PURIFICACIN Y DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CIDOS NUCLEICOS OBJETIVO: Extraer ADN a partir de hgado de rata y cuantificarlo por el mtodo de la difenilamina. Realizar una electroforesis en gel de azarosa para visualizar las bandas de ADN. A. AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS INTRODUCCION Los cidos nucleicos son macromolculas que se encuentran tanto en el ncleo como en el citoplasma celular. Por ello para su aislamiento es necesario digerir previamente las membranas citoplasmticas y nuclear con un detergente adecuado. Este detergente a su vez desnaturaliza las protenas asociadas a los cidos nucleicos. Una vez que ha actuado el detergente, se trata la solucin con disolventes orgnicos (fenol, cloroformo, alcohol isoamlico, etc). Tras una centrifugacin, en el precipitado (fase orgnica ms densa) quedan los lpidos de membrana, en la interfase quedan las protenas desnaturalizadas y en el sobrenadante (fase acuosa menos densa) quedan disueltos los cidos nucleicos. Se separa el sobrenadante y se aade alcohol absoluto, el cual insolubiliza el ADN, que va quedando en forma de fibras.

MATERIALES Y REACTIVOS Higado de rata DNAzol Reagent (Reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtrencin de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgnicos de este reactivo son no fenlicos, obviando la toxicidad del mismo) Etanol 100% Etanol 95% NaOH 8 mM HEPES 1 M B. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE DNA POR EL MTODO DE LA DIFENILAMINA INTRODUCCION La concentracin de ADN en la muestra se puede estimar con la reaccin de la difenilamina. Este colorante reacciona selectivamente con 2-deoxipentosas. En disolucin cida la deoxipentosa se convierte en el altamente reactivo -hidroxilevuln aldehido que reacciona con la difenilamina para dar un compuesto azul. Una curva patrn de concentraciones conocidas de DNA nos permitir determinar el contenido en DNA del problema por interpolacin sobre la recta patrn de las densidades pticas de la disolucin problema.

1. La parte del ADN que reacciona es la fenilalanina. 2. La reaccion es la siguiente: C6H5-N-H-C6H5 + C6H5-CH-NH2-COOH = C6H5 - N - C6H5 (Doble union N=N) C6H5CH2-CH- N-C0OH + H2 (GAS)

(Producto de color rojo)