Protocolo del Proyecto “Evaluaciónde las Proteínas del Ciclo Celular en

el Cáncer de Pene”

PROCIENCIA 14-INV-323

Dirección de Investigación & Divulgación Cientifica

Protocolo 14-INV-323

Índice

Descripción 2

Equipo de investigadores 2

Investigador principal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Asistente de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Objetivos del proyecto 2

Objetivos principales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Objetivos principales específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Antecedentes 2

Marco teórico 3

Plan de trabajo 3

Diagnóstico de las lesiones tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Evaluación de microarrays tisulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Confección de la base de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Redacción de informes de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Relevancia 5

Relevancia social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Relevancia científica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Relevancia contemporánea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Estrategia de divulgación 5

Referencias 6

1

Protocolo 14-INV-323

Descripción

Este documento describe el protocolo a seguir para laejecución del Proyecto “Evaluación de las Proteínasdel Ciclo Celular en el Cáncer de Pene”, gestiona-do por la Dirección de Investigación & DivulgaciónCientífica de la Universidad del Norte. El Programase ejecuta dentro del Programa Paraguayo para elDesarrollo de la Ciencia y la Tecnología (PROCIEN-CIA), Proyecto 14-INV-323, con fondos adjudicadospor el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACYT) de la República del Paraguay segúnResolución Nº 437/2014.

Equipo de investigadores

Investigador principal

El Investigador Principal del proyecto es elProf. Dr. Alcides Chaux, Director de Investi-gación & Divulgación Científica de la Universidaddel Norte. El Investigador Principal está a cargo deldiseño y supervisión del proyecto, del análisis dedatos, y de la redacción de informes de investigacióny documentos relacionados.

Asistente de investigación

La Asistente de Investigación está a cargo de la re-colección y análisis de datos y redacción de informesde investigación y documentos relacionados. La Asis-tente de Investigación tiene una carga horaria de 15(quince) horas semanales.

Objetivos del proyecto

Objetivos principales

Los objetivos principales de este proyecto puedenagruparse en 2 categorías:

Incrementar el conocimiento acerca de la bio-logía molecular del cáncer de pene, con énfasisen la evaluación del ciclo celular.Ofrecer un programa de entrenamiento efec-tivo en investigación científica, orientado a laadquisición de habilidades concretas para eldiseño, gestión y ejecución de proyectos de in-vestigación.

Objetivos principales específicos

Los objetivos específicos de este proyecto puedenagruparse en 2 categorías:

Evaluar visual y digitalmente la expresión in-munohistoquímica de proteínas relacionadas alciclo celular en carcinomas escamosos del pene,determinando su asociación con característicashistopatológicas y virales.Entrenar efectivamente a la Asistente de In-vestigación en el diseño de proyectos de in-vestigación, recolección de datos, morfología ybiología molecular del cáncer de pene, análisisestadístico de datos, programación en R, utili-zación de RStudio, herramientas de ciencia dedatos, interpretación de resultados, y redaccióny publicación de informes de investigación.

Antecedentes

Debido a factores aún no totalmente caracterizadosel cáncer de pene presenta una alta incidencia enel Paraguay comparada con la observada en paísesdesarrollados.1 Esto permite la explotación de unnicho de investigación centrado en la patología delcáncer de pene en nuestro país. Tras varios añosde estar realizando investigaciones en la morfología,características clínicas y epidemiológicas, y factorespronósticos patológicos2 hemos incursionado en elcampo de la biología molecular del cáncer de pene.3–6

Uno de los problemas principales dentro de este tó-pico es la falta de información detallada y profundaacerca de la biología molecular del cáncer de pe-ne. El conocimiento acabado acerca de la biologíadel cáncer de pene permitiría comprender cómo seorigina y por qué presenta las particularidades epide-miológicas observadas. Más aún, este conocimientopodría ser útil para el desarrollo de estrategias clíni-cas más efectivas, con diagnósticos más significativosy tratamientos mejor orientados.7

Dentro de nuestro programa de investigación en cán-cer de pene hemos recolectado a lo largo de dosdécadas más de 100 muestras de tejido tumoral yconstruido a partir de estas muestras 4 microarraystisulares (TMA, por tissue microarray). Utilizandoestos 4 TMA hemos iniciado hace 2 años nuestrainvestigación en la biología molecular del cáncer depene, estudiando varias vías metabólicas tales comolas de blanco de rapamicina en mamíferos y la delreceptor epidérmico del factor de crecimiento .3,4

2

Protocolo 14-INV-323

Hemos estado publicando los resultados de estas in-vestigaciones en revistas internacionales indexadasevaluadas por pares, estableciéndonos firmemente enel frente de avance de esta área de la Ciencia. Sinembargo, aún quedan muchas vías metabólicas porestudiar, sobre todo las directamente relacionadascon el control del crecimiento y diferenciación de lascélulas tumorales.Considerando la escasa tradición científica seria en elcampo de la biología molecular del cáncer en nuestropaís y la imperiosa necesidad de educar una genera-ción de nuevos científicos, proponemos este proyectodenominado “Evaluación de las Proteínas del CicloCelular en el Cáncer de Pene”. Mediante este pro-yecto se entrenará a la Asistente de Investigaciónen el diseño de estudios de investigación, recolec-ción de datos, análisis estadístico y programación depaquetes informáticos, interpretación de resultados,y redacción y presentación de informes de investi-gación. Este entrenamiento estará centrado en laejecución específica de este proyecto, por lo que seespera generar habilidades y capacidades efectivaspara la investigación científica.

Marco teórico

El cáncer de pene es un tumor infrecuente en paísesdesarrollados de Norteamérica y Europa, representan-do, sin embargo, un serio problema de salud públicaen países en vías de desarrollo.8,9 La incidencia esparticularmente alta en países como Brasil y Para-guay, donde las tasas son de hasta 4 veces mayoresa las observadas en países del primer mundo.1

No existen explicaciones satisfactorias para estas va-riaciones geográficas, pero factores de riesgo talescomo la falta de circuncisión, fimosis, tabaquismo,antecedentes de desgarros peneanos, enfermedadesinflamatorias crónicas, pobre higiene genital, y cier-tas infecciones virales podrían tener alguna influenciaen las regiones con mayor incidencia.1,9

La mayoría de los cánceres peneanos son carcino-mas escamosos, reconociéndose un variado espec-tro de subtipos histológicos distintos, cada unocon características clinicopatológicas y pronósticasparticulares.10 El desarrollo del cáncer de pene sigueuna vía patogénica bimodal, una asociada con lainfección por el virus del papiloma humano (HPV)y otra independiente de la infección viral.11

A pesar de que el cáncer de pene es más frecuen-temente una enfermedad loco-regional, se observadiseminación sistémica y metástasis a distancia en

hasta el 40% de los pacientes. En este contexto, lamuerte por cáncer diseminado aparece habitualmen-te dentro de los 2 a 3 años del diagnóstico inicial.12Mientras que la cirugía y la radioterapia son las opcio-nes de elección en pacientes con tumores localizados,la quimioterapia es la opción principal para aquelloscon enfermedad diseminada. Desafortunadamente,las tasas de respuesta al tratamiento quimioterapéu-tico están lejos de ser aceptables.13 Por lo tanto, serequieren de otros enfoques, especialmente aquellosque involucran el uso de terapias dirigidas.7

Las terapias dirigidas han cambiado significativamen-te el tratamiento del cáncer durante los últimos 10años. Al involucrar mecanismos de acción distintos alos de la quimioterapia citotóxica tradicional, suelenser mejor toleradas, asociándose con menos efectossecundarios adversos. Estos fármacos son parte hoyen día del tratamiento de muchos tumores malignos.7

Sin embargo, no existen protocolos de tratamientodirigido para pacientes con cáncer de pene disemina-do, principalmente por dos razones. La primera estárelacionada con la rareza de estos tumores en paísesdesarrollados en los que estos fármacos están en eva-luación o aprobados para su uso clínico. La segundase relaciona con la escasez de reportes de investi-gación estudiando la biología molecular del cáncerde pene, buscando identificar alteraciones en víasmetabólicas que sean de interés para el desarrollo deterapias dirigidas.El propósito del presente proyecto es evaluar la ex-presión inmunohistoquímica de diversas proteínasinvolucradas en el control del ciclo celular en tumorespeneanos, evaluando la asociación entre los nivelesde expresión, las características histopatológicas y lapresencia de HPV.

Plan de trabajo

El tiempo de duración del proyecto es de 12 meses,desde julio de 2015 a junio de 2016. Se medirán losniveles de expresión inmunohistoquímica de 5 pro-teínas relacionadas con el ciclo celular (p53, Ki67,cyclin-D1, p16INK4a y MDM2) en 112 muestrastisulares de carcinomas escamosos.Las muestras tisulares fueron obtenidas de los casosde consulta del Investigador Principal y consistieronen tejido tumoral fijado en formol al 10% y embebi-do en parafina. A partir de estas muestras tisularesse confeccionaron 4 TMA en el TMA Lab Core de laJohns Hopkins University (Baltimore, MD), siguien-do un protocolo previamente publicado.14

3

Protocolo 14-INV-323

A partir de estos bloques de TMA se obtuvieroncortes tisulares que fueron teñidos con Hematoxilina& Eosina (HE). Las tinciones inmunohistoquímicasfueron llevadas a cabo siguiendo protocolos previa-mente publicados.15–18 Los TMA correspondientesa las tinciones con HE e inmunohistoquímica se en-cuentran almacenadas en los archivos tisulares delInvestigador Principal.

La medición se realizará visualmente y medianteanálisis digital de imágenes. Posteriormente se anali-zarán estos niveles de expresión, evaluando su rol enla alteración del ciclo celular de las células tumora-les y su asociación con características morfológicasdel tumor. Este proceso requerirá el uso intensivode herramientas de ciencias de datos tales comoR/RStudio, ImageJ, GitHub, MarkDown, y simila-res.

La hipótesis básica de trabajo es que existen alte-raciones específicas de vías metabólicas particularesen las células tumorales del carcinoma escamosoque son evidenciables de una forma más objetivamediante el análisis digital de imágenes. Asimismo,existen correlaciones entre las expresiones inmunohis-toquímicas de ciertas proteínas relacionadas al ciclocelular y las características morfológicas del tumor,lo que sugeriría mecanismos oncogénicos particularesy posiblemente blancos terapéuticos específicos.

El uso de estos TMA para investigación fue aprobadopor el Institutional Board Review (IBR) de la JohnsHopkins University (Baltimore, MD).

El Proyecto estará dividido en 5 fases: diagnósticode las lesiones tumorales, evaluación de microarraystisulares, confección de la base de datos, análisis es-tadístico, y redacción del informe de investigación.Estas fases se describen a continuación.

Diagnóstico de las lesiones tumorales

Primeramente se procederá a la clasificación de los4 TMA disponibles conteniendo muestras tisularesde 112 casos de cáncer de pene. Se identificarán lasláminas histológicas completas correspondientes aestos casos y se procederá a la clasificación histopa-tológica de las lesiones tumorales, usando criteriospreviamente establecidos.2,10 El AI trabajará bajola supervisión del IP para la correcta clasificación delas lesiones tumorales y la adecuada identificaciónde las características histopatológicas relevantes. Es-ta evaluación se realizará sobre muestras tisularesteñidas con hematoxilina & eosina.

Evaluación de microarrays tisulares

Una vez que todas las lesiones tumorales hayan sidoclasificadas se procederá a la evaluación visual dela expresión inmunohistoquímica de proteínas rela-cionadas con el ciclo celular, incluyendo p53, cyclinD1, Ki-67, p16INK4a, y MDM2. Esta evaluación sellevará a cabo en un microscopio Zeiss AxioLab 2.La Asistente de Investigación estimará visualmentelos niveles de expresión utilizando una escala semi-cuantitativa previamente desarrollada y validada.19Esta estimación será controlada por el InvestigadorPrincipal.Tras la evaluación visual se procederá a digitalizar losTMA, utilizando una técnica previamente descrita.15Posteriormente se procederá al análisis de las imáge-nes utilizando un protocolo de análisis digital previa-mente desarrollado y publicado por el InvestigadorPrinicpal.3 La Asistente de Investigación trabajaráactivamente en la redacción de nuevos protocolos deanálisis digital y en la programación de algoritmospara mejorar los protocolos ya existentes.

Confección de la base de datos

Tras la recolección de datos visuales y digitales laAsistente de Investigación confeccionará una basede datos en la que consignará toda la informaciónrecolectada hasta el momento, incluyendo los datoshistopatológicos y la evaluación visual y digital decada uno de los casos de cáncer de pene. Dentro denuestra consigna de libertad de información haremosque esta base de datos esté disponible gratuitamentepara todos los investigadores a través de repositoriosdigitales internacionales.

Análisis estadístico

La Asistente de Investigación procederá al análi-sis estadístico de los datos bajo la supervisión delInvestigador Principal. El análisis de datos se reali-zará utilizando el lenguaje de programación R.20 LaAsistente de Investigación aprenderá las habilidadesnecesarias para la programación en R y la utilizaciónde RStudio como interfaz de usuario.Se espera además que la Asistente de Investigaciónadquiera conceptos y habilidades para la aplicaciónde técnicas estadísticas avanzadas, centradas princi-palmente en la construcción de modelos matemáticospredictivos. Asimismo, dentro de nuestra política deinvestigación reproducible, La Asistente de Investi-gación utilizará GitHub (https://github.com/) para

4

Protocolo 14-INV-323

publicar el código de su análisis estadístico, y pondráa disposición de la comunidad científica global susresultados a través de repositorios digitales interna-cionales.

Redacción de informes de investiga-ción

Como fase final la Asistente de Investigación re-dactará el informe de investigación reportando losresultados del proyecto. Este informe se enviará parapublicación en una revista internacional indexadacon evaluación por pares. La Asistente de Investiga-ción redactará además todos los materiales para serutilizados en simposios, congresos, talleres, y confe-rencias en las cuales se divulguen los hallazgos delProyecto. El Investigador Principal supervisará todoel proceso de redacción.

Relevancia

Relevancia social

La implementación de este Proyecto sobre la “Eva-luación de las proteínas del ciclo celular en el cáncerde pene” permitirá obtener un conocimiento másacabado y preciso acerca de la biología molecular delcáncer. Este Proyecto ayudará no sólo a comprendermejor cómo se origina y progresa la enfermedad sinotambién dará pistas acerca de cómo ofrecer mejoresopciones terapéuticas a los pacientes afectos.

Considerando que el Paraguay es uno de los paísescon la incidencia más alta de cáncer de pene en elmundo, la importancia social de este conocimientoes evidente. Más aún, considerando que las muestrasde tejido tumoral corresponden a pacientes paragua-yos, esto permitirá que los resultados sean aplicablesdirectamente a los pacientes afectos, ya que no setrataría de información importada o llevada a caboen otras poblaciones.

Relevancia científica

Debido a la rareza del cáncer de pene en paísesdesarrollados el conocimiento disponible acerca desu biología molecular es escaso. Este Proyecto so-bre la “Evaluación de las proteínas del ciclo celularen el cáncer de pene” permitirá estudiar los nive-les de expresión inmunohistoquímica de proteínas

relacionadas al ciclo celular, investigando alteracio-nes metabólicas en células tumorales y evaluando suasociación con características histopatológicas y vira-les. Todo esto permitirá incrementar el conocimientocientífico disponible acerca de la enfermedad.

Además, este Proyecto permitirá continuar con nues-tra línea de investigación en el cáncer de pene, dentrode un programa de iniciación científica, ofreciendoun entrenamiento formal en ciencia de datos e incre-mentando por lo tanto el capital humano disponiblepara realizar investigación.

Relevancia contemporánea

El conocimiento puramente morfológico o clínico yano es suficiente hoy en día para comprender una enfer-medad, mucho menos para su adecuado diagnósticoy tratamiento. Actualmente se requiere un conoci-miento más profundo acerca de la biología molecularde las enfermedades, buscando mejores modelos teó-ricos mediante los cuales desarrollar estrategias másefectivas para el manejo de los pacientes.

Dentro de esta línea, este Proyecto sobre la “Evalua-ción de las proteínas del ciclo celular en el cáncer depene” evaluará uno de los aspectos más importantesde la biología molecular del cáncer, el control delciclo celular.

Estrategia de divulgación

Este Proyecto acerca de la “Evaluación de las pro-teínas del ciclo celular en el cáncer de pene” incre-mentará el conocimiento que se tiene acerca de labiología molecular del cáncer de pene. Este Proyectopermitirá una mejor comprensión de la relación exis-tente entre las características morfológicas y viralesde las células tumorales y el control del ciclo celular.Mediante esto, este Proyecto permitirá evaluar y vali-dar estudios similares que se han o se están llevandoa cabo centrados en el área de investigación del cán-cer de pene. Todos estos resultados serán puestosa disposición de la comunidad científica nacional einternacional y del público en general interesado demanera abierta y gratuita.

Se buscará la difusión de los resultados de esta in-vestigación mediante canales académicos y no aca-démicos. En el ámbito académico, los resultados sedivulgarán mediante Congresos y Simposios, ya seaorganizados por la Universidad del Norte u otras

5

Protocolo 14-INV-323

instituciones académicas, y el reporte de investiga-ción final será enviado para publicación a una revistacientífica internacional indexada evaluada por paresy con opción de acceso libre al artículo publicado.En el ámbito no académico, estos resultados se di-vulgarán al público en general mediante entrevistasradiales y televisivas, además de medios impresos ydigitales, y redes sociales.

Referencias

1. Chaux A, Netto GJ, Rodríguez IM, et al. Epide-miologic profile, sexual history, pathologic features,and human papillomavirus status of 103 patientswith penile carcinoma. World J Urol. 2013;31(4):861-867. doi:10.1007/s00345-011-0802-0.

2. Chaux A, Velazquez EF, Algaba F, Ayala G, Cu-billa AL. Developments in the pathology of penilesquamous cell carcinomas. Urology. 2010;76(2 Suppl1):S7-S14. doi:10.1016/j.urology.2010.02.038.

3. Chaux A, Munari E, Katz B, et al. The epi-dermal growth factor receptor is frequently ove-rexpressed in penile squamous cell carcinomas: Atissue microarray and digital image analysis studyof 112 cases. Hum Pathol. 2013;44(12):2690-2695.doi:10.1016/j.humpath.2013.07.012.

4. Chaux A, Munari E, Cubilla AL, et al. Immunohis-tochemical expression of the mammalian target ofrapamycin pathway in penile squamous cell carcino-mas: A tissue microarray study of 112 cases. Histo-pathology. 2014;64(6):863-871. doi:10.1111/his.12338.

5. Bezerra SM, Chaux A, Ball MW, et al.Human papillomavirus infection and immu-nohistochemical p16INK4a expression as pre-dictors of outcome in penile squamous cellcarcinomas. Hum Pathol. 2014;46(4):532-540.doi:10.1016/j.humpath.2014.12.004.

6. Faraj SF, Chaux A, Gonzalez-Roibon N, et al.Immunohistochemical expression of ARID1A in pe-nile squamous cell carcinomas: a tissue microarraystudy of 112 cases. Hum Pathol. 2015;46(5):761-766.doi:10.1016/j.humpath.2015.01.018.

7. Gerber DE. Targeted therapies: A new ge-neration of cancer treatments. Am fam physi-cian. 2008;77:311-319. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18297955.

8. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer sta-tistics, 2015. CA Cancer J Clin. 2015;65(1):5-29.doi:10.3322/caac.21254.

9. Bleeker MCG, Heideman DAM, Snijders PJF, Ho-renblas S, Dillner J, Meijer CJLM. Penile cancer:Epidemiology, pathogenesis and prevention. World jurol. 2009;27:141-150. doi:10.1007/s00345-008-0302-z.10. Chaux A, Cubilla AL. Advances in the pathologyof penile carcinomas. Hum pathol. 2012;43:771-789.doi:10.1016/j.humpath.2012.01.014.11. Chaux A, Cubilla AL. The role of human pa-pillomavirus infection in the pathogenesis of peni-le squamous cell carcinomas. Semin Diagn Pathol.2012;29(2):67-71. doi:10.1053/j.semdp.2011.09.001.12. Pizzocaro G, Algaba F, HorenblasS, et al. EAU penile cancer guideli-nes 2009. Eur Urol. 2010;57(6):1002-1012.doi:10.1016/j.eururo.2010.01.039.13. Sonpavde G, Pagliaro LC, Buonerba C, Dorff TB,Lee RJ, Di Lorenzo G. Penile cancer: Current therapyand future directions. Ann oncol. 2013;24:1179-1189.doi:10.1093/annonc/mds635.14. Fedor HL, De Marzo AM. Practical methodsfor tissue microarray construction. Methods MolMed. 2005;103:89-101. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15542899.15. Chaux A, Cubilla AL, Haffner MC, et al. Combi-ning routine morphology, p16INK4a immunohisto-chemistry, and in situ hybridization for the detectionof human papillomavirus infection in penile carci-nomas: A tissue microarray study using classifierperformance analyses. Urol oncol semin orig investig.2014;32:171-177. doi:10.1016/j.urolonc.2012.04.017.16. Chaux A, Han JS, Lee S, et al. Immu-nohistochemical profile of the penile urethra anddifferential expression of GATA3 in urothelialversus squamous cell carcinomas of the peni-le urethra. Hum Pathol. 2013;44(12):2760-2767.doi:10.1016/j.humpath.2013.07.023.17. Munari E, Chaux A, Maldonado L, et al. CyclinA1 expression predicts progression in pT1 urothelialcarcinoma of bladder: a tissue microarray study of149 patients treated by transurethral resection. Histo-pathology. 2015;66(2):262-269. doi:10.1111/his.12499.18. Bezerra SM, Chaux A, Ball MW, et al.Human papillomavirus infection and immu-nohistochemical p16(INK4a) expression as pre-dictors of outcome in penile squamous cellcarcinomas. Hum Pathol. 2015;46(4):532-540.doi:10.1016/j.humpath.2014.12.004.19. Chaux A, Compérat E, Varinot J, et al. Highlevels of phosphatase and tensin homolog expres-

6

Protocolo 14-INV-323

sion are associated with tumor progression, tu-mor recurrence, and systemic metastases in pt1urothelial carcinoma of the bladder: A tissue mi-croarray study of 156 patients treated by transu-rethral resect. In: Urology. Vol. 81.; 2013:116-122.

doi:10.1016/j.urology.2012.09.007.

20. R Core Team. R: A Language and Environmentfor Statistical Computing. http://www.r-project.org/.

7