RADIOFÁRMACOS TERAPÉUTICOS

E. Silvia Verdera – Silvia Gomez de Castiglia COMITÉ DE RADIOFARMACIA ASOCIACIÓN LATINOAMERICANA DE SOCIEDADES DE BIOLOGÍ A

Y MEDICINA NUCLEAR

DICIEMBRE 2007

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CONTENIDO Lista de colaboradores. ……………………………………………………….....v

Prólogo…………………………………………………………………………...vii

Radiofármacos de tercera generación ………………………………………………………. 1 Guillermina Ferro Flores – Consuelo Arteaga de Murphy Radiofármacos para terapia paliativa del dolor……………………………………………..11 Henia Balter Radiofármacos para tumores neuroendócrinos, análogos de la somatostatina ………………..……………………………………………….15 Marycel Figols de Barboza Anticuerpos monoclonales y derivados para terapia………………………………………..21 José Crudo Radioinmunoterapia del linfoma no Hodgkin……………………………………………….. 25 Carlos Oscar Cañellas Uso del anticuerpo monoclonal humanizado Nimotuzumab (h-R3) en el tratamiento de pacientes portadores de gliomas de alto grado de malignidad…………..29 Tania Crombet Ramos - Angel Casacó Parada Modelos Radiofarmacocinéticos y cálculo de dosis interna .............................................45 Guillermina Ferro Flores – Consuelo Arteaga de Murphy Design of therapeutic radiopharmaceuticals………………………………………………….55 Maria Neves Diseño de radiofármacos terapéuticos………………………………………………………..59 Maria Neves Traducción: Ana María Robles Farmacopea Argentina………………………………………………………………………….65 Juan Carlos Furnari Legislación sanitaria relacionada con la Industria Farmacéutica y la Farmacopea Mexicana ………………………………………………………………………67 Consuelo Arteaga de Murphy - Guillermina Ferro Flores

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LISTA DE COLABORADORES Dra. Henia Balter Dra. Guillermina Ferro Flores Directora del Centro de Investigaciones Investigadora Titular – Dpto. de Nucleares, Facultad de Ciencias, Materiales Radioactivos Universidad de la República Instituto Nacional de Investigaciones Montevideo, Uruguay Nucleares (ININ) Email: jbalter@cin.edu.uy Toluca, México Email: gff@nuclear.inin.mx Dra. Marycel Figols de Barboza Dr. Juan Carlos Furnari Gerente de Producción Gerente de Capacitación, Química Centro de Radiofarmacia Nuclear y Ciencias de la Salud IPEN - CNEN / SP Centro Atómico Ezeiza Sao Paulo, Brasil Buenos Aires, República Argentina Email: mbarboza@ipen.br Email: furnari@cae.cnea.gov.ar Dr. Carlos Oscar Cañellas Dra. Consuelo Arteaga de Murphy Vicepresidente de Investigador Titular – Dpto. de Medicina Tecnonuclear S.A. Nuclear, Instituto Nacional de Ciencias Buenos Aires, República Argentina Médicas y Nutrición Salvador Zubirán Email: canellas@tecnonuclear.com México D.F., México Email: consuelo_murphy@yahoo.com.mx Dr. Angel Casacó Parada Dra. María Neves Centro de Inmunología Molecular Investigadora Principal- Departamento PoBox 16040, Havana 1600, Cuba de Protección Radiológica Tel: (537) 2717933 Instituto Tecnológico e Nuclear Fax: (537 2720644 Sacavem, Portugal Emal: casaco@cim.sld.cu Email: mneves@itn.pt Dra. Silvia Gomez de Castiglia Ing. Quím. Ana María Robles Investigación y Desarrollo Profesor Honorario de Radiofarmacia, Tecnonuclear S.A. C.I.N., Facultad de Ciencias, Buenos Aires, República Argentina Universidad de la República Email: silgomez@tecnonuclear.com Montevideo, Uruguay Email: anamar@cin.edu.uy Dra. Tania Crombet Ramos Dra. E. Silvia Verdera Presto Centro de Inmunología Molecular Gerente de Calidad PoBox 16040, Havana 1600, Cuba TECHI S.A. Tel: (537) 2717933 Montevideo, Uruguay Fax: (537 2720644 Email: sverdera@hotmail.com Lic. José Crudo Jefe División Radiofarmacia Comisión Nacional de Energía Atómica Buenos Aires, República Argentina Email: jlcrudo@cae.cnea.gov.ar

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PRÓLOGO En la reunión de radiofarmacéuticos que se celebró durante el XX Congreso de ALASBIMN, 2005, se sugirió la elaboración de una contribución a presentarse en Bolivia en ocasión del próximo evento de encuentro de todos los profesionales latinoamericanos. Es así que se inició este proyecto del grupo de radiofarmacia, con el objetivo de disponer de un material de divulgación a nivel de la totalidad del equipo multidisciplinario que integra ALASBIMN. Gracias a la valiosa colaboración de destacados expertos de la región para la coordinación y/o redacción de capítulos con especial hincapié en radiofármacos terapéuticos, se pudo concretar el presente material el cual brinda información científica actualizada de temas, procedimientos y/o desarrollos que están al alcance de la comunidad médica con el apoyo y responsabilidad del profesional radiofarmacéutico. A partir de un primer aporte introductorio que reseña los radiofármacos de tercera generación, se desarrollan en las siguientes contribuciones las principales aplicaciones de la radiofarmacia en el campo terapéutico, la temática de modelos radiofarmacocinéticos y cálculo de dosis interna así como del diseño de estos productos. Finalmente se hace referencia a las Farmacopeas de países de la región que incluyen monografías de radiofármacos y otros aspectos regulatorios. Este material no se considera exhaustivo de un campo tan dinámico y amplio; por el contrario, representa un primer paso en el cometido de difundir y apoyar las áreas involucradas en el desempeño de la Medicina Nuclear, anhelando que el proyecto pueda continuar incorporando a tantos otros reconocidos colegas que tienen mucho para compartir en esta gran familia radiofarmacéutica. E. SilviaVerdera – Silvia Gomez de Castiglia Editores

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RADIOFÁRMACOS DE TERCERA GENERACIÓN

Guillermina Ferro Flores - Consuelo Arteaga de Murphy

1. Generalidades de los radiofármacos

“Un radiofármaco es toda sustancia que contiene un átomo radiactivo dentro de su estructura y que, por su forma farmacéutica, cantidad y calidad de radiación, puede ser administrado en los seres humanos con fines diagnósticos ó terapéuticos” [1].

De acuerdo con el criterio de diseño, los radiofármacos pueden ser divididos en tres generaciones. En la primera de ellas, simplemente se radiomarcaban compuestos químicos que pudieran ser dirigidos a un órgano determinado sin un receptor específico, o se administraban radiopartículas que fueran captadas explotando procesos fisiológicos normales en el cuerpo. Por ejemplo, la fagocitosis fue la base para preparar coloides como el 99mTc2S7 y el bloqueo capilar para desarrollar 99mTc-macroagregados de albúmina, dando origen a la gammagrafía hepática y pulmonar respectivamente. Dado que el 99mTc se obtiene del generador 99Mo/99mTc en cantidades de nanogramos, estos agentes no fueron caracterizados por métodos químicos analíticos convencionales debido a las bajas concentraciones (escala micromolar).

La segunda generación de radiofármacos emergió en la década de los 80´s como resultado del desarrollo de compuestos que tenían un radiometal unido con ligantes y con una geometría bien definida, como los complejos Tc(V)-oxo. Su biodistribución se establecía por sus características fisicoquímicas como tales como carga total, peso molecular, forma y lipofilia. De este trabajo surgió el concepto de agentes quelantes bifuncionales (BFCA por sus siglas en inglés), que son ligantes que no sólo enlazan al radiometal, sino que también pueden unirse por otro extremo de la molécula a receptores biológicos, por ejemplo los derivados del ácido iminodiacético [1, 2]. El concepto fue expandido en los años 90 para incluir el acoplamiento de radiometales con fragmentos bioactivos usando BFCA a y se iniciaron así los estudios en el diseño de radiofármacos de tercera generación.

1.1 Diseño de radiofármacos de tercera generación

Los radiofármacos diagnósticos de tercera generación se utilizan en medicina nuclear para obtener imágenes de blancos moleculares específicos, y son únicos en su capacidad para detectar in vivo sitios bioquímicos determinados tales como receptores y enzimas. El agente bifuncional de encuentra ubicado entre el radionúclido y la molécula blanco, este coordina firmemente al ión metálico y está covalentemente enlazado con la molécula específica del receptor de forma directa o con una molécula de unión. El fragmento bioactivo sirve como un transportador que lleva al radionúclido al sitio receptor en las células o moléculas blanco [3]. Las moléculas bioactivas específicas de los receptores que pueden ser fracciones de anticuerpos, péptidos, péptido miméticos, análogos de ADN, oligonucleótidos antisentido (antisense) y ligantes no peptídicos. Los agentes de este tipo representan un cambio sustancial en los paradigmas del desarrollo farmacéutico por el empleo de las capacidades propias del organismo como vectores de radionúclidos, en lugar de considerar al organismo como un simple tubo de ensaye donde interactúan moléculas extrañas.

2. Caracterización de los radiofármacos 2.1 Caracterización química

La espectrometría de masas junto con la cromatografía líquida de alta resolución y la detección radiométrica (radio-LC-MS) son importantes técnicas en el análisis de los compuestos que están siendo desarrollados. La radio-LC-MS detecta trazas de impurezas [4-11] y determina la actividad específica [5], con lo que se confirma la identidad de la mayoría de los radiofármacos con 99mTc [6-11] e identifica sus metabolitos [12-17].

La cantidad de radiofármacos usada en preparaciones para aplicación clínica se encuentra típicamente en el rango micromolar (nanogramos). A esta concentración es difícil elucidar la estructura molecular del compuesto en investigación, lo cual es muy importante para predecir las propiedades de biodistribución del radiofármaco. La química de coordinación convencional,

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a concentraciones milimolares, es llevada a cabo utilizando cantidades macroscópicas del isótopo natural y estable. Los compuestos, obtenidos en cantidades de miligramos, son caracterizados con técnicas fisicoquímicas convencionales, como la resonancia magnética nuclear, espectroscopia infrarroja, espectrometría de masas y determinación de la estructura cristalina por difracción de rayos X, obteniendo de ese modo una identificación estructural de las especies en estudio. El siguiente paso es comparar la identidad química obtenida a concentración milimolar, usando el isótopo estable, con la obtenida en condiciones de alta dilución sin portador agregado (NCA “non carrier added”) con el radionúclido. Ambos, el isótopo estable y el radiactivo, son inyectados juntos en HPLC y los cromatogramas son obtenidos usando dos sistemas de detección diferentes, el detector UV-visible para el isótopo estable y un detector radiométrico para el radionúclido [3]. La correspondencia del tiempo de retención del pico de interés en el cromatograma se acepta como prueba de la identidad química de las dos especies (fig. 2). De todas formas, es importante mencionar que la moderna tecnología de radio-LC-MS ofrece sensibilidad a bajas concentraciones, como Verdyckt et al. [9] concluyen, “la radio-LC-MS puede ser un sensible auxilio en el control de calidad de radiofármacos NCA”. Es una herramienta esencial durante los estudios in Vitro de estabilidad de radiofármacos en buffer y en suero humano, antes de la evaluación in vivo.

O

Tc

N

N

N

N

OO

H

OH

OH

NH

OH

NH

O

NH

SO

NH

N

O O

NH2

O

NH

NH

ONH

S

NH

O

OH

NHO

NH

N

TcN

N

N

ON

H H

OH

O

HOH

O

H

O

O

O H

Región para quelar el radiometal (99mTc)

Tc-d,l-HM-PAO

Región del péptido para unirse in vivo a receptores de somatostatina

2TcO4- + 7S2O3

2- Tc2S7 + 7SO42- + H2O

99mTc-colide de azufre

Figura 1. Representación esquemática de radiofármacos de primera generación (arriba)

segunda generación (en medio) y tercera generación (abajo) [2].

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Figura 2. Identificación química del radiofármaco HYNIC-TOC radiomarcado con Tc-99m por espectroscopía de masas (arriba) y U. V./radio-HPLC (abajo) [2].

Es importante mencionar que el cálculo de la Mecánica Molecular (MM) es también una herramienta útil en la explicación de resultados experimentales asociados con el reconocimiento molecular y estabilidad, debido a que esos fenómenos son regidos por fuerzas intermoleculares como las electrostáticas y las de Van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones de donador-aceptor y efectos hidrofóbicos. Para que un receptor reconozca un potencial sustrato y, subsecuentemente, se unan, las dos especies deben ser complementarias en tamaño, forma (geometría) y sitio de unión (energía) [18-20].

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2.2 Caracterización bioquímica “Las técnicas de obtención de imágenes moleculares, directa o indirectamente, monitorean

y registran la distribución espacio temporal procesos moleculares o celulares para aplicaciones bioquímicas, biológicas, de diagnóstico o tratamiento” [21]. La molécula blanco, para la imagen molecular diagnóstica, debe ser cuidadosamente elegida y la elección debe hacerse teniendo como base ensayos de unión específica (SB), de unión no específica (NSB) y de unión a proteínas no blanco; así como la farmacocinética de la SB y NSB; metabolismo, diferenciación de especies y sensibilidad [22].

Los criterios generales de diseño aplicados al desarrollo de radiofármacos receptor-específicos están dictados por la localización en el cuerpo/órgano de las proteínas blanco y si están dichos receptores expresados extra o intracelularmente. Además, otros parámetros que determinan la calidad de la imagen incluyen la densidad de estos blancos y la unión no específica [23].

Los estudios de unión a receptores son hechos para determinar la afinidad del radiofármaco por su molécula blanco. Estos ensayos son llevados a cabo en membranas celulares, membranas de tejido o en células intactas de tejido. Los dos principales tipos de experimentos de unión son los estudios de saturación y de competencia.

Los estudios de saturación son llevados a cabo por incubación de las membranas, el competidor y un incremento en la concentración del radioligante, por un periodo de tiempo a temperatura ambiente. A una concentración más alta de la sustancia radiactiva todos los receptores se encuentran ocupados (saturados) por el ligante radiactivo. Las membranas son separadas de la mezcla de incubación por filtración. Cuando los ligantes se unen al tejido, lo hacen usualmente en más de un sitio. La unión específica (SB) es la que se lleva a cabo en el receptor que se está estudiando. Otros sitios de enlace, por ejemplo otros receptores, proteínas de tejido, el tubo de ensaye o los filtros de fibra de vidrio, pueden ser sitios de unión no específica (NSB), la SB es obtenida de la diferencia entre de la unión no específica a la unión total (TB).

La curva de saturación es obtenida por la gráfica de la concentración del radioligante adicionado contra la concentración del ligante unido. Los experimentos de saturación sirven para determinar la constante de disociación (Kd), que es una medida de la afinidad de un ligante por su receptor, y Bmáx, que es el número total de sitios receptores en la membrana que se estudió. El valor de Kd es igual a la concentración de radioligante que se requiere para ocupar el 50% de los receptores y es calculada usando una gráfica Scatchard (concentración del ligante unido (M) contra el cociente del ligante unido/libre) (fig. 3). Una baja Kd indica un alto grado de afinidad del ligante por su receptor.

1.50E-012 3.00E-012 4.50E-012 6.00E-0120.00

0.02

0.04

Kd = 0.16 nM

ββββmax

= 5.836 x 10-12M

Uni

do/L

ibre

Unión(M)

Figura 3. Afinidad del 99mTc-HYNIC-TOC en membranas de células de cáncer pancreático

AR42J que expresan receptores de somatostaina (gráfica de Scatchard) [2,3].

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Los ensayos de competencia están basados en la capacidad de un ligante no marcado de

competir con el ligante radiomarcado por el receptor. Como muchos ligantes no se encuentran disponibles en una forma radiactiva y no hay manera directa de medir su afinidad por el receptor, el método indirecto es usado para determinar su habilidad de competir con un radioligante. Las membranas, el radioligante y las concentraciones incrementadas del ligante competidor son incubados por varias horas a temperatura ambiente. Las membranas son entonces separadas de la mezcla de incubación por filtración y lavado. La curva de competencia es obtenida graficando el porcentaje de actividad unida a las membranas contra la concentración del competidor (fig. 4). La SB, NSB e IC50 (la concentración del competidor que inhibe el 50% de la unión con el radioligante), puede ser calculada con una regresión no lineal usando la siguiente fórmula:

+

+=

50ICX 1

SB NSB Y

donde Y es la actividad y X la concentración del competidor (nM).

1E-3 0.01 0.1 1 10 100 10000

1

2

3

4

5

Radiofármaco: 99mTc-HYNIC-TOCCompetidor: TOCMembranas: AR42J Unión no específica 0.80 ±0.06Unión específica 3.41 ±0.09IC

500.40 ±0.06

Uni

ón(%

del

tota

l)

Concentración (nM)

Fig. 4. Curva de competencia del 99mTc-HYNIC-TOC en membranas de células de cáncer

pancreático AR42J que expresan receptores de somatostaina (Especificidad) [2,3].

La curva de competencia obtenida debe mostrar un desplazamiento específico del radioligante por el competidor si el ligante mantiene su afinidad por el receptor. Si la concentración del radioligante y la afinidad por el receptor son conocidas, el valor Ki (la constante de disociación en el equilibrio por un inhibidor competitivo del receptor) puede ser obtenido del valor IC50 usando la ecuación Cheng-Prusoff [24].

D

i

K

DIC

K+

=1

50

Donde D es la concentración del radioligante y KD es la constante de disociación de la unión del radioligante con el receptor bajo las mismas condiciones experimentales usadas en el experimento de competencia. El valor Ki para un ligante no marcado debe estar en el mismo rango que un valor de KD obtenido con el mismo ligante radiomarcado.

La cinética de la unión y el grado de internalización y externalización de los radiofármacos en células vivas son parámetros importantes que se evalúan frecuentemente como parte de la caracterización bioquímica además de las pruebas mencionadas antes [25-33].

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2.3 Evaluación in vivo

La evaluación preclínica de los radiofármacos incluye estudios In vivo tanto de biodistribución como de toxicidad en animales. Los estudios de biodistribución en un modelo animal normal identifican patrones de distribución en órganos y de excreción. Los animales con tumores malignos inducidos (usualmente ratones atímicos) son usados para determinar la unión específica a los receptores que están sobre-expresados en células cancerosas. Los estudios de bloqueo, inyectando simultáneamente el radiofármaco (radioligante) y un exceso de ligante no radiactivo, son útiles para determinar el grado de captación específica. Los animales con tumores malignos inducidos son esenciales para evaluar la eficacia terapéutica.

Los estudios de toxicidad están enfocados a la toxicidad potencial química de los componentes, no del radionúclido, ya que son sólo cantidades muy pequeñas del elemento radiactivo son las que están presentes en el radiofármaco. 2.4 Receptores de péptidos reguladores

Los receptores de péptidos reguladores están sobre-expresados en numerosas células cancerígenas. Esas moléculas han sido usadas como blancos moleculares de péptidos radiomarcados para localizar tumores cancerosos. Los resultados clínicos exitosos obtenidos durante la última década con la obtención de imágenes moleculares de los receptores de somatostatina, que se encuentran sobre-expresados en las células de los tumores neuroendocrinos, han sido extendidos al estudio de otros radiopéptidos para hacer blanco en otros receptores asociados al cáncer como el péptido liberador de gastrina, colecistoquinina, péptidos ligantes para receptores de integrinas o neurotensina. La mejora de los radiopéptidos análogos está permitiendo una imagen molecular específica de diferentes tipos de tumores, incluyendo cáncer de mama, próstata, intestino, páncreas y de cerebro [34-37].

2.4.1 Bombesina Como ejemplo de podemos citar a la bombesina (BN). La BN (BN,14 aminoácidos) fue

aislada de la piel de la rana y pertenece a un amplio grupo de neuropéptidos con muchas funciones biológicas. El equivalente humano es el péptido liberador de la gastrina (GRP, 27 aminoácidos) y sus receptores (r-GRP) que están sobreexpresados en las membranas de las células de diversos tumores. El GRP y la bombesina difieren por sólo uno de los 10 residuos carboxílicos y eso explica una actividad biológica similar de las dos moléculas [34]. La unión fuerte y específica BN-GRP-r es la base del marcado de la BN con radionúclidos [36-55].

El receptor subtipo 2 de bombesina (receptor GRP) está sobreexpresado en varios tumores humanos incluyendo mama, próstata, células pulmonares y cáncer pancreático [36]. Se han desarrollado varios radiofármacos análogos de BN. Los conjugados de BN radiomarcada hacen blanco en los receptores BN1 y BN3 y han sido desarrollados también para dirigirse a otros tipos de cáncer [45, 46]. No obstante, la mayoría de los análogos de la bombesina marcados con 99mTc tienden a acumularse en el hígado e intestino debido a su alta lipofilia [37, 45-52]. La gran acumulación de radiactividad puede interferir durante la detección de cánceres positivos BN/GRP y sus metástasis en las áreas abdominales.

La Demobesina-1 se ha reportado como un análogo de BN selectivo con un grupo quelante -N4- para una unión estable con tecnecio-99m y con una baja eliminación hepatobiliar [26]. Este péptido ha mostrado una alta afinidad en preparaciones de membranas humanas de adenocarcinoma PC-3 humano. Los valores de IC50 determinados para Demobesin-1 y Tyr4-BN son 0.70 y 1.5 nM respectivamente, mientras que la Kd definida para 99mTc/99Tc-Demobesin-1 fue de 0.67 nM después de la inyección en ratones sanos, 99mTc-Demobesin-1 se acumuló muy eficientemente en los órganos blanco (páncreas, tracto gastrointestinal) vía mediación GRP-R., como es demostrado por experimentos de bloqueo de receptores in vivo. Igualmente se mostró una alta incorporación mediada por GRP-R después de la inyección a ratones atímicos con tumores PC-3 [27].

Los 99mTc Demobesin-3, 4 y 5 se reportaron recientemente como agonistas de la bombesina. Todos ellos demostraron valores de IC50 <0.60 nM. Los estudios in vitro en células PC-3 mostraron una rápida incorporación e internalización. 99mTc-Demobesin-3 y 4 se excretan primordialmente por vía renal [53].

Lin et al. [54] reportó otro análogo de BN marcado con 99mTc con alta afinidad, [DTPA1, Lys3 (99mTc-Pm-DADT), Tyr4]BN, teniendo un modificador farmacocinético incorporado, DTPA y marcado con 99mTc usando un diaminedithiol quelante hidrofílico (Pm-DADT) produce una menor excreción hepatobiliar. Los estudios de unión in vitro, usando membranas de células PC-3 de cáncer de próstata humanas, mostraron que Ki para [DTPA1, Lys3 (99mTc-Pm-

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DADT),Tyr4]BN de 4.1 nM. Los estudios de biodistribución para [en ratones normales revelaron una muy baja acumulación de radiactividad en hígado e intestinos. Hubo una incorporación significativa en páncreas, que expresaba receptores BN/GRP [54].

La disponibilidad de un método de radiomarcado simple y reproducible es esencial en el desarrollo de radiofármacos para el uso clínico rutinario, el 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-BN, obtenido a partir de núcleo-equipos liofilizados, ha sido reportado como un radiofármaco con alta estabilidad en suero humano, unión específica a los receptores y rápida internalización. Los datos de biodistribución en ratones mostraron una rápida depuración sanguínea con excreción renal predominante y alta captación en tejidos positivos para receptores GRP como el páncreas y tumores PC-3 [55].

2.4.2 RGD y UBI La angiogénesis, o la formación de nuevos vasos sanguíneos, es un proceso controlado

por ciertos productos químicos producidos por el cuerpo. El producto químico que hace que este proceso se detenga se llama inhibidor de la angiogénesis. El cáncer se disemina por medio de la formación de nuevos vasos sanguíneos, los cuales suministran oxígeno y sustancias nutritivas a las células cancerosas, ayudando a que las células crezcan, invadan los tejidos cercanos y se diseminen a otras áreas del cuerpo (metástasis).

Las integrinas son receptores que median la adhesión celular y regulan la formación de complejos de señalización. El bloqueo de integrinas utilizando anticuerpos o péptidos que contienen la secuencia RGD (-Arg-Gly-Asp-) pueden ser utilizados para la inhibir la angiogénesis. En la búsqueda de inhibidores de la diseminación tumoral, las integrinas y algunas moléculas asociadas a ellas son importantes blancos moleculares farmacológicos. Con radiofármacos del tipo 99mTc-HYNIC/EDDA-ciclo-Lys-D-Phe-RGD y el dímero 99mTc-HYNIC-c-RGDfK pueden obtenerse imágenes in vivo de integrinas y detectar procesos de angiogénesis, lo cual permitiría diagnosticar de manera específica una amplia gama de tumores primarios y sus metástasis [56].

Otra aplicación no oncológica que amerita el desarrollo de un radiofármaco de blancos moleculares específicos es la detección por imagen de procesos infecciosos. Para un paciente diabético realizarle una biopsia para confirmar un proceso infeccioso puede ser de muy alto riesgo. Para un paciente con cáncer un radiofármaco específico que diferencie una metástasis de una infección por imagen puede resultar muy oportuno en la decisión del tratamiento a seguir. La ubiquicidina 29-41 (UBI), es un fragmento de un péptido catiónico antimicrobiano localizado en la piel humana. El derivado UBI 29-41 radiomarcado con Tc-99m ha demostrado una alta utilidad en la detección específica de focos infecciosos [57].

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xviii

RADIOFÁRMACOS PARA TERAPIA PALIATIVA DEL DOLOR EN METÁSTASIS ÓSEAS

Henia Balter

En los últimos 10 años se han producido grandes avances tanto en el desarrollo de radionucleidos para terapia como de moléculas carrier. Uno de los primeros campos de aplicación de radiofármacos terapéuticos ha sido el tratamiento de metástasis óseas, fundamentalmente con un fin de terapia paliativa del dolor. Las metástasis óseas se desarrollan en aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer de mama o de próstata, y el tratamiento de esas metástasis con radiofármacos ha sido beneficioso para muchos pacientes, aliviando el dolor en un 40% a 80%, durante periodos que van de semanas a meses1. Silberstein2 ha realizado un interesante y completo revisión de métodos para tratar el dolor óseo Dentro de los métodos que involucran radiaciones, la radioterapia externa ha demostrado efectividad en el alivio del dolor pero su aplicación está limitada al tratamiento localizado cuando hay pocos sitios específicamente comprometidos con metástasis, dado que un tratamiento mas extensivo produce efectos adversos tales como nauseas y vómitos. Por otra parte su aplicación en tórax y abdomen, debido a la presencia de órganos altamente sensibles a las radiaciones que podrían afectarse se encuentra limitada. Dado que las metástasis están frecuentemente diseminadas, la radioterapia sistémica con radiofármacos es la mejor elección dado que provee alivio del dolor, duradero, y con mínimos efectos adversos; si bien pueden presentarse alteraciones reversibles de la formula sanguínea.

Los radiofármacos para terapia paliativa del dolor deben poseer determinadas características:

1. Alta afinidad por el tejido óseo afectado y permanencia en el mismo. 2. Emisor beta o emisor de electrones. 3. Energía suficiente para llegar a las células responsables del dolor 4. Período de semidesintegración suficientemente largo para producir una dosis de

radiación que destruya o dañe irreversiblemente las células afectadas.

El mecanismo de acción de estos radiofármacos terapéuticos está vinculado a su afinidad por el tejido óseo maduro (hidroxiapatita), con particular, afinidad por regiones con actividad osteoblástica donde el fosfato de calcio amorfo está siendo depositado; como lo son las zonas circundantes a las metástasis. Estos sitios de captación pueden ser identificados y localizados por radiofármacos de diagnóstico óseo como el 99mTc-MDP y el 99mTc-HEDP lo que orienta el tratamiento.

En la tabla 1 se indican las propiedades de algunos radiofármacos de aplicación en terapia paliativa del dolor óseo Radiofármaco T1/2

días E� Máx MeV

E� Media MeV

Rango mm

E� MeV (abundancia)

32P-Fosfato de sodio 14.3 1.71 0.70 3.0 No presenta 89Sr-Cloruro de estroncio 50.5 1.46 0.58 2.4 0.910 (0.009%) 186Re-HEDP 3.8 1.07 0.35 1.1 0.137 (9%) 188Re-HEDP 0.7 2.11 0.76 3.5 0.155 (15%) 153Sm-EDTMP 1.9 0.81 0.23 0.6 0.103 (28%) 177Lu-EDTMP 6.7 0.50 0.13 0.7 0.208 (11%) 117mSn-DTPA 13.6 0.13a

0.15a 0.2

0.3 0.159 (86%)

Modificado de Kowalski-Falen1 a Electrones de conversión interna

xix

32P-Fosfato de sodio

Fue uno de los primeros agentes empleados en el tratamiento de metástasis óseas siendo efectivo en 60% a 90% para la paliación del dolor. Presenta el inconveniente de que, al estar involucrado en muchos procesos metabólicos y particularmente en el sistema hematopoyético, puede afectar los mismos y en especial causar depresión de la médula ósea. Si se compara su efectividad y su toxicidad con la del 89Sr-Cloruro de estroncio, se observa que si bien su eficiencia respecto al alivio del dolor es similar, los efectos adversos, tales como niveles más elevados de mielosupresión, son más importantes3 . El 32P-Fosfato de sodio es una solución transparente e incolora de pH: 5.0-6.0 que se puede administrar por vía parenteral u oral. La reducción del dolor aparece entre 5 y 14 días después de su administración. 89Sr-Cloruro de estroncio ( 89Sr-SrCl 2)

Este radiofármaco fue aprobado por la FDA en el año 1993. Se suministra como solución estéril inyectable de concentración 1mCi/mL (37MBq/mL). La dosis recomendada a administrar es de 40 a 60 uCi/kg (1.48 a 2.22 MBq/kg) por infusión en 1-2 minutos. La dosis puede repetirse después de un tiempo no menor a 90 días. El alivio del dolor aparece entre 1 y 3 semanas y tiene una duración de 4 a 6 meses4

Dado que este radiofármaco afecta la médula ósea, el conteo de plaquetas inicial del

paciente debe ser mayor a 60.000 y el de leucocitos mayor a 2400. Es recomendable no administrar 89SrCl2 si el paciente ha recibido quimioterapia recientemente, dada la aditividad del efecto tóxico.

El alivio del dolor está en un rango de 60 a 85% y el grado de alivio es independiente de la

actividad (rango de 1 a 10mCi; 37 a 370MBq) por lo que no se evidencia una relación dosis-respuesta, según una revisión realizada por Serafini4. En un bajo porcentaje de los pacientes se produce un incremento del dolor en los primeros días después del tratamiento que se calma con analgésicos que no produzcan efectos sobre la coagulación. No se producen nauseas, vómitos ni caída del cabello como en la quimioterapia.

El mecanismo de acción es similar al del calcio y se produce en los sitios de actividad

osteogénica. Aproximadamente el 70% de la dosis es retenida por el esqueleto. La eliminación es por vía renal (2/3) y fecal (1/3)

Dado que el 89Sr tiene emisión gamma muy poco abundante (0.009%) su medición en el

calibrador de dosis está basada en el efecto bremsstrahlung, altamente dependiente de la geometría, por lo cual debe estandarizarse cuidadosamente la metodología5. 153Sm-Etilendiaminotetrametilenfosfonato ( 153Sm-EDTMP)

Se presenta en forma de solución acuosa inyectable, estéril, incolora o ligeramente ámbar y se administra por vía intravenosa. El pH debe estar entre 7.0 a 8.5. La concentración es usualmente de 50 mCi/mL (1850 MBq) y se dispensa en viales de 100 y 150 mCi (3700 y 5550 MBq). Su estabilidad es de 48 hs (congelado) o de 8 hs una vez descongelado.

Debido a que el emisor beta 153Sm es también emisor gamma (103keV), pueden obtenerse imágenes que permiten la localización de las metástasis y determinar la dosimetría interna. Su período de semidesintegración de 46.3 hs hace que produzca una dosis de radiación intensa durante un tiempo de irradiación corto, lo cual se postula, puede producir un alivio más rápido del dolor y un menor daño a médula ósea. El mecanismo de localización en metástasis es similar al del 99mTc-MDP6, pero se produciría una hidrólisis a nivel de superficie del hueso7. Se elimina en 4-6hs post adiministración y su permanencia en tejido óseo esta directamente asociada a las metastasis8. El órgano crítico es la superficie del hueso.

La mielotoxicidad es similar a la del 89SrCl2.

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La medicion de actividad en el calibrador de dosis también debe ser cuidadosamente estandarizada dada la dependencia de la geometría para la medición de emisores beta5. 177Lu- Etilendiaminotetrametilenfosfonato ( 177Lu- EDTMP)

El 177Lu es un emisor beta de menor energía que el 153Sm y con un periodo de semidesintegración mayor, por lo que se encuentra en etapa de investigación clínica a fin de evaluar su eficiencia terapéutica y los beneficios del punto de vista de irradiación mas focalizada en las metástasis produciendo menor daño a hueso sano9,10. 186Re-Hidoxietilendisodiofosfonato ( 186Re-HEDP) y 188Re-Hidoxietilendisodiofosfonato ( 188Re-HEDP)

Las similitudes químicas entre el Renio y el Tecnecio, y la posibilidad de marcar con ellos diversos fosfonatos hacen que estos radiofármacos tengan mucha potencialidad. Además el 188Re tiene la ventaja adicional de ser obtenido mediante un sistema generador basado en el par 188Tungsteno/188Renio que permite la elución de soluciones de 188Re-perrenato en el laboratorio y la preparación del radiofármaco a partir de un kit.

Se han desarrollado kits11 para la preparación del radiofármaco, de marcación sencilla y con elevada pureza radioquímica por lo que no se requiere purificación.

El periodo de semidisintegración corto de ambos isótopos del Re (89 hs y 17hs) permite la

administración de altas actividades y la posibilidad de repetir el tratamiento.

En el caso de 186Re-HEDP estudios que involucran 37 pacientes con metástasis derivadas de cáncer de próstata, cáncer de mama y otros tipos, presentaron un 77% de respuesta después de una única dosis de 34mCi (1258 MBq) con una reducción del dolor del 60%12

Se han realizado estudios con 188Re-HEDP13 en una muestra de 21 pacientes mediante administración tanto de dosis únicas como múltiples, con niveles bajos de actividad (35 mCi, 1.3 GBq) o con niveles altos (60 mCi, 2.2 GBq) a fin de estimar la seguridad y confiabilidad en el empleo de estos esquemas. El 78% de los pacientes evidenciaron una disminución del 60% del dolor, si bien no se detectaron diferencias significativas entre quienes recibieron dosis única o múltiple, siendo importante destacar que todos los niveles de dosis fueron bien tolerados. 117mSn-Acido Dietilentriaminopentaacetico ( 117mSn-DTPA)

El 117mSn se produce por una reacción de dispersión elástica neutrónica sobre 117Sn. El 117mSn decae por transición isomérica (159keV) y produce electrones de conversión interna (127 a 129 keV y 152 keV). En función de esas energías bajas y la conversión interna, se estima que la relación de dosis entre hueso y médula ósea es de 9 a 114. Este aspecto es muy útil a fin de minimizar el daño a médula, aportando simultáneamente una alta dosis de radiación a las metástasis. El estudio comparativo de 117mSn-DTPA y 32P-Fosfato en estudios en animales muestra una ventaja terapéutica de 8 a 1 a favor del primero15.

Un estudio clínico que incluye cinco grupos de pacientes tratados con un amplio rango de actividades (71 a 286 uCi/kg; 2.63 a 10.58MBq/kg) muestra un alivio del dolor de 75% en 40 pacientes tratados16. No parece haber una relación dosis-respuesta si bien se alcanza más rápidamente el alivio del dolor con las dosis mayores

xxi

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RADIOFÁRMACOS PARA TUMORES NEUROENDOCRINOS. ANÁLOGO S DE LA SOMATOSTAINA

Marycel Figols de Barboza

1. Introducción

Durante varios años fue un desafío para los oncólogos encontrar un medio potencial o una herramienta simple para identificar, localizar y tratar neoplasmas en humanos en un estado inicial de desarrollo. Durante 20 años los anticuerpos monoclonales se volvieron populares como una arma mágica para ser utilizados en el cáncer, entretanto, esa fascinación y simple principio se tornó difícil para transportar a la realidad tan deseada, principalmente debido a la gran masa molecular ( 150 kDa) de los anticuerpos.

En los últimos años diversos compuestos o drogas basados en anticuerpos monoclonales o fragmentos se tornaron comercialmente disponibles para diagnóstico y terapia del cáncer, en particular de neoplasias hematológicas. En la década del 80, una alternativa en el marcaje de anticuerpos surge en la forma de un pequeño (1.5 kDa) péptido radiomarcado, un análogo de la somatostatina, el cual conduce a un mejor entendimiento del proceso neoplásico. En base al conocimiento de que la mayor parte de los tumores neuroendocrinos expresan una alta densidad de receptores de somatostatina, fue posible desarrollar un método para la localización “in vivo” de esos tumores y sus metástasis, usando una inyección endovenosa de análogos de la somatostatina radiomarcada y realizando centellografías de los referidos receptores.

Los péptidos son compuestos que contienen aminoácidos (ácidos α-amino carboxílicos) unidos por enlaces peptídico, es decir por la unión del carboxilo terminal de un aminoácido y el amino terminal del siguiente. En contraste con las proteínas generalmente no poseen una estructura tri-dimensional bien definida (terciaria). Diseñados por naturaleza para estimular, regular o inhibir numerosas funciones, actúan principalmente como transmisores de información y coordinadores de actividades de varios tejidos en el organismo. Se ha encontrado que tales sustancias están presentes en las células y fluidos del cuerpo en cantidades extremadamente pequeñas; es por ello que los péptidos se consideran como agentes ideales para aplicaciones terapéuticas. Por otro lado los péptidos son moléculas pequeñas y fáciles de sintetizar, y se espera que sean rápidamente depurados de la circulación.

La somatostatina es un péptido (14 amino ácidos) multifuncional, sintetizada en el

hipotálamo y páncreas, actúa como neurotransmisor a nivel del SNC y como hormona, en otros sitios. La somatostatina posee un tiempo de vida media biológica extremadamente pequeño (2-3 minutos). Entre los varios efectos se destacan los inhibitorios: suprime la liberación de hormona del crecimiento por la glándula pituitaria anterior, así como la liberación de otras hormonas a nivel pituitario, pancreático y gastrointestinal; paralelamente, inhibe la proliferación de ciertas células.

Cuando los tejidos que contienen receptores para la somatostatina llegan a ser

cancerígenos, estos receptores están expresados en las células tumorales, Los diversos tipos de cáncer que se derivan de las células neuroendocrinas (pituitaria, tiroides y páncreas) y del sistema nervioso producen niveles elevados de receptores de somatostatina.

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Figura 1. Diversos análogos de la somatostatina

Algunos tipos de tumores, generalmente los del sistema endocrino o neurológicos, pueden expresar una concentración de receptores de somatostatina hasta 1000 veces mayor que las células normales, es por tal motivo que esta molécula posee un alto potencial para su uso en diagnóstico. Los terminales nerviosos que reaccionan ante la somatostatina se localizan en muchas otras áreas. Además de su función como inhibidor de la hormona de crecimiento, tiene un importante efecto central sobre el comportamiento que sugiere una acción depresiva. Prolonga los efectos sedantes e hipnóticos de los barbitúricos, reduce la actividad motora e inhibe la frecuencia de descarga de muchas neuronas en diferentes regiones del cerebro.

El octreótido fue desarrollado como un análogo de la somatostatina para supresión de la hipersecreción que controla los síntomas de enfermedades neuroendocrinas. Estos análogos de somatostatina tienen menor posibilidad de inducir respuesta inmunogénica y poseen receptores muy ávidos en el organismo humano. Aunque el primer trabajo en la obtención de una imagen ”in-vivo” con un análogo de somatostatina surgió en 1976, el desarrollo presenta el inconveniente de la rápida degradación del péptido nativo por las proteasas del plasma y tejido. Por esta razón se han sintetizado varios análogos de somatostatina para prolongar el tiempo de vida media ”in-vivo” e inhibir la acción de las amino y carboxi peptidasas.

xxiv

2. Análogos de la somatostatina (SST)

Los diferentes análogos de la SST proporcionaron una interpretación adicional de los mecanismos internos de la localización. Fue en 1998 que Otto y colaboradores trataron el primer paciente con acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N´,N” ,N”´- tetra acético (DOTA) conjugaado al D-Phe1-Tyr3]Octreotido (DOTATOC) y marcado con Y-90.

El DOTA tiene alta afinidad por In-111 y Y-90 (log KML = 29), La ventaja del DOTA es que

los derivados marcados con In-111 pueden ser usados en diagnóstico para detectar lesiones, pudiendo ser reemplazado por Y-90 o Lu-177 para terapia. El Y-90 no presenta una fuerte ligación al DTPA y puede ser liberado del DTPA “in-vivo”. 111In-DOTATOC puede ser comparado al 111In- Octreoscan teniendo la misma precisión en el diagnóstico y además con una excreción en sangre y tejidos más rápida. Por consiguiente, la sustitución del Phe3 por Tyr3 no interfiere en la unión a los receptores de SST y siendo grupo Tyr3 hidrofílico estimula una excreción renal rápida.

Kwekkeboon (2000) y colaboradores iniciaron el uso de 177Lu-DOTA-Octreotate. El Tyr3-

Octreotate fue sintetizado originalmente como un análogo del Octreotide con un sitio favorable para la radioyodación. El [Tyr3] Octreotate difiere del [Tyr3] Octreotide, en que el carbono terminal del triptófano (Trp) contiene el ácido carboxílico tradicional en lugar del grupo alcohol. Esto permite una mayor capacidad de internalización a las células tumorales y una mayor depuración sanguínea. Sin embargo, la sustitución del aminoácido Phe3 por Tyr3 produjo un incremento en las características hidrófilicas del complejo así como una mayor internalización celular y captación tumoral, por lo que en lugar de su marcado con Yodo se le han acoplado agentes biquelantes como DOTA para posibilitar el marcaje con Y-90, In-111 o Lu-177. El 123I-[ Tyr3]-Octreotide fue un agente de diagnóstico usado con suceso en las centellografías de tumores neuroendocrinos, entretanto, se observaba una liberación de Yodo causando captación de I-123 en hígado e intestino, que son comúnmente sitios de lesiones de origen neuroendócrino, impidiendo su visualización. Otro factor limitante se refiere al costo, por ser producido en ciclotrón, y al corto t1/2 del radioisótopo (13 horas). Las investigaciones que llevaron a conjugar DTPA al péptido posibilitó el marcaje con radioisótopo como el In-111. La principal vía de excreción del 111In-DTPA-Octreotide es la renal en contraste con la del 123I-[ Tyr3]-Octreotide que es la hepatobiliar, debido a la pérdida de Yodo y a una degradación del producto.

Los péptidos conjugados con DOTA, como los análogos estables [DOTA0-Tyr3]Octreotate

(DOTA-tate) y DOTATOC (figura 1) pueden ser marcados con radionucleidos emisores de partículas β- (Lu-177 o Y-90) de modo de ser utilizados con éxito en terapia de receptores positivo de péptido (PRRT). Dichos compuestos presentan una gran afinidad por receptores de somatostatina expresados en los tumores de origen neuroendócrino.

En estudios comparativos en pacientes, entre el 111In-DTPA-Octreotido y el 177Lu-

DOTATATE, ambos tienen “clearence” sanguíneo similar, pero además con una menor excreción renal y una captación 3 – 4 veces mayor en tumores para el 177Lu-DOTATATE, estando correlacionado con la alta afinidad con los receptores SSTR2. La captación en hígado, riñón y bazo son semejantes en ambos compuestos. La dosis absorbida en órganos es generalmente intermediaria entre 111In-DTPA-Octreotido y 177Lu-DOTATATE.

Son reconocidos 5 subtipos de receptores de somatostatina (SSTRs). El péptido posee una

mayor afinidad por la sub-unidad 2 (SSTR2), que por la sub-unidad SSTR3 o SSTR5. Por otra parte no tiene afinidad por la sub-unidad SSTR1 o SSTR4. La somatostatina-14 y somatostatina-28 se unen a todos los receptores con alta afinidad. Los receptores SSTR1-SSTR4 son expresados en diversas líneas celulares cancerígenas del sistema nervioso central (CNS), colon, hígado, páncreas, pulmón, mama y piel.

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3. Métodos de marcaje de biomoléculas 3.1 Métodos Directos

Desde los años setenta, se han reportado en la bibliografía un importante número de artículos con metodologías para el marcado directo e inespecífico de anticuerpos con Tc-99m mediante cambios de pH, buffer, agentes reductores, etc., sin embargo se tenía poco conocimiento del mecanismo del proceso, que se reflejó en la obtención de proteínas marcadas muy inestables. Cuando se emplea 99mTc, se observa un mayor acúmulo de la radiactividad en hígado (formación de coloide), tiroides, estómago e intestino (Tc-99m libre). A partir de 1986 metodologías más específicas y avanzadas fueron desarrolladas.

El método directo para preparación de radioinmunoconjugados generalmente utiliza un

agente reductor para convertir los enlaces disulfuros de una proteína en tioles libres, los cuales son capaces de enlazar al radionucleído eficientemente. Este método es fácil de llevar a cabo, pero se aplica sólo a proteínas o sus fragmentos porque muchos péptidos pequeños no tienen enlaces disulfuro, o en algunos casos éste es altamente crítico para mantener las propiedades biológicas por lo que no puede ser reducido.

La principal ventaja de este método es que pueden producirse formulaciones instantáneas

o “kits”, para facilitar su uso en la práctica clínica sin tener que realizar procesos de purificación “in situ”. 3.2 Métodos Indirectos

En este método, diversos quelantes como el anhídrido bicíclico del DTPA (caDTPA), hidrazinonicotinamida (HYNIC), benzoil MAG3 o DOTA , entre otros, conjugados a análogos de la somatostatina auxilian en la marcación con diferentes radionucleídos: 99m Tc , 111 In, 153Sm , 177Lu, 188 Re o 90Y.

En los métodos indirectos que se utiliza un Agente Quelante Bifuncional (AQB) que se

conjuga al péptido o AcMo, permite el marcaje con radionucleídos metálicos. Los iones metálicos radiactivos tienen que unirse al péptido a través de grupos quelantes que poseen una adecuada estereoquímica para unir el radio metal y por un enlace covalente, a un grupo funcional de los aminoácidos del péptido o del AcMo. Los AQB por lo general son ácidos poliaminocarboxílicos con un anhídrido cíclico, a un grupo bromo-acetil o isotiocianato. En la mayoría de los casos, el AQB se une a los grupos amino de los residuos de lisina. La eficiencia en la quelación es dependiente de la concentración del agente quelante. Los ligantes macro-cíclicos como DOTA o TETA, requieren que la concentración del metal sea dos veces mayor cuando se trata de Sm-153 o Lu-177. Con Y-90 la concentración del metal debe ser tres veces más para obtener una eficiencia en la quelación con estos ligantes macro cíclicos. En contraste con los ligantes acíclicos como DTPA, TMT-amina o nitro-CHX-A-DTPA, la reacción con el metal puede ser 1:1.

La optimización en la eficiencia de la conjugación también es dependiente del tiempo que

dura la quelación. Los agentes quelantes macro-cíclicos son lentos para adoptar la conformación de menor energía necesaria para la quelación de lantánidos, lo cual se refleja en el aumento del tiempo de reacción necesaria para obtener un mayor rendimiento, en contraste con los quelantes acíclicos que no poseen una conformación forzada para acomplejar los lantánidos. En general estos ligantes tienen una gran habilidad para coordinarse fuertemente, en medio acuoso y a temperatura ambiente ó mayores, con todos los iones metálicos. El reconocimiento selectivo del sustrato, la formación de compuestos estables, la capacidad de transporte y la catálisis son ejemplos del intervalo amplio de la aplicación de las propiedades de las moléculas macro cíclicas.

Marcación del péptido DOTA-Octreotate con Lutecio-1 77

Existen una serie de factores biológicos que dictan la necesidad de una actividad

específica elevada en los DOTA-péptido marcados con Lu-177 / Y-90. Primeramente, para uso “in vivo”, la cantidad del radio-ligante que debe ser administrado está limitado por la afinidad y

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cantidad de los receptores; un incremento en el ligante debe aumentar la competición entre el material marcado y no-marcado por un mismo receptor y consecuentemente una baja captación en el tejido receptor-positivo se observa. Segundo, para péptidos que presentan un efecto farmacológico como la sustancia P, Bombesina, incluyendo sus análogos-DOTA, cantidades pequeñas de péptido son toleradas. La cantidad de algún péptido que puede ser administrada i.v. esta limitada a 0,2 – 0,5 nmol por minuto y tercero, el mecanismo de internalización puede estar afectado o comprometido en alta concentración del péptido.

El 177Lu es un radioisótopo producido en reactor, conforme la reacción nuclear:

176Lu (n, y)177Lu, con un t1/2 = 6,71 días, disuelto en HCl 0,01 – 0,1N. En una marcación es importante considerar la actividad específica del radionucleído, conservando siempre la relación molar entre el péptido / radioisótopo = 2,1. El péptido disuelto en buffer acetato de sodio 50mM, pH 4,5, contiene acido ascórbico (25Mm final) y gentísico (50Mm final) como estabilizador de la reacción y una solución de DTPA para ligar el Lu-177 libre liberado en la reacción.

Diversos estudios fueron realizados para determinar las condiciones óptimas de marcación

de DOTA-TATE y DOTATOC usando e Y-90 y Lu-177. La cinética de la reacción con Lu-177 e Y-90 es adecuada en pH = 4 – 4,5, la que disminuye a mayor pH. Entretanto, el rendimiento de incorporación a pH ≥ 4,5 no es eficiente, observando un precipitado en el frasco de reacción. La cinética de reacción es tiempo / temperatura dependiente. La reacción con Y-90 y Lu-177 está completa después de 20 minutos a 80º C, con una actividad específica alta utilizando la proporción (mol/mol) DOTA/radionucleído de 2,1, para el Lu-177. El rendimiento de marcación es mayor a 98% y la pureza radioquímica mayor a 99% a temperatura ambiente. Cabe resaltar que iones Hf4 y Zn4, proveniente del decaimiento del Lu-177 y Y-90, respectivamente, no interfieren en el marcaje. Entretanto, la adición de iones de Fe y Cd actúa como competidores en la reacción. Los péptido-DOTA son disueltos en acido acético 0,01 – 0,15M con agua Milli-Q, para evitar contaminantes en el proceso.

En la conmemoración de los 100 años de la Medicina Nuclear, Henry Wagner Jr., apuntó al uso de los péptidos radiomarcados en la oncología nuclear como un medio preemisor en las décadas siguientes y en la necesidad de un mejor conocimiento de sus aplicaciones clínicas, en particular sobre el papel de los receptores, expresión en los tejidos y el potencial en la aplicación clínica en el tratamiento y diagnóstico del cáncer.

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ANTICUERPOS MONOCLONALES Y DERIVADOS PARA TERAPIA

Jose Crudo

1. Anticuerpos monoclonales para terapia

En el pasado reciente la aplicación clínica de anticuerpos monoclonales (AcMo) estaba limitada por la disponibilidad única de AcMos de origen murino que generaban una respuesta HAMA (Human Anti Mouse Antibody) y por lo tanto restringían la terapia a una única aplicación. Posteriormente con el advenimiento de nuevas tecnologías de producción se popularizaron los anticuerpos quiméricos que poseían la región hipervariable murina (aprox. 5 % de todo el Ac) y el resto humano. Hoy es posible acceder a AcMos humanizados que no presentan ningún tipo de reacción cruzada y que pueden administrarse reiteradamente.

Actualmente se observa el surgimiento de los AcMo para terapia biológica en el tratamiento oncológico en algunos casos en primera línea de tratamiento y en combinación con agentes quimioterápicos. Especialmente la combinación de agentes biológicos y quimioterápicos es objeto de innumerables estudios clínicos que muestran un aumento de sobrevida libre de progresión y un alto porcentaje de remisión completa y parcial.

Entre éstos AcMo no marcados ya aprobados por la FDA (Food and Drug Administration, USA) podemos mencionar varios grupos clasificados según el blanco contra el cual están dirgidos: I) Contra antígenos específicos asociados a tumor: Se encuentra Rituximab, un AcMo anti CD20 (murino) para el tratamiento de linfoma No Hodgking. Trastuzumab AcMo (humanizado) indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico con hiper expresión de la proteína HER2, bloquea específicamente la función de HER2 producida por un gen con potencial cancerígeno. II) Contra receptores específicos sobre expresados en la membrana de células tumorales: Pertenecen a este grupo Cetuximab (IgG1 quimérico) para cáncer de cabeza y cuello localmente avanzado y colorectal, que también estimula al sistema inmune actuando por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Estudios preclínicos muestran efecto sinérgico cuando se combina con radioterapia. Además con Cetuximab se produce endocitocis del complejo receptor-Ac, lo cual favorece una potencial aplicación del Ac previamente radiomarcado con emisores beta negativos. Panitumumab (IgG2, humanizado) para tratamiento de segunda línea del cáncer colorectal metastásico. Estos dos últimos AcMos se unen con alta afinidad al dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) bloqueando la señalización tumoral e interfiriendo la proliferación celular, metástasis y angiogénesis. III) Contra factores de crecimiento presentes en sangre: La FDA aprueba Bevacizumab para el tratamiento del cáncer colorrectal El cáncer colorrectal es el tipo de cáncer más común en los países desarrollados. Bevacizumab es el primer agente anticancerígeno con eficacia probada en la inhibición del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que limita el crecimiento y la extensión del cáncer de una parte del organismo a otras (metástasis). Dado que este mecanismo de acción podría ser relevante en numerosos tumores sólidos, Roche y Genetech están investigando en la actualidad la eficacia del fármaco en otros tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, de páncreas, de mama y el adenocarcinoma renal. Asimismo se están llevando a cabo importantes ensayos clínicos en pacientes que tienen cáncer colorrectal no metastásico (terapia adyuvante). Siguiendo la clasificación anterior, entre los AcMo radiomarcados de uso potencial en radioinmunoterapia (RIT) podemos mencionar: I) Contra CD20, 131I tositumomab (Bexxar) y 90Y-Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin) que es de origen murino y cuyo BFCA es [N-[2-bis(carboxymethyl) amino]-3-(p-isothiocyanatophenyl)-propyl]-[N-[2-bis(carboxymethyl)amino]-2-(methyl)-ethyl]glycine. Estos AcMos radiomarcados

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aprobados por la FDA para el tratamiento de linfoma No Hodgking, son los primeros que han alcanzado un tratamiento exitoso probablemente a causa de que en las leucemias y linfomas los tumores son radiosensitivos y las células cancerosas están relativamente accesibles. Existe una serie de AcMos humanizados radiomarcados con 90Y que se encuentran en ensayos clínicos de Fase I en USA, a saber: hPAM4 (anti-MUC1 humanizado) para cáncer de páncreas, hAFP (anti-AFP humanizado) para cáncer primario de hígado, Epratuzumab (anti-CD-22 humanizado) para LNH indolente y agresivo y Labetuzumab (anti-CEA humanizado) para tumores sólidos metastáticos inoperables. Estos otros AcMo radiomarcados no han recibido la aprobación por la FDA pero han sido estudiados en distintas fases: 90Y- CITC-DTPA-Pentumomab (Theragyn) es un AcMo que se une a las proteínas MUC1 de la superficie de las células cancerosas de ovario y se encuentra en estudios de fase 3. 90Y-huHMFG1 es un anti MCU1 estudiado para terapia de tumores de mama, a través del estudio multicéntrico SMART (Study of Monoclonal Antibody Radioimmuno-Therapy) 186Re- Bivatuzumab•90Y-bencil-DTPA-BC2 para tratamiento locoregional de glioblastoma 0.54 Gy/ MBq de Y-90 con dosis escalonadas de 185-370-555-740-925 MBq (Riva et al, 1998) 186Re-mAbU36 (quimérico) fue desestimado dado que en los estudios de fase 1, produjo anti-anticuerpos en 5 de 12 pacientes. (Colnot et al, 2000) 90Y-muBC1(AngioMab) para glioblastoma multiforme (estudio clínico en fase 1, testeo de seguridad y tolerabilidad). Es un anticuerpo que interrumpe el proceso de angiogénesis por unión a la fibronectina. 186Re-MAG3-Bivatuzumab (AcMo humanizado anti CD44v6) para Squamous Cell Carcinoma de cabeza y cuello (HNSCC). Estudio de fase 1. (Postema et al, 2003) Estudios preclínicos y comparación de cG250 (anticuerpo monoclonal quimérico anti G250 contra cáncer renal) marcado con 131I, 90Y, 177Lu y 186Re. (Brouwers et al, 2003, Journal of Nuclear Medicine) 2. Derivados para terapia

La RIT de tumores sólidos con AcMo radiomarcados está limitada por la farmacocinética lenta y una baja relación tumor / tejido sano. Con el objeto de mejorar su performance, se

desarrolló el sistema RIT de 3 pasos o PAGRIT® (Pretargeted Antibody-Guided Radioimmunotherapy, Sigma-tau, Milán), un approach terapéutico antitumoral basado en el pretargeting con el sistema avidina/ biotina (i), que emplea DOTA-biotina radiomarcada con 90Y (T ½ 64.1 h, Eβ- 2.3 MeV) y AcMo-biotinado, administrados separadamente de acuerdo al siguiente esquema:

1er día AcMo biotinado específico para el antígeno que expresa la lesión que se desea tratar. 2do día Avidina (PM 65.000), que es una proteína tetramérica altamente glicosilada y cargada positivamente (cada una de cuyas subunidades se une a una biotina) que muestra una afinidad por biotina extremadamente elevada (Ka = 10 15 M-1) 3er día Conjugado 90Y-DOTA-biotina (vía intravenosa o locoregional por un catéter colocado en la cavidad quirúrgica resecada). De esta forma se disocia el reconocimiento y la unión del AcMo al tumor, del transporte del emisor β- que es realizado por la biotina, una molécula pequeña (PM 244), que permite la administración de altas dosis de 90Y (Ai de 3.33 GBq) en forma segura sin producir radiotoxicidad en médula ósea. Esta técnica mejora significativamente la relación tumor / fondo amplificando la dosis entregada al tumor (ya que por cada molécula de avidina se unen cuatro de biotina) y

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disminuyendo la dosis en órganos no blanco debido a la rápida farmacocinética de la biotina radiomarcada. Actualmente son tratados por PAGRIT® varios tipos de tumores entre los cuales se incluyen carcinomas metastásicos (ii), melanoma y tumores neuroendócrinos (iii) pero el blanco mas explotado lo constituye la molécula de matriz extracelular tenascina sobre expresada en gliomas de alto grado. Dentro de este esquema han sido empleados 90 Y-DOTA-Biotina (NeoRx Corp., USA) junto con el AcMo BC4-biotinado (antitenascina) para tratamiento locoregional de gliomas con dosis de 550 a 1110 MBq (30 mCi) por ciclo. (Paganelli et al, 2001).

Un nuevo derivado de biotina conjugado con DOTA llamado r-BHD (reduced biotinamidohexylamine-DOTA) estable contra la degradación enzimática y que retiene una alta afinidad por la avidina fue radiomarcado con 90Y y 177Lu y evaluado en estudios pre-clínicos y en un estudio clínico piloto en pacientes con melanoma metastático. Otra terapia basada en el sistema avidina / biotina radiomarcada (iv), que se está ensayando clínicamente en el tratamiento de cáncer de vejiga se denomina BIART® (la sigla inicial proviene de Bladder Intra Arterial Radio Therapy). En la mayoría de los casos, este tipo de cáncer se presenta en forma superficial pudiendo ser tratado por administración intravesical de avidina y biotina radiomarcada que se acumula selectivamente en el tejido tumoral respecto del urotelio normal. En el área de investigación varios autores han propuesto el uso potencial de derivados de biotina marcados con 188Re pero se ha observado en muchos de ellos menor estabilidad in vitro y una eliminación hepatobiliar, con lo cual estos productos solo serían aplicables bajo un esquema de administración locoregional. Referencias 1 G. Paganelli, P. Riva, G. Delcide et al, Int. J. Cancer Suppl., 1988, 2, 121 1 Goldenberg DM. J Nucl Med 2002; 43: 693-713. 1 Paganelli G et al. Tumor targeting 1998, 3: 96-104. 1 Grana C et al. Tumor targeting 1996,2: 230-239.

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RADIOINMUNOTERAPIA DEL LINFOMA NO HODGKIN

Carlos Oscar Cañellas

1. Características de la enfermedad Los linfomas no Hodgkin (LNH) son un grupo heterogéneo de trastornos linfo-proliferativos que van desde enfermedades malignas indolentes, predominantemente foliculares hasta linfomas altamente agresivos. La clasificación del LNH ha sido modificada varias veces durante las décadas pasadas; muchas de las primeras clasificaciones estaban basadas solamente en la morfología (1) mientras que otras lo estaban en la respuesta al tratamiento y la sobrevida (2); otros sistemas de clasificación se basaron, principalmente, en el linaje celular y la diferenciación, en la creencia de que cada neoplasia correspondía a una célula normal o estado de diferenciación reconocible (3). El mayor conocimiento sobre la biología del LNH ha dado como resultado nuevos abordajes en la clasificación; así surge la Clasificación Revisada Americana-Europea de Neoplasias Linfoides desarrollada por el Grupo Internacional para el Estudio del Linfoma en el cual las entidades nosológicas están definidas por morfología, inmunofenotipo, características genéticas y evaluaciones clíni-cas. El proceso de estadiaje para los LNH requiere la realización de una historia rigurosa en la cual se evalúen los síntomas sistémicos tales como fiebre, perdida de peso y sudoración nocturna; el examen físico incluye la medida del aumento de tamaño de los ganglios linfáticos, hígado y/o bazo y la identificación de cualquier sitio de enfermedad extraganglionar. Se realiza una biopsia de médula ósea junto con una tomografía computarizada (TAC) y/o resonancia magnética nuclear (RMN) de tórax y abdomen y/o estudios con radioisótopos (SPECT). En este proceso debe incluirse el inmunofenotipo de la sangre y médula ósea así como la cuantificación de la enzima deshidrogenada láctica sérica y la determinación de paraproteínas en suero. 2. Revisión de los Tratamientos para LNH El tratamiento de los LNH se basa en la histología tumoral, extensión de la enfermedad o estadio y factores relacionados con el paciente como edad, estado funcional y la presencia de otras enfermedades subyacentes. Ya sea un LNH indolente o agresivo los criterios de respuesta son:

I. Respuesta completa (RC) II. Respuesta completa no confirmada (RCnc)

III. Respuesta parcial (RP) IV. Enfermedad estable (EE) V. Enfermedad progresiva (EP)

Algunos modelos terapéuticos para el tratamiento de LNH recomiendan retrasar su abordaje hasta la aparición de síntomas para limitar la toxicidad y resistencia inducida por la quimioterapia y para preservar la calidad de vida; a este procedimiento se lo denomina “vigilar y esperar”. Por su lado las “quimioterapias” tradicionales han variado desde el uso de agentes únicos, tales como el clorambucil o ciclofosfamida, a combinaciones tales como la de ciclofosfamida/vincristina/prednisona (CVP) o a otros aún más agresivos como la ciclofosfamida/vincristina/doxorrubicina/prednisona (CHOP); sin embargo ninguno de estos tratamientos ha producido una clara prolongación de la sobrevida (4). En el tratamiento de LNH se han introducido recientemente dos tipos diferentes de agentes terapéuticos: interferones y análogos de las purinas . El uso de interferón-α con quimioterapia combinada incrementó la tasa de sobrevida de los pacientes de un 69 a un 86%. Por su lado el uso de fludarabina y 2-clorodeoxiadenosina, derivados de purinas, resultaron muy satisfactorios.

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Para el tratamiento de LNH con mal pronóstico se han usado abordajes más agresivos tales como altas dosis de quimioterapia con trasplante autólogo de médula ósea y más recientemente los trasplantes alogénicos no mieloablativos, también conocidos como mini-alo-trasplantes en el cual el esquema de acondicionamiento se basa en el uso de fludarabina como inmunosupresor para permitir el injerto de células de médula. Ante todo lo expuesto surge que existe una necesidad clara para el tratamiento terapéutico de los LNH que sea más específico para el tumor y menos tóxico para los tejidos sanos. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de superficie específicos del tumor se han erigido como una alternativa válida en los últimos años y ya ha transformado el modelo del tratamiento para estos pacientes; la mayoría de los anticuerpos se han dirigido contra el antígeno CD20. 3. Radioinmunoterapia Implica la administración de anticuerpos monoclonales radiomarcados que ejercen su acción en la superficie de las células tumorales minimizando, por lo tanto, la toxicidad en las células normales sanas (5, 6). Esta técnica difiere de la radioterapia convencional en que esta involucra dosis relativamente altas de radiación en forma intermitente por periodos cortos de tiempo, mientras que en la radioinmunoterapia la dosis máxima es relativamente menor pero la radiación se administra continuamente con una tasa que disminuye exponencialmente durante la vida media de radionucleido. Para esta técnica el antígeno de diferenciación CD20 de los linfocitos B representa un factor diana muy atractivo dado que:

a. se expresa en el 90% de los tumores de células B. b. está presente exclusivamente en células B maduras y en la mayoría de los linfomas de

células B. c. no se encuentra en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células plasmáticas

normales ni otros tejidos normales no linfoides. d. no circula como proteína libre que pudiera desplazar a los anticuerpos anti-CD20 de su

diana celular. e. no se desprende de la superficie celular sobre la que se fija el anti-CD20. f. no se produce internalización y subsecuente inhibición con la fijación del anti-CD20.

Comúnmente se utilizan radioisótopos tales como el iodo-131 (131I) el cual posee como ventajas su disponibilidad, relativo bajo costo y facilidad de conjugación con los anticuerpos pero posee inconvenientes tales como la liberación de radiación gamma de alta energía, la metabolización del iodo-131 que se une a la tirosina plasmática y la necesidad de blindajes de plomo. El uso de radioisótopos emisores de radiación β de alta penetración en los tejidos y de muy baja dosimetria necesitó el desarrollo químico de grupos quelantes específicos tales como el DTPA y el EDTA (7,8) y sus derivados que no comprometían la especificidad del anticuerpo ni alteraban su metabolismo permitiendo una alta relación tumor/no tumor. Entre los derivados del DTPA existe el MX-DTPA o tiuxetan un derivado isotiocianatobenzil del DTPA que se desarrolló con dos premisas básicas: no alterar el metabolismo de los anticuerpos ni comprometer su especificidad al ser conjugados con soluciones de cloruro de itrio (90Y) (9). La comparación de este agente quelante con el derivado ciclo anhidro del DTPA demostró que el tiuxetan tiene un grado de conjugación con el (90Y) que permite una mayor relación tumor/no-tumor así como un mayor tiempo de retención in vivo (10, 11). El desarrollo del ibritumomab, anticuerpo monoclonal derivado de una IgG1 kappa de células ováricas de hámster chino que reconoce específicamente al antígeno CD20 (12), permitió que al unirlo covalentemente al tiuxetan se lograba quelar al (90Y). Durante los estudios preclínicos el ibritumomab-tiuxetan fue marcado con (90Y) e (111In) y se demostró su alta estabilidad radioquímica, superior al 95% durante 8 horas. (13) en una solución buffer fosfato con albúmina humana. El ibritumomab-tiuxetan marcado con (90Y) e (111In), como ya se indicó, se dirige específicamente al antígeno de diferenciación específico de linfocitos Bp35 una proteína hidrofóbica transmembrana con un peso molecular de, aproximadamente, 35 KD y que se encuentra localizada en la superficie de los linfocitos B normales y malignos (14, 15). El CD20

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se expresa inicialmente en los linfoblastos B (células pre-B) y continúa expresándose a lo largo de varios estadios e maduración de las células B hasta su diferenciación a células plasmáticas donde la expresión de CD20 desaparece. El CD20 no se desprende de la superficie celular y no se internaliza con la fijación del anticuerpo (16). El anticuerpo conjugado posee una constante de afinidad aparente para el antígeno CD20 de aproximadamente 17 nM sin reactividad cruzada con otros leucocitos ni con otro tipo de tejidos humanos. Las dosis de ibritumomab-tiuxetan (90Y) recomendadas para pacientes con >150.000 plaquetas/mm3 es de 15 MBq (0.4 mCi)/kg hasta un máximo de 1200 MBq (32 mCi). Las dosis recomendadas para pacientes con trombocitopenia leve (100.000 a 150.000 plaquetas/mm3) es de 11 MBq (0.3 mCi) de ibritumomab-tiuxetan (90Y)/kg hasta un máximo de 1200 MBq (32 mCi). El esquema de dosis consiste en dos dosis intravenosas de anticuerpo monoclonal no conjugado ni radiomarcado seguida por una única dosis de ibritumomab-tiuxetan (90Y) en el siguiente orden: día 1 : una infusión intravenosa de anticuerpo monoclonal no conjugado ni radiomarcado (250 mg/m2); día 8: una infusión intravenosa de anticuerpo monoclonal no conjugado ni radiomarcado (250 mg/m2) seguida de una dosis de ibritumomab-tiuxetan (90Y); pueden pasar hasta cuatro horas entre la administración del anticuerpo monoclonal frío y el radiomarcado.

No se puede realizar el tratamiento en pacientes que:

a. presenten infiltración de la médula ósea por células de linfoma en una proporción mayor al 25%. b. hayan sido tratados previamente con radioterapia externa en más del 25% de la médula ósea activa. c. presenten un recuento de plaquetas < 100.000/mm3 o con recuento de neutrófilos < 1.500/mm3. d. hayan sido sometidos previamente a transplante de médula ósea o con tratamiento de soporte con células madre hematopoyéticas.

Una vez realizado el tratamiento los estudios farmacocinéticas demostraron que el promedio de vida media efectiva de ibritumomab-tiuxetan (90Y) en el compartimiento sanguíneo es de 28 horas mientras que la excreción del 5.8 al 11.5% de la dosis inyectada a las 24 horas. La dosis mayor después de la administración de ibritumomab-tiuxetan (90Y) fue para el bazo (742 cGy) pero las dosis en tumores son extremadamente mayores con relaciones que superan los 3.3:1 para hígado y 64:1 para riñones. Todo esto sumado a las características físico químicas del (90Y); emisión de radiación β de alta energía, vida media de 2.67 días y penetración de la radiación β en los tejidos de 5.3 mm nos pone en presencia de un agente de terapia con características que se aproximan a las ideales para realizar estos tratamientos. Referencias 1. Gall E.A, Mallory T.B. Malignant lymphoma. A clinicopathologic survey of 618 cases. Am. J.

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USO DEL ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANIZADO NIMOTUZUMA B (H-R3) EN EL TRATAMIENTO DE PACIENTES PORTADORES DE GLIOMAS

DE ALTO GRADO DE MALIGNIDAD

Tania Crombet Ramos - Angel Casacó Parada

La incidencia anual internacional para los tumores intracraneales primarios varía según las

fuentes y series pero como promedio es de 4.2 y 12.8 por 100 000 habitantes (SEER, 1995). Los tumores del sistema nervioso central constituyen el segundo tipo de cáncer más común y la segunda causa de muerte en niños (Cancer Statistics, 2004). En general, en las dos terceras partes de los casos, los tumores se clasifican como glioblastomas.

A pesar de los avances en la neurocirugía, la radioterapia y la quimioterapia, se ha obtenido un limitado progreso en el tratamiento de los pacientes con gliomas de alto grado de malignidad. Se estima que en más del 95 % de los casos después del tratamiento de primera línea invariablemente ocurrirá una recurrencia del tumor en el área adyacente a la resección del mismo (Grossman S et al, 1998, Giese A et al, 2003, Stewart LA et al, 2002).

El tratamiento de primera línea para los tumores astrocíticos malignos consiste en la cirugía seguida de tratamiento radiante convencional (50-60Gy) (NCI, 2004). La sobrevida histórica de los pacientes portadores de tumores astrocíticos persistentes o recidivantes es de aproximadamente 6 meses y poco menos del 10 % de los pacientes sobrevive por 2 años (Wersall P. et al, 1997).

Han sido identificados una serie de factores pronósticos que afectan de forma invariable el tiempo de sobrevida de los pacientes portadores de tumores astrocíticos malignos (Perry JR et al, 2003). El tipo histológico del tumor es la variable más importante con relación al pronóstico en estos tumores, y se conoce que los pacientes portadores de tumores astrocíticos anaplásicos tienen relativamente mejor pronóstico que los glioblastomas multiformes. La edad al momento del diagnóstico es un poderoso predictor del comportamiento de la enfermedad, encontrándose mejor pronóstico en aquellos pacientes menores de 40 años con algunas excepciones de tumores de la niñez que presentan un pronóstico pobre.

El grado de resección del tumor esta directamente correlacionado con el pronóstico de la enfermedad así como el estado neurológico funcional (Índice de Karnosfsky) al momento del diagnóstico. Todos estos factores pronósticos deben utilizarse invariablemente como variables de control en cualquier estudio clínico para determinar la eficacia de un nuevo tratamiento en la sobrevida de los pacientes portadores de astrocitomas malignos ((Perry JR et al, 2003). En tumores humanos se han encontrado altos niveles de factores de crecimiento y sus receptores (Mendelsohn J et al, 2003; Libermann TA et al, 1994). En el caso de los tumores cerebrales primarios, se han identificado aberraciones en algunas vías de transducción de señales que juegan un rol fundamental en la patogénesis molecular (Tremont-Lukats et al, 2003; Yang L et al, 2003).

Los tumores astrocíticos se caracterizan por la sobre-expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico, EGF-R (FeldKamp MM et al, 1997, Steck PA et al, 1988; Van der Valk P et al, 1997). En los meningiomas también se han encontrado altas concentraciones de este receptor (Ragel B et al, 2003). La expresión del EGF-R parece incrementarse con el grado de malignidad. Un subset de glioblastomas multiformes expresa una variante de receptor truncada, que posee actividad constitutiva, independiente del ligando (Feldkamp MM et al, 1999; Lorimer IA et al, 2002). Por el contrario, el receptor no se expresa en el tejido cerebral normal (FeldKamp MM et al, 1997).

En los tumores primarios de cualquier localización, la sobre expresión de EGF-R se ha asociado con mal pronóstico debido a ventajas de crecimiento e incremento de invasividad (Khoshiomn S et al, 1999, Laerum OD et al, 2001). Adicionalmente se ha propuesto que oncogenes como el EGF-R pueden contribuir indirectamente al crecimiento tumoral, al facilitar la angiogénesis tras inducir la expresión de factores pro-angiogénicos como el factor de crecimiento del endotelio vascular (Kerbel RS et al, 1998; Kerbel RS et al, 2000).

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El Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) es una molécula polipeptídica de 53

aminoácidos, de peso molecular 6,045 Kd, aislada por primera vez de glándula submaxilar de ratón (Cohen S et al, 1975). Posteriormente se obtuvo una molécula similar aislada de orina humana (Stocheck CM et al, 1984, Gray A et al, 1983).

El EGF-R es una glicoproteína de membrana de 170 Kd. (Ullrich. A et al, 1990, Pérez R et al, 1994;) cuyo dominio intracelular está asociado a actividad proteína quinasa tirosina específica, y presenta homología estructural con el producto del oncogen v-erb-B, evidencia que sugiere su relación con el proceso de transformación maligna. El EGF y su receptor, constituyen un complejo molecular de alta especificidad cuya interacción desencadena importantes mecanismos de regulación del crecimiento celular, demostrándose que es capaz de provocar estimulación sobre el crecimiento de líneas celulares de tumores dependientes de EGF (Schellinger J et al, 1990).

El gen del EGF-R se encuentra amplificado y/o sobre-expresado en los carcinomas epidermoides humanos (Santon JB et al, 1986; Filmus J), lo que al parecer ofrece ventajas de crecimiento a estas células. Por otra parte, estudios bioquímicos e histológicos de biopsias de tumores humanos han demostrado la sobre-expresión del EGF-R en diferentes neoplasias humanas, incluyendo tumores cerebrales neuroepiteliales, mama, vejiga, riñón, ovario, pulmón, páncreas, entre otros (Mendelsohn J. et al, 2002; Herbst RS et al, 2002).

En el Centro de Inmunología Molecular se generó un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal murino que reconoce al EGF-R con alta afinidad y que es capaz de inhibir la unión del EGF a su receptor en un ensayo de competencia (Fernández A et al, 1992). El AcM inhibió la proliferación de líneas tumorales con alta expresión de EGF-R en cultivo y en ratones xenotrasplantados, constatándose evidencias de actividad antitumoral. El AcM murino ior egf/r3 se utilizó en 6 Ensayos Clínicos precedentes. En los ensayos clínicos terapéuticos se incluyeron 58 pacientes con enfermedad neoplásica avanzada.

En el ensayo clínico terapéutico Fase I con el AcM murino ior egf/r3 se trataron 18 pacientes portadores de tumores de pulmón y sistema digestivo y se escalaron 6 niveles de dosis desde 200 mg hasta 2.0 g, no presentándose ninguna reacción adversa severa ni muy severa según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Crombet T el at, 2001).

En el ensayo Fase I realizado en pacientes con tumores cerebrales, se incluyeron 8 pacientes portadores de tumores astrocíticos de alto grado de malignidad y un paciente portador de un meningioma. Todos los pacientes habían concluido la terapia oncoespecífica consistente en cirugía más radioterapia. Tras la administración de 4 dosis del AcM ior egf/r3 se constató incremento de sobrevida y aumento del tiempo de estabilidad. Seis meses después de la administración del AcM, 8 pacientes de los 9 mantenían enfermedad estable y 1 año después, 4 pacientes se mantenían con estabilización. La mediana de sobrevida en estos pacientes fue de 16 meses. Cuatro años después del tratamiento con el AcM ior egf/r3, 2 pacientes se mantenían vivos. En este ensayo se constató una reacción alérgica muy severa (shock anafiláctico) en una paciente que había recibido 2 dosis anteriores del ior egf/r3 con intención diagnóstica (Crombet T et al, 2001).

Con el objetivo de incrementar la eficacia terapéutica y disminuir la toxicidad asociada al AcM murino ior egf/r3 se procedió a la humanización del anticuerpo. La humanización de anticuerpos permite combinar las regiones hipervariables de anticuerpo murino con el marco de soporte de una inmunoglobulina humana y de esta forma fusionar la regiones de origen murino que reconocen con alta especificidad al antígeno con las cadenas pesadas de un anticuerpo humano necesarias para su efectividad biológica. El anticuerpo nimotuzumab (h-R3) humanizado se obtuvo mediante clonaje a partir de la región variable del DNA obtenido del hibridoma murino ior egf/r3. El anticuerpo nimotuzumab (h-R3) que reconoce al receptor del EGF con similar afinidad que su predecesor murino (10 -9 M) contiene las regiones hipervariables (CDRs) de origen murino (ior egf/r3) y los marcos de las regiones variables y de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de origen humano (REI y NEWN respectivamente) (Mateo C et al, 1997).

Para estudiar la inmunogenicidad de los anticuerpos se inmunizaron 2 monos Cercopithecus Aethiops con las inmunoglobulinas murina y humana. Con el anticuerpo ior egf/r3 murino se obtuvo una alta respuesta MAMA (Monkey Antimouse Antibodies) en los monos, sin embargo con el nimotuzumab (h-R3) la respuesta no fue medible después de 2 inmunizaciones y se

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obtuvieron bajos títulos después de 4 administraciones subcutáneas del anticuerpo acoplado a adyuvante (Mateo C et al, 1997). En experimentos realizados in vitro con la línea celular de cáncer de pulmón H-125 se demostró que el nimotuzumab (h-R3) era capaz de mediar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (Actividad ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

En Cuba y en Canadá se han realizado varios ensayos clínicos con el AcM nimotuzumab (h-R3). El ensayo clínico fase I se realizó en 12 pacientes portadores de tumores epiteliales en estadios avanzados que habían concluido el tratamiento oncoespecífico al menos cuatro semanas antes de la inclusión (Crombet T et al, 2003). El anticuerpo humanizado nimotuzumab (h-R3) demostró ser seguro. Siete de los 12 pacientes presentaron eventos adversos consistentes fundamentalmente en temblores, fiebre, náuseas, vómitos y sequedad bucal. En todos los casos los eventos adversos fueron leves o moderados de acuerdo a la clasificación de la OMS y fueron totalmente reversibles. No se encontró relación entre el nivel de dosis y la aparición de eventos adversos (Crombet T et al, 2003).

El análisis de la Biodistribución evidenció la existencia de 5 órganos en los cuales se acumuló el anticuerpo monoclonal nimotuzumab (h-R3) en las 4 dosis estudiadas. Los órganos fuente fueron los siguientes: corazón, hígado, riñones, bazo y vejiga urinaria (Figura 1).

Figura 1: Imágenes seriadas de cuerpo entero (anterior y posterior) obtenidas 1, 3, 5 y 24 hrs tras la infusión del AcM marcado con Tc99 en una paciente portadora de un tumor de ovario y

múltiples lesiones metastásicas hepáticas. Se observa acumulación del radiofármaco en hígado, pool vascular, riñones, vejiga y bazo.

La actividad se acumuló rápidamente en hígado, alcanzando un pico en los primeros tiempos estudiados. Los porcientos de absorción del anticuerpo monoclonal disminuyeron en el tiempo para todos los órganos fuente, excepto para los riñones, la vejiga y el tracto gastro intestinal, ya que los sistemas urinario y digestivo constituyen las vias de excreción del producto, a través de la orina y las heces fecales (Crombet T et al, 2003).

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Se realizó el análisis fármacocinético en 10 pacientes que recibieron infusiones entre 50 y 400 mg. Los datos de farmacocinética sugieren que el nimotuzumab (h-R3) presenta un comportamiento farmacocinético no lineal entre las dosis de 50 y 200 mg. A valores crecientes del producto se obtiene un incremento del tiempo de vida medio de distribución, de eliminación y del volumen de distribución (Crombet T et al, 2003). En ningún paciente se constató respuesta inmune anti-idiotípica contra el AcM humanizado tras 1 sola administración en dosis entre 50 y 400 mg del nimotuzumab (h-R3) (Crombet T et al, 2004).

En el ensayo fase I/II realizado en Cuba en el INOR, se incluyeron 24 pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello de origen epitelial. Este estudio fue diseñado para evaluar la seguridad del AcM nimotuzumab (h-R3) utilizado a múltiples dosis en combinación con radioterapia y la respuesta clínica, así como los potenciales mecanismos de efecto antitumoral en biopsias pareadas de los pacientes. En este estudio, se incluyeron los pacientes de forma secuencial formando grupos de a tres. Cada paciente recibió seis administraciones del anticuerpo a su nivel de dosis correspondiente en combinación con 60 Gy de radioterapia (Crombet T et al, 2004). La sobrevida global aumentó considerablemente con las dosis de 200 y 400 mg en comparación con dosis más bajas. La mediana de sobrevida de los pacientes tratados con dosis del AcM hR3 de 50 y 100 mg fue de 8.60 meses, mientras que la mediana de sobrevida de los pacientes tratados con el AcM nimotuzumab (h-R3) a niveles de dosis de 200 y 400 mg fue de 44.30 meses. La sobrevida a los tres años de los pacientes tratados a dosis más bajas fue de un 16.7 % y de los pacientes tratados a la dosis óptima biológica fue de 66.7 % (Crombet T et al, 2004).

Con el objetivo de evaluar la seguridad, inmunogenicidad y la eficacia preliminar del anticuerpo nimotuzumab (h-R3) como radiosensibilizador se realizó un ensayo Fase I/II en pacientes portadores de tumores cerebrales de alto grado de malignidad. Se trató de un ensayo abierto, no controlado donde se incluyeron 29 pacientes que habían recibido previamente tratamiento quirúrgico. Todos los pacientes eran tributarios de radioterapia al momento de la inclusión. Otros criterios de selección fueron los siguientes: edad ≥ 18 años, Karnofsky performance status (KPS) ≥ 70, conteo absoluto de neutrófilos ≥ 1.5 x 109/L, conteo de plaquetas ≥ 100 x 109/L, niveles de creatinina sérica por debajo del límite superior del valor normal. Los criterios de exclusión más importantes fueron los siguientes: tratamiento previo con otros anticuerpos murinos, embarazo o lactancia, enfermedades crónicas descompensadas e infecciones activas. La sobre-expresión del EGFR no se consideró un criterio de inclusión. Los pacientes recibieron 6 dosis semanales del AcM correspondientes a 200 mg del nimotuzumab (h-R3). La dosis total acumulativa del nimotuzumab (h-R3) fue de 1200 mg. Se administró el anticuerpo monoclonal a través de una infusión endovenosa, diluido en 250 ml de solución salina durante 1 hora. La terapia radiante se administró en dosis diaria de 1.8 a 2.00 Gy, durante 5 días a la semana para una dosis total acumulativa de 50 a 60 Gy

El ensayo clínico se realizó cumpliendo los preceptos establecidos en a Declaración de Helsisnki: el protocolo fue aprobado por los Comité de Etica de los 4 hospitales partcipantes y por la Agencia Regulatoria Nacional Cubana: el Centro Estatal de Control de los Medicamentos. Todos los pacientes firmaron el documento de consentimiento informado antes de la inclusión en el estudio. La toxicidad se evaluó de acuerdo a la Tabla de Criterios Comunes de Toxicidad del Instituto Nacional de Cáncer de EUA (NCI-CTC) en su versión 2. Se realizaron estudios imagenológicos de Tomografía Axial Computarizada o Resonancia Magnética Nuclear, antes de la inclusión en el ensayo y luego una vez al mes. La respuesta antitumoral se clasificó de acuerdo a los criterios modificados de la OMS (Macdonald D et al, 1990).

En los pacientes tratados en uno de los sitios de investigación, se realizó radioinmunoscintigrafía con el anticuerpo monoclonal murino ior egf-r3, para confirmar la respuesta antitumoral y evaluar la expresión de EGFR en los tumores cerebrales. Se seleccionó el anticuerpo murino para la immunoscintigrafía teniendo en cuenta la existencia de un kit frío con esta molécula que facilita el procedimiento de marcaje con Tecnecio 99 (Tc99), así como la baja probabilidad de sensibilización del paciente tras una única exposición a la proteína murina. Se marcaron 3 mg del anticuerpo ior egf-r3 con 50 mCi (1.85GBq) de pertecnectato procedente de un generador de Molibdeno99/Tecnecio99 (Amershan, Lodres, Reino Unido), eluido en las 24 hrs previas. Se adquirieron imágenes planas en una cámara gamma Sophy DS7 (Sopha Medical Systems, Canada), equipada con un colimador de imágenes de baja energía, usando una ventana 20 % centrada en la emisión de 140 kev de la radiación del tecnecio. Se obtuvieron

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imágenes anteriores, posteriores y laterales, 4 horas después de la inyección del radiofármaco, usando un tiempo de adquisición de 15 minutos.

Para evaluar la inmunogenicidad de la molécula se colectaron muestras de suero, previamente al tratamiento y luego una vez al mes hasta completar 6 meses post-tratamiento. Se usó un ELISA cualitativo validado en el CIM para caracterizar la respuesta anti-idiotípica contra la región variable del anticuerpo humanizado.

En total se incluyeron 29 pacientes (13 hombres y 16 mujeres), con tumores cerebrales de alto grado de malignidad, de reciente diagnóstico. El promedio de edad correspondió a 45 años y el promedio de estado general de Karnosfky (KPS) fue de 80. De acuerdo al tipo histológico, se incluyeron 16 pacientes portadores de glioblastoma multiforme, 12 pacientes portadores de astrocitomas anaplásicos y 1 paciente portador de 1 oligodendroglioma anaplásico. Antes de la radioterapia, a 21 pacientes se les realizó una resección parcial de la lesión, en 3 casos fue posible una resección macroscópica total, mientras que en 5 pacientes solo fue posible la obtención de una biopsia.

Se evaluó la seguridad en los 29 sujetos, que recibieron al menos 1 dosis del AcM. El anticuerpo fue muy bien tolerado. No se constataron eventos adversos grado 3 ó grado 4. En 8 pacientes se constataron reacciones grado 1 ó 2 consistentes en escalofríos, náuseas, fiebre, astenia, anorexia, somnolencia, cefalea, así como incremento de las transaminsas o fosfatasa alcalina. Se constató alopecia en todos los pacientes asociados con la irradiación holocraneana. Ninguno de los pacientes desarrolló rash acneiforme o reacciones alérgicas. Un paciente desarrolló respuesta anti-idiotípica. No se encontró ninguna asociación entre la respuesta inmune al nimotuzumab (h-R3) y la seguridad o la respuesta antitumoral. La respuesta antitumoral se evaluó en todos los pacientes, aunque 3 de los sujetos interrumpieron la terapia con el anticuerpo antes de completar el esquema de 6 dosis propuesto

La tasa de respuesta objetiva antitumoral [respuesta completa (RC) + respuesta parcial (RP)] en esta serie fue equivalente a 37.9 % (17.2 % RC, 20.7 % RP), la respuesta estable (RE) apareció en el 41.4 % de los pacientes, mientas que en el 20.7 % se constató progresión tumoral (PT). En 2 de los pacientes que alcanzaron respuesta completa, se había realizado una cirugía macroscópica total de la lesión. El resto de los pacientes que evidenciaron respuesta completa o parcial habían tenido una resección parcial de la lesión tumoral. Se constató estabilización de la lesión en 12 pacientes, de los cuales 10 habían sido sometidos a una cirugía ablativa parcial, mientras que en 2 sujetos se había realizado solamente una biopsia de la lesión.

En los pacientes portadores de glioblastoma multiforme se constató la siguiente respuesta antitumoral: 3 sujetos alcanzaron RC (18.8 %), 2 pacientes alcanzaron RP (12.5 %), 9 pacientes lograron estabilización de la enfermedad (56.3%), mientras que en 2 pacientes (12.5 %) se detectó progresión de la lesión. En el grupo de pacientes portadores de astrocitomas anaplásicos, 2 lograron respuesta completa (16.7 %), 4 alcanzaron una respuesta parcial (33.3 %), en 3 se constató estabilización de la enfermedad (25 %) mientras que 3 sujetos progresaron. Ninguno de los pacientes recibió terapia con citostáticos al momento de la progresión debido a su pobre estado general y a la poca eficacia que evidencian los quimioterápicos en este escenario (Nabors LB et al, 2005).

Se realizó inmunoscintigrafía a todos los sujetos incluidos en uno de los sitios de investigación. Dos de los sujetos que mostraron respuesta completa por TAC o RMN, no evidenciaron captación in vivo del AcM radiomarcado por la técnica inmunogammagráfica, mientras que los pacientes que lograron respuesta parcial, estabilización o progresión tumoral tras la combinación terapéutica mostraron captación positiva del monoclonal murino en las zonas conocidas del tumor. La figura 2 muestra las imágenes planas obtenidas en un paciente, 4 horas de la inyección del radiofármaco en el sitio del tumor en comparación con la imagen de RMN correspondiente en un paciente que alcanzó estabilización de la enfermedad como mejor respuesta.

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Figura 2: Acumulación positiva del AcM ior egf-r3 en un paciente que alcanzó estabilización de la

enfermedad como mejor respuesta en relación con la correspondiente imagen de RMN que muestra la lesión tumoral en el lóbulo parieto-occipital derecho.

Con un tiempo de seguimiento desde el inicio de la inclusión hasta la fecha de evaluación de

29 meses (rango 22 a 45 meses), la media y la mediana de sobrevida correspondió a 24.09 y 22. 17 meses, respectivamente para todos los sujetos tratados. Esta estrategia terapéutica conllevó a una mediana de sobrevida de 17.47 meses para los pacientes portadores de glioblastoma multiforme, mientras que la mediana de sobrevida, no se había alcanzado para los sujetos con diagnóstico de astrocitoma anaplásico. A pesar del uso de terapias agresivas, el pronóstico de los pacientes portadores de tumorales gliales es muy pobre (Akasaki Y et al, 2005). Estas neoplasias son resistentes a todas las modalidades terapéuticas usadas incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia (Sarissky M et al, 2005). Las estrategias actuales se basan en las terapias dirigidas a blancos específicos tumorales. La inmunoterapia constituye una de estas estrategias debido a la identificación reciente de nuevos antígenos tumorales. El EGFR ha sido uno de los blancos más extensamente estudiados.

El anticuerpo nimotuzumab (h-R3) es una nueva molécula humanizada que neutraliza la unión entre el EGFR y sus ligandos, inhibiendo la activación tirosina quinasa (Mateo C et al, 1997). El anticuerpo evidenció un efecto sinérgico cuando se combinó con la terapia radiante en el tratamiento de pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello (Crombet T et al, 2004). La expresión selectiva del EGFR por los tumores astrocíticos unido a la ausencia de expresión de esta molécula en el tejido cerebral normal sugiere la posibilidad de radiosensibilización efectiva en este escenario.

Este estudio se diseñó con el objetivo de evaluar la seguridad e inmunogenicidad del h- R3 en combinación con irradiación en pacientes portadores de tumores de alto grado de malignidad. Secundariamente, se evaluó la eficacia clínica preliminar del anticuerpo en este esquema terapéutico. En este ensayo se demostró la seguridad de la combinación terapéutica del monoclonal y la terapia radiante. La toxicidad de la terapia radiante no se exacerbó con la adición del monoclonal. Los eventos adversos más frecuentes se clasificaron como reacciones infusionales. El monoclonal no provocó reacciones alérgicas que si se habían contactado tras el tratamiento de pacientes con dosis repetidas de la molécula murina en relación con la sensibilización previa al monoclonal y la aparición de respuesta HAMA (Human-Antimouse Antibodies) (Crombet T et al, 2001). Luego de 6 dosis del AcM humanizado, solamente 1 paciente desarrolló respuesta anti-idiotipíca, que no tuvo repercusión en la seguridad ni en la respuesta clínica del paciente.

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Aún cuando se han evidenciado reacciones del tipo rash cutáneo en más del 80 % de todos los pacientes tratados con moléculas antagonistas del EGFR, no se detectaron efectos adversos en la piel de los sujetos que recibieron el nimotuzumab (h-R3). Nuestra hipótesis para explicar la ausencia de toxicidad cutánea se asienta en la afinidad intermedia del AcM y presupone que aquellos anticuerpos con afinidad mediana por el blanco tumoral y que reconocen antígenos ubicuos, evidenciarán un reconocimiento y acumulación preferencial en los tejidos tumorales que sobre-expresan la molécula diana, evitando la aparición de toxicidad indeseable e incrementando el índice terapéutico (Crombet T et al, 2004) Aunque la barrera hemato-encefálica puede bloquear la penetración de moléculas grandes como los anticuerpos en los tumores cerebrales, agentes como la cirugía, la irradiación y el tumor interrumpen su integridad, facilitando la acumulación en las lesiones tumorales. Previamente, nuestro grupo había demostrado la alta sensibilidad, especificidad y exactitud de la inmunogammagrafía con el anticuerpo murino ior egf/r3 marcado con Tc99 en el diagnóstico in vivo de lesiones malignas intracraneales, lo cual corrobora la acumulación de este tipo de molécula en tumores cerebrales (Figura 3) (Ramos-Suzarte M et al, 1999).

Vista lateral derecha Vista lateral izquierda

Figura 3: Inmunoscintigrafía que muestra acumulación del AcM ior egf-r3 marcado con Tecnecio 99 en un astrocitoma anaplásico localizado en el lóbulo temporal derecho.

En este ensayo, la inmunosctingrafía tras la combinación terapéutica, mostró acumulación positiva del anticuerpo en aquellos pacientes con lesiones residuales, mientras que no se acumuló el radiofármaco en los pacientes con regresión tumoral completa. Sin embargo, estos resultados deben ser interpretados con precaución ya que no se obtuvieron imágenes gammagráficas pre-tratamiento y tampoco se caracterizó la expresión del EGFR en las biopsias pre-tratamiento de los pacientes. Otros factores tales como el desorden de la vasculatura y el incremento de la presión hidrostática en los tumores, pérdida de expresión del EGFR así como la emergencia de variantes mutantes del receptor, pudiera también influir en la acumulación específica del monoclonal. Aunque el ensayo no se diseñó para evaluar definitivamente la eficacia de la droga, se estudió la sobrevida de los pacientes tratados con la combinación de irradiación y nimotuzumab (h-R3). La sobrevida global fue relativamente larga en comparación con los datos reportados para la radioterapia sola (Hauch H et al, 2005) Al igual, nuestros resultados se comparan muy favorablemente con los datos reportados para varios esquemas de radio-quimioterapia que han producido resultados negativos o no concluyentes (Lonardi S et al, 2005).

Otros grupos han usado anticuerpos anti-EGR, desnudos o marcados con radioisótopos en el tratamiento de pacientes de nuevo diagnóstico o con tumores cerebrales recurrentes. No se han obtenido evidencias de beneficio clínico significativo en ninguno de los ensayos usando anticuerpos anti-EGFR murinos desnudos o conjugados (Kalofonos HP et al, 1989; Brady LW et al, 1990; Emrich JG et al, 2002). Previamente se han reportado ensayos clínicos con pequeñas moléculas que tienen como blanco el EGFR. Gefitinib (Iressa, Astra Zeneca, Londres, Reino Unido) y erlotinib (tarceva, Genentech, San Francisco, EUA) se han evaluado en el tratamiento de 54 y 45 pacientes con tumores cerebrales recurrentes, respectivamente. La sobrevida global tras el tratamiento con

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Iressa fue de 39.4 semanas, mientras que los eventos adversos fueron discretos o moderados y consistieron principalmente en reacciones en piel y diarrea (Rich JN et al, 2003). Tras el tratamiento con el tarceva, solo 2 de los 45 pacientes evidenciaron respuesta parcial y no se constató incremento de la sobrevida libre de progresión tras 6 meses (Newton HB et al, 2003).

En resumen, la combinación de nimotuzumab (h-R3) e irradiación fue segura. La sobrevida prolongada de nuestro grupo de pacientes es promisoria, pero se debe ejecutar un ensayo controlado para confirmar este resultado. El incremento de sobrevida y la prolongada duración de la respuesta tras el tratamiento durante 6 semanas pudiera estar asociado con el efecto anti-angiogénico del AcM nimotuzumab (h-R3), dado su rol marcado en la regulación negativa del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (Crombet T et al, 2002). Para predecir y caracterizar mejor la población de pacientes respondedora al nimotuzumab (h-R3) se impone la realización de estudios farmacogenómicos, que incluyan la evaluación de la amplificación del gen del EGFR, así como la caracterización de mutaciones en este gen así como en las moléculas relacionadas con la cascada de señalización del receptor tales como PTEN, RAS, fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3K), proteina cinasa activada por mitógenos (MAPK). Radioinmunoterapia.

A pesar de las intensas investigaciones realizadas en los últimos años, el pronóstico de los gliomas de alto grado de malignidad sigue siendo pobre. Estos tumores son altamente resistentes a las terapias disponibles en la actualidad, por lo tanto existe una imperiosa necesidad de desarrollar nuevas estrategias más efectivas. Una de ellas es el uso de anticuerpos monoclonales (AcMs) asociados a radioisótopos. Con esta metodología, teóricamente, se debe lograr un incremento de la respuesta terapéutica antitumoral al combinar los efectos beneficiosos del AcMs y las radiaciones (Paganelli et al., 2006).

La radioinmunoterapia (RIT) difiere de la radiación externa convencional en que puede ser administrada sistémicamente o en forma locorregional. Por otro lado, la RIT tiene la posibilidad de vencer el problema de la heterogeneidad tumoral observada en la inmunoterapia con AcMs debido a que las radiaciones pueden matar a las células tumorales antígeno negativas que no tienen el radioinmunoconjugado específicamente localizado en su superficie al producirse el efecto de fuego cruzado (crossfire effect) desde las células tumorales antígeno positivas (Dixon, 2003). Secundariamente, los radionúcleos no están sometidos al fenómeno de la resistencia observado en múltiples drogas anticancerosas. A pesar de las ventajas anteriormente señaladas, los resultados más alentadores de la RIT, han sido obtenidos principalmente en el tratamiento de linfomas no-Hodgkin (Postema et al., 2001). Los resultados observados en pacientes portadores de tumores sólidos, sólo han sido, por lo general, modestos (Koppe et el., 2005). Radionúclidos.

El número de radioisótopos disponibles para la producción de radioinmunoconjugados está actualmente en ascenso. A pesar de que se conoce que el mecanismo principal de muerte celular producido por los radioisótopos es el daño del DNA, es necesario hacer importantes consideraciones para escoger el radionúcleo a utilizar, factores tales como las características del AcM, la farmacocinética y biodistribución del radioinmunoconjugado, las características de las células tumorales y factores prácticos tales como la seguridad radiológica, deben ser tomados en consideración.

La vida media de los radionúcleos debe ser lo suficientemente larga para permitir que el radioinmunoconjugado alcance el tumor antes de decaer, pero lo suficientemente corta para limitar las radiaciones a los tejidos normales. Es deseable una alta y homogénea acumulación de la dosis en las células tumorales y una rápida eliminación de los tejidos normales. Un vida media y una longitud de penetración (path length) larga se desean para tratar grandes tumores y viceversa cuando se desean tratar tumores más pequeños y accesibles (Bethge and Sandmaier, 2005).

La mayoría de los radionúcleos usados en RIT son emisores beta aunque también pueden utilizarse emisores alfa y electrón Auger. Las partículas beta son electrones emitidos desde el núcleo de un átomo inestable. El Yodo-131 (131I) y el Ytrium-90 (90Y) son los emisores beta más usados en RIT. El Renio-186 (186Re),

xliii

Renio-188 (188Re), Cobre-67 (67Cu), y el Lutetium (177Lu) son beta emisores más recientemente considerados para la RIT. Estos radionúcleos difieren entre ellos con respecto a la vida media física, la emisión o no de rayos gamma, y la energía de las partículas beta (Koppe et al., 1996). Tabla 1.

Tabla 1. Características de algunos beta emisores usados en RIT

Radionúcleo

Tiempo de vida medio

Emax β (MeV)

Rango aproximado

en tejido (mm).

131I

8 días

0.61

2.3

90Y

64.1 horas

2.28

11.3

186Re

3.8 días

1.08

4.8

188Re

17 horas

2.12

10.4

67Cu

61.9 horas

0.58

2.1

177Lu

6.7 días

0.5

1.8

Los factores anteriormente mencionados son importantes al considerar la eventual dosis de radiación que será emitida al tumor, la cual puede ser estimada por análisis dosimétrico (Stabin, 1996).

El uso del renio-188 para la RIT resulta particularmente interesante pues tiene excelentes propiedades físicas y químicas, su efecto terapéutico es debido a la radiación beta que emite de 2.1 MeV, también emite una radiación gamma de 155-KeV que no tiene actividad terapéutica, pero es útil para los estudios de distribución y dosimetría gammagráficos. Generalmente y desde el punto de vista de protección radiológica, los pacientes no necesitan ser hospitalizados después del tratamiento pues este isótopo posee una vida media de 16.7 horas y las actividades terapéuticas administradas están muy por debajo las permitidas por las regulaciones (Jeon et al., 2003).

Por otro lado, el renio y el tecnecio pertenecen a la familia del manganeso y puede ser posible adaptar algunas de las metodologías desarrolladas para el 99mTc, el más común de los isótopos usados en medicina nuclear, para marcar AcMs con el 188Re. Un aspecto muy importante a tener en consideración es el desarrollo de un generador de 188W/188Re, el cual es fácil de usar, especialmente en áreas aisladas del planeta donde es difícil la transportación de radionúcleos de vida media corta (Jeon et al., 2003; Iznaga-Escobar, 2003).

En dos estudios recientes la administración intracavitaria a un pequeño grupo de pacientes

portadores de gliomas malignos de un AcM anti-tenascin (BC-4) o de un anti-EGF-R (nimotuzumab (h-R3)) marcados con 188Re mostraron un incremento importante en la sobreviva de los mismos (Popperl et al., 2006; Casacó et al., 2004). Anticuerpos monoclonales

A pesar de que varios tipos de moléculas marcadas han sido ensayadas en la RIT del cáncer, las investigaciones en pacientes portadores de tumores cerebrales malignos se han realizado casi exclusivamente con AcM (Zalulsky, 2004). Pocos estudios con péptidos análogos a la somatostatina han sido usados en la RIT inyectándolos intracavitariamente o dentro del tumor cerebral con el objetivo de lograr una mejor penetración en el tejido normal, posiblemente portador de células tumorales (Merlo et al., 1999; Merlo et al., 2003).

Los antígenos asociados a la RIT de tumores cerebrales incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (Brady et al. 1992), la molécula de adhesión celular neural humana (NCAM), la cual está presente tanto en el glioma como en el tejido normal y la molécula de tenascina.

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La tenascina-C es una glicoproteína que se sobre-expresa en la matrix extracelular en los gliomas de alto grado de malignidad. La expresión de tenascina crece con el grado de malignidad y se ha encontrado sobre-expresada en más del 90 % de los glioblastomas multiformes. Varios AcM anti-tenascina han sido usados en la RIT de tumores cerebrales, dentro de los más empleados se encuentran el BC-4, BC-2 y el 81C6 (Zalulsky, 2004).

La RIT de tumores cerebrales de alto grado de malignidad usando AcMs anti-EGF-R resulta interesante ya que la expresión de este receptor está aumentada en estos tumores (Libermann et al., 1984; Libermann et al., 1985a; Libermann et al., 1985b., Von Deimling et al., 1992). Por otro lado, existen reportes en la literatura que sugieren que el EGF-R no se encuentra en el tejido cerebral normal (Libermann et al., 1985b, Takahashi et al., 1987, Derui et al., 1992), lo cual a prior, permite suponer una alta concentración del radioinmunoconjugado en el tejido tumoral en relación con el normal cuando este se administra en la cavidad tumoral.

El uso de la RIT por vía intravenosa o intraarterial empleando AcM anti-EGF-R también ha sido reportada (Brady et al., 1992, Emrich, et al., 2002), pero los resultados no han sido muy alentadores (Carlsson et al., 2006), probablemente debido a la alta expresión del EGF-.R en los hepatocitos y el tejido epitelial normal (Gusterson et al., 1984; Damjanov et al., 1986) que hacen inapropiado el uso por vía sistémica de AcMs anti-EGF-R unidos a radionúcleos (Carlsson et al., 2006). Sin embargo, el uso de la vía intracavitaria pudiera ser una buena alternativa al incrementar la concentración del radioinmunoconjugado en el sitio de acción y disminuir los efectos tóxicos sistémicos.

Estudios toxicológicos preclínicos en ratas han demostrado que la administración intracerebral del AcM anti-EGF-R, Nimotuzumab (h-R3) marcado con renio 188 y administrado en dosis relativamente altas del radionúcleo (hasta 44 mCi/m2) no produjo importantes efectos tóxicos locales o sistémicos (González et al., 2000), pocos efectos tóxicos también se obtuvieron cuando el renio 188 se dejó decaer hasta osmio 188 y se administró en igual forma (González et al., 2005).

Con estos antecedentes nuestro grupo decidió realizar el siguiente ensayo clínico.

“Radioinmunoterapia locorregional de tumores cerebrales de alto grado de malignidad usando el anticuerpo monoclonal Nimotuzumab (h-R3) marcado con renio 188” (Torres et al. 2007). El objetivo del trabajo fue evaluar en un ensayo clínico fase I la seguridad y la máxima dosis tolerable (MTD) después de la administración intracavitaria del radioinmunoconjugado nimotuzumab (h-R3) marcado con diferentes y crecientes dosis de renio 188 en pacientes adultos portadores de gliomas recurrentes de alto grado de malignidad. El posible efecto antitumoral fue evaluado secundariamente.

Se realizó un estudio abierto, no controlado, prospectivo y de escalado de dosis al administrar intracavitariamente una sola dosis del radioinmunoconjugado formado por 3 mg del AcM nimotuzumab (h-R3) dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) marcado con renio 188 en un rango entre 10 y 30 mCi. La dosis de renio 188 se incrementó en 5 mCi cada 3 pacientes con el objetivo de determinar la MTD. Si 2 pacientes o más presentaban toxicidad severa o muy severa de acuerdo al Criterio de Toxicidad Común del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) de los Estados Unidos, entonces el nivel de dosis previo fue considerado como la MTD y se incluían 3 nuevos pacientes en ese nivel.

Se incluyeron 11 pacientes portadores de tumores cerebrales recurrentes confirmados histológicamente como astrocitomas anaplásicos (AA) o glioblastoma multiformes (GBM) y comprobados por inmunohistoquímica que sobre-expresaban el EGF-R. Una cámara de Ommaya se implantó en la cavidad tumoral después de la biopsia o resección parcial del tumor. Los pacientes esperaron por la RIT un período de 2-4 semanas después de la cirugía.

El estudio se aprobó por el Comité de Ética del Centro de Restauración Neurológica (CIREN) y por la Autoridad Nacional Regulatoria de Cuba (CECMED). Otros criterios de inclusión que se consideraron fueron los siguientes: mayor de 18 años de edad; estado general según escala de Karnofsky ≥70; conteo absoluto de neutrófilos ≥1.5 x 109/L; conteo de plaquetas ≥100 x 109/L; creatinina y bilirrubina séricas dentro de valores normales. Los criterios de exclusión más importantes fueron: tratamientos previos con AcMs; embarazo o lactancia y el padecimiento de enfermedades crónicas descompensadas o de infecciones activas. Antes de la RIT, se les realizó a todos los pacientes una tomografía computarizada (CT) o una imagen de resonancia magnética (MRI). Estos estudios se repitieron al menos cada 3 meses después de la RIT.

xlv

La respuesta tumoral se evaluó de acuerdo a los criterios modificados de la Organización Mundial para la Salud (McDonald et al., 1990). El AcM Nimotuzumab (nimotuzumab (h-R3)) se produjo en el Centro de Inmunología Molecular (Habana, Cuba) y se marcó con renio 188 por el método directo como se ha descrito en otros artículos (González et al., 2000; González et al., 2005). Después de la RIT todos los pacientes presentaron empeoramiento temporal de los síntomas pre-existentes. Los eventos adversos observados fueron grado 1-2 en los pacientes tratados con la dosis de 10 mCi de 188Re, no así en los pacientes tratados con la dosis de 15 mCi con la que algunos presentaron eventos neurológicos adversos severos y/o muy severos, acompañados de importante edema cerebral que imposibilitó el escalamiento al nivel de dosis superior.

Es de notar el inesperado efecto beneficioso observado en 3 de los 6 pacientes tratados con la dosis de 10 mCi de 188Re al observarse en ellos respuesta completa, desde el punto de vista imagenológico, en algún momento de su evolución clínica. El paciente 3 (GBM) está aún vivo, en respuesta completa y con buen estado general después de más de 4 años de la RIT (Tabla 2). La paciente número 4 (Figura 1), AA en un inicio, tuvo una respuesta completa a la RIT desde el punto de vista imagenológico durante más de 2 años. A los 26 meses de la RIT la imagen por resonancia mostró recidiva tumoral y la biopsia realizada evidenció una evolución del tumor a GBM. Se le administró un segundo tratamiento de RIT con 3 mg de nimotuzumab (h-R3) marcados con 10 mCi de 188-Re, pero evoluciona desfavorablemente y fallece. Tabla 2

No.

inclusión Sexo Edad (años)

Diag-

nóstico Localización tumoral

Nivel de

dosis

Mejor

respuesta

Sobrevida desde la

RIT(meses)

1 M 53 GBM Temporo-occipital

derecha I

EE 6.1 2

M 32 GBM Temporo-parietal

derecha -

- ? 3

M 20 GBM Parieto-occipital

derecha I

RC *50.6 4

F 25 AA/GB

M Fronto-parietal

izquierda I

RC +38.4 5

M 44 AA Fronto-parietal

izquierda II

EP 9.4 6

F 65 GBM Fronto-parietal

izquierda II

EP 2.4 7

M 62 GBM Parieto-occipital

derecha II

EP 1.2 8

M 54 GBM Parieto-occipital

izquierda II

EP 3.8 9

M 53 GBM Parietal posterior

derecha I

RC 15.7 10 M 35 AA Frontal derecha I EE 18.7 11

M 51 GBM Temporo-occipital

izquierda I

EP 5.9 GBM=Glioblastoma multiforme; AA=Astrocitoma anaplásico. I=nimotuzumab (h-R3) maracado con 10 mCi de 188Re, II=nimotuzumab (h-R3) marcado con 15 mCi de 188Re. ?=Al paciente 2 nos fue imposible aplicar la RIT debido a que el crecimiento tumoral obstruyó la cámara de Ommaya. *=El paciente 3 aún permanece con vida. += La paciente 4 era portadora de un AA que evolucionó a GBM (ver texto). RC=Respuesta completa; RP=Respuesta parcial; EE=Enfermedad estable; EP=Enfermedad progresiva.

xlvi

A= Imagen axial de Resonancia Magnética en T2 previa a la RIT, donde se evidencia la cavidad post-resección del núcleo tumoral con edema perilesional en región fronto-parietal izquierda, lugar donde se colocó el catéter del reservorio. B= Imagen axial de Resonancia Magnética en T1 con gadolinio 15 meses después de la RIT, constatándose la cavidad post-quirúrgica sin edema adyacente y sin evidencia de residiva tumoral. C= Imagen axial de Resonancia Magnética con gadolinio en T1 26 meses después de la RIT, apareciendo nuevamente en la misma región zona heterogénea de captación de contraste y edema perilesional significativo con efecto de masa, compatible con una residiva lesional. La paciente fallece un año después.

Estos resultados nos permiten concluir que la administración intracavitaria del radioinmunoconjugado formado por 3 mg de nimotuzumab (h-R3) marcado con 10 mCi de 188Re (MDT) es relativamente segura y puede ser una prometedora acción terapéutica en pacientes portadores de gliomas de alto grado de malignidad. Referencias 1. Akasaki Y, Black KL, Yu JS. Dendritic cell-based immunotherapy for malignant gliomas. Expert Rev Neurother; 5(4):497-508, 2005. 2. Bethge WA, Sandmaier BM. Targeted cancer therapy using radiolabelled monoclonal antibodies. Technol Cancer Res Treat 4: 393-405, 2005. 3. Brady LW, Markoe AM, Woo DV et al. Iodine125 labeled anti-epidermal growth factor receptor-425 in the treatment of malignant astrocytomas. A pilot study. J Neurosurg Sci., 34 (3-4):243-9, 1990. 4. Brady LW, Miyamoto C, Woo DV et al.: Malignant astrocytomas treated with iodine)125 abeled monoclonal antibody 425 against epidermal growth factor receptor: a phase II trial. Int J Radiat Oncol Biol Phys 22: 225–230, 1992. 5. Cancer Statistics 2004. The American Cancer Society, 2004 6. Carlsson J, Ren Z.P, Wester K, Sundberg A .L, Heldin N.E, Hesselager G, Persson M, Gedda L. Tolmachev V, Lundqvist H, Blomquist E, Nister M. Planning for intracavitary anti- EGFR radionuclide therapy of gliomas. Literature review and data on EGFR expresión. J Neuooncol. 77: 33-45, 2006. 7. Casacó A, Lopez G, Fernandez R, Diaz L, Perera A, Batista J, Leyva R, Peña Y, Rodriguez JA, et al. Loco-regional radioimmunotherapy of high grade malignant gliomas using the humanized monoclonal antibody, h-R3, labelled with 188-Re. Proc Am Soc Clin Oncol 23 Abs 2530, 2004. 8. Cohen S. Human Epidermal growth Factor: Isolation and Chemical and Biological

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C B

Figura No. 4 Paciente No. 4

A

xlvii

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l

li

MODELOS RADIOFARMACOCINÉTICOS Y CÁLCULO DE DOSIS IN TERNA

Guillermina Ferro Flores - Consuelo Arteaga de Murphy

Un modelo radiofarmacocinético es una descripción matemática de la distribución biológica de algún radiofármaco en función del tiempo.

Desde un punto de vista real, existen marcadas diferencias farmacocinéticas en la aplicación de un determinado radiofármaco. Por ejemplo, para el caso de los anticuerpos monoclonales se encuentran diferencias entre especies, individuos, anticuerpos, radionúclidos, modos de administración y cantidades administradas.

En un tratamiento o estudio de diagnóstico en medicina nuclear, la dosis de radiación absorbida será precisamente el producto de los factores dependientes del tiempo (biocinéticos) por aquellos que son independientes del tiempo como el tipo y energía de emisión del radionúclido. Los factores que no dependen del tiempo pueden por tanto manejarse como constantes. Sin embargo, para poder evaluar los parámetros dependientes del tiempo, es necesario realizar cálculos sobre bases individualizadas o pe rsonalizadas y, dichas evaluaciones, no pueden ser consideradas como aspectos obvios ni triviales. En este punto valdría recordar lo expresado por el Dr. Loevinger, reconocido especialista en dosimetría interna: “NO ES POSIBLE CALCULAR LA DOSIS A UN PACIENTE, SÓLO ES POSIBLE CALCULAR LA DOSIS A UN MODELO. EL MODELO POR SUPUESTO, ES EL TOTAL DE SUPOSICIONES NECESARIAS PARA HACER EL CÁLCULO, DICHAS SUPOSICIONES DEFINEN UNA CLASE DE PACIENTES Y LA DOSIS APLICA A ESTA CLASE. EL COMO SE AJUSTE UN PACIENTE AL MODELO ES SÓLO UNA CONJETURA”

Es por ello que en la literatura encontramos que constantemente se genera un buen número de publicaciones en revistas especializadas sobre métodos cuantitativos radiofarmacocinéticos prácticos a partir de imágenes incluyendo planares, SPECT y PET, así como mediciones de cuerpo total y mediciones “ex-vivo” de concentraciones de actividad en sangre, con la finalidad de establecer modelos radiofarmacocinéticos que sean lo más cercano posible a la realidad. Los modelos radiofarmacocinéticos se dividen por lo general en tres tipos:

1. Empíricos o de integración directa 2. Analíticos o análisis de regresión “mínimos cuadrados” 3. Compartimentales o modelo compartimental

Sin embargo, antes de describir a cada uno valdría la pena recordar que los procesos

biológicos, como el intercambio de cantidades de material entre tejidos, siguen una cinética de primer orden, es decir, la velocidad de intercambio es proporcional a la concentración de un solo compuesto. Por tanto, las curvas de actividad vs tiempo se ajustan a una suma de exponenciales. Así, al graficar los datos en papel semilogarítmico, cada componente exponencial aparecerá como un segmento lineal.

lii

1. Modelos empíricos .

Aplicando la metodología de los radiotrazadores, puede obtenerse una serie de medidas de concentración del radionúclido en los diferentes tejidos y graficarlas en función del tiempo post-administración. Las curvas resultantes de actividad-tiempo pueden ser caracterizadas como un modelo farmacocinético empírico, puesto que es una descripción matemática de la distribución del radionúclido incorporado cuya información derivó de la medición directa.

Este método tiene su mayor aplicación en el desarrollo de nuevos radiofármacos específicamente durante su evaluación biológica en animales de experimentación como ratones o ratas. La principal ventaja del modelo farmacocinético empírico es que no se introducen suposiciones simplificadas respecto a la forma analítica de distribución del radionúclido.

El área bajo la curva actividad vs tiempo puede ser evaluada por métodos de integración

numérica simples y obtener la actividad acumulada (~A ), parámetro biocinético necesario para

el cálculo de la dosis absorbida. Sin embargo, la precisión de tal integración es completamente dependiente del adecuado cálculo de la fracción (o porcentaje) de actividad administrada en los órganos fuente importantes y en las muestras de excreta. Es importante tomar suficientes muestras de la distribución y la retención del radiofármaco durante el transcurso del estudio. Por tanto, debe tenerse presente los siguientes criterios: • Colectar los picos de captación rápida y la fase de eliminación rápida • Realizar el estudio cubriendo al menos un lapso de tiempo de tres vidas medias efectivas del radiofármaco (3Tef). • Colectar al menos dos datos por tiempo. • Contar 100 % de actividad todo el tiempo • Contar las principales vías de excreción (orina, heces, exhalación, etc.)

Es deseable tener un conocimiento de la cinética esperada del radiofármaco para realizar un buen diseño del estudio. Por ejemplo, el espaciamiento de las mediciones desde el tiempo inicial, será muy diferente cuando se evalúa un compuesto de Tc-99m que en 180 min se elimina en un 95 %, a evaluar un anticuerpo monoclonal marcado con I-131 donde el 80 % del radiofármaco se elimina el primer día y el otro 20 % en las siguientes dos semanas. Un punto clave son los órganos excretores (intestino y vejiga), ya que por lo general reciben las dosis absorbidas más altas puesto que 100% de la actividad (menos el decaimiento) pasará por alguna o ambas de estas vías de eliminación a diferentes velocidades. Si la excreción no es cuantificada, se tendrá que hacer la suposición de que el compuesto es retenido en el cuerpo y removido únicamente por el decaimiento radiactivo. Para radionúclidos de vida media muy corta, esto puede no ser un problema y obtener mediciones hasta precisas. Para radionúclidos de vida media moderadamente largos, esto puede causar una sobreestimación de la dosis en la mayoría de los órganos del cuerpo y una subestimación para los órganos excretores posiblemente significativa. Para radionúlcidos de vida media muy larga (C-14, K-40) tal suposición no es realista produciendo dosis comprometidas verdaderamente grandes.

La extrapolación de los datos de los animales a humanos no es una ciencia exacta, pero algunas veces se puede introducir factores de peso para correlacionar tales datos. Es decir, la extrapolación puede convertir el % por órgano en el animal a % por órgano en el humano después de corregir la fracción de peso que representa el órgano respecto al peso del cuerpo total en ambas especies:

%( )

%

g organoKg Peso total del cuerpo

g organo

Kg peso total del cuerpo organoanimal

animal

humano humano

=

Por tanto, el método de integración directa para un compuesto en que se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo puede ser calculado de acuerdo al siguiente ejemplo: “Las actividades acumuladas y los tiempos de residencia en todos los órganos estudiados fueron calculados de los datos biológicos obtenidos de animales (ratones balb-c). El cálculo de la dosis absorbida, se basó en la metodología MIRD de acuerdo a las siguientes consideraciones:

liii

∑ ←∞=h

hkhk rrSArD )(),0(~)( (1)

donde D rk( ) es la dosis absorbida promedio a cualquier órgano blanco rk de la actividad acumulada en cualquier órgano fuente rh.

),0(~ ∞hA = A t dth ( )0

∞

∫ es la actividad acumulada en el órgano fuente y

S r rk h( )← es la dosis absorbida en rk por unidad de actividad acumulada en rh. A su vez, el factor “S” está dado por:

S r rk h( )← = ∆ Φi i k hi

r r( )←∑ (2)

Los términos ∆ i son las energías promedio emitidas por unidad de actividad acumulada

para varios tipos de radiaciones (emisión i-tipo). Los términos Φ i son las fracciones específicas absorbidas que dependen de las propiedades de la emisión i-tipo y del tamaño, composición, forma y separación de los órganos fuentes y blancos.

Específicamente, la actividad acumulada para cada órgano, se obtuvo por integración entre cada tiempo en que los animales fueron sacrificados. La integración de la actividad acumulada, considera que la concentración de los radioinmunoconjugados en cada órgano, está representada por la media aritmética de los niveles al principio y al final de cada intervalo. La forma general de integración para cada órgano fuente fue:

∫∫∫∫ ++

++

++

+= −−−−h

h

th

h

th

h

th

t eAA

dteAA

dteAA

dteA

A3

2

)3()2(2

1

)2()1(1

5.0

5.0

0

)1()5.0()5.0(

2222~ λλλλ

++

++− −

∫ ∫A A

e dtA A

e dtt

h

ht

h

h( ) ( ) ( ) ( )3 4 4 5

3

4

4

5

2 2λ λ +

++

+− + −+

∫ ∫A A

e dtA A

e dtt T

h

ht

h

T( ) ( ) ( ) ( )5 24 24

5

24

242 2λ λ

Las constantes A(0.5), A(1), A(2), A(3), A(4), A(5) y A(24), son el porciento de la dosis inyectada en el órgano a las 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 y 24 h. A(T+) es el porciento de la dosis inyectada en el órgano más allá de 24 h, y como se muestra arriba, A(T+) se considera que es constante (48h).

A~ se expresa relativa a la actividad administrada, A0. Con la relación 0/~ AA se obtuvo el

tiempo de residencia, τ, el cual tiene dimensiones de tiempo (h). La multiplicación de τ por S proporciona la dosis absorbida por unidad de actividad acumulada”.

2. Modelos analíticos

Para superar la limitante de los métodos empíricos, en cuanto a extrapolar razonablemente

un dato más allá del último tiempo de lectura, los datos biológicos obtenidos pueden ajustarse a una función analítica, también conocida como “función de distribución”. En el modelo analítico queda implícito que la curva actividad vs tiempo puede ser ajustada a una función dependiente del tiempo antes de la primera medición y después de la última medición. Como se planteó en un principio, los procesos biológicos siguen una cinética de primer orden, por lo que las curvas de actividad vs tiempo pueden ajustarse a una suma de exponenciales, así:

( ) tjhh

jheAtq )(

)(λ

∑= (3)

Donde qh(t) = es la función de distribución de la región fuente rh, que es la actividad corregida por decaimiento radiactivo (Bq) en la región fuente rh al tiempo t post-administración (h) del radiofármaco; Ah(j) es la actividad (Bq) para el j-ésimo componente exponencial en la región fuente rh al tiempo t=0 ; y λh(j) es la constante de eliminación efectiva (h-1) de j-ésimo componente exponencial de la curva actividad vs tiempo en la región fuente, que es la fracción

liv

de la actividad eliminada por unidad de tiempo para el j-ésimo componente exponencial de la curva actividad vs tiempo. Los datos de actividad vs tiempo al ser graficados en papel semilogarítmico (la actividad se grafica en la escala logarítmica de las ordenadas y el tiempo en la escala aritmética de las abscisas), producen un segmento lineal para cada componente de la función de distribución qh(t) y, el número de componentes exponenciales corresponde al número de segmentos lineales identificables, de esta forma, se puede obtener, por arreglo de mínimos cuadrados, la función correspondiente.

Por ejemplo, la mayoría de los radiofármacos cuando son administrados intravenosamente, puede considerarse que siguen una fase inicial rápida (distribución) seguida de una etapa lenta (equilibrio y eliminación) como se muestra en la figura 1.

Matemáticamente, esto se puede representar por una función de distribución biexponencial:

( ) ( ) ( )t

h

t

hhhh eAeAtq )2()1(

21λλ −− += (4)

donde Ah(1) y Ah(2) son constantes relacionadas a la actividad inicial

[ ( ) )1()1(00 hht AAAA +== = ]; las constantes de decaimiento λh(1) y λh(2) son indicativas de la

rapidez con la que la curva decae en cada compartimento. Ya que le primer término del lado izquierdo de la ec. (15) es despreciable para tiempos largos, ésta se puede aproximar por:

( ) ( )t

hhheAtq )2(

2λ−≈ (5)

Tomando el logaritmo natural en ambos lados de la ecuación se obtiene: ( )[ ] ( )[ ] tAtq hhh )2(2lnln λ−= (6)

Esta es una expresión lineal (y=mx + b), la pendiente puede calcularse considerando únicamente los puntos para los tiempos grandes, de tal forma que:

)2(hm λ=− (7)

)2(hb Ae = (8)

Usando estos dos valores, la ecuación (15) se puede reescribir: t

ht

hhhh eAeAtqtz )1()2(

)1()2()()( λλ −− =−= (9)

Nuevamente se vuelve a obtener una expresión lineal: ( )[ ] ( )[ ] tAtz hh )1(1lnln λ−= (10)

Finalmente, de una nueva regresión lineal sobre todos los puntos:

)1(hm λ=− (11)

)1(hb Ae = (12)

Con esto se obtienen los cuatro parámetros requeridos para la función analítica, ec. (15).

Actividad (KBq)

Tiempo

Fase inicial rápida

Fase lenta (equilibrio y

m = λh(1)

m = λh(2)

Ah(1)

Ah(2)

Fig. 1. Curva de actividad vs tiempo en sangre.

lv

Incorporando la función de distribución en la expresión de actividad acumulada, esta puede escribirse como:

∫∞

=∞0

)(),0(~ dttqeA htλ

(13) Evaluando la integral resultante para el modelo biexponencial antes propuesto:

)2(

)2(

)1(

)1(~

h

h

h

h AAA

λλ+=

(14) y,en términos generales:

∑=∞j jh

jhAA

)(

)(),0(~λ

(15)

Como un ejemplo rápido, supongamos que a un paciente se le tomaron las siguientes muestras de sangre después de la administración de algún radiofármaco : Tabla 1. RADIACTIVIDAD EN MUESTRAS DE PLASMA DESPUES DE ADMINISTRAR UN

RADIOFÁRMACO.

NUMERO DE MUESTRA

TIEMPO (h)

PLASMA Radiactividad (KBq/mL)

1 1 4438 2 2 3268 3 3 2404 4 4 2062 5 24 870

-λh(2)= (lnC1-lnC2)/(t2-t1) = (ln 2062 - ln 870)/(24 h - 4 h) = 0.04315 h-1 A los datos experimentales que conforman la fase rápida se le sustraen los valores correspondientes a la fase lenta (método de los residuos o “feathering”) y así se traza la pendiente rápida de la fase de distribución inicial real. Ah(1) y Ah(2) se obtienen del intercepto con las ordenadas.

-λh(1)= (lnC1dif.-lnC2dif)/(t´2-t´1) = [ln(4438 - 2350 )-ln(2404 -2510)]/(3-1)= 1.053 h-1 de la extrapolación en la curva (fig. 1) : Ah(1) = 6072 KBq Ah(2) = 2450 KBq Por lo que la función de distribución puede expresarse como:

La actividad acumulada puede expresarse como : A~= 6072 KBq/(1.0543 h-1) + 2450 KBq/ (0.0431 h-1)

A~= 62.545 MBq.h

3. Modelos compartimentales

En el modelo compartimental el sistema biológico es tratado como compartimentos

interconectados como un ensamble de unidades físicas y químicas idénticas. Cada ensamble es una entidad anatómica identificable (ej. un órgano como el hígado), una entidad fisiológica identificable (ej. sistema retículo endotelial) o una entidad física identificable (ej. agua del espacio extracelular) (Fig. 2).

lvi

Figura 2. Modelo general para la cinética de los radionúclidos

Sin embargo, referirse a una entidad identificable o un compartimento discreto es

únicamente conceptual. Un modelo compartimental está caracterizado por el número de compartimentos a por las probabilidades de transición, o velocidades de intercambio, entre los compartimentos, lo cual puede ser representado matemáticamente como un grupo de ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas (Fig. 3).

La forma general de la solución para el sistema compartimental puede expresarse como:

tki

ieCtA −∑=)( (16)

Ci y k i son constantes las cuales consisten en la suma y produc tos de las λs en las ecuaciones diferenciales. El número de exponenciale s en cada solución será el mismo

que el número total de compartimentos en el modelo.

Transfer Compartment

Spleen Kidneys

UrineLiver

λ

λλ

λ

λ

1

2

3

45

λ

λ

6

7λR

λ R

λR

λR

λR

Bazo (S)

Hígado (L)

Compartimento de

transferencia (TC)

Riñones (K)

Orina (U)

Bazo: dAS

dt= λ1ATC − λ2 + λ R( )AS

Hígado: dAL

dt= λ6ATC − λ7 + λR( )AL

InhalaciónModelo del

Tracto respiratorioModelo del

tractoGastrointestinal

Ingestión

Excreción fecal

Compartimento de transferencia

Compartimentotejido

1

Compartimentotejido

2

Compartimentotejido

3

Compartimentotejido

i

a1 a2 a3 ai

Excreción

Vejigaurinaria

Excreción urinaria Excreción fecal sistémica

Modelo del tractoGastrointestinal

fu f f

lvii

Riñones: dAK

dt= λ3ATC − λ4 + λ5 + λ R( )AK

Orina: dAU

dt= λ5AK − λR( )AU

C. Transferencia:dATC

dt= − λ1 + λ 3 + λ 6 + λ R( )ATC + λ2 AS + λ4 AK + λ7 AL

Figura 3. Modelo biocinético compartimental

Los factores que determinan la cantidad de dosis ab sorbida por un órgano son:

� Los parámetros biológicos (modelo biocinético) que describen la captación, distribución, retención y liberación del radiofármaco en el órgano en particular y en el cuerpo.

� La energía emitida en cada transformación nuclear, que puede provenir de emisiones penetrantes y no penetrantes.

� La fracción de energía emitida que es absorbida en el blanco. En un tratamiento o estudio de diagnóstico en medicina nuclear, la dosis de radiación

absorbida será precisamente el producto de los factores dependientes del tiempo (biocinéticos) por aquellos que son independientes del tiempo como el tipo y energía de emisión del radionucleido. Los factores que no dependen del tiempo pueden por tanto manejarse como constantes. Sin embargo, para poder evaluar los parámetros dependientes del tiempo, es necesario realizar cálculos sobre bases individualizadas o personalizadas.

La ecuación genérica para el cálculo de la dosis absorbida en un órgano es:

m

EnAD

iii φ∑=~

(17)

Donde D = dosis absorbida (Gy); ~A = es la actividad acumulada (MBq.s); ni= número

de partículas con energía Ei emitidas por transición nuclear; Ei= energía por partícula (MeV); φi = fracción de la energía absorbida en el blanco; m= masa de la región blanco (Kg).

El término “actividad acumulada” (~A ) es el área bajo la curva de actividad-tiempo para

un órgano fuente o región. Como la actividad es el número de desintegraciones por unidad de tiempo, integrando ésta sobre el tiempo da el número total de desintegraciones.

⋅= ∫ dttAAt

h )(~

0

(18)

La ecuación de la dosis absorbida en el sistema MIRD (“Medical Internal Radiation Dosimetry”) es una representación simplificada de la ecuación (17) como sigue:

D = A~S. (19) La actividad acumulada representa el factor biológico como anteriormente se explicó,

mientras que el factor “S” engloba a todos los parámetros físicos involucrados en la evaluación de la dosis absorbida:

m

EnS i

iii∑=

φ (20)

En cualquier problema real de dosis interna, siempre habrá más de un órgano que concentre la actividad, por tanto, se tienen que considerar muchos blancos para los que se requiere saber la dosis absorbida. En este caso, la ecuación MIRD necesita ser resuelta para cada región fuente (rh) y para cada región blanco (rk) como sigue:

)(A~)( h hkh

hk rrSrrD ←=← ∑ (21)

lviii

Si el área bajo la curva actividad-tiempo para un órgano fuente (actividad acumulada) es normalizada a la cantidad de actividad administrada (A0), esto es definido como “tiempo de residencia”.

τ hhA

A=

~

0

(22)

Utilizando esta definición, la ecuación de la dosis puede ser escrita como:

)()( 0 hh

khhk rrSArrD ←=← ∑τ (23)

Los valores de actividad acumulada (~A ) o tiempo de residencia (τ ) deben de ser

calculados para aquellos órganos donde la actividad se concentra (ejem. hígado, riñones, bazo, tiroides), para los órganos involucrados en la excreción del radiofármaco del cuerpo (ejem. vejiga e intestinos) y el cuerpo remanente. Así, la dosis absorbida se calcula multiplicando los

valores de ~A (ó τ ) por los apropiados valores de “S”.

Programas de cómputo para el cálculo de la dosis in terna.

El programa de computadora MIRDOSE se desarrolló para realizar el cálculo de dosis a órganos en medicina nuclear. El código se renombró OLINDA (Organ Level Internal Dose Assessment), para distinguirlo de las actividades del Comité MIRD y para integrar el nombre dentro de un nuevo sistema unificado de evaluación de la dosis interna y externa. La ecuación implementada en el programa MIRDOSE fue:

SASAD ⋅⋅=⋅= τ0~

(24)

Dondeτ es el tiempo de residencia (el cual es igual a 0/~ AA , la actividad acumulada

dividida entre la actividad administrada al paciente [A0] y S está dado por la ecuación (20). El sistema OLINDA para coincidir con el Comité MIRD, expresa la dosis como:

DFND ×= (25) Donde N es el número de desintegraciones que ocurren en un órgano fuente, y DF (el factor

de dosis) es:

mEnkDFi

iii

= ∑ φ (26)

El DF matemáticamente es el mismo que el valor S. El número de desintegraciones es la integral de la curva tiempo-actividad para una región fuente. La integral de esta función tiene unidades de actividad x tiempo (Bq s). Si se usa el número de desintegraciones que ocurren en una región fuente, se obtiene la dosis total para las regiones blanco seleccionadas. Sin embargo, si se usa el número de desintegraciones que ocurren en una región fuente por unidad de actividad administrada, se define N en unidades de Bq-s/Bq administrado. Se puede introducir el valor de N, en unidades de tiempo. Debido a que el sistema OLINDA pide como entrada los valores de N en Bq-h/Bq, esto es el valor del tiempo de residencia utilizados por MIRD.

OLINDA incluye dados de decaimiento para más de 800 radionucleidos y 10 fantomas de cuerpo donde se pueden variar el tamaño de las masas de los órganos. OLINDA además usa el valor del factor de peso (wR), como está definido por la Comisión Internacional en Protección Radiológica (ICRP) y es un programa validado y aprobado por la FDA (“Food and Drug Administration”) en Estados Unidos para realizar cálculos de dosimetría interna.

mwEnkDFi

Riii

= ∑ φ (27)

El programa de cómputo SAAM II (SAAM II version 1.2, bajo licencia SAAM Institute, Inc., USA), ejecuta rutinas de mínimos cuadrados para optimizar el ajuste de las curvas de actividad vs. tiempo en cada órgano e iterativamente ajusta los valores de los coeficientes de transferencia entre compartimentos.

lix

Dosis en radioterapia de blancos moleculares.

En un tratamiento de radioinmunoterapia la limitante de la actividad a administrar es la dosis de radiación recibida a médula ósea (no más de 2-3 Gy). Específicamente en el tratamiento de linfomas donde muchas veces no se encuentran masas visibles, se recomiendan 0.75 Gy a cuerpo entero (aproximadamente 2 Gy a médula ósea) mediante la administración de aproximadamente 2.22 a 4.44 GBq de 131I-anti-CD20 (Bexxar).

En el caso de radioterapia con péptidos radiomarcados, la limitante es la dosis recibida por los riñones, ya que la dosis máxima tolerada por éstos es de 25-30 Gy.

Entre los péptidos más exitosos para radioterapia de blancos moleculares están los análogos de la somatostatina marcados con Y-90 ó Lu-177: DOTA-Tyr3-octreótido (DOTATOC), DOTA-lanreótido (DOTALAN) and DOTA-Tyr3-octreotato (DOTATATE). Los pacientes con tumores neuroendócrinos metastásicos reciben por ejemplo de 1.7 a 27 GBq durante 1-5 ciclos de 90Y-DOTATOC, depositando dosis de radiación a los riñones de 5.9 –26.9 Gy por ciclo para un total 18.3–38.7 Gy. Otros pacientes han recibido de 3 a 7 ciclos (3.7 a 7.4 MBq) de 177Lu-DOTATATE hasta una actividad final acumulada de 22.2–29.6 GBq, depositando dosis de radiación renales de 1.8 –7.8 Gy por ciclo y un total de 7.3–26.7 Gy. Las dosis absorbidas a los tumores han alcanzado hasta 600 Gy. Los resultados muestran una adecuada regresión del tumor, una duración promedio de 2 años como respuesta a la terapia y son favorables con las pocas opciones de tratamiento que tienen estos pacientes. Si se logra optimizar el uso de agentes protectores para los riñones, los efectos secundarios se reducirán considerablemente.

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4. de Jong M., Kwekkeboom D.J., Valkema R., Krenning E.P. (2004) Tumor therapy with radiolabelled peptides: current status and future directions, Digestive and Liver Disease 36: S48-S54.

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Design of Therapeutic Radiopharmaceuticals

Maria Neves

1. Introduction

Radiopharmaceuticals are extensively used in diagnostic imaging and have seen a rapid growth in the last few years in a systemic radionuclide therapy modality. This one is based on the selective uptake of the radiopharmaceutical by a molecular target - also named molecular targeted radiotherapy (MTR) - and selective delivery of radiation doses to target tissues. 131I as iodide, 32P in the form of orthophosphate and 89Sr in chloride form have been the first radiochemicals to be evaluated for radiotherapy purpose, with the first clinical use dating back to 1939. This recent revival of interest, it is a consequence of improvements in specific biomolecules and its potential advantages over external radiotherapy, particularly for patients with inoperable or multi-site diseases. Since MTR requires the administration of significantly higher activities than for diagnostic applications, a larger number of exigencies are necessary: high target binding, uniform target distribution, minimum irradiation of critical organs, effective biologic dose-response, precise estimation of radiation dosimetry, radiation protection, etc. Being a radiopharmaceutical constituted by three components: targeting vector, radionuclide and a molecule linking together, substantial efforts in several research areas are required. The radiation dose delivered to the cancer cells by a radionuclide, should be intrinsically related to the radiobiology response in terms of the relative ability of different tissues to recover from radiation damage, and the absolute ability to control concurrent tumour re-growth. As each human cancer has its own cellular cytoxicity and cytoprotective response to ionizing radiation, a certain energy threshold has to be surpassed to achieve the cell death. This means that a “tailored” radionuclide should exist that will be able to provide the desired therapeutic effect. This energy threshold depends on several chemical/biochemical factors (carrier molecule, target affinity, cell distribution, biokinetics, route of administration, radiation safety, etc.) although the radionuclide properties play one of the most important roles.

Basic research in molecular biology, have led to an understanding of the fundamental

mechanisms of biological processes associated to diseases at molecular and cellular levels, and consequently there are hundreds of molecules that could be considered potential targeting vectors. Molecular targets are often differently expressed, i. e. show significant increased level of expression in tumours and normal tissues, offering a ”window” of possibilities to study new targeted biomolecules. The selective uptake of radiopharmaceuticals by a target, using a molecular vehicle, which either its located on the surface of cells or is preferentially accumulated within them, could be considered the basis of two main mechanism: (i) extracellular specific cell surface receptors and (ii) intracellular metabolic process or metabolic trapping. Extracellular specific cell surface receptor biomolecules are mostly monoclonal antibodies, their fragments and peptides, and hormones. Selective uptake of radiopharmaceuticals by metabolic processes are: - 131I (as the thyroid requires about 1 mg of iodine per week, it indicates that 131I is rapidly

incorporated), and m-iodobenzylguanidine (131I-MIBG) (a catecholamine analogue which is taken in catecholamine storage vesicles).

- 89Sr in chloride form, which is taken up into the mineral bone matrix and is selectively concentrated in areas of osteoblastic activity with a biological behaviour resembling that of calcium, and radiolabelled bisphosphonates which are also taken by the mineral bone matrix.

- Ligands that map metabolism pathways and associated with uncontrolled metabolism of cells proliferation - sugars, aminoacids and nucleotides – being 18F- labelled deoxyglucose the paradigm ligand.

- Ligands that interact with other pathways of cell metabolism as aminoacids, nucleosides, nitroimidazoles or caspase inhibitors are being explored for radioimaging, but could be screened for therapy purposes.

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For identified diseases locals, more effective radiation doses may be deposit by non-systemic locoregional application of therapeutic radiopharmaceuticals. This approach can be considered as interventional nuclear medicine. Examples are:

- Intracavitary administration of radiolabelled colloids, chelates or antibodies to treat malignant effusions, cystic tumours, as well as arthritic diseases (radiosynoviorthesis).

- Intraluminal applications, e.g. intracoronary radionuclide therapy of coronary artery disease. - Intraarterial targeting of localised tumours using radiolabelled lipiodol, resin particles and

glass microspheres. - Direct intratumoural injection of radiopharmaceuticals, e.g. the use of 131 I-labelled

monoclonal antibodies or 90Y-DOTA-octreotide in glioma and 32P-colloids in unresectable pancreatic or hepatic tumours.

The research of therapeutic radiopharmaceuticals for locoregional applications includes two main approaches. To consider radionuclide labeled substances that bind specifically to over expressed molecules, as the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the case of glioblastoma multiforme, and to explore the physical properties of the radiopharmaceutical as lipophilicity and/or particles size adjusting these properties to the physiological tissue binding or cavity size, as in the case of I-131-lipiodol for hepatocarcinoma and hepatic metastasis, and radionuclide labelled particles for radiation synovectomy.

The new challenge, is to enhance MTR by combining it with the transfer into tumour cells of genes encoding specific transporters. The genomic revolution, i.e. sequencing of the human genome and developments in high-throughput technology, which provide extensive capabilities for the analysis of a large number of genes or the whole genome, has the potential to enable us to predict patient responses to radiotherapy. These assays can be carried out in various clinical samples at the DNA (genome), RNA (transcriptome) or protein (proteome) level. There is a belief that this genomic revolution, heralds a future of personalised medicine. For clinical oncology, this progress should also increase the possibility of predicting individual patient responses to radiotherapy. A better understanding of the radiobiology and mechanism of action of MRT will facilitate the development of future compounds and the future designs of prospective clinical trials, and new carrier and targeting agents have engendered great enthusiasm and are beginning to emerge for clinical use. As additional agents for tumor targeting imaging become available, one should not lose sight of the effective bound radionuclides in their therapeutic armamentarium.

2. Targeting vector

The biochemistry of life involves a complex series of interdependent interactions that comprise homeostasis. These interactions can be envisaged as the interaction of the genome and the ‘functional’ molecules it encodes through bioenergetically driven chemical interactions. The main interactive groups of molecules are: - those arising from expression of the genome, namely, the proteins, including enzymes,

receptors, structural elements, and antibodies, - those related to the genome, including nucleosides and nucleotides, nucleic acids,

aptamers, and oligonucleotides, - those providing energy to drive these systems, specifically glucose, acetate, and fatty acids,

and compounds that reflect oxygen-dependent processes.

Radiopharmaceutical chemistry has addressed the issue of biomolecular chemistry, and radiopharmaceuticals are unique in their ability to monitor receptor binding sites. There are a growing number of biologically targeted agents that include not only radiolabeled immunoconstructs, but also radiolabeled peptides, nanoparticles and bisphophonates which selectively image diseases areas. Major developments in the molecular biology of cancer, have brought forth the discovery of a number of receptor systems and other cell surface molecules, that can be utilized as molecular targets for peptide based agents. Many types of tumour over express cell surface-associated antigens or receptors suitable as targets for radionuclide therapy, and many types of targeting agent have been suggested or are already being applied for such therapy. The main problem is that the incorporation of the radionuclides could affect the

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ligand targeting function, and so non-specific uptake my play a greater influence on the overall biodistribution pattern. Non-specific uptake increases the radiation dose to normal tissues, limiting the desired therapeutic effect. Recent years have seen an increased effort in the development of peptide based radiopharmaceuticals for nuclear medicine applications in therapy, in particular new treatment strategies.

Several nanoscale carriers (nanoparticles, liposomes, water-soluble polymers, micelles and

dendrimers) have shown to be promise for targeted delivery of cancer diagnostic and therapeutic agents. These carriers can selectively target cancer sites and carry large payloads, thereby improving cancer detection and therapy effectiveness. Nanocarriers may also used to deliver therapeutic agents, including radionuclides. The surface of liposomes can be modified with different functional groups (antibodies, peptides, etc.), enabling radiolabeled liposomes to be used for molecular imaging and targeted radionuclide therapy. Radiotargeted nanoparticles are a promising class of new experimental medicines that throughout the enhanced permeability and retention effect, tend to accumulate within tumors.

Although such strategies are very appealing and shows great potential for application in humans, there are as yet very few radiopharmaceuticals developed based on these scheme that have made it into clinical practice. Many different factors contribute to the generation of a successful radiopharmaceutical. Among these, a thorough and efficient preclinical evaluation process is necessary to single out those lead compounds that show more promise in clinical applications. To maximize the efficacy of pre-clinical testing, one must utilize currently available technology to the best extent possible. Expertise in different areas of drug development is indispensable for this type of research.

The future of diagnostic and therapeutic nuclear medicine, is focused on the use of

radiolabeled protein fragments, peptide structures and DNA chains. Ribosomes (RNA that acts as a messenger between DNA and the protein synthesis complexes), offers a highly promising target for therapeutics. Scientific and technical breakthroughs have significantly advanced, and several classes of molecules and different approaches have been investigated as RNA therapeutics, including antisense RNA, ribozymes, RNA decoys, aptamers, small interfering RNA and microRNA. However, potential applications of RNA drugs in the treatment of human diseases remain in their infancy. Multiple challenges, such as optimization of selectivity, stability, delivery and long-term safety, have to be addressed in order for RNA drugs to become a successful therapeutic category. The advent of gene transfer technology, promises to widen the scope of MRT by enabling the expression by tumor cells of membrane-bound proteins that actively accumulate radiopharmaceuticals. Antigene radiopherapy is based on targeting local damage to specific sites in the genome by using sequence-specific triplex-forming oligonucleotides to carry Auger electron emitters.

3. Radionuclide selection

For MRT to be successful various physical, physiological and biological parameters have to be carefully studied in order to optimize the choice of the radionuclide. As uncertainty risks of internal radiations are often likely to be much greater than for external radiation therapy, the radionuclide selection is a fundamental key issue. The radionuclide selection is essentially related to the appropriate radiation absorbed dose which should match the desirable biologic effect, i.e. deliver a cytotoxic radiation dose and avoid unnecessary radiation dose to surrounding healthy tissues. Auger electrons, alpha and beta particles differ considerably in mass, energy and range, and these factors contribute to the different biological effects they produce and their respective potential for therapeutic use. Auger are very low-energy electrons with subcellular ranges (nanometers), while alpha particles exhibit high linear energy transfer (LET) acting directly to disrupt cellular targets, such as DNA, and beta particles with low LET act indirectly via the generation of free radicals. The radiobiology response to the radiation is dependent on an essential parameter - the radiation range in tissues. The radiation range in tissues can vary from 2-500 nm for Auger electrons, to approximately 40-100 µm for alpha particles, and from 0.05-12 mm for beta particles. Three main categories of decay have been studied for therapeutic applications. These are beta-particle emitters, alpha-particle emitters, and Auger and Coster-Kronig electron emitters. Gamma-ray emission may or may not accompany these decay processes and will contribute little to the therapeutic effectiveness;

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however, if the gamma-ray energy is in the diagnostically useful range, it may be useful for scintigraphic imaging and for determinations of in vivo localization of the radiopharmaceutical

The biological response will depend of the radiopharmaceutical hall-life and pharmacokinetics parameters, such as: uptake, circulation, metabolisation, clearance time, vascular supply, tumour size, cells radiosensibility, etc. Radionuclide selection should include an analysis of what would be best in terms of radiobiology, despite of being undoubtedly a relevant discipline to which little attention has been paid. In general antigen expression is heterogeneous, but it could be minimized by selecting a radionuclide with energy values that allows effective use of the called “crossfire effect”, that occurs when ionizing radiation still reaches a neighboring nonantigen expressing cell. Also, the poor ability of most carriers to penetrate in sufficient quantities into solid tumors has led to the use of intermediate and high-energy β-emitters (most notable 90Y and 131I), with typical ranges spanning several cell diameters, which are capable of effectively cross-irradiating tumor cell populations that are not directly targeted by the radiopharmaceutical. Radiochemicals tagged with low energy electron emitters are preferred in bone metastases palliative therapy, because they are more likely to deliver a therapeutic dose to the bone and spare the bone marrow. Auger electron emitting radionuclides, are ideally fit for targeting radionuclides of genes, providing that they can be positioned near to the genomic DNA, i.e. the emitted energy should be absorbed maximally within the DNA of the targeted tumor cells. Since differences in radiosensibility between tumor cell`s types could decide on the success or failure of MTR, the following aspects have to be considered: - The appropriate radiation absorbed dose (which should match the biologic desirable effect),

and consequently the properties of the radionuclides emissions (type of radiation, energy and half-life);

- The biological response i. e. the response of cells to radiation in terms of radiosensitivity, repair capacity and proliferation rate or repopulation;

- The continuous refinement of nano- and microdosimetry in order to increase the accuracy and the dose/response correlations.

Related experience in external radiotherapy, in spite of the similarities but also

profound differences of MRT, could support researchers in a radiobiological selection linking physics and radiobiology. In external radiotherapy, the absorbed dose can be calculated relatively straightforwardly from the energy loss in the body from the point where the radiation enters the body to the target, while in MTR a dynamic metabolic process, both biochemically and physically within the time interval of the decaying isotope, entails a much more complex spatial and temporal radiation distribution. Radionuclide therapy provides a low and continuously decreasing dose rate, while external radiotherapy is a fractionated high dose. A better understanding of the radiobiology and mechanism of action of MTR, will provide the basis to develop new radiopharmaceuticals and designs of prospective clinical trials. References - Stephen J. Mather, Design of radiolabelled ligands for the imaging and treatment of cancer,

Molecular BioSystems, 2007, 3, 30-35. - M. Neves, A. Kling and A. Oliveira, Radionuclides used for therapy and suggestion for new

candidates, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2005, 266(3), 377-384. - A. C. Perkins, In vivo molecular targeted radiotherapy, Biomedical Imaging and Intervention

Journal, 2005, 1(2), 1-7. - C. M. L. West, R.M. Elliott and N.G. Burnet, The Genomics Revolution and Radiotherapy

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Diseño de Radiofármacos Terapéuticos

Maria Neves

Traducción: Ana María Robles

1. Introducción

Los radiofármacos son ampliamente empleados en diagnostico por imágenes y han visto (experimentado) un rápido crecimiento en los pasados años en la modalidad de Terapia radionucleídica sistémica. Esta última es basada en la captación selectiva del radiofármaco por una molécula “target” y se denomina radioterapia molecular (RTM)

131I como yoduro, 32P en la forma de ortofosfato y 89Sr como cloruro han sido los primeros radionucleidos en ser evaluados con fines radioterapéuticos con un primer uso clínico en 1939. Este reciente resurgimiento del interés, es consecuencia del progreso en biomoléculas específicas y sus potenciales ventajas sobre la radioterapia externa, principalmente en pacientes con enfermedades inoperables o diseminadas. Ya que la RTM requiere de la administración de actividades significativamente más elevadas que para las aplicaciones diagnósticas, un mayor número de requisitos son exigidos: elevada unión a la molécula “target”, distribución uniforme en la molécula “target”, irradiación mínima en órganos críticos, efectiva relación dosis biológica-respuesta, estimación precisa de la dosimetría de la radiación, protección radiológica, etc. Siendo un radiofármaco constituído por tres componentes: molécula vector, radionucleido y una molécula que enlace los dos, se requieren esfuerzos importantes en varias áreas de investigación.

La dosis de radiación depositada a la célula cancerosa por un radionucleido, debería ser intrínsecamente relacionadas con la respuesta radiobiológica en términos de la capacidad relativa de los diferentes tejidos de recuperarse del daño por radiación y la absoluta capacidad de controlar el simultaneo re-crecimiento del tumor. Como cada tipo de cáncer humano tiene su propia citotoxicidad y respuesta cito-reparadora a la radiación ionizante, una energía umbral dada tiene que ser superada para alcanzar la muerte celular. Esto significa que debería existir un radionucleido “a medida” que sea capaz de alcanzar el efecto terapéutico deseado. Esta energía umbral depende de varios factores químicos/bioquímicos (molécula portadora, afinidad de la molécula “target”, distribución celular, biocinética, vía de administración, seguridad radiológica, etc.), a pesar de que las propiedades del radionucleido desempeñan uno de los papeles más importantes.

La investigación básica en biología molecular, ha llevado a una comprensión de los

mecanismos fundamentales de los procesos biológicos asociados a las enfermedades en los niveles molecular y celular y en consecuencia, hay cientos de moléculas que podrían considerarse posibles “targets” moleculares. Los “targets” moleculares, a menudo se expresan diferentemente, por ejemplo, muestran un nivel significativamente incrementado de expresión tanto en tejido tumoral como sano ofreciendo un espectro de posibilidades para estudiar nuevas biomoléculas-“targets”. La captación selectiva del radiofármaco por un “target”, utilizando un vehículo molecular, que es localizado sobre la superficie de la célula o es acumulado dentro de ella, podría considerarse basada en dos mecanismos principales: (i) receptores específicos extracelulares de superficie y (ii) procesos metabólicos intracelulares o captación metabólica. Biomoléculas especificas de receptor de superficie extracelular son en su mayoría anticuerpos monoclonales, sus fragmentos y péptidos y hormonas. Procesos metabólicos de captación selectiva de radiofármacos son:

- 131I (ya que la tiroides requiere aproximadamente 1 mg de yodo por semana, el 131I es rápidamente incorporado), y m-iodobenzylguanidina (131I - MIBG) (un análogo de catecolaminas, que es captado en las vesículas de almacenamiento de catecolaminas).

- 89Sr en forma de cloruro, que se captado por la matriz mineral ósea y es selectivamente concentrado en zonas de actividad osteoblástica con un comportamiento biológico que asemeja al del calcio y bifosfonatos radiomarcados que también son captados por la matriz mineral ósea.

- Ligandos que siguen rutas metabólicas y se asocian con el metabolismo no controlado de proliferación celular- azúcares, aminoácidos y nucleótidos- siendo la deoxyglucose marcada con 18F, la molécula paradigma.

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- Ligandos que interactúan con otras vías de metabolismo celular como aminoácidos, nucleósidos, los nitroimidazoles o inhibidores de caspasas, están siendo explorados para radioimagen aunque podrían ser analizados con propósitos terapéuticos.

Para enfermedades localizadas identificadas, dosis de radiación más efectivas pueden ser depositadas por aplicación locoregional no sistémica de radiofármacos terapéuticos. Este enfoque puede considerarse como medicina nuclear intervencionista. Ejemplos de ello son:

- Administración intracavitaria de coloides radiomarcados, quelatos o anticuerpos para tratar derrames malignos, tumores quísticos, así como enfermedades artríticas (radiosinoviortesis).

- Aplicaciones intraluminales, por ejemplo, terapia radionucleídica intracoronaria para la enfermedad de la arteria coronaria.

- Aplicaciones intraarterial de tumores localizados utilizando lipiodol radiomarcado, partículas de resina y microesferas de vidrio.

- Inyección intratumoral directa de radiofármacos, por ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales marcados con 131I u DOTA-octreotide marcado con 90Y en el glioma y coloides de 32P en tumores pancreáticos o hepáticos no resecables.

La investigación de los radiofármacos terapéuticos para aplicaciones locorregionales

incluye dos enfoques principales. Considerar sustancias marcadas con radionucleidos que se unen específicamente a moléculas sobreexpresadas como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en el caso del glioblastoma multiforme, explorar las propiedades físicas del radiofármaco como lipofilicidad y/o tamaño de las partículas que adaptan estas propiedades a la unión al tejido fisiológico o al tamaño de la cavidad como en el caso de 131I-lipiodol para hepatocarcinoma y metástasis hepática, y partículas marcadas con radionucleidos para radiosinovectomía.

El nuevo desafío, es estimular la RTM combinándola con la transferencia de genes que

codifican “transporters” específicos a las células tumorales. La revolución genómica, es decir, la secuenciación del genoma humano y desarrollo de tecnología de alto rendimiento, que ofrecen amplias capacidades para el análisis de un gran número de genes o la totalidad del genoma, tiene el potencial de permitirnos predecir las respuestas del paciente a la radioterapia. Estos ensayos pueden ser llevados a cabo en diversas muestras clínicas a nivel de ADN (genómica), ARN (transcriptosomica) o proteínas (proteómica). Existe la creencia de que esta revolución genómica, anuncia un futuro de medicina personalizada. En la oncología clínica, este progreso debería también aumentar la posibilidad de predecir las respuestas individuales de los pacientes a radioterapia. Una mejor comprensión de la radiobiología y mecanismo de acción de RTM facilitará el desarrollo de futuros compuestos y futuros diseños de prospectivos ensayos clínicos y los nuevos agentes portadores y sondas han generado gran entusiasmo y están comenzando a surgir para uso clínico. A medida que más agentes para imagen de tumores marcados estén disponibles, no se debería perder de vista los radionucleidos unidos efectivamente como arsenal terapéutico.

2. Molécula vectora

La bioquímica de la vida supone una compleja serie de interacciones interdependientes que conforman la homeostasis. Estas interacciones pueden ser vislumbradas como la interacción del genoma y las moléculas funcionales que codifica a través de interacciones químicas bioenergeticamente dirigidas. Los principales grupos interactivos de moléculas son:

- Los derivados de la expresión del genoma, es decir, las proteínas, incluyendo las enzimas, receptores, elementos estructurales, y anticuerpos,

- Aquellos relacionados con el genoma, incluidos nucleósidos y nucleótidos, ácidos nucleicos, aptámeros, y oligonucleótidos,

- Los que proporcionan la energía para conducir estos sistemas, en particular la glucosa, acetato, y los ácidos grasos, y los compuestos que reflejan procesos dependientes de oxígeno.

La química radiofarmacéutica ha incorporado la química biomolecular debido a que los radiofármacos son únicos en su capacidad para monitorear sitios de unión del receptor. Hay un número creciente de agentes biológicamente dirigidos, que incluyen no sólo immunoconstructos radiomarcados sino también péptidos, liposomas, nanopartículas y bisfosfonatos radiomarcados que selectivamente delinean áreas de enfermedad.

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Enormes desarrollos en la biología molecular del cáncer, han apoyado el descubrimiento de un número de sistemas receptores y otras moléculas de la superficie celular que podrán ser utilizados como “targets” moleculares para agentes basados en péptidos. Muchos tipos de tumores sobreexpresan antígenos asociados a la superficie celular o receptores adecuados como “target” de la terapia radionucleídica y muchos tipos de agentes radiomarcados se han sugerido o ya se aplican para este tipo de terapia. El principal problema es que la incorporación de los radionucleidos podría afectar la afinidad del ligando y así la captación no específica puede tener una mayor influencia en el patrón general de biodistribución. La captación no específica aumenta la dosis de radiación a los tejidos normales, lo que limita el efecto terapéutico deseado. En los últimos años se ha producido un mayor esfuerzo en el desarrollo de radiofármacos basados en péptidos para aplicaciones en medicina nuclear, en particular, nuevas estrategias de tratamiento.

Varios portadores a escala nanométrica (nanopartículas, liposomas, polímeros solubles en

agua, micelas y dendrímeros) han mostrado ser prometedores para liberar agentes diagnósticos y terapéuticos de cáncer. La superficie de los liposomas se pueden modificar con diferentes grupos funcionales (anticuerpos, péptidos, etc.), lo que les permite, radiomarcados, ser usados para Imagenología molecular y RTM. También las nanopartículas marcadas radionucleidicamente son una prometedora nueva clase de medicamentos experimentales que a través del incremento de su permeabilidad y el efecto de retención, tienden a acumularse dentro de los tumores.

Aunque estas estrategias son muy atractivas y ofrecen grandes posibilidades de aplicación en el ser humano, existen aún muy pocos radiofármacos desarrollados en base a estos esquema que hayan alcanzado la práctica clínica. Diferentes factores contribuyen a la generación de un radiofármaco exitoso. Entre ellos, un exhaustivo y eficiente proceso de evaluación preclínica es necesario para seleccionar los compuestos de primer nivel que muestran mayor promesa de aplicación clínica. Para maximizar la eficacia de la prueba pre-clínica, se debe utilizar la tecnología disponible en la actualidad en su mayor medida posible. La experiencia en diferentes áreas del desarrollo de fármacos es indispensable para este tipo de investigación.

El futuro de la medicina nuclear diagnóstica y terapéutica, se enfoca hacia el uso de

fragmentos proteicos radiomarcados, estructuras peptídicas y cadenas de ADN. Los ribosomas (secuencia de ARN que actúa como mensajero entre el ADN y los complejos de síntesis de proteínas), ofrece un muy prometedor objetivo de la terapéutica. Resultados científicos y técnicos han avanzado significativamente y varias clases de moléculas y enfoques diferentes se han investigado como ARNterápicos incluyendo RNA-antisentido, ribozimas, RNA-señuelos (mutantes), aptámeros, ARN interferente y micro ARN. Sin embargo, las potenciales aplicaciones de ARN-drogas en el tratamiento de enfermedades humanas siguen en sus comienzos. Múltiples desafíos, como la optimización de la selectividad, la estabilidad, liberación y seguridad a largo plazo, tiene que estar explicita para que las ARN-drogas para convertirse en una categoría terapéutica exitosa. El advenimiento de la tecnología de la transferencia génica, promete ampliar el ámbito de la RTM al permitir la expresión por las células tumorales de las proteínas de membrana que activamente acumulan radiofármacos. La radioterapia anti-gen se basa en la marcación localizada de sitios específicos del genoma mediante oligonucleótidos en triple hélice específicamente secuenciados portadores de emisores de electrones Auger. 3. Selección del radionucleido

Para que la RTM tenga éxito, diversos parámetros físicos, fisiológicos y biológicos tienen que ser cuidadosamente estudiados con el fin de optimizar la elección de los radionucleidos. A medida que la incertidumbre de los riesgos de radiación interna es a menudo más probable de ser más elevados que los derivados de la terapia de radiación externa, la selección del radionucleido es un asunto fundamental. La elección del radionucleido está esencialmente relacionada con la dosis absorbida de radiación que debe ajustarse al efecto biológico deseado, es decir, entregar una dosis de radiación citotóxica y evitar la dosis de radiación innecesaria a los tejidos sanos cercanos. Auger, partículas alfa y beta difieren considerablemente en masa, energía y alcance y estos factores contribuyen a los diferentes efectos biológicos que ellos producen y sus respectivos potenciales de uso terapéutico. Auger

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son electrones de muy baja energía con alcances subcelulares (nanómetros), mientras que las partículas alfa, exhiben una elevada transferencia lineal de energía (LET) actuando directamente para destruir “targets” celulares tales como el ADN, y las partículas beta, de baja LET actúan indirectamente a través de la generación de los radicales libres. La respuesta radiobiológica a la radiación depende de un parámetro esencial- el alcance de la radiación en los tejidos. El alcance de la radiación en los tejidos puede variar de 2-500 nm para los electrones Auger, a aproximadamente 40-100 µm para partículas alfa y de 0.05-12 mm para partículas beta. Tres tipos principales de decaimiento se han estudiado para aplicaciones terapéuticas. Estos son emisores de partículas beta, emisores de partículas alfa y emisores de electrones Auger y Coster-Kronig. La emisión gamma puede o no acompañar estos procesos de decaimiento y contribuirán poco a la eficacia terapéutica; sin embargo, si la energía de la radiación gamma esta en un intervalo útil desde el punto de vista diagnostico, puede ser valioso para centellografia por imágenes y para la determinación de la localización in vivo del radiofármaco.

La respuesta biológica dependerá de la vida media del radiofármaco y de los parámetros

farmacocinéticos tales como: captación, circulación, metabolización, tiempo de depuración aporte vascular (irrigación), tamaño del tumor, radiosensibilidad celular, etc.. La selección del radionucleido debería incluir un análisis de que sería mejor en términos de la radiobiología, a pesar de ser, indudablemente, una disciplina relevante a la que se ha prestado poca atención. En general la expresión antigénica es heterogénea, pero podría ser minimizada mediante la selección de un radionucleido con valores de energía que permitieran una utilización eficaz del llamado "efecto fuego cruzado", que se produce cuando la radiación ionizante aun alcanza a las células vecinas que no expresan esos antígenos. También, la escasa habilidad de la mayoría de los portadores de penetrar en cantidad suficiente en tumores sólidos ha conducido al empleo de intermediarios y emisores de alta energía (más notables 90Y y 131I), con alcances típicos que abarcan varios diámetros celulares, que son capaces de efectivamente irradiar colateralmente poblaciones de células tumorales que no son directamente marcadas por el radiofármaco. Sustancias radioquímicas unidas a emisores de electrones de baja energía son preferidos para terapia paliativa en metástasis óseas, porque parecen más cercanos a liberar una dosis terapéutica a los huesos y proteger la médula ósea. Radionucleidos emisores de electrones Auger, son idealmente ajustados al marcado con radionucleidos de genes, siempre y cuando se puede colocar cerca del ADN genómico, es decir que la energía debería ser absorbida al máximo dentro del ADN de la célula tumoral marcada. Ya que diferencias de radiosensibilidad entre tipos de células tumorales podría decidir sobre el éxito o fracaso de la RTM, los siguientes aspectos han de ser considerados:

- La dosis adecuada de radiación absorbida (que debe ajustarse al deseable efecto biológico), y, en consecuencia, las propiedades de las emisiones de radionucleidos (tipo de radiación, la energía y la vida media);

- La respuesta biológica es decir la respuesta de las células a la radiación en términos de radiosensibilidad, capacidad de reparación y la velocidad de proliferación o repoblación;

- El continuo perfeccionamiento de la nano o microdosimetria con el fin de aumentar (su) la exactitud y la correlación dosis/respuesta.

La experiencia relacionada con radioterapia externa, a pesar de las similitudes, pero

también profundas diferencias de RTM, podría apoyar a los investigadores en una selección radiobiológica que vincule la física y la radiobiología. En la radioterapia externa, la dosis absorbida se puede calcular relativamente en forma directa a partir de la perdida de energía del cuerpo desde el punto donde la radiación entra al cuerpo del blanco mientras que en MTR un proceso metabólico dinámico ambos desde el punto de vista físico y bioquímico en el lapso de decaimiento radiactivo del isótopo, entraña una distribución espacial y temporal de la radiación mucho más compleja. La terapia radionucleídica aporta una velocidad de dosis baja y continuamente decreciente mientras que la radioterapia externa es una dosis alta fraccionada. Una mejor comprensión. Una mejor comprensión de la radiobiología y mecanismo de acción de la RTM será la base para desarrollar nuevos radiofármacos y diseños de posibles ensayos clínicos.

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- A. C. Perkins, In vivo molecular targeted radiotherapy, Biomedical Imaging and Intervention Journal, 2005, 1(2), 1-7.

- C. M. L. West, R.M. Elliott and N.G. Burnet, The Genomics Revolution and Radiotherapy 2007, Clinical Oncology, 19(6), 470-480.

- D. Murray and A. J. McEwan, Radiobiology of Systemic Radiation Therapy, 2007, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 22(1), 1-23.

- Y. C. Jeffrey and M. D. Wong, Systemic targeted radionuclide therapy: Potential new areas, 2006, International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 66(2), S74-S78.

- R. J. Mairs and M. Boyd, Targeting Radiotherapy to Cancer by Gene Transfer, 2003, J. Biomed Biotechnol 2003(2), 102-109.

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FARMACOPEA ARGENTINA

Juan Carlos Furnari

En Argentina, el Instituto Nacional de Medicamentos (INAME), dependiente de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT), es responsable de la Farmacopea Argentina y se ha propuesto realizar un proyecto de actualización periódica de su contenido, cuyo fruto fue el primer tomo de la Séptimas Edición, publicado en 2003. Para realizar las revisiones, se han conformado una Comisión de Farmacopea y subcomisiones que cubren las distintas especialidades medicinales, todas integradas por especialistas en las distintas ramas. En particular, la Subcomisión de Radiofármacos está compuesta por profesionales de la Comisión Nacional de Energía Atómica, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires, de las empresas fabricantes de radiofármacos y del mismo INAME . Todos los integrantes tienen experiencia en el desarrollo, fabricación, control de calidad, comercialización, fiscalización o empleo de radiofármacos en Argentina y en el exterior. Dentro de las tareas encomendadas, se incluye la revisión crítica y actualización de cada monografía de los radiofármacos existentes en el mercado local basándose en las farmacopeas más reconocidas, como la europea, la española y la estadounidense, entre otras, además de los antecedentes nacionales, la experiencia personal antes indicada y eventualmente la consulta a otros profesionales externos a la subcomisión. El listado de los radiofármacos ya actualizados, que serán incluidos en los tomos siguientes de la Séptima Edición, incluyen a:

- Pertecneciato de sodio (Tc-99m)

- Gluconato Tc-99m - Pentetato Tc-99m - Medronato Tc-99m - Succimero Tc-99m - Albúmina Tc-99m

- Azufre coloidal Tc-99m - Ioduro de sodio solución (I-131)

- Iobenguano (I-131) - m-iodobencilguanidina (I-131)

- Ioduro de sodio solución (I-123) - Iobenguano (I-123)

- Macroagregados de albumina (Tc-99m) - Clururo de indio (In-111)

- Pentetato de indio (In-111) - Oxiquinolina (In-111)

- Cloruro de talio (Tl-201) - Citrato de galio (Ga-67)

- Cianocobalamina (Co-57) solución y cápsulas - Indio oxina (In-111)

- FDG (F-18) Los radiofármacos aun en revisión incluyen

- Amonio (N-13) - Radiofarmacos de Y-90

- Anticuerpos monoclonales marcados con Y-90 - Preparaciones Radiofarmacéuticas de desarrollo y producción nacional, registradas en

ANMAT no contemplados en Farmacopeas internacionales.

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LEGISLACIÓN SANITARIA RELACIONADA CON LA INDUSTRIA

FARMACÉUTICA Y LA FARMACOPEA MEXICANA

Consuelo Arteaga de Murphy - Guillermina Ferro-Fl ores

LEY GENERAL DE SALUD

La Ley General de Salud Mexicana se promulgó en 1984 y se publicó en el Diario

Oficial de la Federación (DOF 07-11-1984). A partir de entonces ha habido muchas modificaciones a la Ley con objeto de actualizarla y de incluir leyes, reglamentos, normas, acuerdos y decretos nuevos o que no estaban satisfactoriamente enunciados.

La lista es grande y algunos son de interés para la farmacia. Por ejemplo, la “Ley Federal para el Control de Precursores Químicos, Productos Químicos Esenciales y Máquinas para Elaborar Cápsulas, Tabletas y/o Comprimidos” (DOF 26-XII-1997)” y su reglamentación (DOF 15-IX-1999).

Otros reglamentos interesantes son los de la “Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios”; el de la “Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud”, el “Reglamento de la Comisión Interinstitucional del Cuadro Básico de Insumos del Sector Salud” y otros sobre la seguridad social en salud, sobre publicidad y el de una comisión para definir los tratamientos y medicamentos asociados a enfermedades que ocasionan gastos catastróficos. Un inciso lista los medicamentos psicotrópicos de los grupos II, III y IV a los que se refiere el artículo 245 de la Ley General de Salud.

En cuanto a lo que se refiere a Normas se encuentra la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSAI-1993 sobre buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos. Otras normas se refieren al etiquetado de los medicamentos, estabilidad y farmacovigilancia. Otra norma establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable y los requisitos que deben tener los terceros autorizados que realicen las pruebas.

Entre los acuerdos está, entre otros muchos, el que establece las reglas de operación para la fijación o modificación de precios de los medicamentos o de su materia prima.

Otros acuerdos se refieren a los trámites de registro de nuevos medicamentos, a la importación y exportación; a aditivos; coadyuvantes; empaques; y a medicamentos genéricos, herbolarios, alopáticos y homeopáticos.

De la Secretaría de Salud depende la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) que tiene a su cargo, entre otras funciones, el registro sanitario de medicamentos. Para el registro sanitario de un medicamento o radiofármaco se especifican las características u ordenamientos (más de 150 y sumamente rigurosos) que deben cumplir para obtener el registro sanitario. Entre las características se debe especificar detalladamente el proceso de elaboración o ruta sintética, los componentes, contaminantes, control de calidad, estabilidad, estudios in vitro, biodistribución, farmacocinética, estudios de toxicidad, esterilidad e indicaciones (diagnóstico-terapia), entre otros. Un expediente completo facilita el registro del medicamento. De la dirección COFEPRIS dependen muchas otras direcciones y comisiones entre las que se encuentran las comisiones de evidencia y manejo de riesgos sanitarios y la Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (CPFEUM).

Por decreto oficial se creó la CPFEUM que está formada por un consejo directivo, presidido por el director de la COFEPRIS, por una dirección ejecutiva con funciones operativas, por un consejo técnico con funciones científicas formado por más de 150 expertos en todas las áreas de la farmacia, y de un fideicomiso. Entre las muchas funciones del consejo directivo está el de asesorar a la Secretaría de Salud en materia farmacéutica y el de velar porque la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM) se actualice y re-edite periódicamente.

Históricamente, en México ha habido catálogos y registros de medicamentos desde la época pre-colombina. Los panacani o farmacéuticos, preparaban los remedios en forma de infusiones o ungüentos y los vendían en las calles o en “boticas” especializadas (panamacoyan) pero legalmente no podían recetarlos. Los tlama o médicos sí recetaban a los enfermos pero no podían preparar medicamentos. Martín de la Cruz escribió en náhuatl el libro “Hierbas Medicinales” que fue traducido por Juan Babiano quien lo llevó a Europa inmediatamente

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después de la Conquista. En los siglos 17, 18 y 19 hubo muchos tratados de medicamentos y de plantas medicinales y varias farmacopeas pero hasta 1928, por decreto presidencial, se editó la primera farmacopea oficial. Por problemas bélicos y políticos la segunda edición se hizo en 1950 y actualmente está en elaboración la novena edición que se expenderá en enero de 2008 y será parte de las 44 farmacopeas mundiales. Además, se han editado la farmacopea herbolaria y la farmacopea homeopática. Existe el proyecto de editar una farmacopea latinoamericana tomando como fundamento a la FEUM.

Legalmente, la FEUM es la norma de calidad para medicamentos y materias primas y es un instrumento de vigilancia que garantiza la misma calidad de un medicamento con la calidad con la que fue registrado ante la COFEPRIS.

La preparación y la calidad de los radiofármacos ha sido de interés en Latinoamérica por lo cual elaboró un programa, patrocinado por la Agencia Internacional de Energía Atómica (IAEA), sobre Acuerdos Regionales Cooperativos para la promoción de la Ciencia y Tecnología Nucleares en América Latina (ARCAL XV) incluyó tres reuniones de Coordinadores del Proyecto sobre Producción y Control de Calidad de Radioármacos llevadas a cabo en Cartagena de Indias, Colombia (1993), Salvador-Bahía, Brasil (1995) y en Costa Rica (1998). Durante estos años se llevaron a cabo 63 actividades científicas incluyendo cursos regionales, cursos nacionales, talleres, capacitaciones, visitas de expertos extranjeros y se editaron dos Manuales: Manual sobre Recomendaciones para la Aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura Radiofarmacéutica y el Manual de Control de Calidad de los Radiofármacos.

Uno de los talleres, efectuado en Caracas, Venezuela (7-11 octubre 1996), fue el Taller de Armonización de Normas para el Registro y Control Sanitario de los Radiofármacos y en él se discutieron los lineamientos generales para el diseño de un reglamento para el registro sanitario de los radiofármacos que se presentaría a la autoridad competente y se adaptaría a las necesidades de cada país Latinoamericano. En México se ha logrado el registro de los Radiofármacos y su inclusión en la farmacopea nacional

Para el registro de un radiofármaco ante la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) se debe elaborar un expediente detallado que incluya el mayor número de las características para el registro de un fármaco y las pertinentes a la radiactividad de un inyectable. Una vez obtenido este registro se incluye en la Farmacopea y se propone a las autoridades correspondientes que el radiofármaco sea incluido en el cuadro básico de medicamentos de los hospitales del Sector Salud. Un expediente completo facilita el registro del radiofármaco.

FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS (FEUM)

En México se utilizó parte de los lineamientos y recomendaciones de los dos Manuales,

además de experiencias nacionales y se escribió un documento que apareció como Capítulo sobre Radiofármacos en la 8ª Edición de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM) en 2004. Actualmente está en revisión el Capítulo de Radiofármacos de la 9ª edición, que saldrá al mercado en enero de 2008. La responsabilidad por el contenido y redacción del capítulo recae en los expertos del Comité de Radiofarmacia y la edición de la FEUM recae en la máxima autoridad sanitaria nacional que es la Secretaría de Salud (SS).

El Capítulo de Radiofármacos se escribió con el formato de la FEUM que es de dos columnas por página y comprende una introducción, definición de algunos términos específicos de la materia, generalidades, guía de buenas prácticas de manufactura, guía de actividades recomendadas para los estudios en los gabinetes de medicina nuclear y las monografías de diversos radiofármacos de uso general en Medicina Nuclear. En la introducción se menciona el importante papel del ARCAL XV en este capítulo de la FEUM: “La radiofarmacia en México se inició en el año 1965 y esta rama de las ciencias farmacéuticas se ocupa del diseño, preparación, control de calidad y dispensación de los radiofármacos. Con su desarrollo y apoyando el “Programa de Acuerdos Regionales Cooperativos para la Promoción de la Ciencia y la Tecnología Nuclear en América Latina”, ARCAL XV, patrocinado por el Organismo Internacional de Energía Atómica, a través de su proyecto “Producción y Control de Calidad de Radiofármacos”; la Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos junto con un grupo de expertos en Radiofarmacia, se han dado la tarea de elaborar el capítulo de radiofármacos; relacionando conceptos como son garantía de calidad, buenas prácticas de manufactura y control de calidad”.

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Entre las definiciones someras de términos utilizados en este capítulo aparecen las de nucleido, radionucleido, unidades de radiactividad, tiempo de vida media, pureza radionucleídica, radioquímica y química, detección y medida y espectrometría de las radiaciones, entre otros. En los requisitos de control de calidad se elabora sobre: la inspección visual, tamaño y número de partículas; determinación de la actividad y pureza del radiofármaco inyectable; protocolo de estabilidad; biodistribución; afinidad biológica; etiquetado y conservación; radiofarmacocinética y aplicaciones radiofármacodiagnósticas y radiofármacoterapéuticas.

Varias metodologías están incluidas en el cuerpo de la farmacopea como son la cromatografía y la determinación de pirógenos por LAL (MGA 0316) por lo cual no se incluyen en el texto del capítulo.

Con objeto de estandarizar la actividad administrada por los médicos nucleares en gabinetes oficiales y particulares se elaboró la guía de niveles de actividades recomendadas de radiofármacos en pacientes adultos en estudios de medicina nuclear que contiene los estudios, el radiofármaco utilizado, su forma química y la actividad dada en MBq y está redactada en forma de tabla con 4 columnas, por ejemplo: ESTUDIO

RADIONÚCLIDO

FORMA QUÍMICA

ACTIVIDAD

(MBq) Sistema Óseo

Gammagrama óseo

99m Tc

Compuestos de fosfonatos

y fosfatos

600

SPECT óseo

99m Tc

Compuestos de fosfonatos y

fosfatos

800

Médula ósea

99m Tc

Coloide de azufre

400

Para los radiofármacos terapéuticos se mencionan, en dos columnas, el radionucleido, y la forma química. Se especifica que la actividad máxima administrada debe ser determinada en forma individual (radiofármacoterapia personalizada). Para los radionucleidos emisores de positrones solamente se menciona una actividad de 185 MBq. La guía de buenas prácticas de manufactura en radiofarmacia incluye las radiofarmacias hospitalaria, centralizada y la industrializada. En la primera se mencionan capacitación y características del personal; diseño y requisitos de las instalaciones y del equipo; procedimientos de trabajo y preparación de los radiofármacos y de los juegos de reactivos; control de calidad y documentación. Para la radiofarmacia centralizada, además de todo lo ya mencionado, se hace hincapié en la documentación, retiro del producto, y manejo de devolución y de queja y se incluyen auditorías y limpieza y saneamiento para la radiofarmacia industrializada. Las monografías se presentan, en dos columnas por página, en orden alfabético comenzando con el fluor-18, galio-67, yodo, indio-111, renio-188, samario-153 hasta los radiofármacos de 1ª, 2ª y 3ª generación de tecnecio-99m, y terminando con los radiofámacos terapéuticos de renio y samario. Además del 99mTc-HYNIC-octreótido se incluyen otros dos ejemplos de reciente registro sanitario que son el 188Re-anti-CD20 y el 99mTc-UBI 29-41:

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99mTc–HYNIC-OCTREÓTIDO. SOLUCIÓN DESCRIPCIÓN. Solución de un complejo de 99mTc-hidrazinonicotínico-Phe1-Tyr3-octreótido, límpida, incolora, estéril. ENSAYO DE IDENTIDAD. Espectrometría gamma. El espectro de rayos gamma de una preparación de la muestra presenta un fotopico principal con una energía de 0,140 MeV. CONTROLES FISICOQUÍMICOS pH. Entre 6,0 y 7,0. PUREZA RADIOQUÍMICA. Cromatografía ascendente. Mayor de 90 por ciento.

Soporte CCDI-SG CCDI-SG

Disolvente 2-butanona Metanol/acetato de amonio 1 M (1:1 v/v)

Rf 99mTc-HYNIC-octreótido 0,0 0,9-1,0

Rf 99mTcO4

- 0,9-1,0 0,9-1,0

Rf 99mTc-reducido-hidrolizado 0,0 0,0

ACTIVIDAD. Activímetro calibrado. Medir la actividad a inyectar. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No más de 175 UE/V. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO. El radiofármaco es estable almacenado entre 4°C a 8°C durante 24 h, salvo indicación contraria del productor. ___________________________________________________________________________

188Re-ANTI-CD20. SOLUCIÓN DESCRIPCIÓN. Solución de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 marcado con 188Re, límpida ó ligeramente opalescente, incolora, estéril. ENSAYO DE IDENTIDAD. Espectrometría gamma. El espectro de rayos gamma de una preparación de la muestra presenta un fotopico principal con una energía de 0,155 MeV. CONTROLES FISICOQUÍMICOS pH. Entre 5,0 y 7,0. PUREZA RADIOQUÍMICA. Cromatografía ascendente. Mayor de 90 por ciento. Soporte CCDI-SG CCDI-SG CCDI-SG impregnada de HSA ó

BSA*

Disolvente NaCl 0,9 % Acetona Etanol: agua:NH4OH (2:5:1 v/v)

Rf 188Re-Anti-CD20 0,0 0,0 0,9-1,0

Rf 188Re-tartrato 0,9-1,0 0,0 0,9-1,0

Rf 188ReO4

- 0,9-1,0 0,9-1,0 0,9-1,0

Rf 188Re-reducido-hidrolizado 0,0 0,0 0,0

*Para este sistema se prepara in situ una solución de seroalbúmina bovina (BSA) ó seroalbúmina humana (HSA) al 5 % y las placas de CCDI se embeben en esta solución por 2 min, posteriormente se sumergen en agua de 2 a 3 s y se secan al aire a temperatura de 18-20°C. Finalmente se guardan en refrigeración a 4-8°C protegidas de l a humedad. Estas placas no deben utilizarse después de una semana de su preparación. ACTIVIDAD. Activímetro calibrado. Medir la actividad a inyectar. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. No más de 175 UE/V. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO. El radiofármaco es estable almacenado a temperatura ambiente durante 3 h, salvo indicación contraria del productor.

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99mTc–UBI 29-41. SOLUCIÓN DESCRIPCIÓN. Solución de un complejo de 99mTc-ubiquicidina 29-41, límpida, incolora, estéril. ENSAYO DE IDENTIDAD. Espectrometría gamma. El espectro de rayos gamma de una preparación de la muestra presenta un fotopico principal con una energía de 0,140 MeV. CONTROLES FISICOQUÍMICOS pH. Entre 7,0-8,0. PUREZA RADIOQUÍMICA. Cromatografía ascendente. Mayor de 95 por ciento.

Soporte CCDI-SG

Disolvente NaCl 0,9 %

Rf 99mTc-UBI 29-41 0,0

Rf 99mTcO4

- 0,9-1,0

Adicionalmente la pureza radioquímica se puede determinar utilizando un sistema de extracción en fase sólida (cartuchos Sep-Pak C-18, Waters) bajo las siguientes instrucciones:

a) Activar el cartucho Sep-Pak C-18 haciendo pasar 10 mL de etanol absoluto grado reactivo.

b) Pasar a través del cartucho 10 mL de agua destilada. c) Eliminar los residuos de agua en el cartucho haciendo pasar 10 mL de aire con una

jeringa. d) Colocar en el cartucho 0,1 mL de la solución de UBI marcada con 99mTc. e) Extraer el 99mTcO4

- del cartucho, pasar 5 mL de agua destilada y colectarlo en un tubo de ensayo.

f) Extraer el 99mTc-UBI 29-41 eluyendo el cartucho con 5 mL de una solución de metanol: HCl 1 mol/L (80:20). Colectar en un tubo de ensayo.

g) Realizar una segunda extracción del 99mTc-UBI 29-41 eluyendo el cartucho con 5 mL de una solución de metanol: HCl 1 mol/L (80:20). Colectar en un tubo de ensayo.

h) Colocar el cartucho Sep-Pak en un tubo de ensayo con la misma geometría de aquellos donde se colectaron las diferentes fracciones, ya que en el cartucho queda retenido el 99mTc-reducido-hidrolizado.

i) Determinar el por ciento de radiactividad en cada fracción. j) El por ciento de radiactividad presente en las fracciones donde se extrae el 99mTc-UBI

29-41 debe de ser mayor al 90 por ciento.

ACTIVIDAD. Activímetro calibrado. Medir la actividad a inyectar.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No más de 175 UE/V.

ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO . El radiofármaco es estable almacenado entre 4°C a 8°C durante 24 h, salvo indicación contraria del pr oveedor. ___________________________________________________________________________ Conclusión:

Se concluye que como instrumento legal La Ley General de Salud cubre todos los aspectos farmacéuticos y que en la FEUM, que es la norma de calidad para medicamentos y materias primas, se han insertado los radiofármacos al igual que en el Cuadro Básico de Insumos del Sector Salud. Esto ha sido de suma importancia para la radiofarmacia nacional.

Siendo la FEUM el documento oficial para normar los radiofármacos es obligatorio legalmente para todos los miembros que laboren en un gabinete de medicina nuclear leer y poseer, por lo menos un ejemplar de la FEUM, además de apegarse a los lineamientos allí inscritos.

Cabe recordar que durante el “Taller de Armonización de Normas para el Registro y Control Sanitario de los radiofármacos” celebrado en Caracas, Venezuela en 1996 se propuso que todos los expertos allí reunidos se comprometieran a presentar a la autoridad competente normas para el diseño de un reglamento para el registro y control sanitario de los radiofármacos. Este objetivo del ARCAL XV se ha cumplido en México.

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Referencias i G. Paganelli, P. Riva, G. Delcide et al, Int. J. Cancer Suppl., 1988, 2, 121 ii Goldenberg DM. J Nucl Med 2002; 43: 693-713. iii Paganelli G et al. Tumor targeting 1998, 3: 96-104. iv Grana C et al. Tumor targeting 1996,2: 230-239.