Purificacin y propiedades de hidratasa cianuro de lateritium Fusariumy el anlisis del gen correspondiente chylEl hongo filamentoso Fusariurn lateritiurn es tolerante con el cianuro, debido, al menos en parte, a la induccin por cianurode la hydrolyase formamida enzima (EC 4.2.1.66). Esta enzima, ms comnmente conocido como hidratasa cianuro,cataliza la hidratacin de cianuro de formamida. La enzima fue purificada a partir de F. lateritiurn y mostr una subunidadmasa molecular de 43 kDa (a juzgar por SDS-PAGE), mientras que la protena nativa pareca formar agregados de hastaa 1217 kDa (a juzgar por filtracin en gel y PAGE no desnaturalizante).ARNm de las muestras de las culturas crecido con ysin cianuro en vitvo traducido y immunoprecipitated. Esto demostr que, en esta especie, el genque codifica la enzima designado chyl, es inducible cianuro. Cribado diferencial se utiliz para aislar un cianurohidratasa cDNA clon que se utiliz posteriormente para obtener el clon genmico correspondiente. Un fragmento de laclon de ADNc que codifican todos, pero el puo siete aminocidos de la protena se expres en E. coli mediante la expresinvector pGEX-2T. Caractersticas de F. hidratasa lateritiurn cianuro junto con un anlisis de la secuencia de nucletidosque codifica esta enzima se presentan.introduccinA pesar de la extrema toxicidad del cianuro de los microorganismos, muchospuede crecer en su presencia ya sea mediante el desarrollo deun sistema respiratorio de cianuro y minsculas y / o degradanteel cianuro (revisado por Knowles, 1976, 1988). en menospor lo menos un microorganismo, Pseudomonas JEuorescens,el cianuro puede ser usado como nica fuente de nitrgeno (Harris &Knowles, 1983). Muchos hongos, particularmente aquellos queson patgenos de plantas cianognicos, son tolerantes con cianuro,y esto es, al menos en parte, debido a la presencia de laenzima formamida hydrolyase (CE 4.2.1.66), mscomnmente conocido como hidratasa cianuro (Fry y Millar,1972).Actividad hidratasa cianuro parece estar correlacionadacon la capacidad de algunos hongos para infectar cianognicoslas plantas a pesar de la liberacin de cianuro de hidrgeno en elinfeccin en el sitio en concentraciones potencialmente txicas (Fry &Munch, 1975; Fry & Evans, 1977). En un estudio, hongospatgenos de las plantas de ciangenos se encontr que contienenvarios niveles de actividad hidratasa cianuro (Fry &Evans, 1977). La actividad enzimtica en las especies estudiadas seinducible, aunque en algunas especies constitutivas de bajalos niveles de actividad hidratasa cianuro tambin fueron vistos. ennivel general, ms bajos de actividad hidratasa cianurovisto de las especies no consideradas como patgenos deplantas cianognicos.Enzima hidratasa cianuro se ha estudiado en doshongos fitopatgenos: Gloeocercospora sorghi yStemphylium loti (Fry y Millar, 1972; Fry y Munch,, 1975). Las enzimas parecen similares, lo ptimoactividad en el rango de pH 7 a pH 9. El G. sorghi enzimay cuenta con un aproximado de 30 m, cianuro de hidrgeno yuna masa molecular estimado de 2.10 x lo6 Da.El trabajo aqu presentado describe la purificacin yanlisis bioqumico de la enzima hidratasa cianuroy la clonacin y secuenciacin de los hidratasa cianurogen de Fusariurn lateritiurn Nees (CommonwealthMicologa del Instituto 300,533). Esta especie es utilizadaen la produccin del producto de degradacin del cianuroCYCLEAR por ICI Productos Biolgicos.mtodosCepas microbianas, los vectores y de ADN recombinante. Estos se enumeran en elTabla 1.Hidratasa cianuro ensayo enzimtico. Las muestras (500 a 100 pl) se incubaronen 1 120 ml de buffer mM-NaCN/lOO mM-Tris/HCl, (pH 8,5, 20 "C)15 min. La reaccin se detuvo con 2 ml2.3 M-hidroxilamina ymuestras incubadas durante 7 minutos a 20 "C. Despus de enfriar en hielo, 1 ml 4 MHClse aadi seguido de 1 ml 1,23 M-FeC13/75 mM-HCl. absorbanciaa 540 nm fue utilizada para estimar la concentracin de formamida pormedio de una curva estndar (Snell y Snell, 1954). La actividad se expresanen pmol min-'(U),Enzima pur $ cationes. La cultura se recogieron durante un perodo de 48 horas a partir de unaquimiostato laboratorio (condiciones de crecimiento descrito por RichardsonY Clarke, 1987) y se mantiene a 4 "C. Las clulas fueron cosechadas porfiltracin al vaco a travs de muselina, y se lavaron y seresuspendido en 100 mM-Tris/HCl buffer (pH 8-5) con 10 m ~ -EDTA. Lotes de la suspensin celular se mezclaron con cuentas de vidrio (50 ml;1 mm de dimetro.) E interrumpi en un molino de bolas (3 min) a 4 "C. Las perlasfueron retirados y lavados por decantacin. El extracto crudo combinadose centrifug (17.000 g, 15 min, 4 "C) para obtener el sobrenadante crudo.Sobrenadante crudo se agit con 120 g de DEAE-celulosa(equilibrada con tampn, como arriba) durante 75 minutos a 4 "C.El gel sese recuper por filtracin al vaco, se lava con buffer, acondicionado en unacolumna (5xl6cm) y se eluy con un gradiente salino, MM-NaCl enbuffer). Las fracciones activas se combinaron para producir el eluato DEAE. laEluato DEAE fue llevado a un 40% de saturacin con sulfato de amoniomediante la adicin de cristales. Se recuper el sobrenadante por centrifugacin(como antes) y llevado a 60% de saturacin. El pellet serecuper por centrifugacin (como antes) y resuspendido en buffer. estese desala con un Sephadex G-25 columna se eluy con 2 0 m ~ -Tris / HCl (pH 8,5) que contiene 10 mM EDTA-. El desalado 60 YOfraccin de sulfato de amonio se carg en un intercambio de anionescolumna (LKB sistema FPLC Mono Q HR 16/10 columna) y se eluycon un 0 4 4 M-NaCl gradiente. Las fracciones activas se reunieron ycargado en un Sephacryl S-400 columna (1,6 x 46 cm, el volumen de la cama92,5 ml) y se eluy con tampn (como el anterior, 5 ml de hectolitros). La columna secalibrado usando los siguientes estndares: azul dextrano (PM masa2 x lo6 Da); ribonucleasa, ovoalbmina, albmina, aldolasa, catalasa;ferritina, la tiroglobulina, (Pharmacia de filtracin en gel kit de calibracin).Electroforesis en gel. PAGE con y sin SDS se llev a cabo utilizando un sistema de Pharmacia Phast con la elaboracin de normas y mtodos de tincin. Los estndares de peso molecular alto o se Pharmacia kits de baja masa molecular. SDS-PAGE de la traduccin in vitro, inmunoblot e inmunoprecipitacin se realiz con 16 x 20 cm125% (w / v) polyacryiamide losa geles y Sigma Delta VII-Lmarcadores de masa molecular. Inmunotransferencia se realiz mediante el estndarmtodos descritos en Harlow y Lane (1988).Anlisis de ARN. El ARN total fue preparado por el mtodo de las Cmaras Y Russo (1986), excepto que 5 g de micelio congelado se utilizaron como material de partida. ARNm se purific mediante dos ciclos de oligo-dTcellulose cromatografa de acuerdo con Maniatis et al. (1982). Muestras Se cuantific por absorbancia a 260 nm. ARNm purificado (2,5 pg) fue en uitro traducido por el mtodo de Pelham y Jackson (1976) con un lisado de reticulocitos de conejo (Amersham) y ~-[~' S] metionina (Amersham). Las muestras (5 pl) fueron retirados y solubilizados en SDSPAGE muestra de tampn de carga (30 pl) [60 pH mM-Tris/HCl 6,8, 5% (W / v) SDS, 1 heb (w / v) ditiotreitol, el 20% (v / v) de glicerol, 0-001% azul de bromofenol]. Las muestras fueron desnaturalizados calor a 100 "C antes de la carga de un 12,5% SDS-PAGE gel a travs de un gel al 5% de apilamiento. Los geles fueron seca entonces expuestos a pelculas de rayos X (RX Fuji) por perodos de 12 a 72 h. Inmunoprecipitacin de las protenas en uitro traducida se realiz mediante el mtodo descrito por Jagus (1987). Anti-cianuro hidratasa antisuero se cri en los conejos y los suministrados por los productos farmacuticos ICI Divisin de Alderley Park, Cheshire, Reino Unido.construccin de la biblioteca de cDNA. cDNA fue preparada con ARNm aislado de I;. cultura lateritium obtenido 57 minutos despus de cianuro induccin utilizando un kit de sntesis de ADNc (Pharmacia) que utiliza un mtodo adaptada de Gubler y Hoffman (1983). Adaptadores EcoRI se ligaron a los extremos romos de cDNA para la ligadura en EcoRI-restringido igt 1 1 ADN (Young & Davis, 1983 a). Fagos se empaquet in vitro de acuerdo a Maniatis et al. (1982). La biblioteca de cDNA contena 2 x 10 ' fagos recombinantes y se amplific en E. coli Y1088 (Young & Davis, 1983b) utilizando el mtodo de lisado de placa (Maniatis et al., 1982).Construccin de la biblioteca genmica. ADN total lateritium F. fue preparadopor el mtodo de Raeder y Broda (1985) con aproximadamente 0,2 g decongelados micelio. Las muestras de ADN se limitaban a terminar conHind111 para la clonacin en el vector de insercin bacterifago un dNMll49(Murray, 1983). Fagos se empaquet in vitro como antes yrecombinantes fueron seleccionados por la infeccin de E. coli NM514 (Murray,, 1983). La biblioteca de genes que contiene aproximadamente 1 x lo6 recombinantefago.Deteccin diferencial. Una sola cadena sondas de cDNA fueron preparadosa partir del ARNm de lateritium F., que haban sido expuestos al cianuro para57min, y tambin de lateritium F. que no haban estado expuestos acianuro. Estas sondas se denominan sondas inducido y no inducido, respectivamente. Las sondas se prepararon esencialmente por el mtodo utilizado parala produccin de una''lnea de cDNA descrito en el kit de Pharmacia.Las actividades especficas de las sondas de cDNA fueron tpicamente 1-2 x lo7 cpmpor pg de ARNm de transcripcin inversa. Las sondas fueron desnaturalizados antesel uso de la calefaccin a 95 "C durante 3 min.Para la deteccin diferencial, cuatro filtros de nitrocelulosa (Schleicher ySchuell) se prepararon de cada placa que contiene los fagos recombinantes(Benton y Davis, 1977). Los filtros fueron prehybridized por lo menos durante 1 h enprehibridacin buffer [6 x SSC, SDS 0-1%, 0-25 de leche en polvo seco YO(Marvel)] a 65 "C. Duplicar los filtros de cada placa se hibridnoche a la maana a 65 "C con inducido y no inducido sondas de cDNA entampn de hibridacin (3 x SSC, SDS YO 0 1, 0-02% Ficoll, 002%polivinilpirrolidona). Los filtros se lavaron en tres cambios de lavadobuffer (2 x SSC, 0-1% SDS), previamente calentado a 65 "C. La exposicin de los filtros paraPelcula de rayos X fue de noche a la maana a 72 h, con dos ms Cronex Rayola intensificacin de las pantallas.Oligonucletidos sondeo. La solucin de oligonucletidos utilizada fue unamezcla de 256 diferentes oligonucletidos (20-mers) sintetizado aasegurar que todas las posibles secuencias de la heptapptido Phe Ala Pro Glu ValTrp Ile (la ltima base de Ile se ha omitido). Esta secuencia se determina partir de la secuencia aleatoria de una hidrlisis parcial de puro cianurohidratasa. La mezcla de oligonucletidos fue suministrada por los productos farmacuticos ICIDivisin en una concentracin de 67-2 pg ml-', a juzgar porabsorbancia a 260 nm. Los oligonucletidos fueron final de la etiqueta con[32P] dATP (Amersham) utilizando T4 polinucletido quinasa de acuerdo conManiatis et al. (1982) y se entreg a las actividades especficas de 2 cpm x LO8por ADN pg.Los filtros fueron pre-hibridados a 65 "C durante 3 horas en 6xNET (90mMTris /HCl, pH 3.8, 0.9 M-NaCl, 6 mM-EDTA), 0,1% SDS, 5 x Denhardtsolucin, 100 mg de ADN de timo de ternera ml. Esta solucin sesustituido por 6 x NET, 0-1 YO SDS, 5 x Denhardt la solucin y 6 ngfinal de la etiqueta de oligonucletidos rn-'. A 1 ml vol. de solucin de hibridacinfue utilizado por filtro y la hibridacin fue a 44 C durante 2 h. latemperatura de hibridacin se calcula a partir de Wallace & Miyada(1987). Los filtros se lavaron en 6 x SSC, SDS al 1% 0 a 4 "C con cuatrocambios de tampn durante 5 minutos cada uno durante 5 minutos a la hibridacintemperatura. Los filtros fueron expuestos a la pelcula de rayos X durante la noche.Estudios de expresin. El vector de expresin pGEX-2T se utiliz paraexpresin en E. coli (Smith y Johnson, 1988). En pGEX-2T, secuenciasque se expresa se fusionan a la glutatin S-transferasa gen relacionadoa la fuerte promotor tac. Los extractos crudos para el anlisis de protenas sepreparado por el crecimiento de cultivos a mediados de la fase exponencial antes de aadirIPTG a 1 mM. Los cultivos se hicieron crecer luego durante 2 horas a 37 "C.A 1,5 ml de volumen. de la cultura se sedimentaron por centrifugacin en una microcentrfugadurante 3 minutos, el pellet se resuspendi en 50 pl de muestra SDS-PAGEbuffer y se hierve durante 2 min. Las muestras (1 5 pl) se realizaron en SDS-PAGEgeles.Manipulaciones del ADN. Mtodos estndar se utilizaron para el sur desecante, nick de traduccin, fagos y aislamientos de ADN plsmido, gelanlisis de la electroforesis, subclonacin y la restriccin (Maniatis et al., 1982). La secuenciacin del ADN fue por el mtodo de terminacin de cadena dideoxide Sanger et al. (1977) adaptada para ADN de doble cadena por Chen ySeeburg (1985). No estndar cebadores de secuenciacin fueron sintetizados enun Applied Biosystems 381A sintetizador de ADN en el Departamento deCiencias Biolgicas de la Universidad de Durham, Reino Unido.Resultados y DiscusinInduccin de la actividad hidratasa cianuroActividad hidratasa cianuro fue inducida por la adicin dede sodio o cianuro de potasio a dejado de crecercultura (Richardson y Clarke, 1987). En una tpicafermentacin, lateritium F. fue aumentado a una tasa de dilucinde 0,08 h-y un peso de la pila seca de 12,0 g de 1-I. no hay actividadse detect en las clulas antes de la exposicin al cianuro, [es decir,