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UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES

Facultad de medicina humana

ESTUDIO DEL GENERO MYCOBACTERIUM - SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLGICAS PARA AISLAMIENTO DE NEISSERIAAlumnas: Almonacid Cajamalqui, Sharmelly Contreras Lpez, Yuliana

3 AO DE MEDICINA (V CICLO)

ESTUDIO DEL GENERO MYCOBACTERIUM - SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLGICAS PARA AISLAMIENTO DE NEISSERIA

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A DIOS Y A NUESTROS PADRES POR SU ESFUERZO DEDICADO Y AHINCO EN APOYARTNOS PARA QUE PODAMOS LOGRAR NUESTROS ANHELOS Y PODAMOS SER MEJORES PERSONAS CADA DA


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DESCRIBIR

Describir las tcnicas y fundamentos implicados en los mtodos baciloscpicos que detectan la presencia de micobacterias en las muestras

DIFERENCIR

microscpicamente entre los bacilos cido-alcohol resistentes y otros microorganismos

REPORTAR

adecuadamente el hallazgo de bacilos acido-alcohol resistentes (BAAR) en las extensiones preparadas a partir de muestras patolgicas

PREVENIR

las medidas de precaucin bajo las cuales se deben efectuar el cultivo de las micobacterias patgenas y su identificacin


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El gnero Mycobacterium est integrado por bacilos largos de 3 a 5m de longitud o curvos en forma de maza, inmviles, no esporulados, con abundantes grnulos citoplasmticos, que poseen una resistencia mayor a la tincin por los colorantes comunes, pero una vez teidos son resistentes a la decoloracin con una mezcla de alcohol cido. Desde el punto de vista de los requerimientos atmosfricos algunos son aerobios y otros microaerfilos. En cuanto a la velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rpido y otros lentos. Se destaca en su estructura una gran riqueza en lpidos (20-60%). El contenido de bases de guanina ms citosina en la molcula de ADN es de 62 a 70 moles %. El gnero comprende 50 especies, entre ellas patgenos primarios, oportunistas y saprofitas.


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Las Mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han acompaado al hombre a lo largo de su historia. Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiolgicos ms frecuentes de las dos enfermedades ms conocidas de este gnero. Poco tiempo despus que Roberto Koch en 1882 descubriera M. tuberculosis, fueron identificadas otras Mycobacterias, constituyendo el grupo de las "Mycobacterias atpicas". El hallazgo de estas ltimas estuvo vinculado por aos a colonizacin transitoria o contaminacin de la muestra clnica, pero es a partir de 1950 que se les ha asignado un rol en determinadas patologas; por ejemplo, actualmente M. avium complex y enfermedad pulmonar y diseminada en pacientes con SIDA.

Clasificacin y nomenclaturaEn 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificacin til de Mycobacterium en cuatro grupos que se basaba en la velocidad de crecimiento (rpido o lento, segn sea superior o inferior a una semana), produccin de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromgeno, escotocromgeno y no cromgeno) y caractersticas coloniales

Morfologa, estructura y composicinLa morfologa caracterstica suele ser bacilar, ligeramente curvada, siendo la observable en frotis provenientes de cultivo ms regular que la que se observa en frotis de materiales patolgicos. Como todas las clulas procariotas, las Mycobacterias poseen un citoplasma, la membrana celular y un espacio periplsmico que lo separa de una gruesa y compleja pared celular.

Fisiologa y metabolismoEl metabolismo de las Mycobacterias es muy variable, encontrndose las Mycobacterias de crecimiento rpido que crecen en menos de tres das en medios simples, as como Mycobacterias que crecen lentamente y necesitan medios ms ricos, hasta M. leprae que an no ha podido ser cultivada en medios sin clulas. Los medios de cultivo pueden ser slidos o lquidos, dependiendo de su uso. Los medios slidos pueden ser en base de agar o en base de huevos (Lowenstein-Jensen), siendo este ltimo el ms usado. Entre 3 a 5 semanas se observa el desarrollo de colonias para las Mycobacterias de crecimiento lento (por Ej.: M. tuberculosis). Desde el punto de vista de los requerimientos atmosfricos M. tuberculosis y mayora de las micobacterias, son aerobios estrictos, excepto M. Bovis que microaerfilo. El crecimiento es favorecido con una atmsfera de 5-10% de CO2. temperatura ptima de crecimiento es variable; M. tuberculosis lo hace a 37C con rango entre 30 y 42C. la es La un


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Resistencia a los agentes fsicos y qumicosLas Mycobacterias son altamente resistentes a la desecacin y permanecen viables en el esputo desecado de 6 a 8 meses cuando estn protegidas de la luz solar directa. Son, en general, ms resistentes a los agentes desinfectantes que otras formas vegetativas, pero son destruidos por procedimientos de pasteurizacin.

Complejo M. tuberculosis: M. tuberculosis, M. bovis, M. microtii, M. africanum.

Clasificacin y Tipos antignicos:

Con excepcin de M. leprae, las micobacterias son clasificadas en 2 amplias categoras:

Micobacterias no tuberculosas: especies habitualmente saprofitas pero potencialmente patgenas para el hombre. M. avium intracellulare, M.kansasii, M. marinum, M. fortuitum y otras. Estas ltimas se describen segn caractersticas de velocidad de crecimiento y pigmentacin con y sin exposicin a la luz.

InmunoprofilaxisBCG es una vacuna con microorganismos vivos atenuados en forma irreversible, derivada de una cepa de M. bovis (Bacilo de Calmette y Guerin, en honor a sus creadores). Esta cepa entra en los macrfagos y se replica brevemente antes de ser destruida, y debera desencadenar el mismo tipo de respuesta inmune que M. tuberculosis, asumiendo que los antgenos ms importantes estn expresados.

M. tuberculosis, se multiplica en promedio cada 20 a 22 horas, muy lentamente, por lo que se requieren 4

a 6 semanas para obtener crecimiento bacteriano. Crecen en medios especiales, a temperatura de 37C y en un rango de pH de 7 a 7.2. El cido alcohol resistencia est dado por la constitucin qumica de la pared bacteriana. Esta pared rgida est compuesta por cidos miclicos, ceras complejas y glicolpidos. Los cidos miclicos contienen largas cadenas laterales que se unen a la molcula de cido murmico del peptidoglicano, a travs de puentes de fosfodisteres y a los arabino galactanos por uniones de glicolpidos. Otro componente importante son los dimicolatos de trehalosa (llamados cord factor) y los sulfolpdos, los cuales juegan un rol en la virulencia. Otro constituyente nico es el lipo-arabino-manano (L.A.M.) que puede contribuir al dao del hospedero. Diferencias en la estructura de ellos, pueden estar relacionados con la capacidad de estimular la produccin de citoquinas en cultivos de clulas mononucleares.


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Caractersticas de M. TuberculosisNaturaleza de la envoltura de M. Pared celular

Tuberculosis

Membrana citoplasmtica La membrana plasmtica de las Mycobacterias aparece en cortes ultrafinos como una membrana biolgica trilaminar clsica, es decir, dos capas electrn-densas separadas por una capa transparente. Sin embargo, tiene como caracterstico la presencia de molculas de lipopolisacridos, lipoarabinomananos (LAM), lipomonanos y fosfatidil-inositol-mansidos.

La envoltura bacteriana provee proteccin y soporte a las bacterias y tambin poseen mecanismos que permiten el intercambio de sustancias entre la bacteria y el medio ambiente. Hay una marcada similitud tanto qumica como estructural entre las envolturas de la mayora de las bacterias. M. tuberculosis y otras Mycobacterias son biolgicamente similares a las bacterias Gram+ (aunque frente a la tincin de Gram las Mycobacterias son dbilmente Gram+ o no se tien); pero tienen aspectos distintos. En especial, se debe destacar que, aunque ambos poseen pptidoglicano, las molculas unidas o asociadas a este polmero son, en las Mycobacterias, fundamentalmente de naturaleza lipdica en vez de protenas y lipopolisacridos, como en otras bacterias. La envoltura consiste en dos partes principales: la membrana plasmtica y, alrededor de ella, la pared celular. La primera le otorga a la clula proteccin osmtica y transporte de iones y molculas, en tanto que la segunda le brinda soporte mecnico y proteccin.

La pared celular est constituida por tres capas. Con tinciones convencionales su apariencia es: capa interna, moderadamente electrndensa, compuesta por el peptidoglicano cuya estructura es similar a la de otras bacterias; capa media, ms ancha que la anterior y electrn-transparente, compuesta por polisacrido, el arabinogalactano, cuyos extremos distales estn esterificados con cidos grasos de alto peso molecular, los cidos miclicos, de tamao y estructura nica para las Mycobacterias (70-90 tomos de Carbono). capa externa de grosor variable, electrnopaca, de la cual no puede conocerse con las tcnicas actuales, su exacta composicin, aunque se le atribuye una estructura glucolpida. Adems de los componentes anteriores existen protenas asociadas a la pared, algunas con funcin enzimtica (necesarias para la construccin y reconstruccin de los polmeros de la pared durante el proceso de divisin celular y crecimiento), otros recientemente descubiertos con funcin de porina.


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Factores de virulencia Un aspecto caracterstico de M. tuberculosis que contribuye a su virulencia es su habilidad para crecer dentro de monocitos y macrfagos. An no est aclarado exactamente como M. tuberculosis entra en el macrfago. Existen dos posibilidades no totalmente aclaradas: mediante el proceso habitual de fagocitosis mediado por la opsonizacin por C3b o C3b. la bacteria estimula su propia fagocitosis a travs de invasinas. Por otra parte, se sabe actualmente que un factor de virulencia que podra contribuir a la supervivencia de M. tuberculosis en los macrfagos, es su habilidad para prevenir la acidificacin del fagosoma. Habitualmente la ingestin de una bacteria por fagocitosis es seguida de la acidificacin del fagosoma, mediada por ATPasas de la membrana fagosomal, la que bombea protones hacia el interior de esta estructura, reduciendo el pH en l. Dicha acidificacin no slo inhibe el desarrollo bacteriano sino que, adems, es un paso importante en la fusin lisosomafagosoma, y en la activacin de los factores bactericidas liberados durante la fusin.

Destruccin tisular Muchos patgenos bacterianos causan dao en los tejidos del husped por desencadenar una respuesta inflamatoria local o sistmica. Esta hiptesis es una posible explicacin del dao pulmonar causado por M. tuberculosis y hay gran inters en detectar qu antgenos son los responsables del desencadenamiento de esta respuesta destructiva del hospedero. Se sabe poco acerca de los antgenos ms importantes responsables de esta respuesta, pero los implicados en la actualidad son: cidos miclicos de la pared celular (factor cuerda). Son txicos cuando son inyectados a animales y pueden desencadenar una respuesta inflamatoria; muramil dipptido, estimula el sistema inmune y dispara la produccin de citoquinas; compuestos de la pared no identificados y productos txicos liberados por los lisosomas que estimulan la produccin de factor de necrosis tumoral alfa (NFT).

PatogenicidadLos ncleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos, dispersos en el aire, provenientes de un sujeto enfermo con tuberculosis pulmonar abierta, son lo suficientemente pequeos para no quedar atrapados en el aparato mucociliar bronquial y as alcanzar el espacio terminal areo donde comienza la multiplicacin. El foco inicial es casi siempre de localizacin subpleural generalmente ubicado en la zona media de los pulmones donde el mayor flujo areo favorece el establecimiento de los bacilos inhalados. Excepcionalmente se encuentra el foco inicial en otras reas (por Ej.: piel, intestino, orofaringe, genitales). En el pulmn las bacterias son ingeridas por los macrfagos alveolares, los cuales pueden tener un bajo grado de actividad antimicobacteriana como para eliminar pequeas cantidades de bacilos. Sin embargo, la multiplicacin bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente, destruye los macrfagos. Hacia el foco son atrados desde el torrente sanguneo linfocitos y monocitos, diferencindose los ltimos en macrfagos que ingieren las bacterias liberadas de las clulas degeneradas y lentamente se desarrolla una o ms reas de neumonitis.ESTUDIO DEL GENERO MYCOBACTERIUM - SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLGICAS PARA AISLAMIENTO DE NEISSERIA

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Los macrfagos infectados son llevados por va linftica a ganglios linfticos regionales (hiliares, mediastinales y, a veces, supraclaviculares o retroperitoneales), pero en el husped no inmune no son retenidos all y se puede diseminar por va hemtica a diferentes tejidos, hecho condicionado por el tipo de flujo sanguneo. Preferentemente se ubicarn en: ganglios linfticos, riones, epfisis de huesos largos, espacio subaracnoideo, pero el sitio ms importante sern las reas apicales pulmonares. Los bacilos tuberculosos que continan multiplicndose lesionan los rganos donde estn localizados, provocando licuefaccin de los tejidos, donde crecen extracelularmente, llegando a ser millones. En estas condiciones es fcil que, dado el gran nmero de bacilos, aparezcan mutantes resistentes a los agentes antituberculosos. Un 5% aproximadamente de los infectados desarrolla la enfermedad durante el primer ao y otro 5% lo har ms tarde como resultado de reactivaciones de los bacilos persistentes dentro de viejos focos de infeccin; Estas reactivaciones tardas se producen habitualmente en las zonas altas del pulmn, pero puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo.

Prueba de la tuberculina El diagnstico inmunolgico se basa en la prueba de tuberculina o Mantoux, que muestra la existencia de respuesta inmunitaria celular o hipersensibilidad retardada (se positiviza entre la semana 2 y 12 tras la infeccin). Su positividad indica infeccin, pero no siempre enfermedad. La AAP y los CDC desaconsejan el empleo sistemtico del Mantoux en nios sin factores de riesgo

Tcnica La lectura registra en milmetros (mm) la induracin mediante palpacin, medida en eje transversal al eje mayor del antebrazo, y debe realizarse a las 48-72 horas de la inyeccin. Puede haber falsos positivos y negativos

Interpretacin de la prueba de tuberculina - Induracin > 5 mm. Positiva en nios en contacto con TBC activa, nios con sospecha clnica o radiolgica de TBC, nios inmunodeprimidos/VIH y nios seroconversores de Mantoux - Induracin > 10 mm. Positiva en cualquier otro caso, incluidos nios inmigrantes, adoptados en el extranjero y cribado de nios sanos (la AAP considera Mantoux positivo 15 mm en nios sanos 4 aos) La vacuna BCG puede determinar cierta reactividad durante 3-5 aos, a veces ms. En caso de vacuna BCG reciente (< 3 aos) se considera Mantoux positivo a una induracin > 15 mm. En situaciones de riesgo de desarrollar TBC debe obviarse el antecedente de la BCG El nio enfermo presenta en ms del 90% de los casos un Mantoux positivo. No obstante, en ciertas ocasiones (anergia) y hasta en el 50% de la tuberculosis miliar y menngea, la prueba puede ser inicialmente negativa Falsos positivos - Infeccin no tuberculosa (micobacterias atpicas y vacunacin BCG previa) - Otras: transfusin de sangre de donantes reactores positivos previa, hematoma local, infeccin del punto de inyeccin, sensibilidad a los componentes de la tuberculina, etc Falsos negativos - Infecciones sistmicas recientes: bacterianas (TBC reciente -fase anrgica-, grave o diseminada, fiebre tifoidea, brucelosis, tosferina, lepra), vricas (VIH, sarampin, parotiditis, varicela, gripe), fngicas - Vacunaciones con virus vivos en 1-2 meses previos: sarampin, parotiditis y varicela - Enfermedades graves, personas inmunocomprometidas. Insuficiencia renal crnica, desnutricin protica grave, linfomas, leucemias, sarcoidosis - Corticoterapia y tratamientos inmunosupresores - Edades extremas (menores de 3 meses) - En relacin con la tcnica de la prueba: tuberculina empleada, mtodo de administracin (no intradrmica), lectura inadecuada (importante medir induracin y no eritema)


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Cules son los medios que pueden usarse para el cultivo de Mycobacterium, y cules son las caractersticas de estos medios?

El mas comnmente usado es el medio de Loweenstein Jensen que contiene todos los elementos necesarios para el crecimiento del BK e inhibidores para posibles contaminantes. La formula contiene KH2PO4 anhdrido, MgSO4 7H2O, citrato Magnsico, Asparagina, Glicerina, agua destilada, harina de papas, huevo frescos, verde de malaquita (sol. acuosa al 2%). Es un medio slido. Existen tambin medios lquidos como el medio de DUBOIS que contiene Tween 80. Otros sintticos como el de SULA. En medios slidos, el germen requiere no menos de 15 das para presentar desarrollo visible. Las Colonias son de color ante, secas y rugosas.

En qu consiste la clasificacin Runyon para micobacterias?En 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificacin til de Mycobacterium en cuatro grupos que se basaba en la velocidad de crecimiento (rpido o lento, segn sea superior o inferior a una semana), produccin de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromgeno, escotocromgeno y no cromgeno) y caractersticas coloniales. Se presenta una clasificacin modificada de la original de Runyon que incluye los miembros del gnero Mycobacterium de importancia humana actualmente. Bacilos Atpicos segn Runyon: a.- Grupo I (Fotocromgenos) b.- Grupo II (Escotocromgenos) c.- Grupo III (No cromgenos) d.- Grupo IV (de crecimiento rpido).

EXPLICA LA REACCION A LAS PRUEBAS DE TUBERCULINA

La prueba de Tuberculina o PPD continua siendo el estndar de oro en el diagnstico de la infeccin tuberculosa, especialmente prevalente en Espaa, con aparicin de unos 14.000 casos nuevos al ao, calculndose una incidencia del 33% a nivel mundial, y asociada a otros procesos patolgicos emergentes en las ltimas dcadas y a las deficientes condiciones de vida de algunos sectores de nuestra sociedad, siendo una importante fuente de morbi-mortalidad. De sencilla aplicacin intradrmica, este test inmunoreactor introducido por Charles Mantoux precisa de personal especialmente entrenado para su administracin y lectura, temas que se describirn en este captulo, mostrando tambin diversas consideraciones sobre su utilidad e indicacin en diferentes situaciones inmunolgicas.


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Prueba de Mantoux

Administracin:

Con el brazo del nio ligeramente flexionado y apoyado en una superficie plana, exploraremos e identificaremos una zona del antebrazo (preferentemente el no dominante) a nivel de la unin entre el tercio medio y el superior, libre de escoriaciones y alejada de los vasos, donde realizaremos la tcnica. Procederemos a la limpieza de la zona con el antisptico elegido, dejndolo secar completamente antes de la inyeccin para evitar que la penetracin en la dermis afecte al resultado. Se utilizaran guantes desechables no estriles, para la administracin de este test, como medida universal profilctica. Se identificar la zona de la puncin con la rotulacin de una circunferencia de ms de tres centmetros de dimetro.

Lectura: se debe realizar en las 48-96h posteriores a la inoculacin de la prueba de tuberculina, y su base la constituye la ausencia o presencia de induracin y su tamao, que se determina como el dimetro de induracin transversal al eje mayor del antebrazo. (imagen 5: lectura correcta e incorrecta) Se realizar medicin de la induracin, no del eritema circundante, directamente o por tcnica Sokal que ha demostrado en algunos estudios ser ms eficiente en los resultados, sobretodo en personal poco experimentado. Para ello emplearemos un bolgrafo con punta de bola tradicional que traccionaremos a travs de la piel circundante hacia la induracin, detenindose en el lugar donde se inicia sta. Realizaremos el procedimiento de igual manera en la zona contralateral, delimitando un espacio que corresponde al endurecido, facilitando as la medicin de los puntos finales trazados y obteniendo el dimetro de la zona indurada con la regla flexible


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Registro: se debe anotar el dimetro en milmetros (no como positivo o negativo), el tiempo exacto transcurrido desde la realizacin de la prueba diagnstica, y posibles factores que hayan podido influir en el resultado o lectura del test intradrmico.

Resultados: Cada sociedad elige unos puntos de corte de positividad de la prueba de Mantoux, hecho que junto a la infradeclaracin de la enfermedad, hace menos uniformes los resultados obtenidos en los diferentes pases y poco comparables. Estos estndares estn ligados a la prevalencia de la enfermedad en cada medio.

As la American Academy of Pediatrics considera la intradermoreaccin de Mantoux positiva:Induracin 5 mm Casos Positivos Contacto ntimo con casos ciertos o sospechosos. Nios sospechosos de enfermedad tuberculosa clnica o radiolgica. Inmunodeprimidos o Infectados por el VIH. Menores de 4 aos Malnutricin, linfoma, Enfermedad de Hodgkin, diabetes o IRC. Expuestos a adultos de riesgo: infectados por el VIH, drogadictos, vagabundos, cuidadores de instituciones, institucionalizados, seroconversores de la prueba de tuberculina en los dos ltimos aos. Nios con riesgo aumentado de tuberculosis diseminada. Nios mayores de 4 aos sin contacto ni factores asociados de riesgo.

10 mm

15 mm

En cambio en el Informe de la Sociedad Espaola de Infectologa Peditrica sobre la interpretacin de la prueba de Mantoux, la considera positiva en todos los nios: Induracin 5 mm Casos Positivos Contactos ntimos con casos ndice o sospechosos. Nios sospechosos de enfermedad tuberculosa clnica o radiolgica Nios en situaciones de inmunosupresin o infeccin por VIH. Nios con conversin de Mantoux previamente negativo. Cualquier otro caso (incluidos los nios inmigrantes y el cribado de nios

10 mm


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sanos). Puede ir acompaado de linfangitis e induracin de los ganglios linfticos regionales.

La solucin de PPD debe conservarse protegida de la luz y a una temperatura entre 2 y 8C. Nunca congelar. No deber diluirse la solucin y una vez cargada la cantidad necesaria (0,1ml) en la jeringa deber administrarse en el periodo mximo de 15-30 minutos para evitar la absorcin de la protena por parte de las paredes de la jeringa. Se recomienda que los viales de tuberculina usados no deben ser guardados ms de dos das, debiendo indicar la fecha de apertura, aunque en recientes estudios se ha comprobado su efectividad y asepsia en ampollas abiertas semanas antes de su empleo. Comprobar la fecha de caducidad del vial. No administrar el test tuberculnico hasta seis semanas despus de la administracin de vacunas de virus vivos (DTP), aunque no est contraindicada la administracin simultnea de la vacuna y la prueba de la tuberculina.

Qu pruebas de susceptibilidad pueden usarse para el diagnstico de Mycobacterium?DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO DE M. TUBERCULOSIS.a.- Por examen directo. b.- Por cultivo. c.- Por Inoculacin. OBTENCIN DE LA MUESTRA.El M. Tuberculosis se puede aislar de diversos productos patolgicos: esputo, lavado gstrico, orina, LCR, liquido ascitico, secrecin de fstulas, heces, lesiones de piel, huesos, etc. La forma correcta de obtencin de muestras y su procesamiento forma todo un capitulo especial.


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EXAMEN DIRECTO.

METODOLOGIA.Tratndose de esputo, este gran valor, pues nos permite adems de hacer el diagnostico, detectar aquellos pacientes baciliferos. (de gran importancia desde un punto de vista epidemiolgico). Es un procedimiento sencillo, barato, al alcance de cualquier centro de salud del pas. Se necesita solamente un microscopista bien entrenado, un microscopio, colorantes y laminas. Colorantes: La coloracin indicada es la de Ziehl Neelsen

Usando lpiz para vidrio dividir la lamina en tres tercios. El primer tercio sirve para la rotulacin. Hacer el frotis lo ms homogneo posible en los restantes dos tercios.

TECNICA DE LECTURA.Se debe colocar la lente de inmersin en la mitad del primer tercio y leer siguiendo el sentido de las flechas hacia la derecha como indica el grabado. Cuando se ha hecho esta operacin, significa que sea ledo 1000 campos caso de negatividad leer otros 1000 campos siguiendo el sentido inverso de la flecha MODO DE INFORMAR.No se encuentran Bacilos en 200 campos: BK negativo Menos de 1, a un Bacilo por campo en 100 campos: BK positivo 1 De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos: BK positivo2 Ms de 10 Bacilos por campo, por 20 campos: BK positivo 3

TECNICAS DE COLORACION. Preparar el frotis y fijar a la llama. Cubrir con el colorante (fuccina fenecida). Calentar a la llama hasta la produccin de tres humos. Lavar con agua de cao. Decolorar con alcohol acido. Lavar con agua de cao Colorear con azul de metileno. Lavar con agua de cao; secar y observar con lente de inmersin usando aceite de inmersin. Los grmenes que retienen el color rojo a pesar de la decoloracin son los llamados alcohol acido resistentes y destacando en un fondo de color Azul.

Reactivos: Sol. de fuccina fenicada. Sol. de alcohol acido. Sol. de Azul de metileno o sol. saturada de acido pcrico


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OTROS TIPOS DE EXAMEN DIRECTO

1.- Examen directo previa homogenizacin: usando NaOH al 4 % y luego centrifugando el homogenizado. Del sedimento se hace frotis y coloracin. Se usa en aquellos esputos negativos al examen directo comn. 2.- Diagnostico directo por fluorescencia: Se usa como colorante la Aureamina. Se necesita microscopio de fluorescencia. Se utiliza para el diagnstico en masa de centros de referencia.

CULTIVOS.Se utiliza en aquellos casos en que pese a la negatividad del examen directo se sospecha de cuadro de TBC. Tambin se utiliza para el aislamiento del germen y poder realizar posteriormente pruebas de sensibilidad virulencia y tipificacin de Micobacterias. Hay especimenes que se pueden sembrar directamente: Ejem. LCR o las que proceden de cavidades cerradas es decir, que no estn contaminadas. Otras en cambio, como el esputo, necesitan previamente de un proceso de DESCONTAMINACIN. En general estos procesos de recontaminacin tienen pro objeto eliminar los grmenes comunes y poder recuperar el BK; mientras mas energtico es el mtodo, hay menos peligro de contaminar el medio de cultivo y menos poder de recuperacin del Bacilo Tuberculoso, y al revs, mientras menos energtico es el mtodo, hay mayor poder de recuperacin del BK pero mayor riesgo de contaminar el medio de cultivo. En los mtodos usados en la actualidad, el riesgo de contaminacin hasta un 4% se considera aceptable, por eso se deben inocular por lo menos 2 tubos con medio L.J. METODOS DE DESCONTAMINACON.Mtodo en el que se usa NaOH y HCl, usando Rojo de Fenol como indicador. Otro mtodo recomendado es el de CORPER Y STORNER en la que se emplea Trifosfato de Sodio. METODO DE SCHMIEDEL: Se usan dos soluciones: Solucin A - NaOH 5 grs - Na2HPO4. 12 H2O ... 3 grs - Agua destilada... 1000 ml Solucin B : - CaCl2 6H2O ... 3 grs - BaCl2 2H2O ... 2 grs - Agua destilada 1000 ml.


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Procedimiento: A 2 ml de esputo en un tubo estril con tapn de goma, se aade 8 ml de Sol. A y 2 gotas de Sol B. Agitar fuertemente y dejar reposar 18- 24 Hrs. En la oscuridad a temperatura ambiente; el sedimento se usa para la siembra utilizando pipeta de Pasteur. Se incuba en forma vertical los tubos oculados. MEDIOS DE CULTIVO.El mas comnmente usado es el medio de Loweenstein Jensen que contiene todos los elementos necesarios para el crecimiento del BK e inhibidores para posibles contaminantes. La formula contiene KH2PO4 anhdrido, MgSO4 7H2O, citrato Magnsico, Asparagina, Glicerina, agua destilada, harina de papas, huevo frescos, verde de malaquita (sol. acuosa al 2%). Es un medio slido. Existen tambin medios lquidos como el medio de DUBOIS que contiene Tween 80. Otros sintticos como el de SULA. En medios slidos, el germen requiere no menos de 15 das para presentar desarrollo visible. Las Colonias son de color ante, secas y rugosas. METODOS DE SENSIBILIDAD A LAS DROGAS ANTITUBERCULOSAS.Se realiza incorporando las drogas a los medios de cultivo. Dos principalmente: El mtodo de las concentraciones Absolutas y el Mtodo de las Proporciones. Tambin se estn ensayando mtodos engorrosos y costosos, solo se realizan en laboratorios muy especializados. PRUEBAS DE VIRULENCIA.Se utiliza las pruebas de Crecimiento en Cuerda (factor Cord); La prueba de la Niacina, la del Rojo Neutro, etc. INOCULACIONES.S utiliza el cobayo; tiene el mismo valor que el cultivo. Se inocula para ciertos especimenes clnicos como LCR para evitar el riesgo de su contaminacin. PRUEBAS INMUNOLOGICAS.Prueba de la Cutirreaccin a la Tuberculina (Sensibilidad Retardada). Otros tipos de pruebas de inmunidad humoral.


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Pruebas usadas para diferenciar MycobacteriasTIPICAS (no se toman en cuenta el microtii)Tuberculosis CORDON + Bovis + Avium + Grupo I +/Amarillo o Rojo (a la luz) +++ Brick dust polvo de ladrillo -

ATIPICAS

Grupo II Anaranjado De ( luz oscura +++

Grupo III -

Grupo IV Blanco naranja Rojo +

PIGMENTO

Ante +

Blanco +

Blanco +

Blanco +

CATALASA

ROJO NEUTRO Rojo NIACINA + Rojo Rojo -

Brick dust -

Amarillo -

Amarillo -

PATOGENECIDAD PARA EL COBAYO PATOGENECIDAD PARA EL CONEJO

+++

+++

-

-

-

-

-

+/-

+++

+

-

-

-

-

PATOGENECIDAD PARA AVES

-

-

+++

-

-

-

Crece en menos de una semana y bien a 25 C

TEMPERATURA DE DESARROLLO

No crece a 45C debajo de 25C

Igual al anterior

Crece a 45C no a 25C

En 1- 2 semanas crece bien a 25C

Crece lentamente a 25C

Semejante al humano


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EXPLICA LA REACCION A LAS PRUEBAS DE TUBERCULINA

Por qu la bacteriologa de la Tuberculosis es la columna vertebral del programa de control? M. tuberculosis es una bacteria que requiere tcnicas especiales de tincin y medios de cultivo distintos a los empleados habitualmente en bacteriologa. Qu es la proporcin crtica en la prueba de sensibilidad a frmacos antituberculososo por el mtodo de las proporciones? Prescripcin de esquemas de tratamiento Inadecuados - No seguir rgimen recomendado - Irregularidad en la ingestin de Medicamentos - Intolerancia a drogas. - Resistencia inicial a las drogas administradas. - Suspensin prematura del tratamiento.


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con otros genros ya estudiados el medio de cultivo ideal para el aislamiento de neisseria

COMPARAR

REALIZAR

DIFERENCIAR

Las caracteristicas singulares del genero neisseria


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Caractersticas del gnero Neisseria El gnero Neisseria incluye bacterias con morfologa de diplococos Gram-negativos con una reaccin positiva a las pruebas de oxidasa y catalasa. Conjuntamente con los gneros Moraxella (incluyendo Branhamella catarrhalis, actualmente Moraxella catarrhalis), y Kingella conforman la familia Neisseriaceae. Algunas de las caractersticas que permiten diferenciar entre los gneros de la familia Neisseriaceae En el gnero Neisseria, el cual tiene la mayor importancia clnica dentro de la familia Neisseriaceae, se incluyen las siguientes especies: N. gonorrhoeae N. meningitidis N. lactamica N. cinerea N. polysaccharea N. subflava N. sicca N. mucosa N. elongata N. flavescens Los diplococos Gram negativos del genero Neisseria se asemejan a granos de caf y algunos producen capsula. Las especies de Neisseria se caracterizan por ser de metabolismo aerobio y el crecimiento de las especies patgenas se ve favorecido mediante incubacin en una atmosfera altamente hmeda y enriquecida a 5-8% de CO2. Su temperatura de crecimiento es ptima entre los 35-37oC y tienen requerimientos nutricionales complejos. Algunas especies son capaces de degradar unos pocos carbohidratos, mientras que otras son completamente incapaces de hacerlo, mientras que las especies saprofitas, especialmente, producen pigmentos carotenoides. Las especies patgenas primarias para el ser humano son

N. gonorrhoeae

Es nutricionalmente mucho mas exigente que N. meningitidis, de manera tal que puede crecer nicamente en medios enriquecidos como agar chocolate, pero no puede crecer en agar sangre, mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en agar sangre como en agar chocolate. Es el agente etiolgico de la gonorrea, una enfermedad de transmisin sexual Es una bacteria altamente sensible a la desecacion y cambios de temperatura, por lo que la infeccion se presenta al haber contacto intimo y prolongado de mucosas y secreciones. El periodo de incubacin de la infeccin vara de 2 a 7 das. Posterior a este periodo, en hombres se presenta una descarga purulenta abundante, disuria y si no se da tratamiento pueden presentarse complicaciones como epididimitis y prostatitis.


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En mas del 50% de las mujeres se puede presentar una infeccion asintomatica o con solo un aumento de las secreciones vaginales. En las infecciones sintomaticas hay un aumento de secrecion vaginal, disuria, dolor abdominal y alteraciones menstruales. Las muestras clnicas de origen genital deben ser inoculadas en medios enriquecidos pero selectivos, como el agar Thayer-Martin modificado (MTM) o el agar Martin-Lewis (ML), que contienen cuatro antibioticos que ayudan a suprimir el crecimiento de bacterias contaminantes: vancomicina (MTM, 3 g/ml; ML, 4 g/ml) colistina (7.5 g/ml) lactato de trimetoprim (5 g/ml) un agente antifungico (MTM, nistatina, 13.5 g/ml; ML. anisomicina, 20 g/ml). Las colonias de N. gonorrhoeae a las 24 horas de incubacion son pequenas, de 0.5 a 1.0 mm de diametro, generan una coloracion blanca-grisacea y son levantadas y brillantes.

N. meningitidis

Es agente etiologico de bacteremia y meningitis epidemica. Puede presentar una capsula de polisacaridos extracelulares, la cual se ha clasificado en trece diferente serotipos: A, B, C, D, X, Y, Z, W125, 29E, H, 1, K y L. Coloniza la mucosa respiratoria, puede alcanzar sangre y generar una meningococcemia, la cual puede evolucionar a coagulacion intravascular diseminada, choque endotoxico y necrosis en glandulas suprarrenales, ademas de un cuadro de meningitis aguda. La infeccion invasiva por N meningitidis puede provocar rapidamente la muerte del paciente. Para el aislamiento de N meningitidis a partir de muestras clinicas como sangre y liquido cefalorraqudeo se puede utilizar agar sangre y agar chocolate. El crecimiento en agar sangre de un aislamiento primario de N meningitidis es variable, aunque posteriormente la bacteria puede adaptarse al medio durante los subcultivos. Luego del periodo de incubacion bajo las condiciones adecuadas, las colonias de N. meningitidis son de 1.5 mm de diametro aproximadamente, redondas, de superficie y borde lisos, con aspecto humedo y brillante. Algunas colonias son mucoides por la capsula dando una coloracion que va de blanco a gris.

Branhamella (Moraxella) catarrhalis

Es considerada como parte de la flora normal, aunque se ha relacionado como agente causante de infecciones pulmonares y de oido medio. Esta es una bacteria no fastidiosa que crece tanto en agar chocolate como en agar sangre, dando una morfologia colonial similar a las de Neisseria, pero que puede ser facilmente diferenciada de las especies de Neisseria mediante la prueba de ADNasa.


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