MANIPULACIONE.S GENETICAS.A.D.N. RECOMBINANTE

DISCURSO DE INGRESO

Por el

Muy lltre. Dr. Fn.lucrsco FEnnÁNnrz Gancí¡

Académico Correspondiente Electo

Excuo. SR. PnesroENrs:Exc '¿os. e l luos. Srñonrs:

Muy IlusrnEs SRES. AcaoÉulcos:S¡ñonas v S¡ñon¡s:

Hace ahora poco más de un año me vi gratamente sorprendido porun magnífico amigo e Ilustre Académico con el anuncio de que seme había elegido para formar parte, como Académico correspondiente,de esta Real Academia de Farmacia, lo que me fue posteriormenteconfirmado por su Ilmo. Sr. Secretario, mediante comunicación ofi-cial, que me llenó de alegría.

A partir de ese momento inicié la búsqueda de un tema paraCesarrollar, que pudiera estar a la altura de otros presentados en estaReal Academia y, después de muchas dudas y de haber evaluado variasposibil idades, l legué a la conclusión de que sería bueno hacer miaportación en el terreno de una tecnología de vanguardia, directamenterelacionada con posibil idades futuras de la industria farmacéutica ydel medicamento.

Me fue de gran ayuda el estudio realizado por la OCDE sobre laevolución futura de las sociedades industriales avanzadas en armoníacon la de los países en desarrollo, en el cual se plantean cuatro interro-gantes fundamentales:

- ¿Puede continuar el crecinriento mundial en el futuro sin verse

entorpecido por las l imitaciones de las disponibil idades mun-

diales de materias primas, etc.?

- ¿Cuáles serán los problemas a los que deberán enfrentarse las

sociedades industriales avanzadas en los próximos veinticinco

años? ¿Cuál serír la capacidad de estas sociedades para adaptar

sus eslruc¡uras industriales y económicas a las situaciones fu-

turas?- ¿Cómo evolucionarán las sociedades del tercer mundo ante los

problemas a que se enfrentan?

- La intensificación de la interdependencia mundial ofrece nue-vas posibil idades, pero a la yez deja a ciertos países con unacierta vulnerabilidad. ¿Cuáles son las perspectivas a largo plazopara esa interdependencia? ¿C,ráles son los problemas que plan-tean en sectores tan diferentes como la industria, las materiasprimas, la energía, etc.?

Frente a este marco se dibujan como prioritarias una serie de ac-

tuaciones referidas a áreas tan importantes como la agricultura, lasmaterias primas, la energía, la industrialización y muy especialmentecuatro grandes aventuras tecnológicas: la electrónica (teleproceso yautomación); la producción de energía primaria; el uso de los océanosy del espacio y, muy especialmente, los desarrollos fundamentales enla biología que tienen grandes implicaciones para la industria farma-céutica, los medicamentos, la medicina, la agricultura y las actividadesindustriales.

Justamente en este último campo hemos fijado nuestra atención ytenemos el honor de presentar nuestro trabajo a esta selecta audienciacon el título de:

MANIPULACIONES GENETICAS.A. D. N. RECOMBINANTE

INrnonucclóN

Hasta 1940 se aceptaba que las bacterias eran seres unicelularesque se multiplicaban fácilmente y por simple escisión. Durante la dé-cada de los 50 se puso de manifiesto que las bacterias y los virus erancapaces de diferentes tipos de fusión en consonancia con las variadasformas de reproducción sexual de ciertos organismos superiores.

Las recombinaciones resultantes de los ensayos de laboratorio po-dían ser interesantes y úti les (p. ej., el desarrollo de una variante no vi-rulenta de un microorganismo para la preparación de vacunas).

A comienzos de 1960 se comenzó a discutir en los medios cientí-f icos sobre la posibil idad de que las cepas recombinantes pudieran l le-gar a ser peligrosas y que era posible que cualquier equipo de trabajopudiera producir gérmenes con virulencia enormemente aumentada.

El fenómeno de la transferencia de la resistencia a los meclica-mentos dio un gran impulso a la realización de estudios detailadosacerca de cómo los materiales del núcleo podían ser transferidos entrediversas especies de bacterias.

Este nuevo y excitante campo de la investigación fue inmediata-mente desarrollado, comenzándose a uti l izar plásmidos microbianos(ADN circular), que hoy son manejados corrientemente en los labora-torios de investigación; por otra parte, recientes avances en las técnicasde aislamiento y unión de segmentos de ADN permiten actualmente la"construcción" de moléculas biológicamente activas de ADN recom-binante (in vitro). Se ha demostrado que este material se repiica y semantiene estable en E. coli.

Los científicos responsables han llegado al compromiso de renun-ciar a dos diferentes tipos de ensayo en relación con el ADN recom-binante. Se ha propuesto la creación de un Comité que defina perma-nentemente los peligros potenciales y desarrolle las normativas bajolas cuales puedan realizarse estas investigaciones. El E. coli que seutil iza normalmente para "clonar" el ADN recombinante, aparececomo un componente normal de la flora intestinal del hombre y de

los animales y se puede transferir su material genético a géneros y es-pecies bacterianas diferentes, alguna de las cuales puede ser patógenapara el hombre, los animales y las plantas.

Esto daría lugar a que el hombre tuviera que enfrentarse con cepasbacterianas conteniendo nuevos y vigorosos determinantes replicativosque incrementarían la resistencia bacteriana a los antibióticos, podríanformar toxinas o serían de una gran capacidad invasora. Resulta con-veniente establecer una pausa y meditar sobre cuántos de estos deter-minantes existen ya realmente en la naturaleza, aun cuando sus efectostodavía no se hayan detectado. La inquietud por la posibil idad de unincremento en el número de tumores que se producen en el hombre,también está justificada; el ADN oncogénico transferido a poblacionesbacterianas o virales en el hombre y otras especies podría dar lugar aun aumento en la incidencia de determinadas enfermedades de este uotro tipo. Muchos fragmentos de ADN animal unidos a plásmidos bac-terianos (ADN) o a ADN de bacteriófago podrían producir secuenciasde ARN similares a las del ARN de los tumores.

Habiéndose producido ya esta alerta es lógico esperar una actua-ción a escala mundial por parte de la Organización Mundial de la Sa-lud y, a otros niveles, de las correspondientes autoridades sanitarias delos diferentes países.

Evidentemente, no se trata de prohibir, sin más, las investigacionesen este campo de la ciencia, pero sí de vigilarlas y regularlas adecua-damente, en previsión de riesgos.

P¡.nrs I

GENETICA HUMANA

La genética está relacionada directamente con la herencia, sea éstanormal o anormal, y con la acción de los genes y del medio ambiente.Este últ imo concepto es de especial interés para la genética clínica,desde el momento en que la expresión de los genes puede ser modi-ficada por manipulación del medio ambiente. Por ejemplo, en una socie-dad que no ingiera productos derivados de la leche y en la que losniños no reciban tampoco el pecho de la madre, no es posible caeren un proceso denominado galactosemia, que es una enfermedad here-dada. La Genética Humana puede dividirse en diversas líneas de es-tudios: población genética, genética de las células somáticas, citogené-tica, genética bioquímica, inmunogenética y genética aplicada y clínica.

Población genética

La población genética estudia la herencia de los individuos en losrasgos de los mismos y también la distribución de los genes en las po-blaciones. Con excepción de los cromosomas sexuales dei hombre, todoslos cromosomas, estructuras que transportan los genes, existen aparea-dos; nuestras células contienen dos copias de cada gen que puedenactuar ambas de acuerdo o diferir en la sub-estructura y por tanto ensus acciones. Las diferentes formas de los genes en los mismos lugares-locus- o posiciones se denominan alelos. Si ambas copias del genson iguales, el individuo es homozigótico, si dif ieren una de la otra, elindividuo es heterozigoto.

Citogenéüca

La citogenética estudia las anormalidades cromosómicas y sus me-

canismos. Para hacer esto posible es preciso establecer primero el ca-

riotipo humano normal y la estructura de los cromosomas del hombre.

Los cultivos de tejiclos, técnicas hoy día muy desarrolladas, han per-

mitido estudios muy exactos y clasificaciones n1uy específicas, así como

la definición de cariotipos en los que alguno de los pares de cromosomas

podrían ser identif icados exactamente y otros agrupados en clases en

iunción cle su tamaño y, también, por la relación entre los tamaños

de los extremos o regiones superior e irlferior'

Recientes <lesarrollos han permitido una exacta identif icación de

cada cromosoma y de sus porciones, mediante un estudio especial de

las secuencias repetitivas del ADN, por la afinidad de ciertos segmen-

tos para la mostaza de quinacrina o de su clorhidrato (permitiéndose

de esta forma su visualización por microscopia de fluorescencia): por

tratamiento con determinados tampones en caliente se han logrado

asimismo caracterizaciones, lo que también se ha conseguido mediante

el empleo de enzimas proteolít icas específicas.

La frecuencia de la detección de aberraciones cromosómicas en los

recién nacidos alcanza el ll2oo, mientras que en los abortos espontá-

neos dentro del primer trimestre i legan al 50 7o . Así, mientras las en-

fermedades citogenéticas se presentan como posibilidad corriente entre

los recién nacidos vivos, la mayor parte de los mismos se pierden du-

rante la vida fetal.Los síndromes más corrientemente descritos después del nacimiento

se deben a la existencia de un número anormal de cromosomas. Es-

tos pueden corresponder a los autosomas o a los cromosomas se-

xuales.Las trisomiasas más importantes (defectos autosómicos) se deben

a la presencia del cromosoma 21 (anomalías en los ojos, síndrome de

Down o mongolismo; cuya incidencia es de I i650 nacimientos)' cromo-

soma 13 (labio y paladar abiertos, afecciones oculares, otras malfor-

maciones, deficiencia de peso en el nacimiento, vida acortada; cuya ilr-

cidencia es de 1/5000 nacimientos); cromosonla 18 (anomalías de las

manos, micrognatismo, bajo peso, vida acortada' otras malformaciones'

con una incidencia de 1/5000 nacimientos). Otras trisomías incluyen

la de los cromosomas 22,y las de los 6 a 12 (grupo C).

Las aberraciones numéricas de los cromosomas sexuales son tam-

bién bastante frecuentes. [-as más importantes afectan a los que tienen

I 0

47 cromosomas, que pueden ser de tres tipos: 44 (XXY-XYY-XXX) ylas de 45 cromosomas.

Genética bioquímica

Los mayores conocimientos que se poseen de los mecanismos ge-néticos en el hombre, provienen del estudio de la genética bioquímica.Este campo corresponde al estudio de las variaciones de la herencia enrelación con la estructura y la síntesis de las proteínas, que son origende las enzimas. Una de las proteínas que en su estudio ha dado mayorinformación ha sido la hemoglobina. Otros estudios l levados a cabosobre otras proteínas diferentes han llevado a la conclusión de que loscambios por mutación en el ADN resultan luego en la sustitución deuno o varios aminoácidos en la cadena de la proteína, de acuerdo conlo que determine el código genético del ADN.

Muchas mutaciones que conducen a la sustitución de un amino-ácido no l levan, por el contrario, a un cambio en la carga eléctrica dela proteína. Otras mutaciones prodr.rcen la reducción o completa desapa-rición de la síntesis de una de las cadenas. Como ejemplo de ello pode-mos citar la talasemia (anemia mediterránea), etc. Mecanismos muysimilares llevan a la deficiencia de una enzima determinada y tal fallocondiciona las actividades, caso de la analbuminemia.

Una nueva rama de la genética bioquímica que está teniendo cadavez más interés, es la farmacogenética, que corresponde al estudio delas respuestas anormales en los mecanismos de la herencia de los indi-viduos tras la ingestión de medicamentos.

El primer ejemplo de sensibilidad detectado y poco usual fue el dela succinilcolina, que produce parálisis muscular y apnea, efectos que

se achacan a fallo en la actividad de una determinada enzima plasmá-

fica: la colinesterasa. Otros, tales como algunas "idiosincrasias", inclu-yen inactivación condicionada por ingestión de isoniazida o resistencia

a la acción de los agentes anticoagulantes (warfarina y otros). Parececierto que muchas otras respuestas inesperadas a los agentes farmaco-lógicos y terapéuticos están soportadas por las modificaciones de losgenes de la herencia (p. ej., anormalidades producidas por ingestión detalidomida por la madre gestante, etc.).

1 1

Genética

Corresponde a este campo el estudio de dos tipos diferentes de pro-biemas. Uno es el estudio de la variación genética en ios determinantesen las células, mientras que el otro se refiere a los aspectos genéticos

de las respuestas inmunológicas.En el primero de estos campos, podenos citar, entre otros, los gru-

pos denominados MN, Rh, Xga (l igados a aspectos sexuales), etc. Suimportancia en las transfusiones sanguíneas, eritroblastosis fetal y de-terminaciones de la paternidad, son ya bien conocidos. Un avance re-ciente ha sido el descubrimient<l del sistema de células HL-A, de histo-compatibil idad de antígenos, en los l infocitos y otros tejidos.

En el segundo de los campos enunciados está la inmunogenética,con los estudios de determinación de moléculas de gammaglobulina concapacidad de anticuerpo, así como las anomalías heredadas en la pro-ducción de estos mismos anticuerpos y la respuesta celular inmuneasociada con hipersensibil idad. Estos sujetos, en general, t ienen una ele-vada susceptibil idad a las infecciones, pero estas deficiencias son de-bidas a variaciones senéticas (hipoagammaglobulinemia, alinfoplasia tí-mica, enfermedad granulomatosa crónica, etc.). Los mecanismos de de-fensa del organismo están controlados por numerosos genes, cuyas mu-taciones dan lugar a estos fallos anotados y pueden llegar a dejar inde-fenso al organismo frente a la acción de células extrañas, típicas de lostumores malignos.

Genética de las células somáticas

Las nuevas aportaciones en las técnicas de cultivo celular hanpermitido no solamente un gran incremento del número de estudiosde diagnóstico en genética humana, sino que también han hecho po-sible el estudio de estos aspectos mediante reacciones en tubo deensayo.

Una nueva técnica para el desarrollo del cultivo en masa de loslinfocitos permite estudios muy cuidadosos de la disfunción de lasenzimas, su efecto en el metabolismo, etc. Todos estos avances puedenllevar a que el ADN humano o el de los microorganismos pueda seruti l izado fuera de las células y se transfiera a otras células, virus, etc.,lo cual a la par que puede ser el origen de nuevos problemas, podríatambién ser el camino mediante el que se consiguiese normalizar si-tuaciones hoy insolubles.

1 2

Actualmente es posible fundir células hunranas cultivadas con lasde otras especies. Tales híbridos tienden a perder cromosomas huma-nos, lo que permite profundizar en el estudio del cariotipo y del equipoenzimático y descubrir la localización de los genes que codifican lasenzimas o los cromosomas específicos. Esta técnica es la rnás úti l parala construcción del mapa genético, es decir, la asignación de los genesy su orden en los cromosomas independientes.

Genética clíníca

En este particular aspecto de la _qenética, son pieza clave los espe-cialistas científ icos. El genetista clínico debe, en cualquier caso, no sóloasegurarse de su diagnóstico, sino intentar disponer del mayor númerode datos dada la gran variedad de síndromes genéticos existentes. Paraello debe disponerse de técnicas muy especiales y sofisticadas y de me-dios capaces de l levar a cabo todos los ensayos convenientes.

Algunas enfermedades genéticas pueden ser ya tratadas terapéu-ticamente; p. ej.: fenilcetonuria, galactosemia, etc.

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Pnnre II

INGENIERIA GENETICA

Bases moleculares de la herencia

El material que contiene los factores de la herencia en todas lascélulas es el ADN, molécula de doble cadena en forma de hélice. Lasunidades que forman esta molécula se denominan deoxirribonucleóti-dos, cada uno de los cuales consiste en una base orgánica nitrogenadadel t ipo cle las purinas o de las pirimidinas, un azúcar (desoxirribosa) yfosfato. Las bases orgánicas nitrogenadas son cuatro: adenina (A) yguanina (G), que son purinas y timidina (T) y citosina (C), que son pi-rimidinas. Los elementos de Ia herencia, que se denominan genes, estándefinidos precisamente en determinadas zonas de la molécula del ADN.Un gen puede ser definido como la secuencia de deoxirribonucleótidosa lo largo de una molécula de ADN que contiene la información parala síntesis de una proteína dada.

En otras palabras, de acuerdo con lo que postulan los biólogos mo-leculares, es el código genético para las proteínas. El número y tipo degenes (la información genética) son característicos y írnicos para cadacélula. De todo ello se deduce que el contenido genético de cada es-pecie es único y característico y sirve para distinguirla de otras.

La persistencia del material genético es válida hasta para organis-mos tan sencil los como las bacterias, lo que hace posible reconoccr y

definir especies estables entre los microorganismos, a pesar del elevadonúmero de generaciones que se originan en su proceso reproductor.

Los mecanismos para impedir la modificación del material genéticoy su regulación existen de hecho en la naturaleza y se puede considerarque son absolutamentc necesarios para la permanencia de las especiesy responsables de que éstas mantengan su identidad genética generación

tras generación, aunque, por el momento, no se conozcan a fondo la na-

turaleza de cstas barreras y controles biológicos'

1 5

Ingeniería genética

A pesar de las barreras y mecanismos reguladores biológicos que

mantienen la identidad de las especies, mediante el uso de una nueva

técnica conocida como "ingeniería genética" es posible ahora sobre-

pasarlas y modificar, bajo diferentes supuestos, lo que la natural,eza

había mantenido a través del tiempo como inmutable.

Estas técnicas han sido desarrolladas fundamentalmente a lo largo

de los últ imos diez años y es ahora cuando comienzan a usarse am-

pliamente en los centros de investigación especializado y en algunos

casos, incluso, para la producción industrial de determinados com-

pLlestos.La base del espectacular desarrollo en estas técnicas ha sido la evo-

lución de la biología molecular y especialmente, el haberse profundi-

zado en la enzimología del ADN.Algunas bacterias contienen además del ADN cromosómico' P0-

queñas cantidades de ADN circular conocido como "ADN plasmídico".

El tamaño del ADN de los plásmidos es pequeño en comparación con

el ADN cromosómico.

,a'----'

C r o m o s o m a P l á s m i d o F l e p l i c a c i ó n B e s i s t e n c i a a l o s a n t i b i ó t i c o s

Frc. 1. - Célula bacteriana con cromosoma y plásmi'do. Se han indicado las regiones del plásmido quecodifican la replicación y las que producen la resisten-

cia a los antibiót icos.

Todos los plásmidos conocidos son unidades autónomas de repl i-

cación, esto es, son capaces de copiarse a sí mismos independientemen-

te. En ocasiones, el plásmido puede quedar incorporado a una región

del ADN cromosómico y podrá ser transferido a otra bacteria y, a veces,

el plásrnido y el segmento de ADN cromosómico pueden quedar inte-

grados en el cromosoma de la célula receptora.

t 6

Esta rarísima posibil idad representa una transferencia de genes en-tre especies (hechos de este tipo ya han sido detectaclos en la natura-leza).

El ADN plasmídico también actúa como código para funciones di-ferentes de la autorreplicación. Alguna de estas funciones puede serpeligrosa; p. ej., ciertas toxinas bacterianas pueden quedar codificaclaspor el ADN del plásmido. Otro grupo de plásmidos confiere a su hués-ped bacteriano la capacidad de resistir a determinados antibióticos talescomo penicil ina, tetraciclina, etc. Tales plásmidos se designan como"factores de resistencia" y las bacterias que los contienen pueden cau-sar graves infecciones (p. ej., en los hospitales). A pesar de ello, lasespeciales propiedades de los mismos son de un gran interés en inge-niería genética.

Proceso de preparaci<in del ADN recombinante

El procedimiento uti l izado en ingeniería genética puede dividirse encuatro diferentes etapas:

1. Purif icación del plásmido (ADN).2. Manipulación del gen, consistente en unir el ADN extraño al

el plásmido.3. Transferencia del ADN recombinante, que se obtiene en Ia

manipulación anterior, a una célula o huésped adecuado, porlo general un Escher ich ia col i K 12.

4. Selección de las bacterias en las que el ADN recombinante seha replicado. Este proceso se denomina "clonación',; un cló-nido es una familia de células que contienen idénticas moléculasde ADN. Recordamos en este punto que sigue en discusión eneste momento la posible manipulación genética de las célulasreproductoras de la mujer (óvulo), extrayéndole su materialgenético e introduciéndole el aislado cle los espermatozoidesdel padre, de tal manera que el hijo que se produzca sea unacopia clónica del padre (único que aportará el material gené-t ico) .

Purificación del ADN plasmídico

El ADN plasmídico se purif ica por ultracentrifugación en gradientede densidad de cloruro de cesio conteniendo bromuro de etidio seco.Después de la extracción total del ADN bacteriano (ADN cromosó-

T1

mico y el clel plásrnido), éste se airade a un¿r solución de cloruro decesio/bromuro de ctidio, que es centrifugada de 40 a 60 horas a muy

elevada velocidad. Durante la centrifugación se genera el gradiente de

densidad. Como el ADN plasmídico es una molécula circular con múl-

tiples enlaces, es capaz de unirse a más moléculas de bromuro de etidio

que el ADN cromosómico por lo que adquiere un mayor peso específico.

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Frc. 2. - Ais lamicnto dc plásmidos. La f igura muestr l r var iasetapas dcl proceso. Durantc Ia extracción tota l dcl ADN bac-tc¡iano el cromosómico sc dcsintegra generando fragmentosl incales dc di ferentcs tamaños. El p lásmido c i rcular perma-necc intacto. Después dc la scparación dc los dos ADN me-diantc ccnt¡ i fugación cn gradientc de densidad, e l ADN plas-midico pucde scr a is lado cn el fondo del tubo dc contr í fuga.

El difcrente conportamiorto de ambos ADN frente al bromuro deetidio hace que el ADN plasmídico adquiera un peso muy superior y sesepare formando un anil lo en el fondo del tubo de centrífuga de dondese puede separar puro. A par t i r de estc momento se puede proceder ala operación de t ransferencia.

Tratatnienfo del ADN plavnídico purilicado pora su posteriortranslererrcia

En la pr imera etapa e l ADN plasmíc l ico puro se t rata para, median-te su hidrólisis, obtener una cadena lineal cle ADN. Este paso se logra,normalmente por medio de una endonuclcasa especial de ADN. ElADN lineal es trataclo con una exonuclcasa específica (enzima que se-para ios nucleót ic los cn los enlaccs,5,8 c le cada una de las caclenas dc l

1 8

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6

ADN). Este tratamiento da origen a una molécula l ineal de la que sehan aislado las regiones terminales.

A continuación el ADN se trata con una enzima-transferasa termi-nal, que en presencia cle adenosintrifosfato (ATP) añade varios restosde adenosina monofosfato (A) a los enlaces 3' terminales del ADN. Deesta forma el ADN tiene en cada posición 3' una cadena de variospoliA.

Otro ADN diferentc, que puede provenir de cualquier organismo,se trata de forma similar. La única diferencia es que en lugar de unirleen posición 3' restos de adenosinamonofosfato (A) se le unen restosde timidinamonofosfato (T).

A D N p o l i m e r a s a l A D N l r g a s a

Flc. - -1. - Procedint iento de la t r rnsfcrasa terminal para unir e l ADN ¡r lasmídicoaI ADN extraño. El ADN ci¡cul¿i r qLreda hidrol izado. El ADN resul tante se t ratacon exonucleasa (h idról is is de las caclenas ternt inales 5 ' ) . Se l iga adenosina mo-nofosfato en 3 'mediante t ransfer¿rsa-ATP. Operaciones s imi lares se l levan acabo con el ADN extraño. Este se une por la pcrs ic ión 3 'a restos de t imidinamonofosfato, mediante la t ransferasa terminal y TTIr . La t . ransferasa ternt inalañade As y Ts al ADN tratado con exonucleasa. como se ve en la f ígur: r . Cuandolos dos t ipos de ADN se mezclan, se obt iene el correspondiente par comple-mentar io. Nucleír t idos y ADN pol imerasa son los agentes de la reacción qtrcl lenan los huecos y la ADN-l igasa se añade parr t l l r f in a l rs unioncs del ADN.

Después de estas operaciones los dos ADN se mezclan. Debido alprincipio de qr.re los pares de bases (A-T y G-C) se acomoclan de acuer-do cor.l Ios trabajos Watson y Crick, las cadenas se fonnan en la manera

o

E

a

o

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6

zo

zo

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oo

L

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1 9

en que aparece en la figura comentada. La l igazón entre Ios extremosse debe imputar a la fuerza cohesiva de las funciones terminalcs de lascadenas. Se añaden entonces proporciones adecuadas de nucleótidos y7a enzima ADN-polinrerasa para obtener el ADN recombinante. Lasúltimas uniones son catalizadas por la enzima ADN-ligasa. Resulta unADN híbrido consistente en una parte del mismo originada en el plás-mido (ADN) y otra en el ADN del organismo seleccionado.

Método de la restriccíón por endonucleasa

El descubr imiento de una nueva c lase de enzimas. qrre por \u espe-cial función se han denominado "endonucleasas de restricción", ha con-ducido a los investigadores hacia un método de tratamiento del ADNmucho más sencil lo que el anteriormente citado. Estas enzimas hidro-lizan el ADN en posiciones específicas que mantienelt una secuenciade bases en grupos de 4 a 6 pares de bases ordenadas alrededor de uneje de rotación simétrico.

Las secuencias ordenadas en este sentido se denominan "palindro-mes", terminología que significa que la secuencia de los nucleótidos al-rededor del eje de simetría, se leen igual en ambas cadenas en las di-recciones 3' y 5'.

En algunos casos, las roturas de las cadenas de ADN por la endo-nucleasa de restricción son opuestas una a la otra. Con otro tipo de nu-cleasas de restricción, a veces las aperturas producidas en ambas cade-nas están separadas unas de otras por varios nucleótidos.

La especificidad de una enzima de este tipo, la EcoRI, puede apre-ciarse en la figura que se inserta a continuación. A causa de la ordena-ción palindrómica simétrica de los nucleótidos en la región en la que

Ftc. 4.- Sustrato especí f ico dc la enzima, cndo-nucleasa de restricción EcoRI. El eje dc rotaciónsimétr ico va indicado en la l ínca nunteada. La sc-

cuencia es un "palindromc". la misma sccuencia puede ser lcída igual en amboslados partiendo de posicioncs -j' 1. 5'. En la figura se indica c(rmo la enzima

rompc la cadena.

selectivamente se produce Ia hidrólisis con separación de ambas zonasde la cadena circular doble clel plásmido, los fragmentos cle ADN pro-cedentes de la hidrólisis por EcoRI pueden servir de base de ordena-ción uno para el otro. Esta actuación se uti l iza en trabajos genéticos,ya que la enzima actúa tanto sobre el ADN plasmídico como sobre el

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ADN de otro organismo. El ADN plasmídico sólo sufre una única aper-tura que le transforma en lineal, por Io que los fragmentos de ADñ derestricción extraño pueden insertarse en el ADN plasmíclico, ya que am-bos tipos de ADN dispone.n entonces cie cadenas finales complementa-

A D N l n e a t !

Io e p r a s m j d o

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F¡c ' 5.-Método de la ¡estr icc ión por en<lonrc leasa para unir ADN plasmídicoa un ADN donado por otro organismo. El prásnr ido es atacado r ;or ra h,coRlen una única posic ión, dando or igen a una cadena l ineal con zonas terminables.F.l_ tratamiento por EcoRI del ADN extraño genera varios fragmentos cle ¡estric-c ión con terminales idént icos. se mezcian los dos t ipos de ADN y las basescomplementar ias s i rven para al inear ambas moléculai . F inalmente una ADN-I igasa sel la la nueva cadena, s iendo el resul tado una molécula de ADN híbr ido

circular.

rias. Los "fallos" en ambas cadenas quedan entonces resueltos y sella-dos por la ADN-ligasa. El resultado es un ADN híbrido que consisteen los ADN plasmídico y el procedente de otro organismo.

Translerencia det ADN recombinante

La molécula de ADN recombinante "construida" debe ser ahoraintroducida en una célula viva de E. coli. Eso se logra mediante elpretratamiento de la bacteria con una solución de CaCl2. por razones

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aún no bien conocidas este tratamiento hace permeables las membra-nas a las moléculas de ADN. Después del tratamiento con CaCl2 labacteria se expone a una solución conteniendo ADN recombinante,siendo el resultado que una pequeña parte de las bacterias aceptaránmoléculas de ADN recombinante. Dado que el plásmirJo es una enti-

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Ciertos experimentos han demostrado que no sólo el ADN plas-mídico, sino que también el ADN de otro origen presente en el ADNrecombinante podría ser aplicado en estas circunstancias. Lo que tam-bién se produciría en subsiguientes generaciones. En otras palabras, seha "clonado", obteniéndose ya células bacterianas conteniendo ADNrecornbinante en todas eilas.

Selección de clones

Se plantea ahora el problema de cómo reconocer y aislar estos clo-nes de otras bacterias. Tal como se ha mencionado anteriormente, al-gunos plásmidos codifican regiones que crean resistencia a los antibió-ticos. Si se ha uti l izado tal plásmido y la manipulación del gen no eli-mina esta región, el ADN recombinante que resulta contendrá intactauna función de resistencia al antibiótico. Por tanto, bacterias que noson resistentes a un antibiótico podrán llegar a serlo si toman ADNrecombinante que posea esta función. La selección de estos ADN re-combinantes se hace en placas de cultivo en las que se cultivan lascélulas bacterianas tratadas frente al antibiótico que se supone objetode la resistencia. Sólo bacterias que contienen el ADN recombinantesobreviven, ya que la resistencia al antibiótico es codificada por elADN recombinante que posee esta cualidad. Las bacterias que no con-tengan en ese cultivo el citado ADN recombinante serán incapaces clecrecer en esas condiciones y morirán.

Es posible investigar los clones resultantes, en cuanto a la pre-sencia de ADN extraño, por varios métodos que no se pueden detallaren este trabajo. Algunos de ellos están basados en el principio de lahibridación, que es el método para detectar directamente secuenciasespecíficas de ADN. Otros métodos responden a la investigación defragmentos de ADN generados por digestión del ADN recombinante,mediante el uso de las nucleasas de restricción.

La organización de los genes en organisntos superiores

Conocido lo anteriormente expuesto, parece lógico pensar que existela posibil idacl de recombinar ADN de los más variados orígenes y quesubsiguientemente el ADN recombinante se replicará en las bacteriasdurante muchas gereraciones. La información genética de todos iostipos de organismos se transfiere por este camino a la propia vida de labacteria. Esto significa que han sido superadas las barreras biológicas

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#F e p l i c a c ¡ ó n

Ftc. 6. - Int roducción del ADN recombinante es una célu ia bac-teriana. Las membranas bacte¡ianas se permeabilizan a las mo-léculas de ADN después de tratamiento con CaClr. Sometidas lascélulas a una solución con ADN recombinante una parte delmismo penetra en la célula. Este ADN puede replicarse en 1assiguientes generaciones bacterianas, resultando una célu1a clónica.

dad autónoma de replicación, el ADN plasmídico introducido podráreplicarse.

Existe un pre-requisito; durante la manipulación del gen no debehaberse perdido en esta molécula de ADN recombinante la regiónque codifica la replicación.

. taz-)

que impedían el cambio de nlaterial genético entre diferentes tipos de

células. El conjunto de preparaciones descritas para lograrlo se l lama

frecuentemente manipulación o ingeniería genética.

Esta tecnología permite el aislamiento de genes purit icados de las

células de organismos superiores con bastante buen rendimiento. Esto

no era posible con anterioridad, salvo en casos muy excepcionales. Des-

de que tales genes son ahora disponibles en cantidad suficiente es tam-

bién posible investigar los mismos con suficiente profundidad uti l izando

los métodos conocidos de la biología molecular. Por vez primera esta-

mos capacitaclos para obtener una imagen clara de la organización de

los genes en las células de organismos superiores. Ya se han publicado

importantes resultados, por los que conocemos que la otganización de

hrs genes en las células de organismos superiores es diferente de la de

las bacterias.Existe un punto de acuerdo esencial entre los bioquímicos molecu-

lares en el sentido de que esta tecnología representa un rompimiento

con las antiguas técnicas dentro del campo de la biología molecular,

con la ventaja de haber abierto camino para el estudio de estos meca-

nismos en las células de organismos superiores. Un resultado induda-

blemente favorable puede ser que el tratamiento médico de determi-nadas enfermedades moleculares podrii mejorarse enormemente en lospróximos años. Es un hecl.ro establecido que el mejor conocimientode las funciones de las células normales y la mejor comprensión de lascausas de la aparición de célLrlas anormales debe producir grandes be-neficios oara la sociedad.

Pmrp III

ANALISIS DE LOS PROBLEMAS QUE PLANTEANLAS RECOMBINACIONES GENETICAS

A pesar de que no existe evidencia acerca de los peligros que pue-den entrañar las manipulaciones genéticas, es notabilísimo en este mo-mento su interés y el desarrollo que se está haciendo de esta técnicaque permite hacer progresar de manera eficaz ciertas investigacionesfarmacéuticas, médicas e industriales.

Es tal su repercusión que las manipulaciones genéticas han suscitadoun debate internacional en las relaciones entre la ciencia y la sociedadmoderna.

La evolución científica y técnica es origen de frecuentes contro-versias, desde la rotación de la tierra a la teoría darwiniana, desde lageneración espontánea a los bebés-probeta, de la inconsciencia freudia-na a la herencia intelectual.

Junto a una nube de argumentos, de hipótesis, de pruebas de lasque se desprende una "verdad" siempre contestada, toman forma lascorrientes que crean y dividen la opinión, contribuyendo a definir elespíritu de una época. Lo que se cuestiona no es únicamente el hechocientífico o la posibilidad técnica, sino la quimera que se designa porla extraña frase de "elección de la sociedad".

Un ejemplo que está permanentemente presente en todas las discu-siones en nuestros días es el de la energía nuclear. Por tanto, la con-troversia que suscitan, desde hace siete años, las manipulaciones gené-ticas, no merecen menor atención. El eco de la tempestad que nos llegadisminuido, a este lado del mar, mantiene desde hace algún tiempo uncierto rumor de disminución de preocupaciones, es decir, una búsquedade soluciones. Si bien es cierto que ya no se producen las fuertes discu-siones que tenían lugar cuando se originó el fenómeno, también esverdad que los primeros elementos de evaluación proporcionados porla experiencia no parecen confirmar todos los miedos iniciales, aun cuan-

24 25

do la mayor parte de las preguntas se mantengan aún sin contestaciÓn,pero teniendo en cuenta que la importancia del asunto no hace más que

confirmar la necesidad de seguir adelante.

Período inicial ( I 97 I -1 977 )

Las manipulaciones genéticas, más exactamente denominadas re-

cornbinaciones genéticas in vitro (r. g. v.) son la última aportación ver-

daderamente importante de la biología molecular, a la que proporcionan

un magnífico método de trabajo.La clave de los resultados de estas experiencias reside en que el

sistema de replicación autónomo del cual está provisto el portador se

mantenga con actividad funcional después de la transferencia del ADNextraño, sistema por e[ que se consigue una nueva especie híbrida, capazde reproducirse.

Llegada la experimentación a este punto se pueden presentar dossituaciones diferentes, dependiendo de que la bacteria híbrida sea capazde sintetizar o no las proteínas codificadas en el fragmento transplantadodel ADN extraño. La expresión del gen extraño es el punto central detoda una serie de interrogantes. Mientras no tenga lugar la producciónde proteínas (lo que evidentemente reduce sensiblemente el interés de laexperincia), cabe esperar que la bacteria huésped, inofensiva en su es-tado natural, mantenga sus características después de la recombinación.Pero si el gen trasplantado presenta capacidad de expresión, la bacteriacomenzará, a producir sustancias nuevas de las que nuestros conoci-mientos actuales no nos permiten en modo alguno prever el efecto queserían capaces de producir sobre el organismo vivo en el que se desa-rrollarán.

Este tipo de expresión es bastante frecuente cuando el donador es unprocariote (organismo inferior cuyas células están desprovistas de nú-cleo, tales como las bacterias), o incluso un eucariote (organismo concélulas provistas de núcleo) inferior como la levadura; por el contrario,este tipo de expresión es excepcional para un eucariote superior.

Desde el punto de vista teórico, las recombinaciones genéticas invitro se originaron a partir de los estudios de W. Arber, H. Smith,D. Nathans, al investigar el fenómeno de restricción y codificación, loque les llevó a conseguir por sus trabajos el Premio Nobel en elaño 1978.

En 1965, W. Arber pensó en la utilización de los enzimas de res-tricción para dividir el genoma en sus componentes y establecer el mapagenético de los organismos.

26

Realmente, el punto de partida de estos trabajos hay que situarloentre los años 1971 y 1972, en california. En aquellas fechas, se ais-lan los primeros enzimas de restricción utilizables, se preparan los pri-meros portadores híbridos y los equipos de H. Boyer en san Franciscoy de s. cohen y P. Berg en stanford logran con éxito las primerasrecombinaciones.

Desde 1973 comienza a sentirse inquietud en el seno de ciertosequipos de investigación y, más particularmente, de algunos investiga-dores y en julio de 1974, en una célebre carta envitda a la revista"Science", un grupo de once investigadores en biología molecular, losmás eminentes, entre los cuales no podían faltar p. Berg, H. Boyer,S. cohen, D. Nathans, así como J. watson (quien veinté'años anteshabía descubierto con F. crick la estructura aei AoN¡, se dirigen a lacomunidad científica mundial advirtiendo seriamente contra los

-peligros

que podrían producirse en los trabajos realizados mediante recómbina-ciones genéticas in vitro. En aquel escrito sometían a ra consideraciónde los investigadores un conjunto de recomendaciones transitorias. enrreellas la suspensión de ciertas manipulaciones, hasta que ros conoci-mientos fueran lo suficientemente desarrollados

"o-o

-puru poder de-

terminar la naturaleza y la posibilidad de los riesgos á "orr.r.

Finar-mente, convocaban a una reunión internacional consagrada específica-mente a estudiar estos problemas.

Algunos años más tarde, el inquieto J. Watson diría de aquellacarta que "fue la mayor tontería que había hecho en su vida". Todoslos partidarios de la recombinación genética subrayan que la actitudde los once científicos es sin duda única en los anales áe la ciencia.Sin ninguna intervención de autoridades ajenas a su especialidad, sinexistir ninguna presión por parte de la prensa, o de la opinión pública,los investigadores afectados tomaron li iniciativa de limita^u

"u-pode investigación, se impusieron una moratoria y dictaron normas deseguridad, sin que se hubiera producido en aquel momento el más mí-nimo accidente y antes de que la realidad ¿e tos peligros que puedanpresentarse hubiera sido demostrada. Es sin duda la exigencia de auto-disciplina más notable y más consecuente que se haya adoptado nuncapor un grupo de hombres de ciencia.

En febrero de 1975, en respuesta a la l lamada de los once, la casitotalidad de los "manipuladores" se reunió en Asilomar (california)en compañía de investigadores de diversas especialidades y en presenciade algunos periodistas. 150 expertos de todo el mundo se ieunieronpara analizar el problema.

¿Qué ocurrió durante aquellos días? Las impresiones de los testigosson extrañamente divergentes, aunque los hechos no puedan ser des_

¿ t

mentidos. Los investigadores describieron sus descubrimientos, sus hi-

pótesis y sus proyectos dejados en suspenso desde la instauración de la

moratoria, esforzándose en valorar los riesgos a que pudieran estar

sometidos y preguntándose sobre el sentido de la actividad sobre ellos

mismos. Lo objetivo quedaba mezclado totalmente a lo subjetivo y lo

científico a lo humano y a lo político, es decir a 1o jurídico. Existió.

sin duda, mucha confusión, pero también un intento sincero para esta-

blecer la medida de un problema que no finaliza por el simple análisis

científico.

Estados Unidos

El Instituto Nacional de Salud (N.I.H.) hizo suyas las resoluciones

de Asilomar, modificándolas, completándolas y publicándolas en forma

de directivas en I976. Aunque estas directivas estaban concebidas para

ser aplicadas a las investigaciones financiadas por los organismos fe-

derales americanos, constituyen en sí mismas un código de conducta

que debe ser observado, con mayor o menor rigor, en el mundo entero

en relación con las recombinaciones genéticas ín vitro. El documento

del N.I.H. es el texto de referencia para los primeros proyectos de re-glamentación en el resto de los países. Es precisamente alrededor de

estas directivas en gestión donde se están acumulando las nubes de una

tempestad que se inicia incluso antes de la publicación de este docu-mento oficial. El biólogo Erwin Chargaff, en una carta enviada a larevista Science, publicada en junio de 1976, denuncia lo que considerael intento insensato del desarrollo de las técnicas genéticas. El Alcaldede Cambridge (Massachusets), alertado por el Dr. G. Vald, PremioNobel, impone en Harvard una suspensión de las experiencias de riesgopotencial mediano y elevado, según la clasificación del Instituto Nacio-nal de Salud. Los municipios, los grupos políticos y los grupos ecoló-gicos toman parte en el prblema, mientras se establece una fuerte po-lémica entre los profesionales, produciéndose fuertes tensiones. La con-testación al documento se produce fundamentalmente en base a lacrítica de las condiciones en que han sido elaboradas las directivas,incide sobre las normas de seguridad, sobre los riesgos que puede correrla población y sobre las modalidades de control para llegar a plantearcomo un problema general el de la oportunidad de la relización de estasexperiencias cualquiera que sean las condiciones de trabajo.

El biólogo L. Cavalieri se dirige directamente a la opinión públicaen agosto de 1976 en un artículo aparecido en la edición dominicaldel "New York Times". Se producen reuniones publicadas oficiales en

28

numerosos puntos y se inicia el estudio de una legislación federal,mientras que se constituyen comisiones locales para evaluar los riesgosbiológicos, encargadas de controlar las instalaciones y vigilar la aplica-ción de las normas. La confrontación política tiene su máxima expre-sión a lo largo de 1977. Mientras que las Cámaras legislativas preparancada una su proyecto de Ley (en el Senado, el autor es E. Kennedy),los partidarios de las ¡ecombinaciones genéticas ín vitro preparan sudefensa. Estos investigadores, a la vista de los obstáculos puestos a lacontinuidad de sus trabajos y teniendo en cuenta la sospecha, que sehace sistemática, de trabajos que parecen ser realizados en la sombra,denuncian el peligro de una toma de posición de las autoridades admi-nistrativas sobre la investigación e ironizan sobre el costo de aproxima-damente 25 millones de dólares que tendría la organización adminis-trativa encargada de inspeccionar ,una actividad cuyo presupuesto nosobrepasa los tres millones. En cuanto a los peligros, según los "inge-nieros genéticos", han sido estimados muy por encima de su valor.

Las normas de N.I.H. establecidas prácticamente sin informacionesprecisas al respecto, ganntizan contra unos riesgos que la experienciaadquirida a lo largo de los últimos años hace pensar que son másproducto de la imaginación que peligro real.

Entienden los investigadores que si bien era conveniente que sehiciese sonar la alarma, también lo era el someter el problema a discu-sión general, ya que las normas aplicadas hasta aquel momento eranmás que suficientes para garantizar la seguridad y nada justificaba elque se reforzasen las precauciones y los controles. El conflicto en símismo se desplaza y tiende a enfrentar a una corporación, la de aso-ciación de investigadores, con la opinión pública y Ia clase política yllegan a la conclusión de que no deberían haber invitado nunca al pú-blico a mezclarse en la discusión, renunciando así inútilmente su dere-cho de autocontrolarse y de establecer sus propias normas.

Finalmente, el último día de la conferencia de Asilomar se sometióa discusión un código de conducta para estos ensayos; se pusieron apunto una serie de normas y precauciones, se estableció una distinciónclara entre las experiencias autorizadas y aquellas en las que sería im-prescindible presentar en principio un amplio informe y se definió unagradación en los riesgos. Naturalmente, entre las consideraciones apun-tadas fueron muchas las decisiones que se tomaron coyunturalmente,si bien como resultado final quedó aceptado el código propuesto yconsecuentemente la nloratoria para la realización de ensayos.

En la controversia que se ha establecido en relación a la reuniónde Asilomar hay una frase que reúne las diferentes posiciones: "Dimelo que piensas de Asilomar, y yo te diré qué eres". Los "palomas" ven

29

esencialm€nte una maniobra de los manipuladores para salvarse de la

situación en que les había puesto la carta remitida a la revista Science,

a fin de poner término a la moratoria y volver a sus experiencias; parece

que ciertos laboratorios americanos estaban üspuestos a trabajar y no

esperaban más que la luz verde dada en las conclusiones de la citada

conferencia. Los "halcones", por el contrario, no se explican la reunión

de Asilomar más que en función del complejo de culpabilidad que te-

nían los cientíñcos liberales después de la bomba de Hirosima y el em-

pleo de las sustancias defoliantes en Vietnam; el "espíritu de Asilomar"

resulta ser para ellos un fenómeno de características místicas más que

propiamente intelectuales. En lugar de haber realizado un análisis glo-

bal desde el punto de vista científico y con una amplia perspectiva en

el tiempo, los participantes han pecado contra la ética científica pro-

nunciándose sobre cuestiones de las que ignoraban casi todo (por ejem-plo: genética bacteriana), llegando incluso a conclusiones en algunos

temas donde la ausencia total de información recomendaba la absten-ción.

En cualquier caso, Asilomar ha marcado un cambio importante en

este debate, desbordando incluso el ámbito de Ia biología de puntapara extenderse progresivamente a ambientes de opinión cada vez másampüos.

Inglaterra

Los especialistas ingleses que ocupan en el campo de la biología mo-lecular un auténtico primer plano, reaccionaron frente a la carta pu-blicada en Science en julio de 79'74 con una rapidez sorprendente. ElMedical Research Council (M.R.C.) ordenó a su personal la suspensióninmediata de todos los ensayos sobre recombinación genética in vítro.Desde el 26 de julio de l9'l 4, una primera comisión presidida por LordAshby, estuvo encargada de debatir el problema.

El informe de esta Comisión entregado en enero de 1975, sin llegara establecer la ¡ealidad de los riesgos atribuidos hipotéticamente a laingeniería genética, concluían al menos en la necesidad de establecerprecauciones y formulaba el principio del confinamiento biológico, no-ción que consideramos que está llamada a tener un gran papel en elfuturo.

Una segunda cornisión, presidida por Sir Robert Williams, teníapor misión la de establecer las reglas prácticas. Sus recornendaciones,publicadas en agosto de 1976, son comparables en lo esencial a las di-rectivas del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos'

30

como diferencia con las normas de Estados unidos, Ingraterra ins-tituyó un organismo nacional de control, el G.M.A.B. (National GeneticManipulation Advisory Board) compuesto por investigadores y pormiembros representantes del público, de los Sindicatos y de Ia Admi-nistración, comité al que deben someterse todos los proyectos de re-combinación genética in vitro que vayan a ser desarrollados en el país.En el momento actual, este proceso de autorización previa no ha sidoobjeto de ninguna normativa legal, si bien existen una serie de dispo-siciones al respecto.

Francía

El Instituto Pasteur inició el estudio de estos temas en 1974, bajola orientación de investigadores franceses que habían estado trabajaná<ren Estados Unidos.

Jacques Monod considera que las recombinaciones genétic as in vitroson una técnica de gran importancia futura y un medio para el Institutoque dirige, de mantenerse en un prirner plano científico. También seplantea la importancia que puede tener este asunto en cuanto a susposibles aplicaciones industriales futuras.

Contando con su ayuda los partidarios de las recombinaciones ge-néticas in vitro salvan las diferentes objeciones y finalmente obtienenla autorización para realizar experiencias y proyectan la instalación enFrancia de un primer laboratorio de riesgo meclio (p3 de acuerdo conla clasificación del N.LH.). Pero esta <lecisión da origen a una pequeñarevolución entre los diferentes estamentos de personal que trabaja en elInstituto de biotogía molecular, ya que todos se pronuncian er contradel Laboratorio.

Después de muchas discusiones, el Laboratorio p3 se construyeen un edificio especial. Esta decisión da origen a que de forma si-multánea se cree una comisión de seguridad para la vigilancia de lostrabajos a realizar en el citado Instituto.

De acuerdo con las competencias establecidas por el Gobierno fran-cés, el organismo responsable de la autorizaci1n para ra implantaciónde este tipo de centros de experimentación es la Dirección General dela Investigación Científica y Técnica y, en efecto, todos los proyectosde recombinación genética in vitro están teóricamente sometidos a laaprobación de una cornisión técnica de la citada Dirección General,compuesta por especialistas en recombinación, expertos de las discipli-nas relacionadas con el tema (bacteriología, virología, etc.) represen-tantes del personal y de los Sindicatos.

3 l

Las garantías que procura esta institución ciertamente son limitadas,

ya que Jn cierto modó los científicos que forman parte de la comisión

,onlrr."., y parte y además, el procedimiento de autorización' si bien

es ságuido pór los usuarios en general, no es todavía una obligación

legalipara que ta comisión pueda actuar jurídicamente es preciso que

el"orgánismó de investigación del que emana el proyecto llegue volun-

tariamente a un acuerdo con la misma.

En una primera etapa, la Comisión se inspiraba en.las normas del

N.LH., si bien en algunos casos se separaba de las mismas' Peto en

Ig77 publican unas normas mucho menos estrictas, que incluso llegan

u ut ui a investigadores americanos que veían retrasarse sus investiga-

ciones debido a los obstáculos que encontraban en su propio país. Es

especialmente en la categoría de experiencias de riego máximo donde

la incidencia de la Comisión era mayor. Por otra parte' dos años más

tarde el N.I.H. disminuyó notablemente el grado de exigencia de sus

propias normas, con lo que, en este aspecto, Francia actuó por delante

de otros países'Uno de los aspectos más desconcertantes del proceso adoptado en

Francia es que la Comisión "ad hoc" una vez aprobado el proyecto no

vuelve a tenir noticias de los resultados de la experimentación en mar-

cha. No existe ninguna disposición que regule la eventualidad de que

sea violado el acuerdo iniciál y sólo las comisiones locales de seguridad

pueden disponer de información para prevenirlos o reprimirlos.

En lo que se relaciona con la cuestión de principios sobre la reali-

zaciin de lás recombinaciones genéticas in vitro, éstas son competencia

de la citada comisión ética, que no se suele reunir con mucha frecuen-

cia y de la que se espera una decisión pública con la fuerza y la altura

que las circunstancias requieren.Además del Instituto Pasteur, el Instituto de Investigación en Bio-

logía Molecular, dependiente de la Universidad de París VII, ha iniciado

también trabajos en este campo, si bien no puede considerarse como

un ejemplo muy válido de lo que se debe hacer en este terreno de la

ciencia.En enero de 1978 tuvo lugar en la Sorbona una conferencia, que

resultó muy polémica, convocada por iniciativa del movimiento univer-

sal para la responsabilidad científica y que, en suma' fue el primero y

único, hasta ef momento, debate público sobre las recombinaciones ge-

néticas.

España

La ciencia española no podía estar ajena a esta nueva corrientede investigación y de alguna manera se plasmaron todas las inquietudesde los científicos españoles que desarrolran sus actividades en el áreade las recombinaciones genéticas in vitro en el curso sobre ,,Avancesy perspectivas de la ingeniería genética" celebrado en la universidadrnternacional Menéndez pelayo en el año i9g0. como resumen delcitado curso podríamos señalar que se han contemplado las aplicacionespotenciales de la ingeniería genética, haciéndose ieferencia i los desa-rrollos que se están logrando en ciertos países europeos y muy espe-cialmente en Estados Unidos.

En el momento actual, se afirmaba en Ia reunión, es muy difícilpredecir en cuál de los campos, industria, medicina o agricultura, vana tener en el futuro más importancia estas aplicaciones y se ponía demanifiesto la urgencia de que nuestro país hiciera un esfuerzo- análogoal que se está realizando en otros países a fin de lograr independenciaen este campo.

se trató ampliamente sobre las manipulaciones genéticas en mi-croorganismos, bacterias y levaduras, en campos tan variados como lafijación del nitrógeno atmosférico y las perspectivas de su utilizacióncomo auténticos fertilizantes; el control de la replicación de los peque-ños genomas y sus implicaciones en la evolución biológica y

"n él .án-

cer; las investigaciones sobre el virus de la peste porcina africana ten-dentes a la consecución de una vacuna contia esa importante epidemiadel ganado porcino, frecuente en nuestro país; la porible obtención deuna vacuna contra el virus de la hepatitis B, aplicación de las citadastécnicas al diagnóstico precoz de enfermedades congénitas e incluso ala corrección de defectos genéticos en animales, etc.

Asimismo, se puso de manifiesto la posibilidad de producir riesgospotenciales por aplicación incorrecta de las técnicas de trabajo, Io quepodría originar un desequilibrio en nuestro ecosistema .uyu, .onr._cuencias son difíciles de prever.

se llegó a la conclusión de que, dado ro avanzado de los trabajosde manipulación genética sobre bacterias y virus, y el estado todavíaincipiente de las mismas en Ias células animales así como el nacimientode aplicaciones industriales importantes como consecuencia de estasinvestigaciones, era necesario operar en condiciones controladas.

32 J J

Itslia

Hasta el momento no existe en este país ningún organismo res-

ponsable de las autorizaciones de los programas de investigación sobre

manipulaciones genéticas. Por otra parte, las autoridades sanitarias ita-

lianas están pendientes de la aprobación de la propuesta de directiva

hecha por la Comisión y el Consejo de la Comunidad Económica Euro-pea, sobre la que varios países miembros no se han pronunciado todavíay que en principio no parecen estar de acuerdo con la aplicación deuna norma comunitaria en su propia legislación.

C otnunidad económicq europel

En los países comunitarios numerosos laboratorios están llevandoa cabo investigaciones sobre recombinaciones genéticas in vito.

Estos trabajos implican la recombinación del ADN, tal como ante-riormente señalábamos y pueden llevar a la formación de nuevas com-binaciones de materiales genéticos.

Dados los potenciales peligros que presenta este tipo de investi-gaciones, ciertos estados miembros han tomado ya sus propias medidasde ordenación para la realización de los mismos. Además de los ya ci-tados países, también existen Comités consultivos nacionales que re-gistran las propuestas de investigación y las estudian, llegándose a unadecisión de autorización o no, en países como Bélgica, Dinamarca, Paí-ses Bajos y Alemania. En este últ imo país las disposiciones son másestrictas en cuanto a las autorizaciones para la realizaciín de este tipode investigaciones.

La Comisión de la Comunidad presentó al Consejo un documento,publicado en el Diario Oficial de las Comunidades, número 301, el 15de diciembre de 1978, en el que se destacaban las posibles consecuenciasde estas investigaciones y la necesidad de una legislación común paratodos los países comunitarios, sobre la base de unos principios fun-damentales de seguridad. Esta legislación serviría para evitar quese desarrollase este tipo de investigaciones en los países más "per-misivos".

La Comisión recordaba en su documento que el método general detrabajo lleva consigo el aislamiento del ADN a partir de un organismo-donante, su fragmentación bajo el efecto de las enzimas de restricciónen grupos de uno o varios genes, el acoplamiento de una sección o un

34

sector' de ordinario un virus o uno cle los constituyentes de una célulareceptora' y su introducción en u'a célula ,uput d," multiplicarse paradar lugar a pobraciones de cérulas idénticas (clones), .rtr"-o, .rto,que se detallan ampliamente en este trabajo

"n ,o puri. g"n.rut. OuOo

que el material genético que se transfiere puede *ultiptiJu.r" y expre-sarse en su nuevo medio ambiente, no existe, tróri.u_rntq l ir it,alguno en el número de organismos dotacros de nuevas f.á¡.ouo.,que pueden obtenerse gracias al empleo cle la tecnología oit ÁnN ,._combinante.

Incidía también er citado documento en la importancia de este tipode trabajo para el desarroilo de la agricurtura mediante la transferenciagenética adecuada en protoprastos aisrados, regenerados posteriormenteen- plantas completas, ro_ qu9 permitiría produciir especies vegetares mo-dificadas que combinarían las caracteristicas de d^iferentes especies ypresentarían nuevas propiedades bioqui¡¡is¿5.

En el plano teórico, er documentó se refería al riesgo que existe deque los organismos vivos y en particular los microorgánir_o, que re_siden en el hombre o en especies animales de impoitancia par'a esteúltimo-, adquieran, por la integración cle un ADN extraño, ciertas pro_piedades que los conviertan en peiigrosos y nocivos.

De hecho, toda transferencia de información genética, que confiereal organismo receptor una ventaja selectiva y una modificación de suscaracterísticas, es susceptible de afectar al medio ambiente. Estos efec_tos, que pueden ser insignificantes o incluso beneficiosos para el hom_bre, pueden, por otra parte, ser catastróficos a corto o largo prazo sipromueven nuevos factores tares como la patogenicidad, la iirouccion opropagación del cáncer, modificación del equilibrio ecológico, alteraciónde la cadena alimenticia, etc. Si bien, tal como hemos múcionado repe-tidamente, no se ha confirmado hasta ahora que ninguno de ros riesgosprevisibles haya tenido confirmación real.

Continúa el documento_reconociendo que, por acuerdo de los pro_pios investigadores impricados en los trabajos sobre el ADN recombi-nante, todos los ensayos se han desarrollado con extraordinario cuidadoy especiales sistemas de vigilancia y confinamiento; se han elaboradométodos para trabajar sobre cepas ieceptoras de supervivencia limita-da fuera del ámbito del laboratorio y dispositivos de protección qu" ."-ducen en gran medida el riesgo de que un organismo t microorganismoportador de un ADN recombinante pueda salir de un raboratorio----*orr-finamiento físico- o sobrevivir en ias condiciones de uiau q,," r-p".anen el exterior del laboratorio ----confinamiento biológico_.

E[ documento recoge, asimismo, la aplicación, u=lurgo plazo de labiología molecular a la industria, y a la agriculturu, to..qrre en cierto

3 5

modo podrá transformar la vida de la sociedad e inducir modificaciones

significativas en el comportamiento de determinados organismos'

También constata ét hectro de que las técnicas que constituyen el

origen de tales cambios deban someterse clesde el comienzo a un control

oblfgatorio y a una legislación especial, 19 qu" por sí mismo no cons-

tituñ un uiuqr," al piogreso, sino más bien al reconocimiento de las

necásidades de adaptar la sociedad a la evolución científica. El hecho

de que el material biológico implicado en estas investigaciones com-

pr.ndu especialmente a los microorganismos y la posibilidad de una

movilización de los mismos reduce, en cierto modo, l¿ libertad de

las naciones consideradas individualmente para definir y mantener

políticas independientes en el ámbito de las recombinaciones gené'

ticas.Por lo tanto, es preciso llegar a un acuerdo entre países vecinos

y lo más globalmente posible, acerca del objetivo general y de la am-

ptit,rO O" las normativas que hayan de sancionarse, así como de las

iisposiciones que deban tomarse para garantizar el respeto a los

acuerdos.Como conclusión, la Comisión propone al Consejo adoptar una

directriz en la que se tomen en cuenta, simultáneamente, los imperativos

necesarios en lo que se refiere a la seguridad y a la necesaria flexibili-

dad y adaptación a las circunstancias de cada país. La directriz explesa

qu" ior trabajos de recombinación genética in vitro no podrán reali-

zarse en tanto no se hayan registrado, estudiado y autorizado por los

correspondientes expertos nacionales, teniendo en cuenta una grada-

ción de peligrosidad en cuanto a riesgos posibles'

La directriz deja plena libertad a cada país para que establezca los

niveles de riesgo y de confinamiento que considere más apropiados. En

relación con los trabajos considerados como de poco riesgo se prevé

que las exigencias sean mucho menores, así como el grado de informa-

ción que se haga sobre el proyecto.Por último se ha previsto en el citado texto que se revisarán con

frecuencia las normativas impuestas por la directiva. La comisión es-

tudiará especialmente el caso de la utilización de ADN recombinante

en la producción industrial en gran escala. Si fuera necesario, la Comi-

sión propondrá nuevas directrices en cada momento.Se preveía que la citada directriz debería estar vigente en el plazo

de un año después de su publicación.

Organización mundial de la salud

La organización Mundial de la salud publicó un artículo sobreeste tema (W. H. O. Chronicle 32: 465-468-1973) con el título de"Ingeniería Genética: beneficios y riesgos,,, basado en la documenta-ción presentada en el simposio internacional de Ingeniería Genéticacelebrada en Milán en marzo del 78, bajo la dirección de la O.M.S. vla Fundación Lorenzini.

Recogiendo la opinión de los científicos allí presentes, esta publi-cación se concreta en que a partir de los conocimientos que r" uunteniendo sobre la ingeniería genética se puede precisar que, én general,los riesgos potenciales relativos al empleo de esta técnica de manipula-ción biológica son menores de lo que al principio se pensaba y existeun acuerdo general a favor de establecer unas normativas más realís-ticas, que tengan presente los beneficios posibles para la humanidadpor estas investigaciones y su posible aplicación práctica, de gran valoren medicina y salud pública.

A pesar de ello, la O.M.S. considera que debe mantener una con-tinua vigilancia responsable y asegurar la mayor libertad para estasinvestigaciones siempre que no supongan riesgos graves parara pobla-ción o el medio ambiente.

En la citada publicación los expertos de la organizaci1n Mundialde la salud revisan toda la documentación publicada al respecto en losdiferentes países así como los datos obtenidos en las diferentes reunio-nes científicas internacionales promovidas específicamente para estu-diar este asunto, y muy especialmente la reunión del comité de expe-rimentación genética (coGENE) del "International council ofScie¡tific Unions", y del proyecto de la Organización Europea deBiología Molecular (EMBO) y del "Imperial Research Fund,' delReino Unido

Como conclusión al análisis de todos estos documentos y aporta-ciones la o.M.S. reconoce, conjuntamente con las autoridades de mu-chos otros países, que indudablemente existen riesgos posibles en lainvestigación del ADN recombinante, pero que éstos pueden ser redu-cidos mediante unas normas adecuadas de trabajo combi¡adas con eluso de organismos o microorganismos experimentales que no tengancapacidad para producir esos riesgos.

El interés de la O.M.S. en el campo de las manipulaciones genéticasestá motivado por el reconocimiento de la Organización sobre los pro-bables beneficios para la salud de las personas.

365 t

Asimismo, la o.M.S. encarece la vigilancia de ia planificación y

realización de tales experiencias y apela a la responsabilidad de los

cierrtíticos que trabajan en el área para minimizar estos riesgos ejer-

ciendo una vigilancia activa sobre tales experiencias mediante la super-

visión y vigilancia <le las autoridades sanitarias y los laboratorios ofi-

ciales áe rálud, ptopugnando una fuerte cooperación entre las institu-

ciones nacionales, regionales e internacionales en todos los aspectos

relativos a las manipulaciones genéticas y, especialmente, a los servicios

de vigilancia, entrenaniento del personal y promoción de la investiga-

ción y de sus aPlicaciones.

COGENE (Comité de Experimentación Genética International "Coun-

cil of Scientif ic Unions").

En abril de 1979 se celebró en Inglaterra una reunión específica del

comité de Experimentación Genética para estudiar los desarrollos

científicos y las normas administrativas aparecidas hasta el momento

en relación con el DNA recombinante y las manipulaciones genéticas.

A esta conferencia concurrieron representantes de treinta países, dis-

cutiéndose todos los aspectos relativos al tema que nos ocupa.

Aun cu¿ndo no se detectaron opiniones contrarias a la realización

de este tipo de experiencias, se suscitó repetidas veces que era muy

conveniente establecer una normativa en cuanto a la tealízación de

estas investigaciones, que aunque no tan estricta como la publicada en

1914 en Estados Unidos, que se consideraba exagerada y en cierto

modo fuera de lugar, evitara el riesgo de estas investigaciones, lo que

llevó al análisis de tres importantes cuestiones:

1. Existe la suficiente experiencia demostrativa de que los microor-

nismos en los que se inserta ADN recombinante no tienen ca-

pacidad para infectar a los técnicos de los laboratorios o man-

tenerse vivos en el medio ambiente.

2. Una amplia revisión de los conocimientos existentes sobre pobla-

ciones genéticas y patogenidad de los microorganismos indican

que es insignificante la posibilidad de crear por accidente, en la

manipulación de laboratorio, organismos capaces de competir

con los que naturalmente existen.

3. Como consecuencia de los experimentos con ADN recombinan-

te, se conoce ahora que los genes de los organismos superiores

no pueden ser expresados en las bacterias a menos que se tomen

medidas muy especiales.

3 8

Analizados estos extremos se l legó a Ia conclusión de quc el riesgode estos experimentos es inferior al que puede producir una partículaviral intacta en su huésped natural. El reconocimiento de estos hechosllevó a la conclusión de que se debía acordar una fiexibilización de lasexigencias y precauciones a tomar en estos experimentos en algunos paí-ses en los que la normativa era excesivamente estricta y que estodebía ser tomado también en cuenta por aquellas otras organizacionesnacionales que desearan introducir una nueva legislación. Asimismo, seexpresó de forma clara que debido a los rápidos avances en la investiga-ción del ADN recombinante las exigencias y recomendaciones hechaspor los gobiernos y/o sociedades científ icas, deberían estar sometidosa continua revisión.

Posibilidades futuras

Por lo tanto, ¿cuáles son los peligros excepcionales, reales o imagi-narios, que podrían producir las recombinaciones genéticas in vitro ycuáles los beneficios, lo suficientemente válidos como para equil ibrarlos riesgos debidos a la realización de estas experiencias? Frente a estapregunta los especialistas se mantienen en duda y divididos; la única es-peranza reside en l legar a una lista de posibil idades, de la que seránecesario, además, intentar separar lo que puedan ser exclusivamenteconclusiones provisionales.

Recogiendo la opinión de Lewis Thomas, biólogo muy conocidointernacionalmente y que en buena parte resume los deseos de los par-tidarios de la ingeniería genética, podríamos señalar que las recombi-naciones genéticas in vitro necesitan un tiempo para desarrollar los mé-todos actuales, de los cuales no habría que esperar demasiadas cosas,pero que, en cambio, dejan abiertos nuevos horizontes con una granproyección futura.

Desde el campo contrario se contesta fuertemente el decisivo papelque se atribuye o se predice para la ingeniería genética en los recientesdescubrimientos y los que se apuntan para el futuro. Sin negar el inte-rés de las mismas se pone en duda el carácter irremplazable de estasexperiencias y todavía más de las esperanzas futuras. Se subrayaespecialmente que pueden originarse complicaciones insospechadasen el funcionamiento del código genético, lo que hace problemáticoel estudio por estos métodos de la expresión de los genes eucarió-ticos.

Desde el plano de la salud, las primeras ventajas deben provenir,en forma general, de la luz que puedan aportar las recombinaciones

39

genéticas in vitro sobre los genes y los virus; si bien la atención se centra

áctualmente sobre el tratamiento de las afecciones genéticamente defi-

nidas, en las que el organismo es incapaz de fabricar una proteína esen-

cial para su metabolismo.ótros científicos menos ambiciosos conciben la posibilidad de hacer

fabricar la proteína que falta por bacterias provistas por recombinación

de la información requerida. El factor no existente sería entonces ad-

ministrado al paciente como cualquier otro medicamento'

En el momento actual se dispone, en ciertos casos, de productos de

sustitución como, por ejemplo' la insulina de cerdo o de buey para el

tratamiento de la diabetes, pero que presentan inconvenientes (reac-

ciones alérgicas en el ejemplo antes citado), que no son disponibles en

cantidades ilimitadas y que no existen para todas las deficiencias cono-

c idas.La producción bacteriana de proteínas humanas representaria un

gron progt"to, si bien para su logro existen como mínimo dos dificul-

t-a¿er. Li primera es el aislamiento del gen responsable de la función

deficitariaf lo que es bastante difícil; la segunda, que durante mucho

tiempo no se hi podido resolver, es la obtención de un gen eucariote

capaz de expresarse en una célula procariótica.

En el año L977 pareció abrirse una vía muy prometedora, al con-

seguirse que una cepa de E. coli produjese una pequeña proteína huma-

na: la somatostatina.Nuevas perspectivas se abren a la investigación farmacológica, de

acuerdo con informaciones que van apareciendo. Existe el proyecto de

una "cirugía genética", mediante la que se trataría de introducir en las

células del paciente un vector no patológico (bacteria, virus) prÓvisto de

un programa de fabricación del factor deficitario o no existente. Se

puede incluso imaginar una actuación del mismo tipo sobre las células

reproductoras, lo que conferiría a este tipo de tratamiento un carácter

definitivo transmitido a la descendencia. Los obstáculos a la genoterapia

concebida de este modo son tales, que los investigadores más optimistas

entre los partidarios más fervientes de la recombinación únicamente ven

en esta vía una aplicación muy lejana.Otra posibilidad, teóricamente más próxima, se refiere a la inmu-

noterapia viral. En lugar de fabricar vacunas a partir de grandes can-

tidades de virus animales activos, atenuados o inactivados por proce-

d.imientos físicos o químicos, se podría ensayar la producción de antí-

genos virales en una bacteria portaclora del ADN híbrido. Esto permi-

tiría resolver por ejemplo la inmunización contra afecciones tales como

la gripe. Esta misma aproximación podría extenderse a la inmunote-

rapia anticancerígena. Parece también posible que en un futuro pró-

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ximo, se logre hacer producir a un colibacilo la proteína vacunante dela hepatit is B.

El medio ambiente podría beneficiarse asimismo de tales productos;por ejemplo, una enzima que eliminase la polución de las aguas. Enagricultura la aplicación más comúnmente aceptada consiste la de con-ferir a ciertos cereales la capacidad de fijar el nitrógeno.

Desde el punto de vista industrial parece muy claro que es el, ítreade la farmacia y del medicamento a la que primero podría aplicarse laingeniería genética, si bien la industria química podría también desarro-llar métodos de producción de ciertos enzimas y de otros productos.Estos nuevos métodos podrían llegar en su momento a paliar la dis-minución de los recursos petrolíferos, de los cuales la química actualdepende en gran manera.

A lo largo del año t919la atención del mundo entero se ha dirigidoa las manipulaciones genéticas, debido a la producción sucesiva desomatostanina y de insulina y, finalmente, por la concesión del PremioNobel de Medicina a los Doctores Arber, Nathans y Smith por su des-cubrimiento y modo de empleo en las enzimas de restricción que per-miten el "troceado" de las cadenas de ADN y su introducción en losplásmidos de los colibacilos.

La gran industria farmacéutica, a pesar de sus grandes posibilidadesfinancieras y de sus implantaciones multinacionales se ha visto obli-gada a contratar hombres jóvenes, competentes y emprendedores, paramantener el nivel de investigación necesario en el área que nos ocupa.El desarrollo de las técnicas de manipulación genétioa requiere, comoexplicaba el Premio Nobel Cuillemin, la necesidad de una colaboraciónen cualquier laboratorio de investigación entre los investigadores "ruti-narios" y los "imaginativos". No podemos olvidar en este capítulo laexistencia de unos jóvenes pioneros de Ia industria, los Dres. Swanson,Farley y Glaser, recientes Premios Nobel de Física, que han abierto unanueva vía en los procesos de biosíntesis controlada.

En esta actividad los Estados Unidos aparecen como los pionerosindustriales de las manipulaciones genéticas, con la aparición en Cali-fornia de dos compañías concurrentes dedicadas específicamente a lasrecombinaciones genéticas y su industrialización.

Como era previsible, se ha producido en Estados Unidos el hechode la aceptación de la primera patente de invención de un ser vivo.La oficina americana de patentes ha concedido al Dr. Chakrabarty, dela firma General Electric, el derecho de propiedad nacional e interna-cional de una bacteria del género Pseudomonas manipulada de tal ma-nera que es capaz de "comer" petróleo. En realidad lo que se ha lo-grado es combinar en este microorganismo las actividades de cuatro

4 l

diferentes bacterias capaces cada una de degradar un tipo determinadode hidrocarburo. Las consecuencias de la concesión de esta patente

tienen gran importancia económica e industrial y anuncian un virajefundamental en la tecnología: la sustitución de la tecnología "pesada"por la tecnología "ligera".

Esta decisión, junto a una disminución de las exigencias sobre lasexperiencias de recombinación genética en los Estados Unidos, ha sa-tisfecho a muchas industrias y muy especialmente a las sociedades deingeniería genética. Además, ha iniciado una nueva era, en la búsquedade nuevas bacterias (bacterias modüicadas) por grandes empresas, talescomo Au¿.co, BETHESDA, BIocEN, Ert LrrrY, GENrNTcu, GENex,Ho¡'ru¡,N-LA RocHE, INco, MoNsento, ScHnnrNc-Ploucu, etc.

Actualmente no existe ningún país capaz de disputar o competir conlas empresas americanas de ingeniería genética y son escasos todavíalos resultados obtenidos por investigadores y empreas europeas en estecampo. Es imprescindible mencionar el nombre de algunas empresasque están hoy día a la cabeza de estas investigaciones:

CEtus, dedica sus esfuerzos a la puesta a punto de una cepa delevadura que permita obtener directamente de la biomasa el etanol.

GeN¿NTpcH. - Esta empresa, que nació como independiente, estáhoy día asociada con Er,t Lrr,ry parala fabricación de insulina, con

Ho¡nu¡N-L¡ Rocun, para la fabricación del interferon y conA. B. Kesl para fabricar la hormona del crecimiento.

GBNex. - También independiente en una primera fase, acaba deasociarse con Bnlsror My¡ns para 7a fabricación de interferon.

BtocEN, S. A. - Fue la primera que produjo interferon. Está desa-rrollando el correspondiente proceso industrial de preparación.

Damos estos nombres únicamente a modo de ejemplo, ya que nosconsta que otros grupos están entrando en este campo. Así, por ejemplo,los formados por Esso, Snr,rr, y BP, RnoNE-PouLENC, INsrlruro P.qs-TEUR. CtC.

Es evidente que a medida que nuevas empresas dedican su esfuerzoinvestigador al campo de la ingeniería genética se produce automática-mente una mayor presión sobre las autoridades que vigilan este tipo demanipulaciones, a fin de lograr un menor grado de exigencia en las in-vestigaciones en desarrollo. Para ello se basan en las nás recientes ex-periencias y en la hipótesis de que los riesgos son en realidad muyinferiores a las primeras estimaciones hechas. Una evaluación empírica

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y de valor muy relativo es que durante siete años de trabajos no se haproducido ningún accidente, contaminación o fenómeno sospechosoatribuible a las recombinaciones genéticas in vítro. Otros argumentosse apoyan en que ciertos genes de células eucariotes superiores se es-cinden y no pueden expresarse hasta después de la separación materialde los fragmentos, lo que no ocurre con el ADN bacteriano, 1o quereduciría las posibilidades de que un fragmento de ADN poco conocidofuera trasplantado por casualidad o por error en una bacteria y pu-diera después manifestarse en éstas de cualquier forma. Además, losvirólogos han llegado a la conclusión de que la inserción y la replica-ción de un fragmento de virus no es más peligroso que la manipulacióndirecta del propio virus y, finalmente, la mayor parte de los bacterió-logos están de acuerdo en afirmar que la cepa de laboratorio Krz delE. coli utilizada en la mayor parte de las recombinaciones genéticasin vitro no puede transformarse en patógena.

Todo lo anteriormente expuesto permite, en este momento, anun-ciar una nueva definición para la investigación molecular, que puederesumirse en tres palabras: "it's safe" (es segura).

A pesar de todo ello es preciso señalar que de este interminabledebate acefca de las manipulaciones genéticas, sólo se puede sacar unaúnica conclusión y es que ninguna de las grandes preguntas formuladasha quedado resuelta y que no puede permitirse un exceso de confianza.

Posibles peligros

Si, como hemos visto, las ventajas que se pueden obtener de lasrecombinaciones genéticas in vitro no son fáciles de evaluar, muchomás complicada es la estimación de los riesgos posibles.

La gran variedad de opiniones autorizadas podría llevar al obser-vador más atento a una situación de perplejidad total. En cualquiercaso, es muy posible que no se pueda constatar un efecto no deseado,producido por un accidente en nuestros días, hasta dentro de unos años.

Puesto que el E. coli es la bacteria humana más abundante en elintestino, según los críticos constituye la elección menos aconsejablecomo microorganismo huésped de las recombinaciones genéticas; sien-do por tanto el riesgo más próximo la contaminación accidental deorganismos humanos por una bacteria portadora de ADN híbrido.

En noviembre de 1978 la revista Nature publicó una lista de posi-bles riesgos. Aunque la mayoría de ellos pueden considerarse comopuramente hipotéticos, creemos conveniente mencionarlos.

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e) Destrucción o modificaciones genéticas de la célula.

La presencia del ADN híbrido podría modificar la bacteria hués-ped, transformando el E. coli, habitualmente inofensivo, en unabacteria virulenta, capaz de destruir la célula infectada.

Otro peligro potencial proviene de los virus que podrían seguirvías no habituales para penetrar en las células y acabar conellas. El comportamiento de ciertos virus, tales como los virusendógenos xenótropos, no es todavía bien conocido. La trans-misión de estos virus de una especie a otra, que por otra partees un hecho excepcional en la naturaleza, podría ser peligrosa-mente favorecido por ciertas experiencias en las que se utiliza-sen células de vertebrados. En cuanto al procedimiento, queconsiste en mutilar los virus, por ejemplo impedir su replica-ción, presenta dos complicaciones: la primera, que estas mo-dificaciones pueden reforzar sensiblemente el carácter patógenodel mismo; la segunda, que los virus actúan sinérgicamente unoscon otros, lo que podría dar lugar a una regeneración de sucapacidad de replicación.

Desorganización del sistema inmunitario.

Una proteína programada por el ADN extraño, fabricado porla bacteria huésped, podría fijarse a la superficie de la célulainfectada originando una reacción inmunitaria del organismo;de esta manera, podría proyocarse artificialmente una enferme-dad autoinmunitaria, cuya gravedad no estuviese determinada.Este mismo mecanismo podría, por el contrario, reducir la sen-sibilidad del sistema inmunitario, paralizando las defensas delorganismo. Finalmente, las células del sistema inmunitario po-drían quedar dañadas.

Alteración de las funciones endocrinas.

La acción fisiológica de las hormonas podría alterarse tantopor la presencia del ADN extraño en el núcleo como por lapresencia de una proteína extraña sobre la pared celular. Esigualmente concebible que la secreción de hormonas humanasprogramadas y sintetizadas por una bacteria huésped puedaconstituir un peligro potencial para el organismo infectado.

Alteraciones del metabolismo celular.

El material genético extraño podría modificar el metabolismode las células invadidas, acelerando por ejemplo la división ce-

lular, lo que podría desarrolrar una cancerización o también elproceso todavía no conocido del envejecimiento celular.

e) Transformación de microorganismos.Determinadas bacterias podrían quedar dotacras, por recombi-nación, de resistencia a ciertos antibióticos. otra hipótesis esque ciertos organismos, benignos en su estado normal. se trans_forman después de la manipulación en agentes patógenos infec_ciosos, capaces por lo tanto de poder provo.u, u* epiclemia.

Previsiones

Frente a este tipo de posibiridades potenciares, Ia actitud más razo-nable consiste en poner los medios para impecrir que las bacterias ma-nipuladas puedan, de una parte, escapar del área experimental en laque son trabajadas y de otra, en caso de evasión, que no puedan sobre-viür largo tiempo, lo que impediría se produjesén efecios no desea-dos. El confinamiento físico tiene como fin reducir las posibil idades deevasión, mientras que el confinamiento biológico consisie en mutilar rabacteria huésped y eventuarmente el vector híbrido para que no seaposible su supervivencia fuera de las condiciones del laborátorio.

Se han defindo cuatro grados de niveles de confinamiento físico enorden creciente de exigencias, desde p1 a p4, a los que correspondenunas normas de equipamiento y unos sistemas de seguridad. Tambiéns9 han creado tres tipos de sistemas huésped/vector por orden de in-viabil idad creciente, clesignados como EKl a EK3. cada exoeclienteautorizado requiere una combinación de confinamiento, por ejemploP3/EK1 o P2/EKZ, de acuerdo con las características del proiocolo.

A pesar de la rigurosidad que se exige en ra apricación de estosgrados de confinamiento se han producido en algunas ocasiones, afor-tunadamente muy escasas, contaminaciones por escape físico o porescape biológico, si bien no han tenido gran trascenclencia hastael momento. Por tanto, la posibil idad de diseminación de una cepa po_siblemente patógena para el organismo humano clebe ser tenida cncuenta permanentemente en la reairización de estos ensavos.

Realidades humanas

El debate científ ico no debe quedar disociado de las realiclacleshumanas. En prin.rer lugar, es patente que el investigador queda some-tido a fuerzas que se le escapan, que están enfrentadas con sus propios

b)

c)

a

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45

deseos y quc afectan a la responsabilidad colectiva. También, la con-

currencia entre individuos, equipos de trabajo o centros de investiga-

ción podría llevar a una carrera perjudicial para la humanidad. Por

tanto es preciso mantener el respeto escrito a la totalidad de las medidas

de seguridad que la incertidumbre actual considera como necesarias

en este preciso momento.Por otra parte, la explotación industrial y comercial dc los logros

científ icos pone en juego otras motivaciones a las que el investigador,

incluso en el caso de que su papel sea el de un cerebro "puro", no

queda insensible. Mediante la patente, puede apropiarse o asegurar a

sus colaboradores el beneficio de sus descubrimientos. Además, el vo-

lumen de una operación industrial conduce, por simple multiplicación,

a la aparición de problemas suplementarios que pueden llevar apareja-

dos complicaciones.Aún suponiendo que la gran mayoría de los experimentadtlres res-

peten rigurosamente los reglamentos establecidos en cada país, subsis-

ten tres causas de inquietud: la primera es que la cadena de seguridad

situada alrecledor de las recombinaciones genéticas ín vifro no es ab-

soluta y que determinado tipo de experiencias que se han considerado

lo suficientemente sencil las como para ser controladas puedan ser el

origen rle posteriores problemas. Asimismo, debe tomarse en cuenta la

posibil idad de que en estas actividades pLreda producirse un riesgo no

medible, cuya detección sea posterior al proceso experimental.La segunda inquietud nace de la lectura de las recomendaciones

que los investigadores favorables a las recombinacior.res genéticas in

vitro dirigen a sus colegas, especialnente en el seno de las comisionesde seguridad o en las reuniones científ icas. Se refieren a la vigilanciabacteriológica sobre el personal, a la importarrcia capital de la existenciade procedimientos de urgencia en el caso de contaminaciones porroturas del uti l laje en las industrias, etc.

La tercera l imitación, y debe considerarse fr"rndamental' se refiere

a las garantías que presenta el hecho del respeto estricto de las reglasestablecidas en cada país y que de hecho afectan tanto a las autoridadesque las deciden como a quienes las controlan y, nruy especialmente. alos investigadores que las aplican.

Como conclusión a todo lo expuesto, nos atrevemos a proponerun anteproyecto rle normas en materia. de recombinaciones genéticas rnvítro para su cstLrdio y posterior aprobación por el Ministerio de Sani-dad y Seguridad Social.

ANTEpnoyncTo DE NoRMAs

Introducción

La finalidad de este documento es la de proporcionar a las insti-tuciones, públicas y privadas, así como a los investigadores y técnicosinteresados las normas esenciales de seguridad en materia á" ...o._binaciones genéticas in yitro.

Para la aplicación de estas normas será preciso crear en su momen-to una comisión Interministerial de clasificación que examine los pro_yectos haciendo su clasificación y el análisis de las tendencias y quevigile Ia educación del personal y equipos de seguridad, elabore uncuestionario y un formulario de respuestas, recoja y coleccione las cepasde trabajo y establezca un laboratorio de referlniiu y dé publicidad acuantas normas, modalidades y criterios vayan adoptándose por lamisma.

sin entrar en el fondo de ra estructura de la comisión, consideramosque ésta debe estar integrada por expertos científ icos, representantesde los Ministerios de Sanidad y Seguridad Social y de úniversidades eInvestigación, representantes de los organismos oficiales de investisa-ción y asimismo de Ia inclustria afectadá. etc.

Principios generales

Las recombinaciones genéticas in vitro se definen como experienciasque ponen en juego la propagación in vivo de moléculas formadas porporciones de ADN ligadas a un sistema no celular.

Estas experiencias comportan riesgos potenciales que imponen lanecesidad de crear medidas de seguridad para su realización.

El objetivo de estas medidas de seguridad es doble; de una parte,reducir los riesgos de contaminación para er investigador y, de otra,evitar el riesgo de la diseminación involuntaria de tor--i".oárganismospotencialmente peligrosos que este últ imo manipula.

El riesgo a que nos referimos está en función de varios parámetros:

- El origen del ADN.- El número de recombinantes independientes creados por una

experiencia.

46 47

- 16 características del sistema vector-huésped.- El grado de püreza del ADN a integrar.

El nivel de seguridad viene determinado por la suma de tres fac-

tores:

- Las barreras físicas. Entre ellas podemos citar las característicasdel local y de los equipos y el empleo de agentes físicos o quí-micos que inactiven los organismos portadores del ADN recom-binante.

- EI sistema bíológico utílizado. Tienen una extraordinaria im-portancia la distancia ecológica entre el sistema vector-huéspedy el organismo donador de ADN y también las característicasgenéticas de los recombinantes.

- L0 lormación del personal.

El nivel de protección puede ser aumentado empleando zonas deseguridad dentro de los locales. E[ conjunto "local, más zona de segu-ridad" determina el nivel de confinamiento físico que viene designadopor L l , L2, L3 y L4.

Las zonas de seguridad pueden ser, fundamentalmente, de dos tipos:de flujo laminar y aisladas.

Para mayor claridad estructuramos en una tabla las posibles com-binaciones:

NIVEL DE CONFINAMIENTO FISICO

Confinamientofísico

L I

Local

P I

P 1

Zona de seguridad

L2Cabína de f luio laminar

Zonas aisladas

Zonas aisladasL4

P4

(a) Los locales P3, con filtros HEPA y autoclave de doble entradadesignarán como P3+.

P3+ (a)

P3+ (a)

Factores biológicos

Los niveres de confinamiento biorógicos se establecen en funcióntanto del vector como del huésped y se designan como nO, Ai, 91_v F2 .

Para las experiencias en las que se utiliza E. coli K 12, sus plás_milfos y sus fagos, los niveres Br* y B2 corresponden a los niveres EK1y EK2 de otras normativas. Er niver Br* se

"bti"n. por la realización

de ciertas mutaciones a un sistema 81. Er nivel B0 ürr.rponá. a sis-temas menos seguros !1

(por ejemplo, plámidos transmisibies)-L'os sistemas de clonaje que utilizan el Bac'lus subtilis 16g como

lTte.ria huésped y piásmidos no transmisibres se crasifican como B1*.si la bacteria huésped es potencialmente más peligrosa, se le adjudicará

el nivel 82.La utilización de plásmidos no transmisibles, que dan origen a re_combinantes inestabres (pérdida d,er 1 % fo, g"n"ru"ión en ausenciade presiórr_selectiva) permiten elevar el nivei de óonfinamiento biológicod e 8 1 a 8 1 " o d e B 1 * a 8 2 .

Formación del personal

_ - L9r investigadores-y técnicos que participen en las experiencias

deberán justificar niveles de formación adecuados a los sistemas deconfinamiento biológico y físico de utilizar:

- Conocimiento del ,sistema biológico huésped vector que permi_

tan verificar regularmente las caracterísjicas qu" ur"gui"., luseguridad del sistema.

- conocimiento del sistema cre confinamiento físico utilizado yde las actuaciones de urgencia en caso de acciclente (incluidoel incendio).

- En el caso de experiencias que se lleven a cabo a niveles de L3y L4, la formación debe corresponder a la de la manipulaciónde microorganismos patógenos.

- El control de la formación será llevado a cabo por comisionesde expertos ad hoc.

4849

C lasif icocí ón ie lcs e't p eriani'ias

I.as investigacioner; r lUe coirsistan et¡ i 'orÍ lar o pf,)pagar ut l nútnCr,--.

i l im i tac to de r t - ' c r l t t lb inan lcs L ' l ) i l ¡ l r 'o l t tn t t l l i n fc r io r a l0 l i t rL rs se c la -

S i f i C a f á l l d C i t c i l . r r l ( , e r . r r t _ . ! r ' ¡ J . r , j l ( r \ r ! . r i t ¡ r l i t t L :

fl L.ASt Ir i(1.'\ {i I Or'1 i}l: ["¡\S ]:X Irii ii I frNCI-4S

F'r r e ntc:

--- si la I<¡calizacitin tie los gene.s respousablc.s de u' carírcter oncó*leno o Je: procli lctcls pafógcn,s y'a conr:cidos y que son elimina-LL-rs trl ir:s del r,: lcnaji: por un l-rroceso cie fracciorramienio, servirách lrasc para ia clasificac-ión, ia cficacia clcl fracciorlamientocicsclito cn el protoccllt i crpr-rintc-ntal propuestct.

" '- si i. l l iúulcr<l t lc cic:; l ics producido a partir dr: u¡r g,euc;nl¿1 es nrily'. ' \c¿rrro sr: ¡r.rrl i 'a autclrizal i in nivcl de colrl ' irrartt icl ltr f i ,cict; r;b i . i ru ic ' r :n ur¡ esc¿i lón i . tcr io¡ ' l . ro qur no cs l , i i l i , . ro para rosvi r t ¡s)" F; l nr ! ¡ lero c lc c lenlcntr - ts se f i ja en n lenos dc 10ü par : rir is f,alirrientos rie t¡maño ¡nedio igLral a 106 proverricnte tle uir!r.euo¡' it3 i lc n-¡amílero. y sir reducirá proportionalmcntc ¡_-¡¡3Se ] l ( ! i l l AS i ncn r )S cOmp le j c : : t .

* ' - 5 i r : l ' l rasnlentcr dc ADN. cualc lu icra que sea su or igen, i ra s iú, - rcl.r 'r;¡ i i ' . car"acte¡-izedo. y sc ".rbc (rur no es patógeno, sc airro-i i i r¿ t : I Lr r i l j¿¿rr ; r i ' * ,e les de c i l l f inanl rEn¡r- ] f ís ico o t r io l r ig ico err u l resciri i in i i l fcrirrr err ¡el;rcit in a lcs dat¡:s ciel cua<lrtr. si atiernii-,rr i íL-conlb in; ln te que c iebc a is l r r ; -sc es por tac ior dc r ¡n f ragmen¡ i r{ t r AI)N patóge' ' . sc ut i l izar i rn n ivc les c le conf inanr ie ' {s f ís ico,v biolírgicc aunlenttdos cn urr escalón calla uno"

--'-" .La uti l ización de -cist*mas B() 'r, i l l sr an¡rriz;rr 'á cas. pof cin'lc"- L¡ ai. l ici i i¡r clc agentes qiiínricos capaces de inactiv¡rr las bacte-

iias portalloras de plásnliclos reconrbinantes y/,o fag(rs recon¡hi_n¿ntes. permitirá la continuación cie las manipularcione:¡ (r:spe-c i i i inrcnte la sxrracci r in i . re l ADN) a un n ivel dc c<¡nf inainrentr :iís,icr.r cn grado ilferi i ir.

*-- L-i¡:.rndo se iocali¡-:e en las cepas port¿ldorils dc recombinzfltr:s L'rl¡ j*ri"".acli] genéticc no previsfi-, en el ¡;royecto inicial. csit rieb*rá¡¡i i 'rrrirsfl inmedi¿tarnrn[e a Ia comisión de. evaruar:ió¡r.

El trabajtr rs nri jtro, io-s ¡esull¿dt:; "son impr*visiL,-ir.s. i ir lenlaciri i iclc desáninro c:i a veccs elemasiad¡ fi lerle, p{r() L:irqyicrtrt ir:J.ttt i [rrcsfnte"y con crt(r rc¡ntino, la cita cle Olivr-r Wcndcil .1.{<.rlmr:.q. , 'Lir vida c:; ac_ción r ' l ; r : i i i i r ; : p i ) r 'cdr !s igui* ; r te , lo ( iucr r i i i hcnrb ' r r r l i l i ta r i r , * . l r r ipa i -i i r l : ¡ - -¿1. . ; , , ' .

, ; l ; i r . rc i . ; ; ¡ i l r : . sr¿ t ic¡ l ¡ l_. , . ¡ aúi¡ ¿ i ic , , r , . i , l , , : ; . ¡ i l * i i i ; ; ; l i : r i i ¡ l i1 , , : rhas '¡i " i¡-ir" '

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pof ct ls i ) . t ¡ ganr ' r l i . *5 i .a ls \ . ' . i r r ¡ i r r ' lc ; i iS ! r ¡ , r r . ! ohjat .od¿ : . r ¡ t : ru¡ncnto i . l¿ l l iv , ' i 'L : sr l lu¡ i r i : ¡ ¡J b io i i ig i tu ' , ' , - r

f ís ica.

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ror i.ii ii ltl:; ;,¡! i;rtcn t rrini -r: D iitli l i ' l;1, : i

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Vl r ( r . ¡ r i l1 : ;( , 'q . rn t r , - r l r i i insci l tos

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lrr'ri ii i z-;l r',i r::t

i l i i , ; i ' t i ' ' f ! l i r 1 \ , J i i i l n i ü i i r

I ¡ l i t l ¡ r r t : i i , , rs r iuí i l - ! icos

f ' ¡ , . ¡ , " . . i , : f ; ¡ h r i a a t i r i ¡ l

i:i i r"'l i ;l rl" ii 'rrt ¡i ' l [ü:;iit li.)s ¡I ::ír ili t^]: 1.,

a i i ; , . ru i l ( ] ¡ r i l l í l !

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P rrtri ui.'i i ir rl i..j i ': ! ir l i.i ir r'trrt r t;

r ' , : . , : i ; , t i ' ' , , , - , - : l r , r l : , ¡ " , , ,

' ' . . i : i '

\ , - i r : l

¡ . i r ¡ i

l ' .

Producto o Procesomicrobiológico

Pnonucros FARMACÉurICos

Aminoácidos, vitaminas

ComPuestos aromáticos

Modificación hormonas es-

teroídicasAntibióticos, su modifica-

ciónPéptidos cadena corta

Hormonas PePtídicasEnzimasAntígenos viralesOtras Proteínas

Preparación de genes

Uso final

Soluciones intravenosasAnalgésicos, narcóticos, etc.

Terapéutica Y Profilaxis

Control de enfermedades infecciosas

Control de las alteraciones de la he-

moglobinaControl de alteraciones metabólicas

Diagnóstico y teraPéuticaVacunasTerapéutica (p. ej., interferon, sero-

albúmina, etc.)Control de las afecciones heredita-

rias

IMPACTO POTENCIAL DE LAS RE,COMBINACIONESGENETICAS SOBRE LA PREPARACION DE PRODUCTOS

QUIMICOS ORGANICOS

Grupo químicoVentas USA 1977

(bi l lones g)

PosrsrLloADES ELEVADAS

fntermedios cíclicos 2,6Productos químicos farmacéutico5 O,gAromas y perfumes O,zAgentes tensoactivos 0,9Otros productos cíclicos y productos químicos acíclicos 9,7

Subtotal

PosrsttroanEs MoDERADAS

Plásticos y resinasGomas y derivadosPesticidas y similaresPlastificantesFinalizadores químicos y otros productos químicos

Subtotal

PosrsrrrnADES ESCASAs

ColorantesPigmentos orgánicosElastómeros (goma sintética)

Subtotal

Torer,

10,90,32 ,80 ,6, ) \

12,4

r7 , l

o,70,3r ,9

2,9

32,4

64 65

Termínología aplícadu a la tecnoloqía del ADN

Los investigadores que están desarrollando la tecnología del ADN

recombinante han creado un lenguaje especial, no siempre demasiado

claro para quien no está dentro del tema y que consideramos de interés

dar a conocer:

- c ADN o ADN complementario. Se refiere a las moléculas de

ADN hechas con Ia ayuda de enzimas especiales a partir de un

ARN mensajero. Estos genes en el caso de algunas proteínas de

células superiores consisten en secuencia interrumpidas de ADN'

c ADN se emplea en el momento del clonaje de los genes de

organismos superiores a las bacterias.

- Clonaie. - La palabra significa originalmente la obtención de

un grupo de células de una única célula "madre", de tal manera

que todas las células son genéticamente iguales. También sirve

para designar la preparación de copias de un gen seleccionado.

- Conjugación. - Esto ocurre en ocasiones, ya que algunas bacte-

rias pueden de forma natural transferir material genético de una

célula a otra. Las células donadoras se pueden llamar célulasmacho y la que reciben, hembras. La conjugación es asexual.

- pysa¡isle y procaoriote. - Los eucariotes son organismos cu-yas células contienen núcleos definidos. Incluyen plantas sim-ples y animales, tales como hongos y protozoos y organismoscomplejos, tales como árboles y el hombre. Las bacterias per-tenecen a los procariotes, por contraste con organismos simples,que no tienen claramente definido el núcleo y consisten en unaúnica célula.

- Proteína híbrida o fundida. - Dado que la bacteria ordinaria-mente no produce péptidos de pequeño tamaño, tales como cier-tas hormonas de los mamíferos, así como sus genes respondena diferentes acciones que las de los eucariotes, el aparato gené-tico de los procariotes no está bien adaptado a muchas de lasexigencias que la ingeniería genética ha solicitado de ellos. Unavía para resolver el problema es la fusión de un gen de mamí-fero con otro de una proteína bacteriana. Tal estrategia produceuna proteína híbrida en la que la porción deseada del mamíferoestá contigua con la pieza no deseada de la bacteria. Ambas

66

fracciones pueden ser separadas por métodos químicos o enzi-máticos.

- Biblíoteca de genes.-_ E[ material genético de un organismopuede ser fraccionado en murtitud de piezas genéticas ñdiunt"el uso de enzimas adecuadas, dando origen a un verdaderomosaico de fracciones de ADN que pueden ser introducidas encélulas bacterianas de acuerdo con las necesidades.

- Sistema huésped-vector. - El huésped es el organismo, gene_ralmente una bacteria, al que se trasplanta un gen de otro or_ganismo. El gen huéspecl es transportado allí pór medio de unvector que puede ser una molécula de ADN de gran tamaño,por ejemplo un plásmido, o un virus en el que

-el gen queda

colocado, infectando entonces a Ia bacteria- comité Institucionar de Bioseguridod (cIB). - Esta denomina-

ción procede de Ia normativa del Instituto Nacional de Saludde los Estados Unidos en relación con el ADN recombinantey se refiere a los comités que deben supervisar los proyectospresentados por los investigadores y más especialmente ja se_guridad.

- Memorándum de presentación y autorización. _ Este docu_mento describe las experiencias con ADN recombinante remi-tidas a las autoridades sanitarias, para la evaluación de su segu-ridad.

- Plásmido. - Molécula-circular de ADN bacteriana, considera-blemente menor que el cromosoma del mismo microorganismo.que puede ser fácilmente transferido en este tipo dJcélulas.Químicamente se puede insertar er gen deseado en un plásmidoy éste actúa como vector que transporta el gen a la bacteria.

- Promotol. - Es una porción de un gen que inicia la produc_ción de una proteína especificada por tui g".,. Un piomotorbacteriano consiste en una secuencia de eóN .rp..?fi"o qu,puede ser atacado químicamente para producir una proteína nobacteriana.

- Comité de vigilancia de ADN recombinante (CAR). _ Es elcomité nacional establecido por el Instituto Nacional de Saludde los EE.UU.

- Enzimas de re-clricción. - Se trata d.e enzimas que ,,recono_cen" e hidrolizan una molécula de ADN en secuencias de nu_cleótidos específicos. Algunos enzimas de restricción son muyespecíficos.

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