pruebas serológicas para el diagnostico en equinos
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RUEBAS SEROLÓGICAS ARA EL DIAGNOSTICO EN
EQUINOS
ruebas serológicas:
Debe recogerse !ues"ras #e sagre #e los ai!ales e los $ue se sos%ec&a #e ua
ele'a#a coce"ració #e a"icuer%os( El icre!e"o #el ")"ulo #e a"icuer%os e las
!ues"ras #e suero recogi#as e la *ase #e co'alececia i#ica $ue el ai!al &a es"a#o
e+%ues"o al %a"ógeo( Los resul"a#os #e es"a %rueba #ebe co!%le"arse co &alla,gos
cl)icos - co el aisla!ie"o #el %a"ógeo e l)$ui#os o "e.i#os %ara %o#er e!i"ir u
#iagos"ico e"iológico #e*ii"i'o(
RUEBAS SEROLÓGICAS UTILI/ADAS EN EQUINOS ARA EL DIAGNOSTICO
ANEMIA INFECCIOSA EQUINA:
Debido a la persistencia del virus de la AIE en los équidos infectados, la detección
serológica de anticuerpos frente al virus de la AIE conrma el diagnóstico de la
infección por dicho virus.
A) PRUEBA DE INMUNO-DIFUSIÓN EN GEL DE AGAR (PRUEBA PRESCRITA
PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL).
Los anticuerpos precipitantes se producen rpidamente como resultado de la
infección por la AIE ! se pueden detectar mediante la prueba A"ID. Las
reacciones espec#cas se indican por las l#neas de precipitación entre el ant#geno
de la AIE ! el suero problema ! se conrman por ser idénticas a la reacción que
se da entre el ant#geno ! el suero estndar positivo. "eneralmente, en las
primeras $%& semanas después de la infección, los caballos presentarn
reacciones serológicas negativas. En algunos casos, el tiempo posterior a la
infección previo a la aparición de anticuerpos detectables puede durar hasta '(
d#as.
Estn disponibles comercialmente reactivos para A"ID de diversas compa)#as.Alternativamente, el ant#geno A"ID ! el suero de referencia se pueden preparar
como se describe a continuación.
* +reparación del ant#geno
El ant#geno espec#co para la AIE se puede preparar a partir del bao de caballos
infectados e-perimentalmente con enfermedad aguda '/, del cultivo de te0idos
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de caballos infectados 1(/, de una l#nea celular de timo canino con infección
permanente &/ o de prote#nas recombinantes e-presadas en bacterias o en
baculo2virus utiliando la técnica del AD3 recombinante $,4/. La preparación del
ant#geno a partir de cultivos infectados o mediante la técnica de AD3
recombinante, proporciona un resultado ms uniforme que utiliando las células
del bao, ! permite una me0or estandariación de los reactivos.
+ara obtener un ant#geno satisfactorio a partir del bao, debe infectarse un
caballo con una cepa mu! virulenta del virus de la AIE. El per#odo de incubación
resultante deber#a durar entre 5 ! 6 d#as, ! el bao debe recogerse 4 d#as
después de la inoculación, cuando ms alto es el t#tulo del virus ! antes de que se
produca cualquier cantidad de anticuerpos precipitantes. La pulpa del bao, sin
diluir, se utilia como ant#geno en la prueba de inmunodifusión'/. La e-tracción
del ant#geno del bao con una solución salina ! una concentración con sulfato
amónico, no proporciona un ant#geno tan satisfactorio como una selección de
baos con un t#tulo alto del ant#geno de la AIE.
Alternativamente, se infectan células de ri)ón fetal equino, células dérmicas o
células del timo canino con una cepa del virus de la AIE adaptado para crecer en
cultivo de te0ido American 7!pe 8ulture 8ollection/. El virus se recoge de los
cultivos por precipitación con polietilenglicol al 9:, por confección en pellets opor ultra2centrifugación. El ant#geno de diagnóstico, p$', se separa del virus por
tratamiento con detergente o éter. Las prote#nas del n;cleo del virus de la AIE,
e-presadas en bacterias o baculo2virus estn disponibles comercialmente ! se
utilian como ant#genos de alta calidad para el diagnóstico serológico. E-isten
evidencias de variación de la cepa en la secuencia del aminocido p$'< sin
embargo no ha! evidencias de que esta variación in=u!a en ninguna de las
pruebas de diagnóstico 14/.
La p$' es una prote#na estructural interna del virus que est codicada por el gen
gag. Este gen es estable ! no se han encontrado variaciones entre las cepas 11/.
* +reparación del antisuero estndar
>e debe recoger un antisuero positivo conocido procedente de un caballo
previamente infectado con el virus de la AIE. Este suero debe producir una ;nica
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l#nea de precipitación densa, que es espec#ca para la AIE, tal como se ha
demostrado mediante una reacción idéntica a la de un suero estndar conocido.
Es esencial equilibrar las concentraciones de ant#geno ! de anticuerpos, con el n
de garantiar la sensibilidad óptima de la prueba. Las concentraciones del
reactivo deben a0ustarse para formar una l#nea de precipitación estrecha
apro-imadamente equidistante de los dos pocillos que contienen el ant#geno ! el
suero.
* +rocedimiento de la prueba 1, ', 1&/
i/ Las reacciones de inmuno2difusión se llevan a cabo en una capa de agar en
placas de +etri. +ara placas de +etri de 1(( mm de dimetro, se utilian 15%16 ml
de agar 3oble al 1:. >e perforan
' pocillos en el agar en torno a un pocillo central del mismo dimetro. Los pocillos
sern de 5,& mm de dimetro ! con una separación de $,?mm. 8ada pocillo debe
contener el mismo volumen de reactivo.
ii/ >e coloca el ant#geno en el pocillo central ! el antisuero estndar en uno de
cada dos pocillos e-teriores. Las muestras del suero problema se colocan en los
tres pocillos restantes.
iii/ >e mantienen las placas a temperatura ambiente en un ambiente h;medo.
iv/ 7ranscurridas $?%$9 horas, se e-aminan las reacciones de precipitación con unha estrecho de lu oblicua e intensa frente a un fondo negro. Las l#neas de
referencia deben ser claramente visibles a las $? horas !, en ese momento,
cualquier suero problema que sea fuertemente positivo también puede haber
formado l#neas idénticas a las que se dan entre los reactivos estndar. @na
reacción positiva débil puede tardar ?9 horas en formarse, ! se indica mediante
una peque)a inclinación de la l#nea de precipitación del suero entre el pocillo del
ant#geno ! el pocillo del suero problema. Los sueros con t#tulos de anticuerpos de
precipitación altos, pueden formar bandas anchas de precipitina que tienden a
e-tenderse. 7ales reacciones pueden conrmarse como espec#cas de la AIE por
dilución al o B antes del contra ensa!o< éstas pueden ofrecer una l#nea de
identidad ms marcada. Los sueros libres de anticuerpos de la AIE no formarn
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l#neas de precipitación ! no tendrn efecto sobre las l#neas de reacción de los
reactivos estndar.
v/ Interpretación de los resultadosC Los caballos que estn en las primeras etapas
de la infección pueden no dar una reacción serológica positiva en la prueba
A"ID. 7ales animales deber#an sangrarse de nuevo después de &%? semanas. 8on
el n de realiar un diagnóstico en un potro 0oven, es necesario determinar el
estado de los anticuerpos procedentes de la madre. >i la !egua posee alg;n
anticuerpo de la AIE, entonces ser necesario un per#odo de ' meses o ms
después del nacimiento para que el anticuerpo materno disminu!a< se somete al
potro a una nueva prueba para determinar si una reacción positiva inicial se
debió al anticuerpo materno o a la infección.
B) ENZIMOINMUNOENSAYO
E-isten tres tipos de ELI>A que han sido aprobados por el Departamento de
Agricultura de los Estados @nidos para el diagnóstico de la anemia infecciosa
equina ! que estn disponibles internacionalmente< un ELI>A competitivo ! dos
ELI>A> no competitivos. El ELI>A competitivo ! uno de los ELI>As no
competitivos detectan los anticuerpos producidos contra el ant#geno proteico del
n;cleo p$'. El otro ELI>A no competitivo incorpora la prote#na del n;cleo p$' !
los ant#genos gp?5 prote#na transmembrana v#rica/.Los protocolos del ELI>A t#picos se utilian en todas las pruebas. >i los materiales
comerciales del ELI>A no estn disponibles, puede emplearse un ELI>A no
competitivo utiliando ant#geno p$' puricado procedente del material de cultivo
de células 1?/.
@n resultado positivo obtenido mediante ELI>A debe comprobarse de nuevo
utiliando la prueba A"ID para conrmar el diagnóstico, debido a que se han
detectado algunos resultados positivos falsos mediante
ELI>A. 7ambién se puede conrmar el resultado por la técnica inmuno2bloting. Los
Laboratorios de
eferencia de la IE tienen disponible un antisuero estndar para inmuno2
difusión que contiene una cantidad m#nima de anticuerpo que deber#a detectarse
en los laboratorios. Féase el cuadro que aparece en la parte & de este Ganual
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para Animales 7errestres/. >e han publicado métodos uniformes para el control de
la AIE 16/.
GRIPE EQUINA
Las infecciones se pueden detectar mediante pruebas serológicas con sueros
pareados para demostrar un aumento en el t#tulo de anticuerpos. Estas pruebas
se deben realiar tanto si se ha intentado, como si no, el aislamiento del virus.
E-isten dos métodos sencillos, la IH ! la hemolisis radial simple >H/, cada uno
igualmente eca ! de amplio uso. 7ambién se puede aplicar la prueba de 0ación
de complemento 8/, pero no es de uso general. Las muestras de ambos sueros
pareados deben probarse 0untas al mismo tiempo para minimiar la variabilidad.
Los ant#genos estndares se han descrito anteriormente >ección J.1.c./. >e
deber#an incluir aislados de casos recientes, si estuvieran disponibles. En el
Laboratorio de eferencia de la IE, en GeKmaret ver 8uadro de la +arte & de
este Ganual/ se dispone de antisueros equinos lioliados contra
AMeqM3eKmarrtM66 H636/, AMeqM3eKmaretM1M4& H&39 NAmericano/ !
AMeqM3eKmaretM$M4& H&39 NEuropeoN/ ! de un suero equino negativo para la
gripe. Estos sueros tienen designación de valor >H en estudios de colaboración
internacional ! se pueden utiliar como sueros de referencia en este ensa!o.a/ +rueba de la inhibición de la hemoaglutinación
+ara incrementar la sensibilidad de la prueba se trata primero el ant#geno con
7Keen 9(Méter, en particular para virus H&39. Esta prueba se realia me0or en
placas de microtitulación con un equipo adecuado de dilución. >e puede utiliar
una macroprueba, donde el ant#geno se dilu!e a un t#tulo nal de HA de 1M9 por
pocillo ! los vol;menes de +J>, sueros ! ant#geno son (.5 ml. Los sueros se pre2
tratan para eliminar hemo2aglutininas no espec#cas ! se inactivan a 5'O8
durante &( minutos. Los pre2tratamientos inclu!en la utiliación de alguno de los
siguientes procedimientosC a/ adsorción por caol#n ! eritrocitos, b/ periodato
potsico, o c/ enima de Fibrio cholerae destructor de receptores. Los tres
procesos dan resultados similares. Los sueros tratados se dilu!en con +J>, se
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a)ade una dosis estndar de ant#geno t#tulo HA de 1M? por pocillo en el ensa!o
de microtitulación/ ! éstos se mantienen a $$O8 P $O8/ durante &( minutos.
Después de meclar ligeramente, se a)aden eritrocitos ! la prueba se lee a los &(
minutos. Los t#tulos HI son la dilución ms alta de suero que produce una
inhibición completa de la hemoaglutinación. >e pueden utiliar eritrocitos de pollo
1: QvMvR de células empaquetadas/ en placas de microtitulación con pocillos de
fondo en F, o eritrocitos de coba!a (.5: QvMvR de células empaquetadas/ en
placas con pocillos de fondo en F o en @. >i se utilian eritrocitos de pollo, las
placas pueden leerse inclinndolas 6(O de modo que las células no aglutinadas
ScorranT al fondo del pocillo. Las células no aglutinadas de coba!a forman un
botón en la parte inferior del pocillo ! la sedimentación puede llevar ms tiempo.
Los aumentos de cuatro veces o ms en el t#tulo entre sueros pareados indican
una infección reciente $1/.
a/ Hemolisis radial simple
En esta prueba, los ant#genos v#ricos se acoplan con eritrocitos 0ados que se
suspenden en agarosa que contiene complemento de coba!a 8U/. Los pocillos se
forman en la agarosa ! se llenan con los sueros de ensa!o. Los anticuerpos
contra la gripe ! el 8U lisan los J8s recubiertos de ant#geno, originando una
ona hemol#tica clara alrededor del pocillo< el tama)o de esta ona esdirectamente proporcional al nivel de anticuerpo espec#co contra la cepa en la
muestra de suero 1(, 14, $(/.
+ara el ensa!o se pueden utiliar placas especiales de inmunodifusión H!land,
Giles >cientic/, pero también son adecuadas las placas de +etri. Los eritrocitos
de ove0a recogidos en solución de Alsever se lavan tres veces. El 8U se puede
obtener comercialmente, o se puede utiliar suero normal de coba!a. Los
ant#genos son l#quidos alantoideos o preparaciones puricadas< las cepas usadas
son las mismas que para las pruebas HI. Los virus se acoplan a los J8s con
periodato potsico o con cloruro crómico. Las preparaciones acopladas de
ant#genoMJ8s se meclan con 8U, 0unto con una solución de agarosa al 1: de
grado de fusión ba0o/ en +J>. Debe cuidarse que la temperatura no e-ceda de
?$O8 en ning;n caso. La mecla se vierte en placas ! se de0an toda la noche a
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?O8. >e perforan en la agarosa solidicada pocillos de & mm de dimetro
separados durante 1$ mm, por lo menos a ' mm del borde de la placa. Estas
placas se pueden guardar a ?O8 por 1$ semanas. Las placas se preparan para
cada ant#geno ! se prueban previamente con antisueros positivos ! negativos.
Los sueros se inactivan a 5'O8 durante &( minutos, pero no es necesario ms
tratamiento. Los sueros pareados deben ensa!arse por duplicado en la misma
placa. 8omo m#nimo, deber#a incluirse un antisuero espec#co de subtipo como
un control de suero en un pocillo de cada placa. 7odos los sueros se ensa!an en
una placa control que contenga todos los componentes e-cepto virus para
controlar la lisis inespec#ca.
Alternativamente, se puede utiliar en la placa control un virus no relacionado, tal
como el
AM+M9M&? H131/. Los sueros que muestran actividad hemol#tica con eritrocitos
de ove0a deben someterse a pre2absorción con eritrocitos de ove0a. Las onas de
lisis deben ser claras ! no difusas o trasl;cidas. >e deben medir todas las onas
claras ! calcular las reas de hemolisis.
ARTRITIS VIRAL EQUINA
+ara detectar anticuerpos anti2 EAF se han usado varias pruebas serológicas queinclu!en la neutraliación microneutraliación Q5$R, ! reducción de placas o
calvas Q?1R 3F/, la prueba de la 0ación del complemento 8/$$/, la
inmuno=uorescencia 1'/, la inmunodifusión en medio sólido 1'/ ! las pruebas
ELI>A 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/ ! el inmunoensa!o de microesferas =uorescentes
GIA comunicación personal/.
Actualmente, la prueba de ma!or uso internacional para el diagnóstico de la
infección, para realiar estudios sobre prevalencia, ! para e-aminar caballos para
e-portación, es una prueba de micro2neutraliación en presencia de
complemento. 7ambién se ha utiliado para el e-amen de sangre de coraón fetal
para el diagnóstico retrospectivo de casos de aborto asociados a la AFE 5'/.
Adems de la prueba 3F, la prueba 8 se ha utiliado para diagnosticar
infecciones recientes por el EAF, puesto que los anticuerpos que 0an el
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complemento son de una duración relativamente transitoria $$/. En contraste,
los t#tulos de anticuerpos neutraliantes anti2EAF pueden persistir con frecuencia
durante a)os después de la infección natural 54/.
Aunque se han desarrollado varias pruebas ELI>A 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/,
ninguna se ha validado tan ampliamente como la 3F, pese a que algunas parecen
ofrecer una sensibilidad ! especicidad casi iguales 11, &(, &1, ?9/. A diferencia
de la prueba 3F, una reacción positiva por ELI>A no re=e0a necesariamente el
estado de protección inmune de un caballo individual anti2EAF !a que estn
implicados anticuerpos neutraliantes ! no neutraliantes.
Gediante protocolos convencionales de inmuniación se han preparado en
caballos ! en cone0os antisueros antiEAF no puricado. Adems, se han
desarrollado en ratón anticuerpos monoclonales ! en cone0o anticuerpos mono2
espec#cos para la prote#na de la nucleo2cpsida 3/, la glicoprote#na principal de
la envoltura "+5/ ! la prote#na de la envoltura no glicosilada G/ del EAF 6, 16,
$9, &4, ?(/.
La IE dispone de sueros estandariados para el EAF$ que pueden facilitar la
estandariación de la prueba de la micro2neutraliación ! la del ELI>A.
Hasta la fecha solo se ha reconocido un serotipo importante ?1, 54/. Este est
representado por la cepa prototipo Juc!rus A788 F 64'/. El virus de referenciautiliado en la prueba de 3F para el EAF es la cepa del 8FL2Juc!rus Ve!bridge/.
El stoc de virus se obtiene en la l#nea celular W21&, se clarica de restos
celulares por centrifugación a ba0a velocidad ! se guarda en al#cuotas a %6(O8. >e
descongelan varias al#cuotas ! se determina la infectividad del virus por titulación
en células W21&.
a/ 3eutraliación del virus prueba prescrita para el comercio internacional/
La prueba de 3F se utilia para e-aminar sementales por si ha! evidencia de
infección por el EAF ! para determinar si se necesita detectar el virus en semen
mediante cultivo celular o por una prueba 72+8. >e utilia también con nalidad
diagnóstica para conrmar la infección en casos sospechosos de AFE. El
procedimiento de la prueba de la 3F de uso ms difundido es el desarrollado por
los Laboratorios del
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>ervicio 3acional Feterinario del Departamento de Agricultura de los EE. @@. 5$/.
Es importante obtener una muestra de sangre estéril para evitar que la
contaminación bacteriana interera en el resultado de la prueba. >e recomienda
realiar la prueba en células W21& utiliando como virus de referencia la cepa
aprobada 8FL2Juc!rus Ve!bridge/&$(/.
La historia completa de pases de la cepa 8FL Ve!bridge/ no est documentada
aunque deriva originalmente de la cepa Juc!rus prototipo del virus. La
sensibilidad de la prueba de la 3F para detectar anticuerpos anti2EAF est mu!
in=uenciada por varios factores, especialmente por el origen ! la historia de
pases de la cepa v#rica utiliada $(, $1/. La cepa 8FL2Juc!rus
Ve!bridge/ ! la cepa vacunal GLF mu! atenuada del EAF son de sensibilidad
seme0ante para detectar sueros positivos de t#tulo ba0o, especialmente en
caballos vacunados contra AFE. >e contin;an realiando esfueros para lograr
una ma!or uniformidad en el protocolo de la prueba ! los resultados serológicos
entre los laboratorios que utilian la prueba 3F u otras pruebas serológicas
comparables para esta infección.
b/ Enimo2inmunoensa!o
+ara detectar anticuerpos anti2EAF se han desarrollado varios ELI>A directos o
indirectos 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/. Estos se basan en la utiliación de viruspuricados o de ant#genos recombinantes derivados de los virus. La utilidad de
las pruebas iniciales estaba limitada por la frecuencia de reacciones positivas
falsas 15/, que se asociaban con la presencia de anticuerpos contra varios
ant#genos de los cultivos de te0idos en los sueros de caballos que hab#an sido
vacunados con ant#genos derivados de cultivos de te0idos 15/. La identicación
del importante papel de la prote#na "+5 en la estimulación de la respuesta
inmune humoral contra el EAF condu0o al desarrollo de varios ELI>A que emplean
una porción de ella, o la prote#na recombinante completa producida en un
sistema de e-presión bacteriano o de baculovirus 1?, 16, &(/. Gs
recientemente, se ha utiliado un péptido sintético con0ugado con ovoalb;mina
que presenta los aminocidos 91%1(' de la prote#na "+5 ?9/. Algunas de estas
pruebas parecen presentar una sensibilidad ! especicidad casi idénticas a las de
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la prueba 3F ! pueden detectar anticuerpos anti2EAF antes de que se pueda
obtener una reacción positiva por la prueba de la 3F 11. >in embargo, pueden
ocurrir reacciones negativas falsas en algunas de estas pruebas. El anlisis al
aar de una bater#a de péptidos fgicos con sueros policlonales de caballos
infectados por el EAF permitió la identicación de ligandos, que se puricaron !
emplearon como ant#genos en un ELI>A para el EAF &1/. >in embargo, no se
encontró correlación entre los valores de absorbancia obtenidos con este ensa!o
! los t#tulos de anticuerpos neutraliantes, lo que indica que los anticuerpos
detectados estaban dirigidos fundamentalmente contra ep#topos no superciales
del virus. @n ELI>A basado en el uso combinado de las prote#nas estructurales
"+5, G o 3 del EAF, e-presadas por baculovirus recombinantes, detectó con é-ito
los anticuerpos en caballos infectados natural o e-perimentalmente, pero no en
animales vacunados contra AFE &(/.
especto a cualquier ELI>A para EAF basado en la prote#na "+5 es mu!
importante considerar el hecho de que la sensibilidad de la prueba var#a en
función de la secuencia del dominio o región supercial que se utilice en el
ensa!o de esta prote#na v#rica. Entre aislamientos del EAF ?6/ se ha encontrado
una considerable variación en la secuencia de aminocidos de este dominio ?/.
+ara aumentar la sensibilidad de un ELI>A basado en "+5 puede ser necesarioincluir varias secuencias del dominio supercial que representen diferentes
aislamientos fenot#picos de EAF en ve de depender de una ;nica secuencia
supercial. tros dos ELI>A de descripción ms reciente parecen ofrecer un
diagnóstico ms prometedor ! able de las infecciones por el EAF 1?, ?9/. >e ha
descrito un ELI>A bloqueante que utilia GAbs producidos contra la prote#na "+5
con una sensibilidad del 44.?: ! una especicidad del 46.6: en comparación
con la prueba 3F 1?/. tra prueba, que es un ELI>A con un péptido sintético de
"+5 con0ugado a ovoalb;mina, tiene una sensibilidad ! especicidad del 4'.65:
! 45.':, respectivamente, utiliando una referencia de ?(( sueros positivos por
3F ! ?(( muestras negativas por 3F ?9/. Es posible que se disponga en breve
de un ELI>A con una sensibilidad ! especicidad similar a la de la prueba 3F.
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ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA
El diagnóstico de la infección por el virus de la EEF requiere la demostración de la
presencia de anticuerpos espec#cos en pares de muestras de suero recogidas
en las fases aguda ! convaleciente. Después de la infección, los anticuerpos
detectados en la prueba de +3 aparecern entre los d#as 5%6, los anticuerpos de
la 8 entre los d#as '%4, ! los anticuerpos de la HI entre los d#as '%6. La segunda
muestra de suero de la fase de convalecencia se deber#a tomar a los ?%6 d#as
posteriores a la recogida de la primera muestra de la fase aguda o en el
momento de la muerte. En el 8ap#tulo $.5.& se describen con detalle los
procedimientos serológicos que se deben seguir. +ara interpretar cualquiera de
los resultados de las pruebas serológicas de la EEF se tendr#a que tener en
cuenta la historia de la vacunación. En el caso de caballos que no se han
vacunado recientemente con una cepa del virus vivo atenuado, la demostración
de la presencia de anticuerpos séricos del tipo IgG espec#cos de la EEF en una
muestra simple de suero conrma una e-posición reciente al virus.
>e deber#a considerar con cierta cautela cualquier diagnóstico de la EEF en un
individuo que se base en la seroconversión en ausencia de una epiootia. A pesar
de que los subtipos ! variantes enoóticos no son patogénicos para los équidos,
la infección estimular la producción de anticuerpos frente a las variantesepioóticas del virus de la EEF.