singulete. Todos estos
procesoselevanelniveldeluminiscencia(golpeoxidativo).Enelcasodelasemilladesauce,alastreshoras
de humidificación, momento en el que es máximo el descenso de la GN, se detectó un aumento de la
luminiscencia.Enlosnumerosostrabajosenlosqueseaplicael�������afindemejorarsucomportamiento
germinativo,nosemencionaquealiniciodelaimbibiciónsehayadetectadoundescensodelaGNodeotro
indicadordelcomportamientogerminativo(Bradford,1986;Liuycol.,1996;Usberti&Valio,1997).Tampoco
sehaceesamenciónenlostrabajossobrehidrataciónenatmósferasaturada(humidificación)(Pollock,1969;
Ellisycol.,1990;BewleyyBlack,1994).
. En este sentido los resultados aquí obtenidos son los primeros en reflejar en un parámetro visible
comoeslaGN,laocurrenciadeestegolpeoxidativoqueseproduceal iniciodelahidratación.Estehecho
parece consistente con el nivel relativamente alto de actividad oxidativa que tienen estas semillas y que
determinasucortalongevidad.Poresarazón,elgolpeoxidativoqueseproducealcomienzodelahidratación
sería importante y además, estaría potenciado porque el contenido de agua en ese momento resultaría
insuficiente para que actuaran los mecanismos enzimáticos de defensa antioxidante y de reparación.
Además, la rápida germinación que tienen estas semillas, probablemente debido al estar ya parcialmente
- 80 -
desdiferenciadas, no permite completar la reparación metabólica. La convergencia de estos dos hechos,
fuerte golpe oxidativo y desdiferenciación parcial, determinaría que cuando las semillas al comienzo de la
humidificaciónsonpuestasagerminarmuestrenundescensode laGNsimultáneoconel incrementode la
luminiscencia. A media que aumenta el tiempo de humidificación se produce una disminución de la
luminiscenciaqueresultaríaconcordanteconelincrementoenelaccionardeesosmecanismos(Fig.3.IV.2)
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
0 3 6 9 12 Tiempo de hidratación (horas)
Bio
lum
inis
cenc
ia (c
pm)
Fig.� 3.IV.2.- Quimioluminiscencia de semillas sometidas a diferentes tiempos de hidratación. Lostratamientoscon lamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey.
Radicales�libres�(RL)�estables�
Lassemillassometidasahumidificaciónmostraron,conelaumentodel tiempodehumidificaciónuna
progresivadisminucióndelosRLestables,sinqueseprodujeraalprincipiounincrementodeesosagentes
que pudiera asociarse con el descenso de la GN tal como ocurre con la quimioluminiscencia y otros
parámetrosdedañoquesedescribenenestecapítulo.
Al respecto, no se descartaqueelmomento en que seefectuó la primeramedición (3h) haya sido
inadecuado para detectar un incremento en la cantidad de radicales libres estables. Por otra parte, el
a 1
d 1
c 1
c 1
b 1
- 81 -
momento que se detecta la mayor formación de RL libres activos (asociados a la generación de
luminiscencia;3hdehumidificación)seríaprácticamenteelmismoenquesedetectanlosestablessóloenel
casoenquelavelocidaddelasreaccionesquelosoriginanapartirderadicalesreactivosfuesemuyalta.Por
otra parte, si se hubiese producido un aumento después de las 3 h no se descarta que tampoco se los
detectaraporqueconelaumentodetiempodehumidificaciónse incrementaría laactividadde lossistemas
enzimáticosqueloseliminan,loqueexplicaríaelpaulatinodescensodeesosradicales(Fig.3.IV.3)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 3 6 9 12hs
Am
plitu
d de
la s
eñal
de
ES
R U
A (
103 )
Fig.�3.IV.3.-RadicaleslibresestablesmedidosporEPRensemillassometidasadiferentestiemposdehidratación.LostratamientosconlamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey.
Perfil�del�ácidos�grasos�
Unsensibleindicadordeladisminucióndelprocesodeperoxidaciónlipídicaporefectodelahidratación
estádadoporloscambiosenelperfildelosácidosgrasos.Lafigura3.IV.4muestraloscontenidosdeácidos
grasos extraídos de semillas después de 9 horas de humidificación (E9). Se observa una marcada
recuperación de los ácidos poliinsaturados (linolénico y linoleico) que superan ampliamente a los niveles
correspondientesalosdelosdelassemillascontrol,indicandounareversióndelprocesodeperoxidación.
a 2
d 1
c 1
b 1
b 2
- 82 -
.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
palm
itico
este
áric
o
oleico
linole
ico
lino len
ico
araq
uidico
gondo
ico
eico
sadie
noico
Aci
dos
Gra
sos
(%)
E0 E9
Fig.�3.IV.4.-Perfildeácidosgrasosdesemillascontrol(E0)yalas9horasdehidratación(E9).
Proteínas�Oxidadas�
Las semillas sometidas a humidificación mostraron, coincidentemente a lo sucedido con los otros
parámetrosdedañoevaluados,unaumentodeproteínasoxidadasaliniciodelaimbibición(Fig.3.IV.5).Sin
embargo, a diferencia de esos mismos parámetros, con el aumento del tiempo de humidificación sólo se
registró una ligera disminución de proteínas oxidadas. Este bajo descenso podría deberse a que esas
proteínas resultaronoxidadasporproductosde laperoxidación lipídica,porqueenesecasonosóloserían
resistentesa laproteólisissinoque tambiénpueden inhibir lacapacidadde lasproteasasparadegradarlas
(Rivet, 1986;Friguetycol., 1994).Esasería la razónpor laque lasproteínasoxidadas disminuyeransólo
ligeramente.
- 83 -
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 3 6 9 12hs
nmol
es/m
g pr
ot
Fig.�3.IV.5.-Contenidodecarbonilosdeproteínassolubleensemillassometidasadiferentestiemposde hidratación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de las columnas no sonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey
Pigmentos
Lassemillassometidasahumidificaciónmostraronalprincipiodelamismaunasensiblereducciónen
elcontenidodeclorofilaaycarotenossinqueseprodujerancambiosapreciablesenelcontenidodeclorofila
b (Fig. 3.IV.6). En el líquen��#���!���� ��������� durante la desecación también se produce una selectiva y
severadestruccióndeclorofilaaresultandolaclorofilabmenosafectada.(Seelycol.,1991)
Asimismo el contenido de carotenos mostró una fuerte reducción. Con el aumento del tiempo de
humidificación tanto el contenido del clorofila a como el contenido de los carotenos aumentaron
sensiblemente.(Fig.3.IV.6).
a 2 c
2
bc 2
b 2
b 2
- 84 -
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 3 6 9 12Tiempo de hidratación (horas)
clor
ofila
a y
b (µ
g/m
g)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
caro
teno
s (µ
g/m
g)
Clf a
Clf b
carotenos
Fig.�3.IV.6.-Contenidodepigmentos(vercuadroinserto)ensemillassometidasadiferentestiemposdehidratación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de las columnas no sonsignificativamentediferentesconunP=0,005porel testdeTukey.Losvaloresdeclorofilabnopresentandiferenciassignificativasentrelostratamientos
Integridad�de�la�membrana�plasmática�
En el capítulo 3.III se evaluó por medio de ESR y por pérdida de electrolitos, el estado de las
membranas plasmática en las semillas envejecidas por la luz y se comprobó que valores bajos de la
intensidadlumínicaeransuficienteparaproducirunimportantedañoalamembrana.Ellosereflejabaenun
aumentodesupermeabilidad (valoresbajosdeW/Lyaltosde pérdidadeviabilidad).Cuando las semillas
envejecidassesometieronahidrataciónseobservóunagradualrecuperacióndelapermeabilidadevaluada
porelcocienteW/L, loque implicaunaclaramuestradel importante rolqueenestassemillascumplen los
mecanismos de reparación. No se evaluó, como en el caso de la semilla seca, la pérdida de electrolitos
e 3
a 3
d 3
d 3
c 3
b 3
h 3
i 2
h 3
g 3
f 2
i 4i
4
i 2
i 3
- 85 -
debidoaquedurantelahidrataciónyaseproduceesteproceso.Resultadosdelmismocapítulosugierenque
elmayordañooxidativoenlassemillasquerecibenluzseproduciríaenlastilacoidespropagándoseaotros
componentes celulares como las membranas plasmáticas. En consecuencia, es esperable que en los
cloroplastos,elnivelderadicaleslibresactivosseamayorqueenelrestodelcitoplasmayenconsecuencia,
tambiénloseaelgolpeoxidativo.Enel restodelcitoplasma,elmenornivelderadicaleslibresdeterminaría
queel incrementoqueseproducealcomienzode lahidratación (3h)noalcanceapromoverundañoque
aumentelapermeabilidadrespectodelaquemuestraelcontrolcomoseapreciaenlafigura3.IV.7.
0
1
2
3
4
0 3 6 9hs
ES
R (
W/L
)
Fig.�3.IV.7.-ESRcomomedidadepermeabilidaddemembranaensemillasenvejecidassometidasadiferentes tiempos de humidificación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de lascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP≤0,05poreltestdeTukey
Reacción�de�Maillard�
LassemillassometidasahumidificaciónmostraronunmarcadodescensoenelcontenidodeMaillard
(Fig.3.IV.8).Sibienenlabibliografíanoexistenreferenciasdeunhechosimilarcabesuponerqueentrelos
mecanismos de reparación que comienzan a actuar al hidratarse la semilla, se encontrarían los que dan
cuenta de ese descenso, sin que se pueda descartar �� ��� �� la existencia de alguno específico para la
eliminacióndeesosproductos.
a 4
c 4
b 4
a 4
- 86 -
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
400 450 500 550 600longitud de onda de emisión (nm)
inte
nsid
ad d
e flu
ores
cenc
ia (
UA
)control priming
Fig.�3.IV.8.-Fluorescenciadesemillasantesydespuésdelahumidificación.
LosresultadosobtenidosenestecapítuloconcuerdanconlasuposiciónexpresadaenIntroducción(de
estemismocapítulo)acercadequelafluctuacióndelaGNdurantelahumidificaciónesdebidaaunasimilar
fluctuaciónenelniveldedañooxidativo.
�
- 87 -
CAPÍTULO�3.V�
CARACTERÍSTICAS�FÍSICAS�DEL�CONTENIDO�CELULAR�
Enestecapítulosetratanseparadamentetresaspectosquetienenqueverconlascaracterísticasfísicasdel
contenidocelulardelostejidosembrionarios.Ellosson.
(a).�TRANSICIONES�VÍTREAS�(página88)
(b).�MOVILIDAD�MOLECULAR(página95)�
(c).�ISOTERMAS�DE�SORCIÓN�DE�AGUA�Y�NITROGENO�(página100)�
- 88 -
(a).�TRANSICIONES��VÍTREAS�
INTRODUCCIÓN�
La capacidad de algunas semillas para mantenerse viables por largos períodos con muy bajos
contenidosdeaguayenalgunos casos soportar contenidos tan bajos comocercanosal 1%, sugirió a los
investigadoresqueelmecanismodetoleranciadebeproducirprotecciónatodosloscomponentescelulares.
Un tipo de protección del citoplasma es el obtenido por la vitrificación delmismo. En sistemas biológicos
deshidratados,granpartede loscomponentesseencuentranenestadoamorfo formandovidrios(Levine&
Slade 1990; Ross & Karel 1991). Los componentes celulares no pueden alcanzar configuraciones de
equilibrio y por lo tanto no pueden organizarse para formar un cristal, sino que permanecen en forma
desordenadaoamorfa.
En el estado vítreo, por lo tanto, un fluido llega a ser altamente viscoso hasta tener propiedades
mecánicassimilaresaladeunsólido.Lossólidosamorfossonmaterialesmeta&establesconaltaviscosidady
bajamovilidadmolecular,existenenunestadodeno&equilibrioyexhibencambiosdependientesdeltiempoa
medida quese acercan al equilibrio. El aspecto de unmaterial vítreo es el de un sólido rígido quebradizo
caracterizadoporunaaltísimaviscosidad(alrededorde1012a1014Pas)(Sperling,1986).
Lamovilidadmolecularenlosvidriosestárestringidaavibracionesymovimientosrotacionalesderango
corto. Los cambios que ocurren en el estado vítreo, generalmente llamados “envejecimiento físico”, son
extremadamente lentos, y por lo tanto, los sistemas se pueden considerar estables a cambios físicos y
químicos. Un material amorfo vítreo puede pasar al estado líquido sobreenfriado dependiendo de la
temperaturaydelapresenciadeagua.Elcambioentrelosestadosvítreosysobreenfriadosseconocecomo
transiciónvítreaycorrespondeaunatemperaturaalacuallosvidriosempiezanaablandarseyfluir(Sperling,
1986). Por debajo de la temperatura de transición vítrea (Tg), que es característica de cada sistema, el
material es un sólido amorfo (vidrio). Las propiedades típicas de la mayor parte de los materiales vítreos
(llamados frágiles) son la fragilidad y la transparencia. La transformación demateriales vítreos en líquidos
- 89 -
superenfriadosviscososocurreenel rangode la temperaturadetransiciónvítrea.Es importantenotar,que
sobreelrangodelaTg,uncambiodepocosgradosdetemperaturapuedeprovocarenlosmaterialesfrágiles,
una disminución significativa en la rigidez. Debido a que las moléculas en los materiales en estado
sobreenfriadotienenmayormovilidadqueenelvidrio,sonmássusceptiblesaqueenellosocurrancambios
físicos o químicos. En este sentido la Tg es considerada como un “punto crítico” o una “barrera” para los
cambiosenloquerespectaaciertosaspectosdelaestabilidaddesistemasamorfos.
Burke(1986)consideraqueelestadovítreoeselmayorcomponentedelaestabilizacióndesemillas
secasenalmacenaje.LostrabajosrealizadosporWilliams(1994),Leopoldycol.(1994)confirmanlas
sugerenciasdeBurkeydesarrollanevidenciasdelacontribucióndelestadovítreoenlafisiologíadelas
semillas.Elestadovítreoesunodelosprincipalesfactoresdelaestabilidadycalidaddesemillassecasal
suprimirreaccionesquímicas,previniendoasídañosamacromoléculasymetabolitos.
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
LostermogramasobtenidosporDSCparasemillasde�����������equilibradasaactividadesdeaguade
0.11 y 0.75 se muestran en la figura 3.V.1 (A&B). Se observan transiciones térmicas que fueron
independientesdelcontenidoacuoso,conunpicoenelrangode0°C,atribuidosaloslípidosdelasemilla.
Enestudiospreviosrealizadosensemillasdequinoa(Matiacevichycol.2007),embrionesdemaíz(Williams
&Leopold1989),semillasde4��"!�(Craneycol.2003)seobservarontransicionesimportantesamenores
temperaturas, en el rango de–80 a &10º C que se atribuyeron principalmente a la fusión de las distintas
fraccionesdelípidos.Enelcasodesauce,lafusiónsepresentaatemperaturascercanasa0°Cyeláreade
lospicosesmásgrande(5.5J/g),comparadoconeldeotrassemillasindicandounaltocontenidolipídicode
un punto de fusión relativamente elevado. Las temperaturas de transición vítrea se muestran también
indicadaenlasfiguras3.V.2(A&D).
- 90 -
Fig.� 3.V.1.- Termogramas obtenidos por DSC para semillas de sauce equilibradas a actividades deaguade:0.11(A);0.75(B).
Lípidos
Proteína
Tg
Lípidos
Proteína
Tg
aw 0,75 6,98 mg; 10°C/min
A�
B�
- 91 -
Paraalgunasmuestras,lastemperaturasdetransiciónvítreasfuerondifícilesdedeterminar,debidoala
superposiciónde lasmismascon las transicionesde los lípidos,queseextendieronenunrangoampliode
temperaturas.EnlaFigura3.V.2seindicapormediodedeflechaselvalorprobabledelastemperaturasde
transiciónvítreaparamuestrasdedistintasactividadesdeagua.
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
2 m
W
exo
>
A� aw= 0,22
2 m
W
exo
>
&50050100°C
�B aw= 0,44
d. aw= 0,58
&50050100°C
exo
>
exo
>
exo
>
exo
>
2 m
W
2 m
W
2 m
W
2 m
W
Fig.�3.V.2.-�TermogramasobtenidosporDSCparasemillasdesauceequilibradasaactividadesdeaguade:
0.22(A);0.44(B);0.58(C);0.84(D).
&50050100°C
�D aw= 0,84
&50050100°C
��C�
- 92 -
Cuandoseextrajeron loslípidosde lassemillasloseventostérmicosatribuidosalafusiónde lípidos,
disminuyeronsignificativamente.Porotraparte,segúnseobservaenlafigura3.V.3lastransicionestérmicas
delextractolipídicomuestraneventosendotérmicosquecoincidenconlosobservadosenlasemillacompleta.
Apareceenlasemilla,además,unatransiciónendotérmicaentre60y90°Cquehasidoobservadaenotras
semillas, que desaparece luego de barridos subsecuentes. Leprince yWalter&Vertucci (1995), Sun y col.
(1998)ySánchezdelÄngelycol. (2003)mostraron transicionessimilaresenporotoyproductosabasede
maíz, respectivamente. Estos picos son típicos y se consideran debidos a desnaturalización de proteínas.
Hastaunahumedadrelativade84%noseobservóaguacongelable(yaquenoseobservanningunadelas
transicionesdelagua,comocristalización/fusióncercade0°C).
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
Fig.�3.V.3.-�TermogramaobtenidoporDSC(5°C/min)delextractolipídicodelassemillasdesauce.
Elaumentodelahumedadrelativadeequilibrio,produjounadisminucióndelvalordelaprobableTg.
Segúnsemuestraenlafigura3.V.4.LamovilidadmolecularporencimadeTgesunfactorimportanteque
Extracto lipídico
-50 -25 0 25 50-1.00
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
T (°C)
mW
- 93 -
puedeinfluirenlaestabilidaddelmaterialbiológicodadoquepuedeinfluirenlavelocidaddereaccionesde
deterioro,disminuyendolalongevidad.Comoseobservaenlamismafigura,a25°C,elcontenidodeagua
límiteparaquelasemillaseencuentreenestadovítreodebesermenorque10%.
Pequeñosaumentosdelatemperaturaodelahumedadrelativaprovocanelpasajedelestadovítreoalestado
menosestabledelíquidosobreenfriado.Deestaforma,paramejorarlaestabilidaddelassemillas,latemperaturaesla
variablequepodríaajustarse.Deacuerdoconlamismafigura,paramantenerelestadovítreo,lasmuestrascon
humedadessuperioresa10%deberíanconservarsebajorefrigeraciónocongeladas.Sinembargo,lospuntos
marcadosenlacurva,correspondenatemperaturasalasquelagerminaciónmuestraundecaimientorelativamente
rápidoquenopareceríacompatibleconunestadodealtaviscosidadcomoeselvítreo.Alrespecto,nosedescartaque
esasituaciónpuedadeberseacausasnoexcluyentesentresí,comounestadodelcontenidocelularconaltaporosidad
loquefacilitaríaladifusióndeloxígenoy,porende,lasreaccionesdeautooxidacióny/oalaestructuracelularmás
compleja(menoshomogénea)quetienenestassemillasrespectodelasortodoxaslongevas,debidoaqueenellasel
procesodedesdiferenciacióncelular(capítulo3.II)esmenosacentuado.
- 94 -
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
Fig.�3.V.4.-�Temperaturadetransiciónvítrea(Tg)obtenidaparasemillasdesaucededistintoscontenidosacuosos(ca)eng/100gdesólidoseco.Loscículossobrelaflecharepreswentanlascondicionesexperimentalesanalizados
�
�
�
�
�
�
SAUCE
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.00
20
40
60
80
100
C.A.
T g,
°C
- 95 -
(b).�MOVILIDAD�MOLECULAR��
INTRODUCCIÓN�
La resonancia magnética nuclear protónica de baja resolución (TD&NMR) ha sido empleada para
estudiar el estado del agua y los cambios metabólicos en muchos sistemas biológicos. La relajación
transversal de los protonesdel agua ha sidoutilizadapara describir la compartimentación del agua en los
tejidos (Ratcliffe 1994). Lasmoléculas de agua que sonmás omenosmóviles tienen diferentes tasas de
relajación, pudiendo calcularse sus cantidades relativas (Krishnan y col. 2004). En comparación con los
métodosgravimétricos,lastécnicasdeRMNpuedenproveerinformaciónmásdetalladasobreelcontenidoy
elestadodelaguaen lassemillascondiferentescontenidosdeaguaduranteelalmacenamiento(Krishnan
2004).
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
Sedeterminaronlostiemposderelajaciónespínespíndesemillasdesauce,equilibradasaactividad
de agua de 0,52, que presentaban contenidos acuosos cercanos al 10%, los que se compararon con los
resultados obtenidosdeotras semillasde tamañosimilar, equilibradasa lamismaactividaddeagua. Los
resultadossemuestranenlaTabla3.V.1.
ElanálisisdelaseñalderelajacióntransversaldeterminadosporFIDparalassemillassecasmostraron
queeldecaimientodelaseñalpodíaserrepresentadoporunacurvaexponencialdeprimerorden,yqueel
tiempo de relajación de las semillas de sauce supera al de las otras. Esto indica una mayor movilidad
molecularqueseríaconsistenteconelmásrápidodeterioroquemuestranestassemillas,sibienladiferencia
enlasmovilidadesnoguardarelaciónconlaqueexisteentrelaslongevidades.Detodasmaneras,respecto
de laaplicacióndeestametodologíaode laquedetectaelmovimientodesondas (ESRespínprobepara
evaluar la movilidad molecular, es necesario tener en cuenta que, como consecuencia de la menor o
incompleta desdiferenciación celular las semillas de sauce presentan un sistema más heterogéneo
estructuralmente que el de las semillas ortodoxas típicas por lo que una estricta comparación de las
- 96 -
movilidadesentresauceylasotrassemillasresultaríacuestionable.Enconcordanciaconestoúltimosurgela
cuestión del grado de homogeneidad del sistema a evaluar que sea compatible con una confiable
interpretacióndelosresultados.Sinembargo,unanálisisdelosecosdeespínatravésdelasecuenciaHahn
exhibiódiferenciasdecomportamientoparalassemillasdesauce(Tabla3.V.2).
�
��Tabla� 3.V.1.- Tiempos de relajación T2 obtenidos por FID, para un modelo de decaimiento
monoexponencial, con para semillasdedistinto tipo.Wcontenidodeaguaenbaseseca;aw: actividaddeagua;I.C.:intervalodeconfianza;Amp:amplitudrelativadelaseñal.�
Tabla� 3.V.2. Tiempos de relajación T2obtenidos por la secuencia de ecos de espín deHahn parasemillasdedistintotipo.IC:intervalodeconfianza;Amp.:amplitudrelativadelaseñal,enporcentaje;
&&:nocorresponde,yaqueelmodelodeprimerordenfueelúnicoadecuado.
W� aw�
T2�FID�
(µµµµs)�
IC�
(µµµµs)�
Amp.�
(%)�
Cilantro 9,2 0,552 9,7 0,1 100
Valenciana 8,9 0,551 9,9 0,1 100
Trebi 8,7 0,553 8,9 0,1 100
Sauce 10,1 0,510 11,4 0,1 100
Trigo 11,0 0,547 9,0 0,1 100
T2�Hahn��
(µµµµs)�
IC�
(µµµµs)�
Amp.�
(%)�
T2�Hahn�
(µµµµs)�
IC�
(µµµµs)�
Amp.�
(%)�
Cilantro 37 4 100 && && &&
Valenciana 40 4 100 && && &&
Trebi 33 3 100 && && &&
Sauce 30 3 80 530 0,461 20
Trigo 33 3 100 && && &&
- 97 -
�
Enlassemillasdesauceaquíestudiadasaparecierondospoblacionesdeprotones,una,quedacuenta
dealrededordel80%delaseñal,contiemposderelajaciónde30microsegundosyunasegundapoblación,
correspondienteal20%delaseñal,conuntiempoderelajaciónde530microsegundos.Lasecuenciade
Hahndetectamovilidadesintermediascuandoyahanrelajadolosprotonesmenosmóviles.Paraelrestode
lassemillasmásdel99%delosprotonesdecayóenuntiempoderelajacióncercanoa30microsegundos.La
presenciadelasegundapoblacióndeprotones,muchomásmóviles,segúnloqueindicasumayortiempode
relajación,probablementeestéasociadaalapresenciadevacuolas,talcomoseobservópormicroscopía
electrónica(Capítulo3.IIdeestatesis).
Cuandolassemillasdesaucesehumedecierondurantetodalanoche,laactividaddeaguadelas
mismasaumentóa0.97yserepitieronlasdeterminacionesparadetectarsieneseestadohídricola
presenciadeagualibrepodríadistinguiralgúncomportamientodiferencialdelassemillasdesaucecon
respectoalasortodoxastípicas.Enestecaso,laaplicacióndelasecuenciadeHahnpermitiódetectarqueel
decaimientodelaseñalsepodíarepresentarporunafuncióndedecaimientobi&exponencialparaelcasode
sauceymono&exponencialparaelrestodelassemillas.Paralassemillasdesaucehúmedassedeterminó
unaprimerapoblacióndealrededorde30µsyunasegundacercanaalmilisegundo(844µs).Paraelresto
delassemillaseldecaimientofueentiemposdelordende60a120µs(Tabla3.V.3).
- 98 -
T2�Hahn��
(µµµµs)
IC�
(µµµµs)
Amp.�
(%)
T2�Hahn��
(µµµµs)
IC�
(µµµµs)
Amp.�
(%)
Cilantro 97 2 100 && && &&
Valenciana 121 20 100 && && &&
Trebi 64 3 100 && && &&
Sauce 30 4 23 844 123 77
Trigo 57 10 100 && && &&
Tabla�3.V.3.-TiemposderelajaciónT2luegodelasecuenciadeecodeespíndeHahnparasemillas
humedecidas.IC:intervalodeconfianza;Amp.%:porcentajedeintensidaddelaseñal.
&&:nocorresponde,yaqueelmodelodeprimerordenfueelúnicoadecuado
Demodosimilaraloquesucedeenlassemillassecas,enlassemillashúmedasdesaucetambiénse
detectarondospoblacionesdeprotonesaunqueconmayormovilidad(Tabla3.V.3).Enelrestodelas
semillas,porestemétodo,sólosedetectasólouna.
Medianteelanálisisdelostiemposderelajaciónporecodeespín,luegodelaaplicacióndela
secuenciaCPMGsepuedeestudiarelcomportamientodelasfraccionesdeprotonesmásmóviles.Yaque
laaplicacióndeestasecuenciainvolucralaaplicacióndetiemposdevariospulsosytiemposdeinterpulsos,
lamediciónserealizacuandolaspoblacionesdeprotonesmenosmóvilessehanrelajado,yporesose
detectaúnicamenteelcomportamientodelosprotonesmásmóviles.Enestecaso,sepudodeterminarque
eldecaimientoeratri&exponencial(locualindicalapresenciadeporlomenostrespoblacionesdeprotones
dealtamovilidad).ComomuestralaTabla3&V&4,laprimerapoblacióncorrespondeaprotonesquerelajanen
elordende5a10ms,lasegundaentre15y50ylatercera(másmóvil)de77a170ms.Enestecasolas
semillasdesaucemuestrantiemposderelajacióndentrodelrangodelrestodelassemillas,yquizáuna
pequeñadiferenciaenladistribucióndemovilidades,yaquepresentanunaproporciónlevementemenorque
elrestodelassemillasdelatercerapoblación(másmóvil).
- 99 -
Tabla�3.V.4.-TiemposderelajaciónT2luegodelasecuenciadeecodeespínCPMGparasemillas
humedecidas.IC:intervalodeconfianza;Amp.%:porcentajedeintensidaddelaseñal
ElanálisisdelosdiferentestiemposderelajaciónT2obtenidossegúnFID,HahnyCPMGindicaquela
diferenciadecomportamientomásnotableencuantoalamovilidaddelosprotonescorrespondealas
semillasconcontenidoacuosocercanoal10%,queeselquealcanzanlassemillascuandosedeshidratan
naturalmente.
Enuntrabajodeinvestigaciónrecientesobresemillasdequinoa(Castellion2008)sereportaquela
tercerapoblacióndeprotonescuyotiempoderelajaciónesdelordende100ms,correspondíaalosprotones
deloslípidosmásmóvilesyaquesuamplitudytiempoderelajaciónnovariabaconelcontenidodeagua
(Castellión2008).Deestamanerasepodríaatribuiraloslípidosunaimportantecontribucióndelosprotones
dedichapoblación.
T2�CMPMG��
(ms)
IC�
(ms)
Amp.�
(%)
T2�CPMG��
(ms)
IC�
(ms)
Amp.�
(%)
T2�CPMG��
(ms)
IC�
(ms)
Amp.�
(%)
Cilantro 13 1 39 46 10 34 164 10 26
Valenciana 8,7 0,4 43 32 2,2 38 136 10 19
Trebi 3,8 0,1 47 19 0,7 35 71 2 19
Sauce 4,3 0,1 44 15 0,3 32 96 1 12
Trigo 4,8 0,2 49 17 0,7 36 77 3 15
- 100 -
(c).�PROPIEDADES�DE�SORCIÓN-�ISOTERMAS�DE�SORCIÓN�
INTRODUCCIÓN�
Elcontenidodeaguaenlassemillasesciertamenteelfactormásimportanteparadeterminarsus
característicasdealmacenaje.Engeneral,lashumedadesadecuadasparaelalmacenamientodesemillas
ortodoxasseencuentranentre7y10%(baseenmasaseca)(Leopolds1990).
Laactividaddeagua(aw),esunamedidaindirectadelaguaqueestádisponibleenundadomaterial
paraparticiparendiferentesreaccionesdeteriorativasyenelcrecimientomicrobiano.
Enelequilibrio,atemperaturaconstante,lasactividadesdeaguadeloscomponentesdeunamezcla
soniguales,mientrasqueloscontenidosdeaguapuedennoserlo.Laactividaddeaguaestárelacionadacon
lahumedadatravésdelaisotermadesorcióndeagua.Suvalorvaríaentre0y1.
ap
pT cteW
V H O
V H Opura
o= ≈ =( )
( )
.2
2
��� ���1.1�
Donde:
aweslaactividaddeagua
peslapresióndevapordeaguaenelsustratoalatemperaturaT
p0eslapresióndevapordelaguapuraalatemperaturaT
Estaigualdadsebasaenasumirlaexistenciadeequilibriotermodinámico.Generalmenteensistemas
complejos,comolassemillas,estacondiciónpuedenocumplirseyporelloseríamáscorrectousareltérmino
presióndevaporrelativa(PVR)enlugardeltérminoaw(Fennema,1996).
Enelequilibrio,larelaciónentrelaawylahumedadrelativa(HR)estádadaporlaecuaciónsiguiente:
aHR
w =100
1.2
- 101 -
Elcontenidodeaguaessimplementeunamedidadelaconcentracióndeaguaenlasemilla.Enelequilibrio,
el contenido de agua se relaciona con la humedad relativa o awmediante las isotermas de sorción. Las
isotermas de sorción de diferentes materiales biológicos muestran un curva de forma sigmoidal reversa
(LeopoldyVertucci,1986;VertucciyLeopold,1987,Ishidaycol,1988;RobertsyEllis,1989).
Ψ Ψ Ψ Ψ (Mpa) a 25°C
1009080
70
60
50
40
30
20
10
0
Con
teni
do d
e hu
med
ad (
% b
ase
seca
)
Con
teni
do d
e hu
med
ad (
% b
ase
húm
eda)50
40
30
20
10
0
Ψ Ψ Ψ Ψ (Mpa) a 20°C
0 50 100
-500 -100 -50 -10 0
-500 -100 -50 -10 0
Humedad relativa (%)
�
Figura�3.V.5.-Isotermadesorcióndesemillasdelechuga(azul)ydecebada(roja)atemperaturaconstante(EllisyRoberts,1980).Elcontenidodeaguasemuestracomo%enbasehúmeday%enbaseseca.
Deacuerdocondichascurvasyestudioscalorimétricos,sehanclasificadoalmenos5rangosdeagua
onivelesdehidrataciónenlostejidosdesemillasortodoxasyrecalcitrantes(Vertucci,1989,1990;Berjaky
col., 1990, 1992; Pammenter y col, 1991). En la región 1 (de 0 a 8&10 g H2O/ 100g demasa seca), las
moléculas de agua están asociadas fuertemente a superficiesmacromoleculares por enlaces iónicos y se
comportancomoun ligandoantesquecomounsolvente.Laenergíadeatracciónesestimadacomo–50kJ
mol&1.
- 102 -
Enlaregión2(8&22%),elaguaformapartedevidriosgeneradosporlossólidos(Williams&Leopold,
1989) y la energía de atracción disminuye a cerca de –2kJ mol&1 sugiriendo una interacción débil con la
superficiemacromolecular(Vertucci,1989).Cuandosuconcentraciónestácercadel22%,elaguarecupera
sus propiedades de solvente y aparecen algunas actividades metabólicas. Las moléculas de agua
correspondientesalasregionesdehidratación1y2seconocentradicionalmentecomo“agualigada”,queda
cuentadelagraninteraccióndeestasmoléculasconlossólidos.
Las propiedades térmicas del tercer nivel de hidratación (22&33%) aparentan ser de una solución
concentrada. A este nivel de hidratación se puedemedir la respiración (Leopold & Vertucci, 1989). En la
región 4 (33&55%) y 5 (encima del 55%), el agua exhibe propiedades térmicas similares a una solución
diluida. Encima del 55 % de contenido de humedad, los tejidos de las semillas están completamente
hidratados,permitiendoqueselleveacaboelprocesodegerminación.
Estudiosdelainfluenciadelaactividaddeagua(aw)enlavelocidaddelasreaccionesquímicasindican
queabajasactividades,elaguanoestádisponibleparaactuarenreaccionesquímicasdebidoaqueestase
encuentrafuertementeligadaalasuperficiedesitiospolares.Amásaltasactividades,elaguaexisteen
multicapasodentrodecapilarescomofasecondensadaylamovilidaddelsistemaseincrementa.Esta
situaciónesatribuiblealasdiferenciasdeintensidadconlaqueelaguaseasociaconlosconstituyentesno
acuosos.Elaguaunidafuertementeestámenosdisponibleparalasreaccionesdegradativas,talescomoel
crecimientodemicroorganismosylasreaccionesquímicashidrolíticas,queelaguaquetieneasociaciones
débiles.
Aunadadahumedadrelativa,ladiferenciadelcontenidodeaguaenelequilibrioentresemillasde
diferentesespeciespuedevariar,yaquedependedelacomposicióndelcitoplasma(Vertucci&
Leopold1987).Másaún,laintensidadynaturalezadelainteraccióndelaguaconlossólidosdelassemillas
incidesobrelavelocidaddelasreaccionesdedeterioro(Vertucci&Ross1993;Leopold&Vertucci1989).Por
lotanto,lascaracterísticasdesorcióndelassemillaspuedentenerinfluenciasobrelavariacióndela
- 103 -
longevidaddelassemillasentrediferentesespecies(Eiraycol.1999)o,aún,entredistintoscultivaresaunque
larelaciónentrelacapacidaddeunióndelaguayelcomportamientoenelalmacenamientonohasido
confirmada.
�
Modelado�de�las�isotermas�de�sorción�de�agua�
Elmodeladodelasisotermasdesorcióndeaguaesparticularmenteimportanteparapredecirlavida
mediadealimentosdehumedadbajaeintermedia(Labuza,ycol.,1970;Labuza,1980;Simatos&Karel,
1988).LasecuacionesdeBrunauer&Emmett&Teller(BET)(Brunauer,ycol.,1938)yGuggenheim&Anderson&de
Boer(GAB)(vandenBerg,1981)sonmodelosconocidosdeisotermasdesorciónqueproveenelvalorde
humedaddemonocapa.Elvalordehumedaddemonocapasueleserconsideradocomoelcontenidodeagua
óptimoparalaestabilidaddealimentosdebajahumedad.ElmodeloBETsederivadeunmodelodesorción
quefueoriginalmentepropuestoparalasorciónfísicadeungasinerteenunasuperficiedeunsólido,ysus
dossupuestossonquelasuperficietieneunáreafijaygeométrica,yquehayunadiferenciagrandeentrela
cantidaddeenergíaliberadacuandounamoléculallegaalasuperficiedelmismosólidooaunsitiodondeya
estácubiertoporotrasmoléculasdegas.Deestaforma,elvalordemonocapasevisualizacomolacantidad
degasquecubrelasuperficieexpuestadelsólidocompletamenteconunacapadeunamoléculadegrosor
(vandenBerg,1981).LaaplicabilidaddelmodeloBETselimitaaawenelrangode0,1a0,5(Labuza,1968),
peroelmodeloGABsepuedeaplicarsobreunrangomásampliodeaw(vandenBerg,1981).
ElmodeloBETesempleadoparaestimarlassuperficiesdesorcióndegasesenmaterialesporososa
findeconocersugradodeporosidad,tipo,distribucióndetamañodeporoyvolumenmediodeporos.
�
�
�
�
- 104 -
�
RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�
Isotermas�de�sorción�de�sauce�comparadas�con�otras�semillas�
Lafigura3.V.6muestralaisotermadesorcióndeaguaobtenidaparasemillasdesauceapartirdelos
datosdecontenidoacuosoacadahumedaddeequilibrioempleada.
SeempleólaecuaciónGABparadescribirlasisotermasdesorcióndesauce,empleandoelmétodode
cuadrados mínimos para minimizar la diferencia absoluta entre los valores experimentales y calculados a
travésdelmodelo.EstaecuaciónGABsehaempleadoparavariosmaterialesbiológicosyesaplicableenun
amplio rango de contenido acuoso. Las constantes GAB m0, C y k, se obtuvieron empleando la forma
cuadrática:
2
00)
)11(()21()1( ww
w amkCaCCkmm
a −+−+=
donde:meselcontenidodeagua;m0eselvalordehumedaddemonocapaGAB,Ceslaconstantede
Guggenheim,relacionadaconelcalordesorcióndelaprimeracapademoléculas,sobrelossitiosprimariosy
kesun factorquecorrige laspropiedadesde lamulticapadeaguarespectode lasdelagua .Cykestán
relacionadosconlaenergíadeinteracciónentrelamonoymulticapayreflejanelefectodelatemperatureen
laspropiedadesdesorción.kesprácticamentesinexcepcióncercanoa1,peromenor.
La bondad del ajuste se evaluó a través de la desviación porcentual (%E) entre los valores
experimentalesyloscalculados,paralocualseempleólasiguienteecuación:
∑−
=m
mim
nE
*100%
Donde:neselnumerodemediciones,meselcontenidoacuosoexperimental ymi*eselcontenido
acuosocalculadomedianteelmodelo.
LosparámetrosobtenidosparaGAB,mo,kyCsemuestranenlaTabla1juntoconeldelassemillas
de especies originarias del desierto de Atacama, pertenecientes a los géneros�� ����&���� � y ����,
- 105 -
algunasextremadamentetolerantesaladesecación.Lasconstanteskfueronmenoresque1paratodoslos
materiales analizados [27]. Es interesante notar que tanto la llamada humedad de monocapa como las
constanteskycnomuestrandiferenciasparalassemillasquetienendistintatoleranciaaladesecación.Enel
trabajo de Vertucci & Leopolds (1987) se sugiere que las semillas intolerantes a la desecación presentan
curvasdesorciónhiperbólicas,caracterizadaspor laausenciadesitiosdesorciónenlaregión1.Segúnlos
resultados obtenidos en el presente trabajo, no es posible distinguir las semillas de sauce, de otras de
estabilidadmuchomayor,porelanálisisdelaspropiedadesdesorción.
- 106 -
SAUCEISOTERMA GAB
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
10
20
30
aw
Hum
edad
, %
(b.s
.) 26°C
BÁLSAMOISOTERMA GAB
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
10
20
30
40
5026°C
aw
Hum
edad
, %
(b.s
.)
�
NOLANA V.ISOTERMA GAB
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
10
20
30
aw
Hum
edad
, %(b
.s.)
Figura�3.V.6.-�Isotermadesorcióndeaguadesemillasdesauce(medicionesporduplicado).�
- 107 -
LosdatosobtenidosatravésdelaaplicacióndelmodeloGABsepuedenobservarenlaTabla3.V.5.
Muestra� moa(%d.b.)� kb� Cb� %Ec� Referencias�
Sauce 5.7 0.697 17.7 4 Presenteestudio
Quinoa,cv.BaerII 5.0 0.873 23 3 Matiacevichycol.2006
Quinoacv.Ollagüe 4.5 0.87 52 3.2 Matiacevichycol.2006
Quinoacv.Chadmo 4.7 0.88 56 3.4 Matiacevichycol.2006
Lechuga 4.6 0.913 7.5 4 EllisyRoberts1995
�����)��� ��� 5 0.679 19.1 5 Scheborycol.2002
Bálsamo 5.1 0.872 39.8 3 Scheborycol.2002
Cebada 7.3 0.807 51.12 7 EllisyRoberts1980
Amaranto 10.2 0.81 16.8 5 Pollioycol.1998
Bálsamo 10.2 0.62 18.6 6 Timmermannycol.2001
Table�3.V.5.-ConstantesdelaecuaciónGABybondaddelajusteaplicadoalasisotermasdesorcióndesemillasdesauceycomparaciónconlosvaloresdeotrassemillas.
aContenidodeaguanecesarioparacubrirlasuperficiedelossitiosmáspolaresconunamoléculadeagua.(mo).
bFactordecorreccióndelaspropiedadesdelaguaenmulticapasconrespectoalagualíquida.cGuggenheimconstantdDesvíorelativoporcentual.
Isotermas�de�adsorción�de�Nitrógeno�
Debidoaqueelairepresenteenlassemillaspuedeserunfactormuyimportanteparadeterminarla
velocidaddedeteriorodelassemillas,seevaluólasuperficiedelassemillasdesauceexpuestaaaire,a
- 108 -
travésdelasisotermasdeadsorcióndenitrógeno,quesegraficanenlafigura3.V.6.Paracomparaciónse
realizóelanálisistambiénensemillasdetrigo.Laformadelascurvasdeambosmaterialescorrespondeala
clasificacióndeisotermastipoIIsegúnlasisotermasestándardeIUPAC(setratadesólidosdebaja
porosidad),yenellaspuedeobservarsequelaadsorcióndeNesmayorenlassemillasdesaucequeenlas
detrigoentodoelrangodepresionesparciales.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
sauce
trigo
Presión relativa
Vol
umen
ads
orbi
do(c
m3 /g
)
Figura�3.V.6.-Isotermasdeadsorcióndenitrógenoparasemillasdesauceyparagranosdetrigo.
Losresultadosobtenidosapartirdelanálisisdelasisotermasdeadsorcióndenitrógenoseencuentran
tabuladosenlaTabla3.V.6enlacualseincorporóademáseláreasuperficialparalaadsorcióndeagua
(SWGAB)calculadaapartirdelosdatosobtenidosmediantelaecuacióndeGAB,delasecciónanterior:
M
moNaSWGAB =
- 109 -
DondeSWGABeslasuperficieparaadsorcióndeagua(m2/g),moeselcontenidodeaguademonocapa
obtenidoporGAB(gH2O/g/NeselnúmerodeAvogadro(6.02x1023moléculas/mol);Meslamasamolarde
agua(18g/mol)y�eseláreadeunamoléculadeagua(10.6x10&20m2/molécula).
Especie SNBET
(m2/g)
Vm
(cm3/g)
SWGAB
(m2/g)
Trigo 0.0212 0.00487 354.50
Sauce 0.0800 0.01839 202.07
Tabla�3.V.6.-�SuperficiesespecíficasparalaadsorcióndenitrógenocalculadaporBET(SNBET)yparalaadsorcióndeaguacalculadaporGAB(SWGAB)parasemillasdetrigoysauce.
Comoloindicanlosdatosobtenidos,eláreaparalaadsorcióndegasesesmuybajaenambas
semillasconrespectoalosmaterialesquenormalmenteseanalizanporestametodología(catalizadores,
polvos,etc.).Además,parasemillasdesauceescasicuatrovecessuperiorqueparagranosdetrigo.Al
respecto,cabemencionarquenoexistenreferenciassobrelamedicióndelaporosidadensemillas,
metodologíaqueporlosresultadosobtenidospodríaaportarunainformaciónmuyútilparadiferenciar
comportamientosysusceptibilidadalaoxidación.Asuvez,elvolumenmediodeporoestambiéncuatro
vecesmayorenlassemillasdesaucequeenlasdetrigo.Lamayoráreasuperficialyelmayorporoindican
unaporosidaddelassemillassuperioraladelosgranosdetrigoanalizados.Asuvez,paraambassemillas,
lasáreasespecíficasparalaadsorcióndeaguaestresórdenesdemagnitudmayorquelascorrespondientes
alaadsorcióndenitrógeno,loqueesconsecuenciadelaaltahidrofilicidaddeambosmateriales,siendoesta
superiorparalosgranosdetrigo.Estosresultadossonconcordantesconlaconclusiónquesederivódelos
capítulosanterioresacercadequelacausadelrápidodeterioropareceríadeberseaciertaspropiedadesdel
- 110 -
contenidocelular,especialmente,aunaporosidadmaselevadaqueladeotrassemillasortodoxas,mucho
máslongevas.
�
- 111 -
CAPÍTULO�5�
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