Tiraje clase 10: PRUEBAS INMUNOLÓGICAS Y DE BIOLOGÍA

MOLECULAR DE USO EN EL LABORATORIO.

El responsable de iniciar la respuesta inmune es el antígeno, el mismo que se

encarga de iniciar la respuesta inmune tipo específica, la cual libera ciertos

tipos de moléculas llamadas “anticuerpos”, los cuales son moléculas solubles y

que circulan en el plasma.

Diferencias entre suero y plasma: la sangre está dividida en una parte sólida

y otra liquida, la parte solida formada por glóbulos rojos, glóbulos blancos etc.

La parte liquida compuesta por un 90 % de agua, un 7 % de proteínas, y el 3

% restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, gas carbónico y

nitrógeno, además de productos de desecho del metabolismo como el ácido

úrico (eso lo saque de inter porque nunca dice que formaba el plasma xD).

Se puede determinar la diferencia de suero y plasma en la manera que se

obtiene el uno del otro en el laboratorio. Si a una sangre se le agrega

coagulante, se le deja coagular y después se hace una separación de la parte

sólida y de la liquida, a esta parte liquida se le llama suero (Es equivalente al

plasma sanguíneo, pero sin las proteínas involucradas en la coagulación).

Si en cambio se le agrega un anticoagulante, se centrifuga, se separan células

y parte liquida, a este sobrante se le llama plasma, el cual contiene factores de

coagulación.

Pero en el laboratorio ambos términos, suero y plasma, se ocupan de

sinónimos.

“Pruebas inmunológicas”

Antes a estas pruebas se les daba el nombre de pruebas serológicas, que en la

actualidad este término a quedado obsoleto, se le daba este nombre a la

prueba, porque la muestra clínica donde se hacían estas pruebas era suero.

Hoy en días se ocupan otras sustancias para hacer pruebas inmunológicas

como lo es el plasma, orina, LCR.

Inmunológico: reacciones antígeno-anticuerpo.

Tanto al antígeno como al anticuerpo se les da el nombre de

inmunoreactantes. La reacción antígeno-anticuerpo es específica, en la cual

un antígeno x, solo reaccionara con un anticuerpo x. Por lo tanto tomando esta

propiedad de especificidad, sí en el laboratorio se conoce el antígeno, se

puede buscar su contraparte el anticuerpo, y así viceversa.

Las reacciones antígeno-anticuerpo se pueden dividir en 3 categorías:

- Primarias

- Secundarias

- Terciarias

Reacciones primarias.

Las reacciones primarias son aquellas en que se da una unión o complejo

antígeno anticuerpo, pero que no es visible al ojo humano, si no es usando

marcadores, marcadores los cuales puede ser: enzimas, radio isotopos o bien

sustancias fluorescentes.

Ejemplos de estas pruebas:

- Elisa

- Ria

- Inmufluorenscencia

Reacciones secundarias.

Las reacciones secundarias son aquellas en que se da un complejo antígeno-

anticuerpo, y que es visible al ojo humano, y se puede ver mediante

aglutinación o precipitación.

Reacciones terciarias.

Están reacciones tienen la característica que forman complejos antígeno-

anticuerpo dentro del individuo, y que son una manifestación biológica de la

formación del complejo antígeno-anticuerpo dentro del individuo.

La formación de este complejo dentro del individuo puede ser dañina o

beneficiosa.

Beneficio: se puede desencadenar el proceso de la fagocitosis, lisis bacteriana

o neutralización de virus.

Daños: personas con lupus eritematoso generalizado, en la cual personas que

tienen esta enfermedad desarrollan anticuerpos contra el DNA de sus células.

Reacciones primarias y secundarias se dan in vitro en el laboratorio, mientras

que las reacciones terciarias se dan in vivo.

¿Cuándo una prueba diagnóstica es buena?

Cuanto se estudia una enfermedad x, y se recurre al laboratorio para el

diagnóstico de esa enfermedad, solo se tienen 2 posibilidades, o sale negativo

o sale positivo, está enfermo o no lo está. Pero puede surgir la problemática

que estando enfermo, la prueba de negativo o casi contrario de positivo.

Una prueba diagnóstica es buena, cuando es capaz de ofrecer resultados

positivos en enfermos y negativos en personas sanas, ósea cuando es capaz

de detectar los verdaderos pacientes enfermos y los verdaderos sanos.

A la propiedad que tiene la prueba de detectar a los verdaderos positivos se le

da el nombre de sensibilidad.

A la propiedad que tiene la prueba de detectar los verdaderos negativos se le

da el nombre de especificad.

Entonces una prueba diagnóstica es buena cuando tiene una alta sensibilidad y

una alta especificad.

Ejemplo: una persona está enferma, y se hace una prueba, si esta persona

estando enferma la prueba le sale negativa, entonces se denomina el resultado

como un falso negativo. En caso contrario si la prueba da positivo pero la

persona no esta enferma el resultado se denomina falso positivo.

Una prueba es buena, cuando detecta la mayor cantidad de pacientes que

estando enfermos da positiva la prueba y hay menos pruebas falsas positivas

esa es una prueba con alta sensibilidad.

Nota, falta lo del minuto 15, que no entendí nada

Las mejores pruebas de laboratorio son aquellas que tiene una sensibilidad y

especificidad arriba del 95%. Si un resultado diera una respuesta de 50% de

positividad y 50% no sería una prueba confiable.

“Pruebas inmunológicas”

Pruebas Primarias:

Elisa (ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas)

Desglosamiento del nombre.

Ensayo: que se hace en el laboratorio.

Inmuno: antígeno-anticuerpo

Adsorbente: que se adhiere a una superficie

Ligado a enzimas: se ocupan enzimas como marcadores.

Los inmunoreactantes que se buscaran en esta prueba serán, tanto antígeno

como anticuerpos, esto depende de lo que se conozca, si se tiene el antígeno

se buscara el anticuerpo y viceversa. Entre las enzimas más utilizadas en esta

prueba están: peroxidasa, fosfatasa alcalina. No son las únicas pero son las

más usadas.

Fundamento: hay una reacción antígeno-anticuerpo que para ser vista en el

laboratorio, se necesita el uso de marcadores, que puede ser una enzima, esa

enzima actuara sobre un sustrato y dependiendo del sustrato que se emplee

los resultados se verán en:

- Presencia de color ( la intensidad del color es directamente proporcional

a la cantidad de inmunoreactante que se ha encontrado).

- Presencia de luz

- Presencia de fluorescencia

Uno de los inmunoreactantes se ha adherido a una superficie solida (que

puede ser placas de poli estireno, micro-esferas de polivinilo) indistintamente

de la superficie que se ocupe, se debe de tener en cuenta que siempre uno de

los inmunoreactantes debe estar en una superficie sólida.

La prueba Elisa tiene 2 variantes: la Elisa indirecta y el método sándwich.

Prueba Elisa indirecta: lo que se adhiere a la superficie solida es el antígeno

(el antígeno es conocido) y lo que se busca en el paciente es el anticuerpo,

pero para poder visualizar esta reacción se necesita otro inmunoreactante un

antianticuerpo marcado con la enzima (ose aun anticuerpo dirigido a ese

anticuerpo que yo estoy detectando).

Método de sándwich: lo que se adhiere a la superficie solida es un anticuerpo

y lo que se busca es el antígeno, al igual que la anterior se necesita un

antianticuerpo conocido marcado con la enzima para poder visualizar la

reacción.

El primer paso de la prueba Elisa es la sensibilización del inmunoreactante

uniéndolo a una superficie solida

Funciones:

- Detección de enfermedades virales (rubeola, vih).

- Detección de enfermedades parasitarias (chagas).

- Bacterianas (Helicobacter Pylori)

- Micosis (enfermedades producidas por hongos)

- Detección de cualquier microorganismo que nos afecta como humanos.

- Evaluar la respuesta humoral en enfermedades autoinmunes.

- Endocrinología

- Niveles de hormonas

- Cuantificar medicamentos

- Detección de proteínas oncofetales, que son marcadores humorales.

- Cuantificar insulina en personas diabéticas

-

Prueba de Inmunoflorescencia

Inmuno: reacción antígeno-anticuerpo

Fluorescencia: emitir una luz diferente a la luz con la que se ha iluminado.

¿Que inmuno-reactante se busca?- puede ser antígeno o un anticuerpo,

depende de cual se conozca. Se combina el inmuno-reactante conocido con

una sustancia fluorescente llamada también fluorocromo, 2 son los más

usados: la rodamina y la fluoresceína.

Fundamento de la prueba.

Una reacción antígeno-anticuerpo, y esta reacción se determinan por la

presencia de fluorescencia

sustancias fluorescentes más usadas:

Isotiocianato de tetrametilrodamina (conocido solamente como

rodamina)

Isotiocianato de fluoresceína (conocido como fluoresceína)

Ambas sustancias fluorescentes tienen la capacidad de producir

fluorescencia (capacidad de emitir luz de un diferente color a la que ha

sido iluminada la sustancia). Al utilizar fluoresceína emitirá una luz verde

manzano y en de utilizar rodamina será de color rojo.

Por ejemplo, para el diagnóstico de Chagas, se coloca una lámina, con el

paracito conocido (que hace el rol del Ag), luego se coloca la muestra del

paciente, si en la muestra hay Ac contra ese Ag, se formara el complejo

Ag/Ac y luego se coloca el inmunoreactivo marcado con la sustancia

fluorescente, el Anti­Ac con el flourocromo, en este caso con fluoresceína,

luego se coloca al microscopio de fluorescencia y se observa el resultado.

En el caso de rodamina, se tiene un corte de un tejido donde se buscan

células tumorales (Ag), se utiliza un Ac marcado con rodamina y se observa

al microscopio el resultado.

Variantes de

Inmunofluorescencia:

a) Inmunofluorescencia

directa:

Ag: ¿? (que se desea buscar)

Ac: marcado con el flourocromo.

Se realiza en dos pasos. Se coloca la muestra en una lámina (por ejemplo un

corte muy fino de un tejido) y se le agrega un Ac marcado con el

fluorocromo, si se forma el complejo Ag/Ac se observara fluorescencia al ver

la muestra atreves del microscopio de fluorescencia. En nuestro país se

utiliza para detectar y confirmar los casos de rabia en perros, si se tiene un

animal que se sospecha o hay una probabilidad que tenga rabia, el animal se

sacrifica, se extrae un corte de tejido cerebral, se coloca en una lámina y se

agrega el Ac contra el virus de la rabia marcado con un fluorocromo y

luego se observa el resultado, si se observa fluorescencia el resultado es

positivo.

b) Inmunofluorecencia indirecta:

Ag: conocido.

Ac: ¿? (que se desea buscar)

Ac: marcado con el flourocromo.

Se realiza en dos pasos, en esta prueba se busca el Ac, se coloca el Ag

a la muestra del paciente y si en la muestra hay Ac contra ese Ag, se

formara el complejo Ag/Ac y para observar el complejo se agrega el

Anti­Ac marcado que causara la fluorescencia y nos permitirá observar al

microscopio.

Importancia de la Inmunofluorescencia:

1. Identificación de linfocitos T y B.

2. Detección de auto­anticuerpos.

3. Identificación rápida de un microorganismo en tejido.

4. La detección de Ag específicos de tumores en tejido neoplásico

5. Cuantificación de Anticuerpos.

Anteriormente a la prueba se le conocía también con el nombre “prueba

histoquímica” pues se realizaba en tejidos; actualmente se ha modificado

y se puede realizar detección también de Ac.

¿Cuándo realizar cuantificación de Ac? Para saber cuánto anticuerpo “x”

tiene una persona, entonces a la muestra del paciente se le hacen

diluciones para establecer el titulo serológico, esto es la mayor dilución de

una muestra, en la que hay una reacción Ag/Ac visible. Entre más alto sea

el titulo serológico quiere decir que hay más cantidad de

inmunoreactante que se está investigando. Un título serológico de 8

posee menos concentración de Ac que en un título de 16. Importante para

el seguimiento y control del paciente, el titulo serológico debe ir

disminuyendo en el caso de una enfermedad que estamos controlando.

Pruebas secundarias (no requieren marcadores, son visibles a

simple vista)

Inmuno­precipitación: Es una técnica secundaria, donde la naturaleza

física del antígeno es: soluble (Ag sin forma).

Fundamento de la prueba:

Cuando se produce la reacción Ag/Ac se da la formación de un anillo de

precipitación, una banda de precipitación o de una línea de precipitación.

Tipos de inmunoprecipitación:

En medios liquidos: Ej.: prueba de Ascoli

En medios semi­solidos “inmunodifusión”: El medio semisólido

se utiliza agar especial altamente purificado (el agar es una sustancia

que se ocupa para darle solidez a medios de cultivo). Se denomina

inmunodifusión porque en el medio semisólido, los

inmunorreactantes difunden, o van avanzando. Tipos de

inmunodifusión:

Inmunodifusión doble. (Prueba de Ouchterlony).

­ Ambos inmunorreactantes difunden en la superficie del

medio semisólido (agarosa).

­ Procedimiento: En una placa o lámina se coloca una capa

de agar y en medio de esa capa se hacen unos orificios o

pozos. En un orificio colocamos el inmunorreactante conocido

y en el otro orificio la muestra del paciente; si

inmunorreactante buscado está presente comienza a difundir;

y cuando se forma el complejo Ag/Ac se forma la línea o banda

de precipitación.

­ Importamcia: Diagnóstico de ciertas enfermedades causadas

por hongos.

­ No muy utilizada en el país.

Inmunodifusión radial simple. ( Prueba de Mancini)

Solo uno de los inmunorreactantes difunde, alrededor del

pozo.

Detecta Ag.

Procedimiento: El medio semisólido generalmente se

mezcla con Ac a una temperatura apropiada, se extiende en

una lámina y se deja solidificar. Al solidificarse se hacen

orificios (pozos) donde se coloca la muestra del paciente; si

en dicha muestra está la contraparte del Ac (el Ag), entonces

esté difunde, formándose un anillo de precipitación.

¿Cómo se cuantifica? Midiendo el diámetro del anillo y

comparándolo con una curva.

Diámetro del anillo es directamente proporcional a la

concentración e inmunorreactante.

Importancia: Cuantificación de proteínas. En nuestro país

para cuantificar proteínas que son fracciones del

complemento: C3, C4. También cuantificación de Ig A, Ig M,

Ig D. (Cuantificación de inmunoglobulinas se hace con suero

de conejo)

Aglutinación: Es una prueba en la que la cual la naturaleza física del

antígeno es particular. (Posee una forma, ya sea de manera natural

como en la superficie de una bacteria; o porque en el laboratorio el Ag

fue pegado a una partícula portadora).

Importancia:

1. Pueden ser cuantitativas y semi­cuantitativas.

2. Pueden investigarse tanto Ag como Ac.

Fundamento de la prueba: La reacción Ag/Ac se visualiza mediante la

formación de grumos.

Tipos: En base a la naturaleza del antígeno, puede ser:

I. Aglutinación directa (Aglutinación activa): El Ag posee forma

por sí mismo y por naturaleza forma parte de una célula o una

bacteria. Mediante un antisuero, podemos hacer la reacción

Ag/Ac y se forma una malla que se observa por aglutinación. Ej.:

Tipeo sanguíneo, Tipeo bacteriano, Antígenos febriles (para

diagnóstico de fiebre tifoidea).

II. Aglutinación indirecta: El antígeno no tiene forma, es decir es

soluble. Para poder leer la prueba con fundamento de aglutinación

se ha pegado intencionalmente el Ag a una partícula portadora.

­ Tipos de partículas portadoras:

De origen vegetal: Carbón. Ej. : en la prueba de

RPR (diagnóstico de sífilis).

Células vivas:

Glóbulos rojos de pavo. En este caso la prueba

recibe el nombre de H emaglutinación pasiva. (El

término “pasiva” indica que no son los Ag naturales

del glóbulo rojo los que están actuando, sino los

que han sido pegados al glóbulo rojo).

Bacterias. Prueba recibe el nombre de Conglutinación.

Partículas inertes: Ej. : Látex

La mayoría de pruebas de aglutinación indirecta en el país poseen como

partícula portadora el látex, a excepción del RPR.

Cuando se investiga A nticuerpo se denomina Prueba de

III. aglutinación indirecta. (El Ag es conocido). Ej.:

RPR, Hemaglutinación pasiva.

Cuando se investiga Ag se llama: Aglutinación Reversa. (Ac es conocido).

Ej. : Prueba de embarazo, Prueba de Proteína C reactiva (es proteína

de la inflamación de fase aguda).

Citometría de Flujo: Se utiliza para cuantificar cantidad de células,

tipo de células y en casos donde se está trabajando con cultivos

celulares, el grado de división celular o la presencia de marcadores. Ej.:

Hemograma, Cuantificación de linfocitos T (importante para pacientes

con VIH).

Resultados se presentan mediante histogramas o puntos.

Fundamento de la prueba:Es una técnica que para su realización se ocupa

un aparato especial denominado Citómetro, dentro del cual se hace pasar la

muestra por un tubo muy fino y en el que su boquilla dispensa una gota, que

contiene solamente una célula; dicha célula al ir bajando es atravesada

por un rayo láser, que al chocar con ella dispersa el rayo de luz y es

captada por unos espejos, los cuales mandan esa señal hacia unos filtros y

estos envían la señal hacia un sistema detector donde se encuentra un

software que hace la medición.

Western Blot. Western Blotting (Inmunoelectrotransferencia).

La técnica consiste en la inmunoelectrotransferencia. Hay presencia de

carga eléctrica y transferencia de un gen a una porción de nitrocelulosa.

Para separación de proteínas.

Confirmación de diagnósticos de VIH. (En nuestro país si una

persona presenta ELISA positiva para VIH, es obligación remitir

la muestra al laboratorio especializado para realizar Western Blot.)

Fundamento de la prueba:

La muestra clínica donde se encuentran las proteínas se coloca en una

cámara de electroforesis que lleva un gel de polietilamida dodecilsulfato de

sodio, al cual se le abre un orificio en la parte superior para colocar la

muestra. Se agrega carga eléctrica y las proteínas comienzan a difundir

hacia abajo; quedando en el gel de acuerdo a su peso molecular: las más

pesadas arriba, y las livianas abajo. Luego, el gel se cubre con una

porción de nitrocelulosa y se pone de nuevo carga eléctrica, quedando en

el pedazo de papel todas las proteínas que estaban en el gel.

Si lo que se investiga son las proteínas, colocamos anticuerpos marcados

con una enzima; los Ac se unirán a las proteínas y se observarán bandas o

líneas coloreadas, que corresponden a la proteína que se está buscando.

Ej. : En la confirmación de VIH.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Método rápido y simple para copiar e identificar secuencias específicas de

ADN, hasta de 1Kb (kilobase) de longitud.

Uso en biología molecular.

Diagnóstico de algunas enfermedades producidas por M.O.

No es necesario que el paciente tenga una gran cantidad de

microorganismos circulando, ya que se detectan con una pequeña

cantidad.

¿Qué se necesita conocer? Secuencias cortas de nucleótidos de la

cadena de DNA, del extremo 3’ – 5’ para luego establecer los primers.

Reactivos:

Primers: secuencias de nucleótidos complementarios a la

secuencia conocida.

ADN polimerasa. T AC polimerasaes la más usada.

Nucleótidos.

Se utiliza un aparato denominado Termoreciclador.

Pasos:

1. Separación del ADN. Se coloca a una temperatura de aprox.

94º C para que se separen las cadenas.

2. Asociación. (Aprox. A 68º C). Los primers se unen al extremo 3’

de la cadena con sentido y al extremo 3’ de la cadena

antisentido y se comienza a sintetizar la cadena

complementaria.

3. Síntesis. (Aprox. A 72º C). Un proceso completo de PCR

requiere más o menos entre 20 a 30 ciclos (57 min

aproximadamente).