proteinasas aspÁrticas digestivas de las langostas ... · 4.1. objetivo general ... 5.1...
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I
P rog rama de Es tud io s de Posg rado
PROTEINASAS ASPÁRTICAS DIGESTIVAS DE LAS
LANGOSTAS QUELADAS Homarus gammarus Y
Homarus americanus: CARACTERIZACIÓN
BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
T E S I S
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias
Uso , Manejo y Preservac ión de los Recursos Natura les
(Or ien tac ión en Bio tecnolog ía )
p r e s e n t a
L i l i a n a C a r o l i n a R o j o A r r e o l a
La Paz, B.C.S. Agosto de 2010
COMITÉ TUTORIAL Y REVISOR DE TESIS
Dr. Fernando L. García Carreño Director de Tesis
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
Dra. Norma Hernández Saavedra Asesor
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
Dra. Adriana Muhlia Almazán Asesor
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
Dr. Fernando G. Noriega Asesor
Florida International University
Dr. Reinhard Saborowski Asesor
Alfred Wegener Institute
MIEMBROS DEL JURADO DE LA DEFENSA DE TESIS
Dr. Fernando L. García Carreño
Dr. Arturo Sánchez Paz
Dra. Adriana Muhlia Almazán
Dr. Fernando G. Noriega
Dr. Reinhard Saborowski
Dra. Patricia Hernández Cortes – suplente –
A mis hombres, Ian y Cian.
Agradecimientos:
La presente investigación fue financiada por el proyecto CONACyT 80935: “Enzimas
digestivas en decápodos crustáceos: proteinasas ácidas y lipasas verdaderas. Desde el
gen hasta la función”. También agradezco a CONACyT por el apoyo recibido a través de
la beca doctoral numero 220577.
Agradezco a los miembros del comité tutorial, a los Drs. Fernando Noriega, Reinhard
Saborowski, Adriana Muhlia, Norma Hernández y László Graf, por alojarme en sus
laboratorios, por su disposición, tiempo y también por su amistad. Al Dr. Fernando
García‐Carreño por presentarme a las proteasas, por compartir conmigo su experiencia
y su visión de la ciencia, por abrirme las puertas a esta aventura; a lo largo de la
realización de este trabajo conocí a personas increíbles, a las que también agradezco
profundamente.
Quiero agradecer a todos mis compañeros de BQ, presentes y pasados, en especial a
María de los Ángeles Navarrete porque sin ser miembro del comité tutorial, me brindó
asesoría y apoyo invaluables que contribuyeron de manera directa en la realización de
este trabajo, a la Dra. Patricia Hernández por revelarme algunos secretitos de las
proteínas; al Dr. Julio Córdova por todas las veces que cruzó la explanada para venir a
ayudarme, a Cris, la ardilla mayor, por las discusiones e intercambios de ideas y por
enseñarme como ser ñoña.
A mi cómplice Ian Balam, por ser conmigo, por tomar mi mano para hacer nuestro
tiempo, por evocar a la locura, la alegría, la cordura, al deseo, la reflexión y al amor. A
mi familia que creció, que me hace crecer y que todos los días me hacen saber que la
vida SI es color rosa: Balam, Maripaz, David, David chico, Conchis, Fer, Ann, Ix y Rubén;
a Mateo y a Cian Lucca (mi chachachá), por existir, porque llenan mi alma de felicidad
inmensa y porque me inspiran ser una mejor persona.
I
CONTENIDO LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................... III LISTA DE TABLAS................................................................................................................................. IV
III
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 1 2. ANTECENTES .................................................................................................................................... 6 2.1. El sistema digestivo de los crustáceos ..................................................................................... 6 2.2. Las proteinasas del sistema digestivo de los crustáceos ......................................................... 8 2.3. Las aspártico proteinasas ......................................................................................................... 9 2.4. Las cisteíno proteinasas ......................................................................................................... 15 2.5. Los sujetos de estudio ............................................................................................................ 17 2.5.1. Homarus gammarus ........................................................................................................ 19 2.5.2. Homarus americanus ...................................................................................................... 19
2.6. Planteamiento de la investigación ......................................................................................... 20 3. HIPÓTESIS ...................................................................................................................................... 22 4. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 22 4.1. Objetivo general ..................................................................................................................... 22 4.2. Objetivos específicos .............................................................................................................. 22
5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 23 5.1 Metodología general ............................................................................................................... 23 5.1.1. Animales experimentales y obtención del jugo gástrico de las langostas ...................... 23 5.1.2. Experimentos de ayuno y realimentación ....................................................................... 24
5.2. Identificación, aislamiento y caracterización bioquímica de una catepsina D digestiva de las langostas queladas ........................................................................................................................ 26 5.2.1. Identificación y comparación de las proteinasas del jugo gástrico de las langostas queladas .................................................................................................................................... 26 5.2.1.1. Ensayos de actividad proteinolítica e inhibición ...................................................... 26 5.2.1.2. Detección de enzimas del jugo gástrico por SDS‐PAGE con sustrato (zimograma) . 27 5.2.1.3. Ensayo de actividad de catepsina D ......................................................................... 29
5.2.2. Aislamiento de la catepsina D1 de las langostas europea y americana .......................... 30 5.2.2.1. Cromatografía de afinidad y ultrafiltración .............................................................. 30 5.2.2.2. Análisis de espectrometría de masas y N‐terminal .................................................. 31
5.2.3. Determinación de las características bioquímicas de la catepsina D1 digestiva de las langostas queladas .................................................................................................................... 32 5.2.3.1. Efectos de agentes reductores y desnaturalizantes sobre el comportamiento electroforético de catepsina D1 de la langosta americana ................................................... 33 5.2.3.2. Determinación del punto isoeléctrico de la catepsina D1 ....................................... 33 5.2.3.3. Tinción de Schiff para la identificación de proteínas glicosiladas ............................ 34 5.2.3.4. Evaluación del efecto del pH y temperatura sobre la actividad de catepsina D ...... 34 5.2.3.5. Evaluación de los parámetros cinéticos a diferentes temperaturas. ....................... 35 5.2.3.6. Evaluación de la actividad enzimática de la catepsina D1 sobre sustratos naturales ............................................................................................................................................... 36
5.3 Caracterización del cDNA de las catepsinas D ........................................................................ 37 5.3.1 Identificación de secuencias de cDNAs de catepsinas D de las langostas queladas ........ 37 5.3.2. Detección del mRNA de las catepsinas D y L en diferentes tejidos de las langostas queladas .................................................................................................................................... 39 5.3.3. Secuenciación del cDNA de las catepsinas D1 y D2 de la glándula digestiva de las langostas queladas .................................................................................................................... 40
II
5.3.4. Cuantificación del mRNA de catepsina D1 y catepsina L por PCR en tiempo real en la glándula digestiva de las langostas queladas ............................................................................ 41 5.3.4.1. Análisis estadístico ................................................................................................... 44
5.3.5. Modelación in silico de las características estructurales de la catepsina D1 .................. 44 5.3.6. Análisis de la agrupación de secuencias por cladograma ............................................... 45
6. RESULTADOS ................................................................................................................................. 46 6.1. Identificación, aislamiento y caracterización bioquímica de la catepsina D digestiva de las langostas queladas ........................................................................................................................ 46 6.1.2. Las proteinasas del jugo gástrico de las langostas .......................................................... 46 6.1.3. Aislamiento de una proteinasa aspártica digestiva de las langostas queladas ............... 50 6.1.3.1. Análisis de espectrometría de masas y secuencia N‐terminal ................................. 53 6.1.3.2. Evaluación de la actividad de catepsina D en el jugo gástrico de la langosta americana en ayuno .............................................................................................................. 53 6.1.3.3. Análisis de las características estructurales de la catepsina D1 deducidas por su comportamiento electroforético bajo diferentes condiciones ............................................. 54
6.2. Caracterización bioquímica de la catepsina D1 digestiva de las langostas queladas ............ 56 6.2.1. Condiciones de pH óptimas para la actividad enzimática —hidrólisis de un sustrato sintético— ............................................................................................................................. 56 6.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH de las catepsinas D1 ............................................. 57 6.2.3. Efecto de la temperatura sobre los parámetros cinéticos de la catepsina D1 de las langostas queladas ................................................................................................................ 59 6.2.4. Efecto del pH en la hidrólisis de un sustrato proteico por las catepsinas D1 ............. 61
6.3. Caracterización del cDNA de las catepsinas D ....................................................................... 64 6.3.1. Detección de mRNA de catepsinas D y L en diferentes tejidos ....................................... 64 6.3.2. El cDNA de las catepsinas D1 y D2 de las langostas queladas ........................................ 65 6.3.3. Las secuencias deducidas de aminoácidos de las catepsinas D1 y D2 ............................ 67 6.3.4. El efecto del ayuno en la concentración del mRNA de la catepsina D1 y catepsina L .... 70 6.3.5. Modelo estructural de la catepsina D1 ........................................................................... 71 6.3.6. Análisis de agrupación de secuencias por cladograma ................................................... 74
7. DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 76 Las proteinasas digestivas de las langostas queladas ............................................................... 76 Las características bioquímicas de la catepsina D1 de las langostas queladas ......................... 80 Las características moleculares de la catepsina D1 de las langostas queladas ......................... 90
Conclusiones ................................................................................................................................... 100 Referencias ...................................................................................................................................... 102
III
LISTA DE FIGURAS Figura 1. La glándula digestiva de los crustáceos. .................................................................. 7 Figura 2. Representación esquemática de la estructura de la catepsina D. ........................ 12 Figura 3. Mecanismo catalítico de la catepsina D. ............................................................... 14 Figura 4. Vista dorsal y distribución de la langosta europea. Tomado de FAO (1991). ....... 19 Figura 5. Vista dorsal y distribución de la langosta americana. Tomado de FAO (1991). .... 20 Figura 6. Método de extracción de jugo gástrico de la langosta europea H. gammarus,
vista ventral. .................................................................................................................. 24 Figura 7. Comparación de las secuencias deducidas de aminoácidos de dos isoformas
putativas de catepsinas D de H. americanus. ............................................................... 38 Figura 8. Actividad proteinolítica total y el efecto de los inhibidores en el jugo gástrico de
la langosta europea H. gammarus. ............................................................................... 46 Figura 9. SDS‐PAGE 12% y zimogramas en donde se muestra el efecto de los inhibidores
sobre la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la langosta (a) europea, (b) americana y (c) roja. ...................................................................................................... 47
Figura 10. SDS‐PAGE 12% y zimogramas en donde se muestra el efecto de los inhibidores sobre la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la langosta (a) europea, (b) americana y (c) roja. ...................................................................................................... 48
Figura 11. Actividad enzimática del jugo gástrico de H. gammarus. ................................... 49 Figura 12. Aislamiento de la catepsina D digestiva de la langosta americana por
cromatografía de afinidad usando pepstatin A‐agarosa............................................... 50 Figura 13. Electroforesis de la catepsina D1 de la langosta americana aislada en una
columna de pepstatin A‐agarosa. ................................................................................. 52 Figura 14. Cambio de la actividad de catepsina D en el jugo gástrico de la langosta
americana por efecto del ayuno. .................................................................................. 54 Figura 15. Comportamiento electroforético de la catepsina D1 la langosta americana bajo
diferentes condiciones. ................................................................................................. 56 Figura 16. Efecto del pH en la actividad de las catepsinas D bovina y de langosta. ............ 57 Figura 17. Estabilidad de la actividad de la catepsina D bovina (a), de langosta europea (b)
y langosta americana (c) incubada a diferentes temperaturas. ................................... 58 Figura 18. Actividad residual de la catepsina D bovina (a), de langosta europea (b) y
langosta americana (c) incubada a diferentes pH......................................................... 59 Figura 19. Dependencia a la temperatura de los parámetros cinéticos KM (a) y kcat/KM (b)
de las catepsinas D de langostas y bovina. ................................................................... 61 Figura 20. Separación de los productos de hidrólisis de la BSA bovina por SDS‐PAGE, 50 µg
de BSA fueron incubados con ~2 µg de catepsina D de langosta americana o en su ausencia (cont). ............................................................................................................. 63
Figura 21. Detección del transcrito de la (a) catepsina D1, (b) catepsina D2, (c) catepsina L y (d) L38 rRNA como control, en diferentes tejidos de H. gammarus (H. g.) y H. americanus (H. a.). ........................................................................................................ 64
IV
Figura 22. Secuencia de nucleótidos y deducida de aminoácidos del cDNA de la catepsina D1 de la langosta americana H. americanus (número de acceso en el GenBank EU687261). .................................................................................................................... 66
Figura 23. Comparación de secuencias deducida de aminoácidos de aspártico proteinasas descritas como digestivas (marcadas con un rombo) y no digestivas. ......................... 69
Figura 24. Cambios en la concentración del mRNA de catepsina D1 en la glándula digestiva a lo largo de un periodo de ayuno medidos por PCR en tiempo real en H. americanus (a) y H. gammarus (b). ................................................................................................... 70
Figura 25. Cambios en la concentración del mRNA de catepsina L en la glándula digestiva a lo largo de un periodo de ayuno medidos por PCR en tiempo real en H. americanus (a) y H. gammarus (b). ........................................................................................................ 71
Figura 26. Representación de la predicción del arreglo de los enlaces disulfuro de la catepsina D1 de la langosta americana (renglón superior) y la comparación con la catepsina D bovina (renglón inferior). .......................................................................... 72
Figura 27. Predicción del modelo molecular que representa la superficie de la catepsina D1 (azul) y la comparación por superposición con la catepsina D bovina (rojo). .............. 73
Figura 28. Cladograma realizado con secuencias de aminoácidos de catepsinas D digestivas y no digestivas de invertebrados depositadas en GenBank. ........................................ 75
LISTA DE TABLAS Tabla I. Inhibidores utilizados y la clase de proteinasas que inhiben. ................................. 27 Tabla II. Secuencias de los oligonucleótidos usados como iniciadores para los análisis de
RT‐PCR, para el PCR en tiempo real y para obtener la secuencia completa del cDNA de la catepsina D1 .............................................................................................................. 44
Tabla III. Purificación de la catepsina D1 de la langosta americana ..................................... 52 Tabla IV. Secuencias de aminoácidos obtenidas por espectrometría de masas que
resultaron idénticas a fragmentos de la secuencia deducida de aminoácidos del mRNA de catepsina D1. ............................................................................................................ 53
Tabla V. Parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato fluorogénico 7‐methoxycoumarin‐4‐acetyl‐GKPILFFRLK‐(DNP)‐d‐R‐Amida por las catepsinas D de langostas y bovina. Los valores fueron determinados a pH 4.0 a la temperatura indicada ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
1
1. INTRODUCCIÓN
Entre los grupos de invertebrados, el subphylum Crustacea es uno de los más
abundantes diversos. Los crustáceos tienen una extensa distribución geográfica, así como
una amplia variedad de estrategias adaptativas pues se los encuentra distribuidos en
diferentes hábitats. Entre dichas estrategias de vida se incluye la habilidad de ingestión y
digestión del alimento disponible. Se sabe que la estructura y fisiología de su sistema
digestivo es especie‐específica y depende de los hábitos alimenticios, género,
disponibilidad de alimento y estadio de muda (Hernández‐Cortés et al., 1999; Lemos et al.,
1999; Vega‐Villasante et al., 1999).
La proteólisis se refiere a la degradación bioquímica de las proteínas por la hidrólisis de
enlaces peptídicos (Kato, 1999); las enzimas proteolíticas, o proteinasas que catalizan este
proceso son enzimas que operan en todos los fenómenos biológicos, como la digestión de
la proteína proveniente del alimento, y otros procesos fisiológicos entre los cuales están la
digestión celular, división y diferenciación celular, remodelado de tejidos y apoptosis
(Geier et al., 1999). Además se sabe que no sólo funcionan como enzimas individuales sino
que también participan en cascadas o redes catalíticas (Delcroix et al., 2006).
Las proteinasas son clasificadas en cuatro grupos con base a los residuos de aminoácidos y
cofactores que forman el sitio activo; las serino‐, aspártico‐, métalo‐ y cisteíno‐
proteinasas (Barrett, 1994; García Carreño y Navarrete del Toro, 1997; Barrett et al., 1998)
(ver recuadro 1).
2
Se cree que en el sistema digestivo de los crustáceos, las enzimas proteolíticas son los
ejecutantes principales en la hidrólisis de los alimentos (Muhlia‐Almazán y García‐Carreño,
2003), estas enzimas hidrolizan proteínas para generar péptidos pequeños y aminoácidos
requeridos por el organismo para llevar a cabo sus funciones vitales (Geier et al., 1999). La
síntesis de éstas enzimas fluctúa en respuesta a diferentes factores y condiciones, como la
edad (van Wormhoudt, 1973; Lee et al., 1984), el estadio de muda (van Wormhoudt y
Favrel, 1988), la temperatura (Galgani et al., 1985), el alimento y el origen y calidad de la
proteína consumida en el mismo (van Wormhoudt, 1973; Lee et al., 1984; Sánchez‐Paz et
al., 2003; Muhlia‐ Almazán et al., 2005).
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Entre las proteinasas digestivas reportadas en los crustáceos están la tripsina,
quimotripsina, elastasa, serin‐colagenasa, aminopeptidasa y carboxipeptidasa, así como
proteinasas lisosomales como la catepsina B y L [Ver revisión de (Muhlia‐Almazán y
García‐Carreño, 2003) para detalles].
En algunos decápodos, como el camarón blanco Litopenaeus vannamei, la tripsina es la
enzima más abundante y la mejor estudiada. La tripsina (EC 3.4.21.4) es una serino
proteinasa que hidroliza enlaces peptídicos en el extremo carboxilo de residuos de
aminoácidos cargados positivamente. Las tripsinas, como otras enzimas digestivas, son un
elemento clave ya que actúan como mediadores entre la ingesta de alimento y la
asimilación de nutrientes (Dittrich, 1992), se cree que pueden ser responsables de un 40 a
un 60% de la digestión de proteínas en penéidos (Galgani et al., 1985).
Las catepsinas (del griego: kathepsein=digerir) fueron originalmente descritas en los
mamíferos como proteinasas lisosomales, en este grupo se incluyen aspártico (catepsinas
D y E) y cisteíno (catepsinas B, H, L, O y S) proteinasas. Las cisteíno proteinasas catepsinas
B y L y la aspártico proteinasa catepsina D, son las proteinasa lisosomales más abundantes
(Barrett et al., 1998). Casi todo lo que se conoce sobre las características estructurales de
las catepsinas proviene de estudios que se han realizado en mamíferos, debido a que en
los humanos son relevantes en diferentes condiciones patológicas (Athauda et al., 1991;
Baldwin et al., 1993; Yamakami et al., 1995). Recientemente se ha incrementado el interés
en el estudio de estas enzimas en invertebrados, sobre todo en parásitos, ya que se ha
encontrado que participan en procesos fisiológicos tan importantes como la digestión
extracelular, el desarrollo larvario y la respuesta inmune (Hamilton et al., 2003). Sin
4
embargo, aun no se han reportado los posibles procesos de selección que les permitieron
a estas enzimas encontrarse en diferentes organismos, haber adquirido diferentes
funciones y continuar compartiendo la misma topología estructural.
La mayor parte de la información acerca de la forma en que las catepsinas de crustáceos
participan en la digestión del alimento se ha generado a partir del estudio de las cisteíno
proteinasas; por ejemplo, se encontró actividad de catepsina L en la glándula digestiva de
Metapenaeus ensis, a la cual se le ha atribuido una función de digestión extracelular (Hu,
2003). También, Aoki y col. (2003) encontraron que el mRNA de la catepsina B se
encuentra distribuido casi exclusivamente en la glándula digestiva del camarón del norte,
por lo que se ha sugerido que, en los crustáceos las cisteíno proteinasas son sintetizadas
en las células de la glándula digestiva en donde participan en la digestión intracelular y
que son después secretadas para funcionar como proteinasas extracelulares.
Asimismo, se ha reportado que las proteinasas del tipo cisteíno forman parte del
metabolismo digestivo de crustáceos homáridos, penéidos y carídeos (Laycock et al.,
1991; Le Boulay et al., 1995; Teschke y Saborowski, 2005). En nefrópidos como la langosta
americana (Laycock et al., 1991) y la langosta noruega (Le Boulay et al., 1995), se ha
reportado que esta clase de proteinasas son componentes de la glándula digestiva. En los
carídeos como Crangon crangon y Crangon allmani, un importante rol digestivo se les ha
atribuido a estas proteinasas (Teschke y Saborowski, 2005). Por otro lado, se ha
demostrado que el gen que codifica la catepsina L de Metapenaeus ensis ha perdido los
intrones, y se sugiere que esto es debido a una adaptación a su papel en la digestión, pues
al no tener intrones y no requerir de mecanismos de modificación postraduccional,
5
incrementa la eficiencia de transcripción y así la enzima activa está disponible con menor
gasto energético (Hu y Leung, 2006).
En algunas especies de crustáceos como el copépodo Calanus finmarchicus (Solgaard et
al., 2007) y la langosta europea también se ha encontrado actividad proteinolítica que es
atribuida a aspártico proteinasas; Navarrete del Toro y col. (2006) reportaron la existencia
de actividad de proteinasas tipo aspártico en el jugo gástrico de dicha la langosta europea,
las langostas queladas (género Homarus) son la única especie de crustáceos en las que se
ha reportado la actividad de aspártico proteinasas en el sistema digestivo (Gildberg,
1987). Sin embargo, la relación directa entre la actividad de aspártico proteinasas y la
hidrolisis de proteínas del alimento en estos crustáceos no había sido aun establecida,
hasta ahora. En el presente estudio se aborda una investigación realizada alrededor de
este tema, describiéndose las propiedades bioquímicas, catalíticas y moleculares de una
aspártico proteinasa que aporta al menos un 30% a la actividad proteinolítica del jugo
gástrico de las langostas queladas; los resultados descritos aquí confirman la participación
de dicha enzima en la digestión de las proteínas del alimento. Se discute acerca de los
procesos de selección que pudieron haber influido en la presencia de aspártico
proteinasas en el sistema digestivo de las langostas queladas. Aunque el mecanismo de
regulación de la actividad de la enzima sigue aun por ser descrito.
6
2. ANTECENTES
2.1. El sistema digestivo de los crustáceos
En los crustáceos decápodos, la alimentación comienza en los maxilípedos (apéndices
orales) que juegan un papel importante en la fragmentación mecánica del alimento. Los
maxilípedos también direccionan los fragmentos de alimento hacia la boca para la
ingestión, la cual es facilitada por las secreciones mucosas descargadas desde el segundo
participante en la digestión, el esófago. Posterior al esófago se encuentra la cámara
gástrica en la cual se pueden distinguir dos partes: la cámara cardiaca o anterior, separada
por una válvula cardio‐pilórica de la cámara pilórica o posterior. La primera funciona como
receptáculo de los alimentos ingeridos, esta estructura presenta una gran elasticidad y en
su parte posterior se encuentran una serie de piezas calcáreas, sedas, espinas y filtros, así
como repliegues por los cuales pasan los alimentos en el transcurso de sucesivas
moliendas. Las partes posteriores del estómago cardiaco y pilórico están reforzadas y
soportadas por un conjunto de piezas calcáreas articuladas, las placas y los oscículos, que
son zonas de espeso revestimiento quitinoso de este órgano. Las partículas
suficientemente pequeñas pasan al segmento pilórico del estómago y son finalmente
filtradas por setas muy cerradas antes de entrar la glándula digestiva donde continúan
siendo procesadas químicamente (Baker y Gibson, 1977).
La glándula digestiva es el principal órgano involucrado en la digestión, este órgano
combina múltiples funciones equivalentes a las del hígado, páncreas e intestinos de los
vertebrados. En dicho órgano se sintetizan diversas enzimas digestivas y otras proteínas
como la hemocianina (Lehnert y Johnson, 2002). El epitelio de la glándula digestiva tiene
7
una monocapa de 5 diferentes tipos de células distribuidas a lo largo de los túbulos: las
células E, R, F, B y M. Se ha encontrado que en las células F se sintetizan las enzimas
digestivas, se cree que estas células maduran a células B para llevar a cabo la secreción de
manera holócrina, éste tipo de secreción consiste en el rompimiento de las células
maduras al tiempo que vierten su contenido al espacio intraluminal. Los productos de la
hidrólisis enzimática son absorbidos por las células R, que participan en el
almacenamiento e incorporación de los nutrientes (Mikami y Takashima, 2000) (Figura 1).
La glándula digestiva está conectada con el estómago pilórico. Los movimientos del
molino gástrico no sólo mastican el alimento sino que además mezclan estas partículas
con las enzimas secretadas por la glándula (Baker y Gibson, 1977). Se sabe que las
secreciones son de carácter ácido (Baker y Gibson, 1977; Navarrete del Toro et al., 2006)
pero el mecanismo que mantiene el pH bajo es desconocido.
Figura 1. La glándula digestiva de los crustáceos. Tomado de Loizzi (1970).
8
2.2. Las proteinasas del sistema digestivo de los crustáceos
A la fecha se han realizado varios estudios para conocer la participación de las proteinasas
del sistema digestivo de diferentes especies de crustáceos en la digestión de las proteínas
del alimento, siendo las proteinasas de la clase serino, tripsina y quimotripsina, las
enzimas más estudiadas a las cuales se les reconoce como responsables de la digestión del
alimento; estas enzimas proteinolíticas presentan actividad óptima a pH alcalinos
cercanos a pH 8 (Galgani et al., 1985; Hernández‐Cortés et al., 1997; Le Boulay et al., 1998;
Hernández‐Cortés et al., 1999; Aoki et al., 2004; Teschke y Saborowski, 2005). Casi todas
las investigaciones han sido desarrolladas alrededor de estas enzimas siendo el estudio
enzimológico (Lee et al., 1984; Galgani et al., 1985; Hernández‐Cortés et al., 1997), la
organización génica (Klein et al., 1998; Sainz et al., 2004a) y el modo de regulación de la
actividad (Muhlia‐Almazan y García‐Carreño, 2002; Sainz et al., 2004b), los aspectos más
abordados
Proteinasas de la clase cisteíno, como la catepsina L y catepsina B también han sido
descritas como participantes en la digestión de éste grupo (Le Boulay et al., 1996; Teschke
y Saborowski, 2005).
La actividad proteolítica asociada con la digestión de langostas queladas ha sido
investigada desde los años 70´s (Brockerhoff et al., 1970; Hoyle, 1973), poco tiempo
después se observó que proteinasas con actividad a pH ácido se secretan en la glándula
digestiva para digerir el alimento de manera extracelular (Baker y Gibson, 1977; Glass y
Stark, 1994). El jugo gástrico de las langostas queladas es ácido, con un pH de ~ 4.7
(Brockerhoff et al., 1970; Baker y Gibson, 1977; Omondi y Stark, 2001; Navarrete del Toro
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et al., 2006). La clase precisa a la que pertenecen las enzimas involucradas en la digestión
de las proteínas provenientes del alimentos no ha sido aun definida. Se han descrito tres
isoenzimas de la clase cisteíno proteinasas en la glándula digestiva de la langosta
americana que han sido consideradas como componentes del proceso digestivo (Laycock
et al., 1991). Recientemente, la actividad proteolítica a pH ácido determinada para la
langosta europea fue adjudicada a proteinasas aspárticas, pues se encontró que la
actividad proteolítica del jugo gástrico se ve casi completamente inhibida, más del 90%,
por el pepstatin A, un inhibidor clase‐específico para las aspártico proteinasas (Navarrete
del Toro et al., 2006), sugiriendo por primera vez, la participación de proteinasas
aspárticas en la digestión de crustáceos; sin embargo el tipo de proteinasas responsables
de la actividad aspártico proteinasa específico permanecía aun sin ser determinado.
2.3. Las aspártico proteinasas
Las proteinasas aspárticas eucarióticas (Familia A1) (EC 3.4.23.X) son endopeptidasas
que comparten el mecanismo de catálisis y muestran actividad a pH ácido que influye en
el estado de ionización de los dos residuos de ácido aspártico que constituyen el sitio
activo (Yonezawa et al., 1988), así como un alto grado de similitud en sus estructuras
primarias, que redunda en una típica estructura tridimensional de forma bilobulada
(Davies, 1990; Andreeva, 1992). Los miembros de esta clase difieren en la topografía del
sitio activo y en la localización celular, por lo que, estas características determinan la
función (Szecsi, 1992). Así, las proteinasas aspárticas han sido clasificadas en varios
subgrupos incluyendo a las catepsinas, las reninas, las pepsinas y las quimosinas (Barrett,
1979) (Ver recuadro 2).
10
Se trata de enzimas monoméricas compuestas de dos dominios, cada uno de los cuales
contiene un residuo de ácido aspártico y juntos constituyen el sitio catalítico, mismo que
se encuentra inmerso en una hendidura cuyas paredes forman el sitio de unión al sustrato
en donde se pueden acomodar hasta 8 o 9 aminoácidos de un sustrato, y cuyos sitios de
unión se forman en las posiciones S5 hasta S´3 (Fusek y Větvička, 2005) (ver recuadro 3).El
sitio activo de la mayoría de las aspártico proteinasas se caracteriza por tener un motivo
consenso DTG (Geier et al., 1999). Las catepsinas D tienen dos estructuras tipo “rizo” o
“loop” que se cierran sobre la hendidura del sitio catalítico y están involucradas en el
reconocimiento y acomodo del sustrato, una de estas estructuras es conocida como “Y75
flap” (Y75 connota a la tirosina de la posición 75 de la pepsina porcina) se encuentra en la
mayoría de las aspártico proteinasas y es movible en la estructura de la catepsina D
humana pero es estable en la estructura de la catepsina D bovina si se encuentra ocupado
por el inhibidor pepstatin A (Fusek y Větvička, 2005); la otra estructura se trata de otro
“lazo” que presenta tres residuos de prolina contiguos conocido como “polyproline loop”
11
y se observa solamente en reninas y catepsinas D. Estas estructuras podrían estar
involucradas en el reconocimiento y unión del sustrato (Metcalf y Fusek, 1993).
Una característica importante de las proteinasas aspárticas son los cambios estructurales
que acompañan la transformación de las enzimas recién traducidas. Todas las proteinasas
aspárticas son sintetizadas como pre‐pro‐enzimas. En el caso específico de la catepsina D
(EC 3.4.23.5), en una primer modificación postraduccional, el péptido señal (de
aproximadamente 20 aminoácidos) que contiene varios residuos de aminoácidos
hidrofóbicos que facilitan su transporte través del retículo endoplásmico (Altschul et al.,
12
1997) en el cual es eliminado. El péptido señal es seguido por un pro‐péptido de alrededor
de 40‐60 aminoácidos, la remoción de esta región permite su activación (Szecsi, 1992), así
como su correcto plegamiento, inhibición temporal y transporte del zimógeno como
precursor inactivo hacia los compartimentos endosomales/lisosomales (Davies, 1990). Se
ha demostrado que esta activación es dependiente del pH (se lleva a cabo a pH 3.5
aproximadamente) e involucra la separación del péptido de activación, así como del
llamado “β‐hairpin” (processed loop en la figura 2). Una representación esquemática de
las características generales de la estructura primaria de la catepsina D se muestran en la
Figura 2 (Bächle, 2005; Fusek y Větvička, 2005).
Figura 2. Representación esquemática de la estructura de la catepsina D. Tomado de Fusek y Větvička (2005).
La especificidad de las aspártico proteinasas difiere entre las diferentes peptidasas. La
pepsina tiene una amplia especificidad mientras que la renina y la proteinasa del HIV son
más estrictas (Benes et al., 2008). La catepsina D acomoda hasta ocho residuos de
aminoácidos en el sitio de unión al sustrato, teniendo preferencia por aminoácidos
hidrofóbicos rodeando al enlace susceptible a la hidrólisis, siendo ligeramente más
específica que la pepsina (Guruprasad et al., 1995). Por otro lado, a pesar de la catepsina
D y la pepsina tienen especificidad y estructura molecular similar, su papel fisiológico es
13
diferente. Ambas enzimas rompen enlaces peptídicos en el extremo amino de los
aminoácidos aromáticos y otros aminoácidos con cadenas laterales abultadas. La pepsina
tiene una función extracelular y es la proteinasa gástrica más importante en los
vertebrados. Mientras que la catepsina D es una enzima lisosomal, que actúa en la
digestión intracelular de proteína (Barrett, 1998). Sin embargo, estudios de enzimas tipo
catepsina D de invertebrados sugieren que adicionalmente tienen una función
extracelular, contraria a la generalmente conocida para las catepsinas D de mamíferos
(Tang y Wong, 1987; Becker et al., 1995). En parásitos hematófagos como helmintos,
ácaros y garrapatas, la catepsina D ha sido reportada como el principal integrante de una
red digestiva multi‐enzimática, contribuyendo con la digestión de la proteína de la sangre
que obtienen de sus hospederos (Hamilton et al., 2003; Boldbaatar et al., 2006; Delcroix et
al., 2006).
La catepsina D es la segunda proteinasa aspártica mejor estudiada después de la pepsina,
las investigaciones relacionadas con esta enzima han llevado al descubrimiento y
descripción de numerosas funciones ejecutadas por esta proteinasa (Benes et al., 2008) en
la que se incluye la degradación proteica intracelular (Metcalf y Fusek, 1993), la activación
de precursores enzimáticos (Khan y James, 1998), la regulación de muerte celular
programada (Gui et al., 2006) y la digestión de proteínas del alimento en invertebrados,
principalmente parásitos (Harrop et al., 1996; Williamson et al., 2002; Delcroix et al.,
2006). Se ha reportado que la catepsina D funciona a pH ácido (Harrop et al., 1996) y que
contiene estructuras de oligosacáridos ricos en manosa unidos a residuos de asparagina
(N) (Takahashi y Tang, 1981).
14
Estudios cristalográficos de las proteinasas aspárticas han revelado que una molécula de
agua se encuentra unida a los grupos carboxilo de ambos residuos de ácido aspártico del
sitio activo. Esta molécula de agua está a un puente de hidrógeno de distancia de cada
uno de los cuatro átomos de oxígeno del carboxilo y se le ha atribuido una función en la
catálisis. Se ha sugerido que dicha molécula es desplazada parcialmente al unirse el
sustrato y que es polarizada por uno de los residuos de ácido aspártico del sitio catalítico.
Después se inicia la catálisis enzimática por medio del ataque al grupo carbonilo del enlace
a hidrolizar en el sustrato (Coates et al., 2008). Existe un estado de transición durante la
catálisis por proteinasas aspárticas que ha sido estudiado utilizando complejos enzima‐
inhibidor (Dealwis et al., 1994) (Figura 3).
Figura 3. Mecanismo catalítico de la catepsina D.
Las aspártico proteinasas han sido aisladas y caracterizadas en un amplio rango de
organismos que van desde mamíferos (Pardesi et al., 2004), plantas (Simões y Faro, 2004),
15
hongos, virus (Khan et al., 1999) y bacterias (Hill y Phylip, 1997), de hecho, en parásitos
hematófagos se encuentra bien caracterizado el rol de las proteinasas aspárticas (Harrop
et al., 1996; Brinkworth et al., 2001; Pinho et al., 2009; Suttiprapa et al., 2009), en donde
se ha establecido su papel en la digestión de la hemoglobina (Williamson et al., 2002;
Williamson et al., 2003).
2.4. Las cisteíno proteinasas
Las cisteíno proteinasas (EC 3.4.22) han sido aisladas de varias fuentes biológicas,
incluyendo frutos, tejidos animales y bacterias. La cisteíno proteinasa mas estudiada es la
papaína, cuya estructura y mecanismo de acción es conocido a detalle (Drenth et al.,
1968; Mitchel et al., 1970; Kyndt et al., 2007). Existen reportes que sugieren que cisteíno
proteinasas activas a pH neutro se encuentran en tejidos epidérmicos y que son
participantes en la hidrólisis de la proteína del exoesqueleto del cangrejo terrestre
Gecarcinus lateralis (O'Brien y Skinner, 1987).
Las cisteíno proteinasas lisosomales tienen actividad óptima a pH ácido, cerca de pH 4.0.
Se trata de un grupo de enzimas relacionadas con la papaína. Estas enzimas son
monómeros con masa molecular de ~30 kDa. Tienen dos dominios, nombrados L (left) y R
(right) de acuerdo a su orientación. Las cisteíno proteinasas que han sido purificadas
generalmente contienen un enlace disulfuro que conecta a ambos dominios, también
llamados cadenas ligera y pesada (Turk et al., 2000). El sitio activo se extiende a lo largo de
la interfase de dichos dominios, tiene forma de V, y está conformado por un residuo de
cisteína y otro de histidina, Cys25 e His159 de la papaína que es usada como referencia. El
residuo Cys25 está posicionado en el extremo amino en el dominio L y el residuo His159 en
16
el dominio R. En la forma activa de estas enzimas ambos residuos están cargados
formando un par de iones (Grudkowska y Zagdańska, 2004).
De manera similar a la mayoría de otras proteinasas, las cisteíno proteinasas se sintetizan
como precursores inactivos, que son activados al eliminar el propéptido de activación, la
activación puede ser facilitada por la acción de otras proteinasas como pepsina o
catepsina D, o por autoactivación catalítica en pH ácido, en un proceso bimolecular en el
cual una molécula activa a la otra en una reacción en cadena (Turk et al., 2001)
La estructura primaria de las cisteíno proteinasas tienen una organización similar en los
dominios que las componen, con un péptido señal en el extremo amino de 16‐18
aminoácidos, seguido de un pro‐péptido de 62‐100 residuos y una región madura activa
de cerca de 220‐230 aminoácidos (Aoki et al., 2003a). Con base en su estructura primaria,
las cisteíno proteinasas lisosomales han sido divididas en dos familias designadas como
tipo‐catepsina L (se incluyen las catepsinas L, V, K, S, W, F y H) y tipo‐catepsina B. Las
enzimas maduras de estas dos familias son muy similares, mientras que las regiones de los
zimógenos muestran poca similitud y difieren en su tamaño (Sajid y McKerrow, 2002). Los
pro‐péptidos de las enzimas de la familia tipo‐catepsina L contienen ~100 residuos y son
sustantivamente más largos que los pro‐péptidos de las catepsinas B, que tienen ~60
residuos. La familia de las catepsinas L contienen dos motivos EFR(W)NIN que están
altamente conservados y el GNFD, este último no se encuentra en la familia de las
catepsinas B (Turk et al., 2000).
17
Las cisteíno proteinasas lisosomales de los mamíferos son relativamente inestables a pH
neutro, quizá como un mecanismo de regulación para minimizar la proteólisis no deseada
en tejidos o compartimentos celulares diferentes a los lisosomas (Aoki et al., 2003a).
2.5. Los sujetos de estudio
La langosta europea Homarus gammarus y la langosta americana Homarus americanus
pertenecen al orden Decápoda, el más diverso de los órdenes de crustáceos. En él se
agrupan formas ampliamente diversas incluyendo a los penéidos, braquiuros y carídeos
(Baker y Gibson, 1977). Con el nombre de langosta se conoce generalmente a los
miembros de 4 familias de Decápodos: Nephropidae, Palinuridae, Synaxidae y Scyllaridae
(Gracía y Kensler, 1980). Las de la familia Nephropidae son comúnmente conocidas como
langostas verdaderas o queladas. Los sujetos de este estudio, Homarus gammarus y H.
americanus, pertenecen a esta familia (van der Meeren, 2005). Las langostas de la familia
Nephropidae se diferencian de las otras langostas por la presencia de un par de quelas
bien desarrolladas, y por producir un menor número de huevos pero de un mayor tamaño
y de desarrollo más lento, seguidos por una fase planctónica corta (Helluy y Beltz, 1991).
En las aguas frías de la plataforma continental que cubre el Atlántico Norte, dominan dos
géneros de langostas queladas, Homarus y Nephrops. Homarus americanus, la langosta
americana, se encuentra distribuida en el Oeste del Atlántico Norte, mientras que
Homarus gammarus, la langosta europea, se distribuye en el Este del Atlántico Norte
(Cobb y Phillips, 1980).
18
Las langostas queladas americana y europea, son de importancia económica pues
representan una de las pesquerías más redituables en las áreas donde se distribuyen
(Holthuis, 1991). En la fase adulta, estas especies pueden ser consideradas como
equivalentes ecológicos por su similitud en tamaño y en general por sus hábitos y hábitats.
Las dos especies viven en aguas relativamente someras en donde hay rocas o arrecifes
que pueden ser utilizados como refugios (Cobb y Phillips, 1980). La ingestión de alimento
de las langostas se efectúa durante la noche principalmente, y en el día sólo en áreas muy
protegidas. Son animales omnívoros y carroñeros, aunque prefieren el alimento vivo al
muerto (Dees, 1963; Hindley, 1977).
El espectro alimenticio de las langostas es variado, pueden consumir los siguientes grupos
de organismos: esponjas, hidrozoarios, equinodermos, gusanos tubícolas, briozoarios,
pelecípodos, gasterópodos, cangrejos, peces y algas coralinas (Pearson y Anderson, 1946;
Lindberg, 1955), de los cuales su alimento preferencial son los crustáceos (anfípodos e
isópodos principalmente), equinodermos, gasterópodos y pelecípodos (Castañeda‐
Fernández et al., 2005). Dada la gran variedad de recursos de los que pueden disponer las
langostas como fuente de alimento, se ha reconocido que la elección del alimento
dependerá preferentemente de la abundancia (mayor densidad de presas posibles para
aumentar la eficiencia en la captura de la presa) (Gracía y Kensler, 1980), por lo que se les
puede considerar como oportunistas.
19
2.5.1. Homarus gammarus
La langosta europea Homarus gammarus se encuentra en aguas someras de menos de 30
m de profundidad. Esta especie tiene un amplio rango de distribución que se extiende
desde el círculo ártico hasta Marruecos y el Mediterráneo (Jørstad et al., 2005), la
temperatura superficial de el área en que se distribuye esta especie fluctúa entre los 0 y
25 °C (Figura 4).
Figura 4. Vista dorsal y distribución de la langosta europea. Tomado de FAO (1991).
2.5.2. Homarus americanus
Las langostas americanas adultas viven generalmente a profundidades menores a 50
metros, sin embargo existen reportes donde se les ha observado a profundidades de hasta
700 metros. Estas langostas prefieren vivir en fondos rocosos cubiertos de algas. Se
distribuyen en la costa Este de Norte América entre Newfoundland (Canadá) y Carolina del
Norte (Estados Unidos) (Jørstad et al., 2005) la temperatura superficial de el área en que
se distribuye esta especie fluctúa entre los 4 y 26 °C (Figura 5).
20
Figura 5. Vista dorsal y distribución de la langosta americana. Tomado de FAO (1991).
2.6. Planteamiento de la investigación
En este trabajo se propone a las proteinasas digestivas de Homarus gammarus y Homarus
americanus como modelo de estudio. Estas langostas pertenecen la familia Homaridae y
presentan conductas alimenticias semejantes, se les considera equivalentes ecológicos
que se distribuyen en diferentes áreas (Cobb y Phillips, 1980). Desde el punto de vista
ecológico, de acuerdo al tamaño, abundancia, y posición trófica, la langostas se
encuentran posicionadas en un punto clave en el ecosistema bentónico (Phillips et al.,
1979; Cobb y Phillips, 1980; Díaz et al., 2001).
Aunque se desconoce el rol que juegan las aspártico proteinasas en los sistemas digestivos
de Homarus gammarus y Homarus americanus, el hecho de que en la primera especie,
más del 30% de la actividad proteolítica total sea inhibida por el pepstatin A (un inhibidor
específico de proteinasas aspárticas que actúa por medio de la acetilación de los grupos
carboxilo del sitio activo, y cuyo Ki para pepsina es aproximadamente de 10‐10 M), podría
21
ser un indicador de que las proteinasas aspárticas participan en la degradación de
proteínas del alimento. Sin embargo muchas preguntas respecto a estas enzimas
permanecen todavía sin resolver, por ejemplo, ¿Cuántas enzimas existen? Si es mas de
una, ¿Son isoenzimas o isoformas? ¿Qué función cumplen? ¿Cuál es su sitio de síntesis? y
¿La expresión de los genes que las codifican es inducible? ¿O se expresan de manera
constitutiva?
El estudio de las propiedades catalíticas y moleculares, las características de las secuencias
completas del RNA mensajero de estas proteinasas incluyendo los mecanismos
regulatorios durante la transcripción y la traducción de dichas enzimas en estas langostas,
nos podría ayudar a elucidar el rol que tienen en la digestión las proteinasas aspárticas de
Homarus gamarus y Homarus americanus. La participación de las proteinasas aspárticas
en el sistema digestivo de estas langostas puede ser utilizada como modelo en un estudio
comparativo para determinar las relaciones evolutivas entre las enzimas que pertenecen a
la familia de las aspártico y cisteíno proteinasas. Además de ser un acercamiento para
definir el rol de las aspártico y cisteíno proteinasas en el proceso de digestión de las
proteínas del alimento.
Por otro lado, la pesquería de langostas constituye una de las mejor remuneradas del
mundo. Las langostas americana y europea soportan una parte relevante de la pesca
comercial y representan uno de los ingresos más importantes para la economía de algunas
de las regiones en que se distribuyen (Nicosia y Lavalli, 1999) (Ver Figuras 4 y 5). Por lo
tanto, el manejo y conservación de las pesquerías de especies marinas comercialmente
22
importantes está dirigido a asegurar su explotación sustentable y debe estar basado en el
conocimiento de la biología y ecología de la especie en cuestión (Ward, 2000).
3. HIPÓTESIS
Si el pH del jugo gástrico de las langostas queladas es ácido y su actividad proteinolítica se
ve afectada por inhibidores específicos de la clase aspártico y cisteíno; entonces las
proteinasas responsables de la digestión son catepsinas D y L, que pertenecen a la clase
aspártico y cisteíno proteinasas, respectivamente. Además estas enzimas tienen
propiedades estructurales y catalíticas adaptadas a los ambientes en que se distribuyen
Homarus gammarus y Homarus americanus, y por lo tanto son diferentes a las de
vertebrados, pero conservan la estructura del sitio activo y el mecanismo de catálisis.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Identificar y caracterizar bioquímica y molecularmente las proteinasas del jugo digestivo
de H. gammarus y H. americanus con actividad a pH ácido.
4.2. Objetivos específicos
1. Identificar las proteinasas ácidas del jugo gástrico de las langostas queladas.
2. Caracterizar bioquímicamente las proteinasas aspárticas del jugo gástrico de las
langostas europea y americana.
3. Detectar la presencia del transcrito de la(s) proteinasa(s) ácida(s) en diferentes
tejidos de las langostas europea y americana.
23
4. Obtener y caracterizar la secuencia completa del cDNA de la(s) proteinasa(s)
ácida(s) encontrada(s) en la glándula digestiva de las langostas europea y
americana.
5. Evaluar los cambios en la concentración de los transcritos de la(s) proteinasa(s)
ácida(s) bajo diferentes condiciones de ayuno.
6. Evaluar y comparar la función biológica putativa que desempeñan estas
proteinasas en el jugo gástrico de las dos especies de langostas.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Metodología general
5.1.1. Animales experimentales y obtención del jugo gástrico de las langostas
El bioensayo se realizó en las instalaciones del Alfred Wegener Institute (AWI), estación
marina de Helgoland en Alemania. Las langostas europeas y americanas adultas fueron
adquiridas vivas en el mercado local y mantenidas en condiciones controladas de
temperatura, salinidad y suministro de alimento en los laboratorios del Instituto. Los
especímenes fueron mantenidos en el mismo laboratorio bajo condiciones idénticas, a 13
°C, con un sistema de intercambio de agua continuo, aireación constante. Las langostas
fueron alimentadas con crustáceos pequeños durante al menos una semana antes de
cualquier manipulación para permitir su aclimatación.
El jugo gástrico de las langostas fue extraído del estómago, utilizando una jeringa
desechable con una sonda de plástico flexible en lugar de aguja, la sonda fue introducida
24
por la cavidad oral hasta llegar al estómago para extraer por succión, aproximadamente 1
ml de jugo gástrico (Figura 6).
Jugo gástrico
Cavidad oral
Figura 6. Método de extracción de jugo gástrico de la langosta europea H. gammarus, vista ventral.
El jugo gástrico que se extrajo fue transferido a un microtubo, se centrifugó por 10 min a 4
°C y 10,000 g para remover el material no soluble y fue liofilizado para su almacenamiento
y posterior uso.
5.1.2. Experimentos de ayuno y realimentación
Quince especímenes adultos de cada especie, con un tamaño de 38.8 ± 1.3 cm y un peso
de 1.1 ± 0.2 kg, fueron aclimatados por al menos una semana en las condiciones ya
descritas. Después del periodo de aclimatación, las langostas fueron privadas de alimento
durante un periodo de 15 días, al final del cual, fueron alimentadas hasta la saciedad con
pequeños crustáceos. Durante este periodo fueron sacrificados tres especímenes en los
siguientes tiempos: al inicio en el día 1 (considerado como control), y posteriormente en
los días 5, 10 y 15 de ayuno; finalmente se muestrearon tres especímenes más 24 horas
después de alimentados de nuevo. Las langostas fueron disectadas y se tomó una muestra
de tejido de gónada, músculo y glándula digestiva que fueron preservadas en solución
RNAlater (Ambion, US) y congeladas a ‐80 °C para su posterior uso.
25
De manera paralela, tres especímenes de la especie H. americanus fueron aclimatados y
mantenidos bajo las mismas condiciones de ayuno y realimentación que los organismos
problema descritos en el párrafo anterior; el jugo gástrico de estos animales fue extraído a
los mismos tiempos (1, 5, 10 y 15 días de ayuno y 24 horas después de la realimentación),
y posteriormente fue centrifugado durante 10 min a 4 °C y 10,000 g, y fue liofilizado para
su uso posterior en la evaluación de los cambios de la actividad de catepsina D a lo largo
de un periodo de ayuno y realimentación.
Las muestras obtenidas durante los experimentos antes mencionados fueron
posteriormente analizadas usando las metodologías descritas a continuación en cada uno
de las secciones que conforman este trabajo.
26
5.2. Identificación, aislamiento y caracterización bioquímica de una catepsina D
digestiva de las langostas queladas
5.2.1. Identificación y comparación de las proteinasas del jugo gástrico de las langostas
queladas
5.2.1.1. Ensayos de actividad proteinolítica e inhibición
Con el fin de comprobar los resultados reportados por Navarrete del Toro y col, (2006), se
realizó un ensayo preliminar para evaluar la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la
langosta europea, mismo que se obtuvo como se mencionó anteriormente, los valores de
pH de los amortiguadores se determinaron a temperatura ambiente (25 °C), y los
reactivos fueron adquiridos en Sigma‐Aldrich Chemical (St. Louis), a menos que otra
información sea especificada en el texto.
El jugo gástrico de langosta europea liofilizado fue reconstituido al diluir 50 mg en 1 ml de
agua y se centrifugó a 10,000 g por 10 min a 4 °C para remover material no soluble. Se
determinó la actividad enzimática a pH 3.0 utilizando como sustrato hemoglobina bovina
(0.5% v/w) disuelta en amortiguador de glicina (100 mM, pH 3.0). En una descripción
breve, 1 ml de la solución del sustrato se mezcló con 20 µl del extracto enzimático y se
incubó por 10 min a temperatura ambiente, la reacción se detuvo añadiendo 500 µl de
TCA al 20%, los péptidos generados por la hidrólisis enzimática fueron detectados
espectrofotométricamente registrando la absorbancia a 280 nm después de haber
centrifugado la solución a 10,000 g por 5 min.
27
Para determinar la clase y el tipo de proteinasas presentes en el jugo gástrico, 100 µl de
inhibidores específicos de clase y tipo para aspártico y cisteíno proteinasas (Tabla I) fueron
añadidos a 100 µl de extracto enzimático, la mezcla fue incubada por 60 min a
temperatura ambiente y la actividad enzimática residual fue medida por el método
descrito en el párrafo anterior. Los controles incluyeron sólo los solventes de los
inhibidores. En la tabla I se muestran los inhibidores utilizados y la clase de proteinasas
que inhiben.
Tabla I. Inhibidores utilizados y la clase de proteinasas que inhiben.
Inhibidor Concentración de
trabajo Clase de proteinasa a la
que inhibe Solución stock diluida
en Pepstatin A 10mM Aspártico DMSO 100%
DAN 2mg/ml Aspártico Metanol 100%
E‐64 1mM Cisteíno Agua
Inhibidor de Catepsina L 1mM Cisteíno DMSO 100%
5.2.1.2. Detección de enzimas del jugo gástrico por SDS‐PAGE con sustrato (zimograma)
Con el fin de observar la composición de las proteínas presentes en el jugo gástrico de las
langostas queladas, éstas fueron separadas, inmovilizadas y visualizadas por el método
SDS‐PAGE, usando geles al 12%. Adicionalmente, la actividad proteinolítica del jugo
gástrico fue monitoreada a un pH cercano al fisiológico (pH 5.0) y a pH alcalino (pH 8.0)
utilizando la técnica de SDS‐PAGE con sustrato descrita por García‐Carreño y col. (1993).
Para revelar la actividad a pH 5.0 se utilizó como sustrato hemoglobina al 0.25% diluida en
buffer McIlvine. El gel fue sumergido por 30 min en el sustrato a 4 °C y después por 90 min
a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó en agua para eliminar los residuos de
sustrato y finalmente el gel fue sumergido por 30 min en la solución de teñido de
28
Coomassie y desteñido toda la noche en una solución que contiene 40% metanol y 7%
ácido acético.
Utilizando la misma técnica se analizó el efecto de los inhibidores en la actividad
proteinolítica del jugo gástrico de las langostas. Para determinar la presencia de
proteinasas aspárticas en dicho extracto, a 100 µg de proteína diluida en 10 µl de agua se
le añadieron 10 µl de pepstatin A (1.45 mM). Para comprobar la presencia de cisteíno y
serino proteinasas se utilizaron los inhibidores E‐64 (14 mM) y pefabloc (100 mM)
respectivamente, como control se utilizó una mezcla de agua y jugo gástrico. Todas las
reacciones fueron incubadas por 60 min a temperatura ambiente y detenidas mediante la
adición de buffer de carga SDS‐PAGE.
Se utilizó jugo gástrico de la langosta roja Panulirus interruptus bajo las mismas
condiciones con fines comparativos, pues ésta es considerada un equivalente ecológico
que se distribuye en aguas más cálidas (16‐30 °C).
Con el fin de identificar a las catepsinas L presentes en el jugo gástrico, se utilizó un
sustrato específico flourogénico, Z‐Leu‐Arg‐AMC (I‐1960, Bachem, Alemania). Las
proteínas del jugo gástrico fueron separadas por SDS‐PAGE 12% de acuerdo a la
metodología descrita por Laemmli (1970). Al finalizar la electroforesis el gel se lavó
durante 30 min en Tritón 2.5%. Después se sumergió en amortiguador de reacción acetato
de sodio 100 mM, pH 5.5, que contenía EDTA 2 mM, DTT 2 mM y Tritón X‐100 al 0.05% y
10 µM de sustrato para catepsina L. El gel fue revelado bajo luz ultravioleta.
29
En el mismo gel se revelaron bandas con actividad proteinolítica a pH ácido. El gel se lavó
por 10 min en agua destilada, y después por 30 min en amortiguador de glicina 100 mM
pH 3.0. El gel fue sumergido por 30 min en el sustrato, hemoglobina al 0.25% en
amortiguador de glicina 100 mM, pH 3.0 a 4 °C y después por 90 min a temperatura
ambiente. Posteriormente el gel fue teñido en solución de Coomasie y desteñido toda la
noche, como se mencionó anteriormente.
5.2.1.3. Ensayo de actividad de catepsina D
La actividad de catepsina D se midió a lo largo del proceso de aislamiento de la proteinasa
aspártica digestiva, así como en las muestras de jugo gástrico liofilizado de langosta
americana obtenido a lo largo del periodo de ayuno. Se registró la hidrólisis del sustrato
sintético fluorogénico 7‐metoxicoumarin‐4‐acetil‐Gly‐Lys‐Pro‐Ile‐Leu‐Phe↓Phe‐Arg‐Leu‐
Lys‐(DNP)‐d‐Arg‐amida (M0938, Sigma‐Aldrich, EUA) (↓ representa el sitio donde el
péptido es hidrolizado) específico para catepsina D, para tal fin se utilizó un lector de
microplaca (Synergy 4, BioTek). Las tasas de hidrólisis fueron determinadas mediante el
monitoreo del incremento en la fluorescencia en unidades arbitrarias (unidades relativas
de fluorescencia –URF) a longitudes de onda de emisión y excitación 328 nm y 393 nm
respectivamente.
Se construyó una curva de calibración mediante la medición de la fluorescencia emitida
por concentraciones conocidas del fluoróforo 7‐methoxycoumarin‐4‐ácido acético (MCA),
se graficaron las URF contra los nanomoles de MCA, y una vez validada la linealidad de la
30
curva, se utilizó la pendiente generada para calcular las unidades de catepsina D presentes
en la muestra de acuerdo a la siguiente fórmula:
La actividad de catepsina D se expresó en nmol de MCA liberados por min por µg de
proteína. Una unidad de actividad se definió como aquella que libera 1 µmol de MCA por
min por µg de proteína.
El sustrato fue mantenido en una concentración inicial de 1 mM en DMSO y fue diluido en
buffer de acetato de sodio 50 mM pH 4.0 para llegar a una concentración de trabajo de 10
µM. La concentración final del sustrato en la reacción fue de 2 µM en un volumen final de
100 µl que contenía cantidades variables de enzima y buffer acetato de sodio 50 mM pH
4.0, dependiendo de la enzima a evaluar.
5.2.2. Aislamiento de la catepsina D1 de las langostas europea y americana
5.2.2.1. Cromatografía de afinidad y ultrafiltración
Las proteinasas aspárticas presentes en el jugo gástrico de las langostas americana y
europea fueron purificadas con base a la afinidad por pepstatin A. Las proteinasas ácidas
del jugo gástrico fueron separadas en una columna de cromatografía que contenía una
matriz de pepstatin A‐agarosa (P2032, Sigma‐ Aldrich, EUA). Un ml de matriz fue
equilibrada en amortiguador 50 mM citrato, pH 4.0 y 1 ml de jugo gástrico fue
31
reconstituido en el mismo buffer (25 mg/ml) y cargado en la columna que después fue
lavada con 5 ml del mismo amortiguador, seguidos por 5 ml de buffer de citrato 50 mM,
pH 4.0 y NaCl 1 M. Las proteínas adsorbidas a la matriz fueron gradualmente eluidas
usando buffer Tris‐HCl 100 mM, pH 7.0 y NaCl 1 M y posteriormente con buffer Tris‐HCl,
pH 7.5, NaCl 1 M. En cada se colectaron diez fracciones de 0.5 ml y se evaluó
espectrofotométricamente (A280) la concentración de proteína de cada una de ellas. La
actividad de catepsina D se midió usando un sustrato fluorogénico (descrito en los
párrafos anteriores), y posteriormente las proteínas fueron visualizadas en SDS‐PAGE 12%
bajo condiciones desnaturalizantes y también reductoras (añadiendo el agente
desnaturalizante DTT y hervidas por un min). Las fracciones que presentaron actividad
enzimática fueron recolectadas y concentradas por ultrafiltración usando una membrana
de celulosa regenerada Amicon Ultra® (UFC901024, Millipore, EUA). Se cuantificó la
concentración de proteína de este concentrado mediante el método de Bradford (1976), y
la actividad proteinolítica se evaluó a pH 3.0. Así mismo, la actividad de catepsina D, y
finalmente la composición proteica fue visualizada por SDS‐PAGE teñido con plata
utilizando el método modificado de Switzer y col. (1979) para verificar la pureza de la
proteína eluida. También se confirmó la actividad de la enzima mediante SDS‐PAGE de
sustrato, siguiendo la metodología descrita por García‐Carreño y col. (1993).
5.2.2.2. Análisis de espectrometría de masas y N‐terminal
Después de la separación electroforética, y de visualizar las bandas de proteínas, se
identificó a la banda que presentó actividad proteinolítica en un zimograma revelado a pH
ácido. La banda correspondiente a la proteína de interés se cortó del gel manualmente
32
usando una navaja estéril para ser analizadas por espectrometría de masas en el Protein
and Nucleic Acid Facilities de la Universidad de Stanford, este análisis incluyó una
digestión con tripsina, posteriormente los péptidos resultantes fueron sometidos a
espectrometría de masas (MS/MS‐TOF).
Adicionalmente, se transfirió la proteína de interés a una membrana Immobilon‐P, PVDF,
0.45 µm (IPVH15150, Millipore, USA), en un sistema de transferencia húmeda durante 10
min, con una corriente de 100 mA, de acuerdo al protocolo descrito por Matsudaira
(1993), las proteínas inmovilizadas en membranas se secuenciaron en su extremo amino
usando tecnología Edman en un secuenciador Applied Biosystems Procise liquid‐pulse en
el Protein and Nucleic Acid Facilities de la Universidad de Stanford.
Los datos resultantes fueron comparados con la secuencia deducida de aminoácidos del
cDNA de las dos isoenzimas de catepsinas D encontradas en las langostas americana y
europea (obtenidas como se describirá posteriormente). De acuerdo con los resultados
del presente análisis, esta proteína fue denominada catepsina D1 (CD1).
5.2.3. Determinación de las características bioquímicas de la catepsina D1 digestiva de
las langostas queladas
Con el fin de comprender los mecanismos moleculares que hacen posible la digestión del
alimento a bajas temperaturas en las langostas queladas, las proteinasas aspárticas del
jugo gástrico fueron purificadas y se estudiaron sus propiedades bioquímicas, éstas fueron
comparadas con las de un homólogo proveniente de un organismo endotermo, la
catepsina D bovina. La catepsina D bovina (extraída de bazo) ( C3138 Sigma, México), fue
33
diluida en agua y almacenada en alícuotas de 5 µl que contenían 1.1 mg/ml a ‐20 °C hasta
su uso.
5.2.3.1. Efectos de agentes reductores y desnaturalizantes sobre el comportamiento
electroforético de catepsina D1 de la langosta americana
Con la finalidad de observar sí la proteinasa aspártica aislada del jugo gástrico de la
langosta americana es una molécula monomérica o dimérica, y para observar posibles
cambios en su conformación provocados por agentes desnaturalizantes y reductores, las
fracciones identificadas como proteinasas aspárticas que resultaron de la cromatografía
fueron visualizadas en un gel de electroforesis nativa y en un gel que contenía SDS como
agente desnaturalizante. Adicionalmente, se observó el comportamiento electroforético
de la catepsina D1 aislada en la presencia del agente reductor DTT (2 µM) y después de
hervir la muestra durante 5 min. El perfil electroforético de la catepsina D1 también fue
analizado en geles que fueron copolimerizados con diferentes concentraciones de urea (2,
4 y 8 M), con el fin de observar el efecto de otros agentes caotrópicos no reductores. Para
fines comparativos se realizaron los mismos análisis a la catepsina D bovina comercial.
5.2.3.2. Determinación del punto isoeléctrico de la catepsina D1
Se realizó una electroforesis de enfoque isoeléctrico analítico usando el sistema Phast
System (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en geles IEF de un rango de pH 3–9. Como
referencia se utilizó Broad pI 3.5–9.3, una mezcla de proteínas con punto isoeléctrico
conocido como marcador. El gel fue teñido con plata utilizando el método modificado de
Switzer y col. (1979)
34
5.2.3.3. Tinción de Schiff para la identificación de proteínas glicosiladas
Ya que las aspártico proteinasas sufren al menos una modificación postraduccional (Szecsi,
1992) y que la mayoría de las catepsinas D descritas contienen al menos dos unidades de
oligosacáridos unidos a residuos de asparágina (Yonezawa et al., 1988), se realizó un
análisis para identificar proteínas glicosiladas inmovilizadas en geles de acrilamida descrito
por Thronton y col. (1994) con el fin de detectar si la proteína aislada es una glicoproteína
como se esperaba. En este método se utiliza ácido peryódico para oxidar selectivamente
los residuos de glucosa creando aldehídos que reaccionan con el reactivo de Schiff el cual
los tiñe de color purpura.
5.2.3.4. Evaluación del efecto del pH y temperatura sobre la actividad de catepsina D
Se evaluó el pH óptimo de la actividad enzimática de la catepsina D1 de las langostas
queladas y se comparó con el de la catepsina D bovina mediante ensayos de la hidrólisis
de 7‐metoxicoumarin‐4‐acetil‐Gly‐Lys‐Pro‐Ile‐Leu‐Phe‐Phe‐Arg‐Leu‐Lys‐(DNP)‐d‐Arg‐amida
incrementando media unidad de pH en el buffer de acetato de sodio 50 mM, desde pH 2.5
a 6.0 a 25°C. La concentración final del sustrato fue de 2 µM, la concentración final de las
catepsinas D fue de 5 ng para las langostas queladas y de 50 ng para la catepsina D bovina,
el volumen final de cada reacción fue de 100 µl.
Se midió el efecto del pH y de la temperatura en la estabilidad de las catepsinas D, las
enzimas se incubaron a diferentes pHs (2.5, 4.0. 5.0 y 6.0) y temperaturas (25, 50 y 60 °C)
durante 0, 15, 30, 60 y 90 min antes de realizar los ensayos de la actividad de catepsina D
remanente. Las reacciones contenían 5 o 50 ng de enzima de langosta o bovina
35
respectivamente, con una concentración final de sustrato de 2 µM, en un volumen final de
100 µl en buffer acetato de sodio 50 mM pH 4.0. Se probó la normalidad y homogeneidad
de varianzas para cada conjunto de datos, las variaciones provocadas a cada tiempo por la
exposición a diferentes valores de pH y temperatura fueron comparadas por una ANOVA
de dos vías, como análisis post‐hoc se realizó una prueba de Tukey (Zar, 1984), para
determinar las diferencias entre las medias, con ayuda del software Statgraphics v. 5.1. La
significancia estadística era considerada cuando p ≤ 0.05.
5.2.3.5. Evaluación de los parámetros cinéticos a diferentes temperaturas.
La eficiencia catalítica de las catepsinas D digestivas de las langostas queladas fue
evaluada a pH 4.0, se determinó la actividad enzimática sobre el sustrato fluorogénico 7‐
methoxycoumarin‐4‐acetyl‐GKPILFFRLK‐(DNP)‐d‐R‐amida a 10 diferentes concentraciones
cuyo valor final varió entre 0.2 y 30 µM; la actividad se expresó en nmoles de MCA
liberados por min, considerándose este valor como la velocidad inicial. Las constantes
cinéticas KM y Vmax fueron determinadas usando la ecuación de Michaelis‐Menten después
de graficar los datos del inverso de la velocidad inicial contra el inverso de la
concentración del sustrato de acuerdo al modelo de Lineweaver‐Burk (Lineweaver y Burk,
1934). Con el fin de evaluar la dependencia de la eficiencia catalítica de las catepsinas D de
langosta a la temperatura, se realizaron estos ensayos a 4, 10 y 25 °C, todas las
mediciones fueron realizadas de manera paralela con la catepsina D bovina.
Se obtuvieron los valores de kcat a partir de la ecuación:
36
En donde [E] es la concentración de la enzima presente en la reacción, en este caso 1. 38
nM de catepsinas D de langostas y 13.26 nM de catepsina D bovina. Los valores
reportados corresponden al promedio de tres determinaciones independientes. Se probó
la normalidad y homogeneidad de varianzas para cada conjunto de datos y se realizaron
análisis estadísticos para determinar las diferencias entre las constantes cinéticas a las tres
temperaturas evaluadas usando pruebas paramétricas y no paramétricas, incluyendo a las
pruebas ANOVA, Kolmogorov‐Smirnov, así como la prueba de diferencias de medias de
Tukey (Zar, 1984), con ayuda del software Statgraphics v. 5.1. La significancia estadística
era considerada cuando p ≤ 0.05.
5.2.3.6. Evaluación de la actividad enzimática de la catepsina D1 sobre sustratos naturales
Se evaluó electroforéticamente la habilidad de la catepsina D purificada de las langostas
queladas para hidrolizar albumina de suero bovina (BSA); en un análisis preliminar se
evaluó el efecto de la catepsina D de la langosta americana sobre la BSA, de esta manera
se determinó la concentración de enzima y sustrato óptimos (resultados no mostrados),
así, a 50 µg de BSA diluidos en buffer de acetato de sodio 50 mM pH 4.0 se le agregaron
~0.2 µg de catepsina D de langosta americana la reacción se detuvo a diferentes tiempos,
1, 5, 10 y 15 min agregando buffer de carga para. Posteriormente se realizó un análisis por
SDS‐PAGE de los productos hidrolizados con la finalidad de evaluar el tiempo en que se
generan suficientes péptidos para poder visualizarlos, y así poder determinar en qué
tiempo de reacción se realizarían las siguientes evaluaciones.
37
También se evaluó el efecto de la concentración del inhibidor pepstatin A sobre la
actividad catalítica de la catepsina D de langosta americana, ~0.2 µg de catepsina D fueron
incubados con 14.5 y 145 µM concentración final de pepstatin A durante 15 min,
posteriormente esta mezcla fue agregada a 50 µg de BSA diluidos en buffer de acetato de
sodio 50 mM pH 4.0 e incubados durante 15 min antes de ser evaluados
electroforéticamente.
Por último, una vez establecidos los parámetros, se evaluó el efecto del pH sobre la
actividad de la catepsina D de langosta americana y europea, esta vez utilizando a la BSA,
una proteína natural, como sustrato; la catepsina D bovina comercial fue utilizada para
fines comparativos; 50 µg de BSA diluidos en buffer MacIlvine a pH 2.2, pH 2.7, pH 3.0, pH
3.6, pH 4.0, pH 4.6, pH 5.0, pH 6.0 fueron incubados con 0.2 µg de catepsina D, después de
15 min la reacción fue detenida agregando buffer de carga para SDS‐PAGE. La hidrólisis de
BSA fue evaluada mediante el análisis de las imágenes de los geles, con la finalidad de
determinar el número de péptidos generados por cada una de las enzimas, los productos
de hidrólisis fueron contabilizados usando el software Digital Science 1D software (Kodak,
Rochester, NY). La BSA diluida a pH 4.0 a la que le fue agregada agua en lugar de enzima
fue tomada como referencia.
5.3 Caracterización del cDNA de las catepsinas D
5.3.1 Identificación de secuencias de cDNAs de catepsinas D de las langostas queladas
Una búsqueda en la base de datos disponible en el GenBank, arrojó nueve ESTs (Expressed
Sequence Tags) similares a catepsinas D provenientes de mRNAs de langosta americana,
38
una comparación entre estas secuencias nos permitió diferenciar dos grupos de ESTs, que
teóricamente son producto de dos genes de catepsina D diferentes que comparten el 65%
de identidad en su secuencia deducida de aminoácidos (Figura 7). Estas secuencias están
representadas por los números de acceso: CN951147 y CN951097.
Figura 7. Comparación de las secuencias deducidas de aminoácidos de dos isoformas putativas de catepsinas D de H. americanus. Las comparaciones se realizaron con el programa Clustal X. La catepsina D1 de H. americanus está representada por la que corresponde al número de acceso en GenBank CN951097 y la catepsina D2 por el CN951147. Asteriscos=residuos idénticos o conservados; dos puntos=sustituciones conservativas; puntos=sustituciones semiconservativas.
Con base en esta información se diseñaron oligonucleótidos específicos que fueron
utilizados como iniciadores de una reacción de PCR para obtener múltiples copias de cada
gen (Tabla V, CatD1 y CatD2). Se analizó la expresión de esos transcritos (nominados aquí
como Catepsina D1 y Catepsina D2) en tejidos de ambas langostas.
En la base de datos del GenBank se encuentran 5 secuencias completas de mRNAs de
catepsinas L de la langosta americana, a partir de las cuales también se diseñaron
oligonucleótidos iniciadores en regiones altamente conservadas para buscar la
distribución de los transcritos en diferentes tejidos (Tabla V).
39
5.3.2. Detección del mRNA de las catepsinas D y L en diferentes tejidos de las langostas
queladas
La presencia del mRNA de las dos catepsinas D fue analizada en diferentes tejidos de las
langostas queladas usando la técnica RT‐PCR. Se obtuvo tejido de músculo, gónada y
glándula digestiva de langostas adultas de donde se aisló el RNA total utilizando el
reactivo TRIzol®Reagent (Invitrogen), siguiendo las instrucciones sugeridas por el
fabricante. Las concentraciones del RNA total aislado fueron cuantificadas
espectrofotométricamente leyendo la absorbancia a 260 nm y a cada muestra se le
eliminó al DNA contaminante utilizando DNAsa I (Sigma; 1 UI para 1 µg de RNA, a 25 °C
por 15 min). Se utilizó 1µg de RNA total para la síntesis de cDNA en una reacción de
trascripción reversa utilizando el kit Reverse Transcription System (Promega A3500,
Madison, WI), usando Oligo d(T) como iniciador, estos cDNAs se utilizaron como
templados en las reacciones de PCR.
La amplificación de los fragmentos de cDNA de las catepsinas D y L fue realizada por una
PCR en un termociclador (DNA Engine‐Bio‐Rad). Las reacciones se llevaron a cabo en un
volumen total de 25 µl que contenían: 20 pmol de cada oligonucleótido (Tabla II), 1 µl del
cDNA (equivalentes a 50 ng de RNA inicial), 20 nmol de una mezcla de dNTPs, 2.5 µl de
amortiguador 10X y 1 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen). El programa de PCR consistió
en dos min a 94 °C, seguido de 35 ciclos con 30 s de desnaturalización a 94 °C, 30 s de
alineamiento a 57 °C, y 30 s de extensión a 68 °C, con una extensión final adicional a 68 °C
por 5 min. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa
40
al 1.5% y visualizados bajo luz UV después de haber sido teñidos con SYBRsafe
(Invitrogen).
5.3.3. Secuenciación del cDNA de las catepsinas D1 y D2 de la glándula digestiva de las
langostas queladas
Para obtener la secuencia completa del cDNA correspondiente al gen de las catepsinas D1
y D2 de las langostas americana y europea, respectivamente se utilizó el kit GenRacer™
5´/3´RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (Invitrogen L1500), siguiendo las
indicaciones del fabricante. El cDNA fue sintetizado a partir de 1 µg de RNA total aislado
de tejido de la glándula digestiva. Como iniciadores internos específicos se utilizaron los
oligonucleótidos de CatD1 o CatD2 sentido y antisentido (Tabla II), según el caso, y los
oligonucleótidos iniciadores anidados 3´y 5´ incluidos en el kit que se alinean en los
extremos del cDNA sintetizado con este kit. El programa de PCR consistió en 2 min a 94 °C,
seguido de 30 ciclos con 30 s de desnaturalización a 94 °C, 30 s de alineación a 57 °C y dos
min de extensión a 68 °C, con una extensión final a 68 °C por 10 min. Los productos de
PCR fueron ligados en un vector de clonación TOPO‐TA (Invitrogen), los cuales fueron
insertados en E. coli cepa DH5α (Invitrogen) para su clonación. Las bacterias fueron
sembradas en placas de agar, se seleccionaron colonias al azar para verificar la presencia
del inserto en el vector del clonación por medio de PCR, una vez elegidas las colonias con
el inserto de interés, éstas fueron colocadas en un medio nutritivo para favorecer la
proliferación, posteriormente se aisló el DNA de los plásmido usando el kit QIAprep Spin
Miniprep Kit (Quiagen, 27106). La secuenciación fue realizada en ambos sentidos en las
facilidades de los laboratorios de Macrogen en Corea.
41
Se utilizó el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997)
para identificar la secuencia obtenida, comparándola con las disponibles en el GenBank. A
partir de las secuencias nucleotídicas, se obtuvieron las secuencias deducidas de
aminoácidos usando el programa Expasy Translate tool disponible en la red, esto permitió
identificar e inferir acerca de las propiedades de la catepsinas D1 y D2 obtenidas a partir
del mRNA de la glándula digestiva. Posteriormente las secuencias fueron comparadas
utilizando el software Clustal X (versión 1.81) (Thompson et al., 1994). Las características
de la proteína se dedujeron a partir de la secuencia de aminoácidos usando el programa
PredictProtein (Rost et al., 2004) y Signal IP 3.0 (Nielsen et al., 1997), esto permitió
identificar e inferir acerca de las propiedades estructurales de las proteínas catepsinas D1
y D2.
5.3.4. Cuantificación del mRNA de catepsina D1 y catepsina L por PCR en tiempo real en
la glándula digestiva de las langostas queladas
Los cambios en la concentración del mRNA de la catepsina D1 y de la catepsina L de la
glándula digestiva inducidos por el ayuno y la realimentación fueron cuantificados por PCR
en tiempo real. El gen de la proteína ribosomal L38 fue utilizado como control interno. Los
oligonucleótidos específicos para estos genes, se muestran en la tabla IV. El RNA total fue
aislado como se describió previamente, y se eliminó el DNA genómico usando DNAsa I
(Sigma, 1 UI a 25 °C por 15 min). Se utilizó 1 µg de RNA total para llevar a cabo la síntesis
de cDNA en una reacción de trascripción reversa utilizando el kit Reverse Transcription
System (Promega A3500, Madison, WI), usando Oligo d(T) como iniciador, los cDNAs de
42
cada muestra obtenidos por este proceso se diluyeron 1:2 en agua destilada y se utilizaron
como templado en las reacciones de PCR.
Las reacciones de PCR en tiempo real tuvieron un volumen final de 20 µl, que incluían 1 µl
de cDNA (equivalente a 50 ng de RNA total), 10 µl de 2X iQ SYBR Green Super Mix
[Bio/Rad, CA, USA 170‐8884; que incluye KCL 100 mM, Tris‐HCl 40 mM, pH 8.4, y dNTPs 1
mM), 50 U/ml iTaq DNA polimerasa, MgCl2 6 mM, SYBR Green I, fluoresceína 20 nM y
estabilizadores] y 50 nM de cada oligonucleótido, Q‐CatD forward y reverse para el mRNA
de catepsina D1, CatL forward y reverse para la catepsina L, y L38 forward y reverse para
el mRNA de L38 (Tabla II). Cada PCR fue realizado por duplicado en cada muestra de
cDNA; se incluyeron controles sin templado para asegurar la ausencia de DNA
contaminante. Se utilizó un termociclador iQ5 con una unidad óptica adaptada (BioRad,
CA, USA), con los siguientes parámetros: 1 ciclo a 95 °C por 5 min, seguido de 40 ciclos que
consistían en 95 °C por 30 s, 61 °C por 65 s y 68 °C por 55 s.
La especificidad de cada par de oligonucleótidos fue validada por medio de la construcción
de una curva de disociación construida para cada reacción de PCR incrementando la
temperatura desde 60 °C hasta los 94.5 °C a una tasa de 0.3 °C cada 20s.
Se determinó el valor CT para cada muestra, el valor CT se define como el número de ciclo
del PCR en el cual la fluorescencia emitida por una muestra en particular se eleva
sobrepasando un umbral (Bustin, 2000). El valor del CT de cada una de las reacciones
amplificadas se utilizó para evaluar los cambios en la concentración del RNAm de cada gen
cuantificado.
43
Para aplicar la ecuación para la cuantificación relativa de cada gen, fueron determinados
el valor CT y la eficiencia de amplificación del PCR. La eficiencia del PCR fue validada por la
construcción de una curva estándar; en breve, productos de PCR de cada gen fueron
purificados usando las columnas Illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE
Healthcare, England, 28‐9034‐70), los productos purificados fueron cuantificados
espectrofotométricamente y llevados a una concentración de 25 ng/µL, la cual fue diluida
de forma serial (1:10) en agua destilada desde una concentración de 25 ng/µL hasta 25
ng/µL x 10‐9. Al menos 5 de las 9 diluciones fueron utilizadas como templados en el PCR
para construir las curvas estándar para cada uno de los genes, graficando el valor
promedio de CT contra el logaritmo de la cantidad inicial de DNA presente en cada
dilución. Las eficiencia de la PCR fue calculada directamente de las curvas estándar usando
la formula E=10[‐1/pendiente]. Las curvas estándar incluyeron los datos del CT de la dilución
seriada de los producto de PCR, y fueron amplificadas y realizadas al mismo tiempo que
las muestras problema. Cada reacción fue realizada por duplicado.
Para calcular el cambio en la concentración del mRNA de catepsina D1 afectado por el
periodo de ayuno y la realimentación, se analizaron los datos usando el método de
cuantificación relativa 2−ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001), de acuerdo a la siguiente fórmula:
2−ΔΔCT = ((CT,CD − CT,L38)tiempo ayuno) – (( CT,CD − CT,L38)control), en donde, CT,CD, es el CT del gen de
la catepsina D1 y CT,L38, es el CT del gen del control interno, ambos evaluados al tiempo
control y en los diferentes tiempos de ayuno y realimentación.
44
Tabla II. Secuencias de los oligonucleótidos usados como iniciadores para los análisis de RT‐PCR, para el PCR en tiempo real y para obtener la secuencia completa del cDNA de la catepsina D1
Iniciador Secuencia (5´→3´) Gen Posición (pb):
CatD 1 Forward 5´ CTCAGTACTACGGCCCCATC 3´ Catepsina D1 223‐243
CatD 1 Reverse 5´ CCSAGGATGCCGTCYAACTT 3´ Catepsina D1 499‐519
CatD 2 Forward 5´ AAAATGGGGAAATCGAGGAC 3´ Catepsina D2 168‐188
CatD 2 Reverse 5´ TGGATGGCAAAATCAGTTCC 3´ Catepsina D2 399‐414
CatL Forward 5´ AGGATGTAATGGTGGCTGGA 3´ Catepsina L 522‐541
CatL Reverse 5´ GGTGACAGAGATGGGTCCAA 3´ Catepsina L 722‐741
L 38 Forward 5´ ATTGAACGGGTGAGGTGAAC 3 ´ L 38 ND
L 38 Reverse 5´ ATCTGGAGCATCGAACCTTG 3´ L 38 ND
Q‐CatD Forward 5´ TGGATTCCCTCAGAGAAGTG 3´ Catepsina D1 301‐320
Q‐CatD reverse 5´ TAGAGAGGAAGCCGTGAAGG 3´ Catepsina D1 429‐449
Iniciado
res de
Q‐
PCR
Iniciado
res de
PCR
5.3.4.1. Análisis estadístico
Se probó la normalidad y homogeneidad de varianzas para cada conjunto de datos y se
realizaron análisis estadísticos para determinar los efectos de los diferentes tiempos de
ayuno usando pruebas paramétricas y no paramétricas, incluyendo a las pruebas ANOVA,
Kolmogorov‐Smirnov, y la prueba de diferencias de medias de Tukey (Zar, 1984), con
ayuda del software Statgraphics v. 5.1. La significancia estadística era considerada cuando
p≤0.05.
5.3.5. Modelación in silico de las características estructurales de la catepsina D1
Se obtuvo un modelo teórico de la estructura tridimensional de la catepsina D1 de la
langosta americana usando el programa MOE (ChemComp) 2009‐10 usando como
templado a la pepsina porcina (PDB 2PRP), a partir de 25 modelos intermediarios. Ambas
estructuras tridimensionales fueron visualizadas usando el programa PyMOL y se realizó
45
una predicción de algunas características moleculares como los enlaces disulfuro y los
puentes de hidrógeno mediante el programa PredictProtein (Rost et al., 2004).
5.3.6. Análisis de la agrupación de secuencias por cladograma
Se realizó una búsqueda de secuencias de aminoácidos de proteinasas aspárticas descritas
como digestivas o no digestivas en organismos de diversos taxa disponibles en la base de
datos de GenBank, se obtuvieron dichas secuencias que fueron alineadas para su
comparación usando el programa Clustal X v. 1.81 (Thompson et al., 1994). A partir de
esta comparación se realizó un análisis filogenético de las especies de invertebrados
usando el programa MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007). Se realizaron análisis de distancias
genéticas usando el modelo de sustitución descrito por Jones y col. (1992), a partir del
cual se construyó un cladograma aplicando el algoritmo “neighbor‐joining” (Saitou y Nei,
1987). Se empleó el método de “bootstrap” para evaluar la significancia estadística de las
ramas basado en 1000 réplicas (Hillis y Bull, 1993).
46
6. RESULTADOS
6.1. Identificación, aislamiento y caracterización bioquímica de la catepsina D digestiva
de las langostas queladas
6.1.2. Las proteinasas del jugo gástrico de las langostas
De manera preliminar se analizó el efecto de diferentes inhibidores (ver tabla I) sobre
actividad proteinolítica del jugo gástrico la langosta europea (Figura 8), los resultados
mostraron que las proteinasas de la clase cisteíno y aspártico predominan en dicho
extracto enzimático, pues los inhibidores de clase y tipo específicos de cisteíno y aspártico
proteinasas como el E‐64 y el inhibidor de catepsina L, el pepstatin A y en DAN inhiben de
hasta en un 98% la actividad proteinolítica total a pH ácido (Figura 8).
Figura 8. Actividad proteinolítica total y el efecto de los inhibidores en el jugo gástrico de la langosta europea H. gammarus.
Un análisis del efecto de los diferentes inhibidores de proteinasas relacionado con el
patrón de bandeo en los zimogramas del jugo gástrico de las langostas queladas mostró
que cuatro de las cinco bandas de actividad a pH 5.0 son bandas que corresponden a
proteinasas de la clase cisteíno (~23, ~45, ~50, ~55 y ~60 kDa, respectivamente) ya que el
47
E‐64 inhibe su actividad casi por completo, mientras que la actividad de una cuarta banda
(~34 kDa) se vio disminuida en presencia de pepstatin A, el inhibidor específico de las
proteinasas aspárticas, este resultado indica que esta banda corresponde a una proteinasa
aspártico. El inhibidor pefabloc no afectó la actividad de ninguna banda a pH 5.0. Por otro
lado, la langosta roja reveló al menos 9 bandas de actividad, el efecto de los inhibidores
sobre estas bandas mostró que el jugo gástrico de la langosta roja está constituido en su
mayoría por serino proteinasas, pues 8 de las 9 bandas reveladas a pH 5.0 resultaron
inhibidas por el pefabloc, resulta interesante remarcar que ésta langosta presenta una
banda (~28 kDa) que podría ser una aspártico proteinasa pues se vio inhibida por el
pepstatin‐A (Figura 9).
Figura 9. SDS‐PAGE 12% y zimogramas a pH 5.0 en donde se muestra el efecto de los inhibidores sobre la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la langosta (a) europea, (b) americana y (c) roja. Las flechas indican las bandas cuya actividad se vio disminuida por los inhibidores, las flechas oscuras indican las bandas que inhibió el pepstatin A, las flechas claras las que inhibió el E‐64, las flechas punteadas las que inhibió el pefabloc. Línea 1‐ marcador de masa molecular. Línea 2‐ perfil proteico del jugo gástrico. Línea 3‐ actividad proteinolítica total del jugo gástrico. Línea 4‐ jugo gástrico + Pepstatin A. Línea 5‐ jugo gástrico + E‐64. Línea 6‐ jugo gástrico + Pefabloc SC.
48
Por otro lado, el zimograma de pH 8.0 reveló las mismas bandas de actividad que a pH 5.0
pero con menor intensidad, quizá por un efecto del sustrato utilizado en cada pH. Además
a pH 8.0 se observó una banda con actividad de serino proteinasa (de acuerdo al efecto
del inhibidor pefabloc) que no se revela a pH 5.0. El zimograma de la langosta roja no
mostró diferencias evidentes en ambos pHs (Figura 10).
Figura 10. SDS‐PAGE 12% y zimogramas a pH 8.0 en donde se muestra el efecto de los inhibidores sobre la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la langosta (a) europea, (b) americana y (c) roja. Las flechas indican las bandas cuya actividad se vio disminuida por los inhibidores, las flechas oscuras indican las bandas que inhibió el pepstatin A, las flechas claras las que inhibió el E‐64, las flechas punteadas las que inhibió el pefabloc. Se utilizó caseína 3% en buffer Tris‐HCl pH 8.0 como sustrato. Línea 1‐ marcador de masa molecular. Línea 2‐ perfil proteico del jugo gástrico. Línea 3‐ actividad proteinolítica total del jugo gástrico. Línea 4‐ jugo gástrico + Pepstatin A. Línea 5‐ jugo gástrico + E‐64. Línea 6‐ jugo gástrico + Pefabloc SC.
Debido a que el patrón de actividad entre las dos langostas queladas resultó ser muy
similar, la siguiente figura corresponde únicamente a los resultados de la langosta
europea. En un zimograma con el sustrato específico (Z‐Leu‐Arg‐AMC) se observaron 4
bandas de actividad que corresponden a catepsina L, dichas bandas corresponden a
49
proteínas con masa molecular de 18, 36, 40 y 45 kDa. El zimograma a pH 3.0 del mismo gel
usando hemoglobina como sustrato mostró una quinta banda con masa molecular de 32
kDa que coincide con la banda identificada como aspártico proteinasa por Navarrete del
Toro y col. (2006) (Figura 11).
Figura 11. Actividad enzimática del jugo gástrico de H. gammarus. a) Actividad de catepsina L usando un sustrato fluorogénico, la actividad se revela como bandas brillantes. b) Actividad proteinolítica ácida total usando hemoglobina como sustrato. La flecha indica la banda con actividad a pH ácido que no tiene actividad de catepsina L.
Hasta este punto se logró identificar la clase de proteinasas a la que corresponden las
bandas de actividad observadas a pH fisiológico en el jugo gástrico de las langostas
queladas. Adicionalmente, el zimograma del jugo gástrico de langosta europea mostró al
menos 5 bandas de actividad; 4 de ellas son de proteinasas de tipo cisteíno,
específicamente catepsina L, como se lo reveló el sustrato fluorogénico. Se presumió
entonces que la quinta banda (con masa molecular de 32 kDa), es una aspártico
proteinasa, probablemente una catepsina D. Los resultados mostrados a continuación nos
confirman dicha presunción.
50
6.1.3. Aislamiento de una proteinasa aspártica digestiva de las langostas queladas
Los resultados descritos en esta sección corresponden a la langosta americana que se
utilizó como especie representativa, pues las condiciones y los resultados fueron idénticos
para ambas especies. Se logró purificar una proteinasa aspártica digestiva a partir del jugo
gástrico de ambas langostas queladas, de acuerdo a los análisis de SDS‐PAGE. En un
cromatograma típico se observó que la lectura de la absorbancia a 280 nm de las
fracciones eluidas resulta en dos picos, el primero se obtiene en paso de elusión a pH 7.0 y
el segundo a pH 7.5. Se determinó la actividad de catepsina D de todas las fracciones
usando el sustrato fluorogénico específico y sólo el segundo pico de A280 mostró actividad.
Las proteínas eluidas fueron visualizadas en SDS‐PAGE 12% bajo condiciones reductoras y
se observaron dos bandas, una de ~20 kDa y otra de ~50 kDa correspondientes a cada uno
de los pico (Figura 12).
Figura 12. Aislamiento de la catepsina D digestiva de la langosta americana por cromatografía de afinidad usando pepstatin A‐agarosa. La columna fue equilibrada con buffer de citrato 50 mM pH 4.0 y eluida con buffer Tris‐HCL 50 mM pH 7.0 y 7.5, NaCl 1 M. Se muestran los patrones electroforéticos de las fracciones eluidas. La línea oscura representa la A280 relativa, la línea clara representa la actividad de catepsina D de cada fracción (nmol MCA/libres/min).
51
En un análisis más minucioso se visualizó a la proteína eluida en un SDS‐PAGE 12% que no
contenía ningún agente reductor, en el gel se observó una banda de ~34 kDa que en el
zimograma mostró actividad proteinolítica a pH ácido y el pepstatin A inhibe su actividad
(Figuras 13a, línea 2 y 13c, líneas 4 y 5), por tinción con plata se demostró su pureza
(Figura 13b) y resultó positiva a la tinción de Schiff (Figura 13d), estos resultados en
conjunto demostraron su identidad como aspártico proteinasa y que se trata de una
proteína glicosilada, esta enzima fue posteriormente llamada catepsina D1 (CD1),
independientemente de la especie de origen. Por otro lado, en el SDS‐PAGE bajo
condiciones reductoras de la proteína eluida mostró una banda de ~50 kDa, que
concuerda con la banda observada en el gel de las fracciones de la cromatografía de
afinidad, los análisis de los efectos de los agentes reductores y desnaturalizantes sobre
esta proteína son descritos en una sección posterior.
El análisis de enfoque isoeléctrico confirma que las catepsinas D1 de ambas especies se
encuentran puras y tienen un pI idéntico, de 4.69 (Figura 13e). La estrategia de
purificación resultó en un factor de purificación de 123.16 veces con un rendimiento del
9.3 % (Tabla II).
52
Figura 13. Electroforesis de la catepsina D1 de la langosta americana aislada en una columna de pepstatin A‐agarosa. a) Perfil proteico del jugo gástrico (1) y la fracción eluida de la cromatografía (2). b) Tinción en plata de la fracción eluida. c) Zimograma a pH 5.0, (3) extracto crudo, (4) Fracción eluida, (5) Fracción eluida inhibida con pepstatin A, (6) Fracción eluida mezclada con E‐64, (7) Fracción eluida mezclada con pefabloc. d) Tinción de Schiff de la catepsina D1. e) Enfoque isoeléctrico de la catepsina D1 de la langosta americana (Ha) y europea (Hg) corrido en un rango de 3.5‐9.5. Los números verticales corresponden a los estándares.
Tabla III. Purificación de la catepsina D1 de la langosta americana
Secuencia Volumen (µl)
Concentración proteína (mg/ml)
Proteína total (mg)
Actividad
(U/µg)**
Actividad total (U)
Actividad específica (U/mg)
Factor de purificación
Rendimiento (%)
Sobrenadante 10,000 g
450 3.51 1 575 31.62 14229 9.03 1 100
Pepstatin A‐agarosa y filtración
500 0.24 120 267.05 133525 1 112.70 123.16 9.3
** Una unidad de actividad se definió como aquella que libera 1 µmol de MCA por min por µg de proteína.
53
6.1.3.1. Análisis de espectrometría de masas y secuencia N‐terminal
Se obtuvieron las secuencias de los péptidos calculadas por espectrometría de masas de la
fracción con actividad de catepsina D de la langosta americana, estas secuencias fueron
comparadas con la secuencia deducida de aminoácidos de la catepsina D1 de las langostas
europea y americana (obtenida como se describe en la sección 6.2), confirmando su
identidad de catepsina D1 (Tabla III, Figura 22). De manera adicional el análisis de N‐
terminal nos permitió identificar a la secuencia DVIDLDN como el principio de la proteína
madura.
Tabla IV. Secuencias de aminoácidos obtenidas por espectrometría de masas que resultaron idénticas a fragmentos de la secuencia deducida de aminoácidos del mRNA de catepsina D1.
Péptido Masa
calculada (Da)
Masa
observada (Da)
CFILNLACR 1109.55 1109.53
LHNRYDSTK 1133.56 1133.54
VGYWQVTAEAIK 1364.72 1364.68
6.1.3.2. Evaluación de la actividad de catepsina D en el jugo gástrico de la langosta
americana en ayuno
Usando el sustrato fluorogénico 7‐methoxycoumarin‐4‐acetyl‐GKPILFFRLK(DNP)‐d‐R‐mida
que es altamente específico para la evaluación de la actividad de catepsina D (Yasuda et
al., 1999) se determinó la actividad de dicha enzima en el jugo gástrico de tres
especímenes de langosta americana, y se evaluó la variación en la actividad de catepsina D
a lo largo de un periodo de ayuno y la subsecuente realimentación. Se observó que
durante 10 días de ayuno no hay un cambio significativo en la actividad de catepsina D en
54
el jugo gástrico de los especímenes, a los 15 días de ayuno se encontró que la actividad de
catepsina D aumenta de manera significativa (p ≥ 0.05). Cuando los animales se
alimentaron de nuevo, se observa una disminución significativa al valor del día 15, la cual
es considerada como regresar al valor basal, pues no resultó significativamente diferente
al valor del día 1.
Figura 14. Cambio de la actividad de catepsina D en el jugo gástrico de la langosta americana por efecto del ayuno. Cada punto representa la media de los valores obtenidos de tres individuos diferentes, los valores muestran la media y error estándar de tres determinaciones independientes. Las letras indican las diferencias significativas entre los puntos (p ≥ 0.05).
6.1.3.3. Análisis de las características estructurales de la catepsina D1 deducidas por su
comportamiento electroforético bajo diferentes condiciones
Se analizó el patrón de migración en PAGE de la catepsina D1 de la langosta americana
bajo condiciones nativas (sin SDS ni DTT), desnaturalizantes (SDS‐PAGE, urea) y reductoras
(DTT + calor). Se observó que la misma muestra tiene diferente comportamiento
dependiendo de la condición bajo la que fue analizada. En PAGE nativa aparece como una
sola banda con actividad proteinolítica (Figura 15, gel b, línea 1), mientras que en SDS‐
PAGE se observan dos bandas de ~34 y ~50 kDa, solamente la banda de menor masa
55
molecular muestra actividad proteinolítica (Figura 15, gel a, línea 2). Bajo condiciones
reductoras, se observa una sola banda de ~50 kDa que no muestra actividad proteinolítica
(Figura 15, gel a, línea 3 y 5). Los resultados revelan que la proteinasa aspártica del jugo
gástrico de la langosta americana es una enzima monomérica que cambia su configuración
bajo condiciones reductoras. De manera paralela, se analizó la capacidad caotrópica de la
urea sobre la catepsina D1, es notable que la urea parece desnaturalizar a la catepsina D1
de manera gradual (Figura 15, gel b) pues 2 M urea modifica de manera importante la
estructura de la catepsina D1, retrasando la migración, aumentando la masa molecular
aparente y anulando la actividad proteinolítica, mientras que 4 M urea continua la
desnaturalización de la proteína retrasando aun más la migración (Figura 15, gel b, líneas 3
y 4). Comparativamente, la presencia de 2 M urea parece no tener ningún efecto en la
migración de la catepsina D bovina y aunque reduce la actividad proteinolítica, ésta no se
extingue por completo (Figura 15, gel c).
56
Figura 15. Comportamiento electroforético de la catepsina D1 la langosta americana bajo diferentes condiciones. PAGE (bandas negras) y PAGE de sustrato (bandas blancas). a) SDS‐PAGE y zimograma, línea 1‐ buffer de carga nativo (sin SDS), línea 2‐ buffer de carga con 4% de SDS, línea 3‐ buffer de carga con SDS y calor (2 min), línea 4‐ buffer SDS + DTT, línea 5‐buffer SDS+DTT+calor. b) Perfil electroforético de la catepsina D de langosta americana y c) de catepsina D bovina en geles con urea, línea 1‐PAGE nativa, línea 2‐ gel con urea 2M, línea 3‐ gel con urea 4M, línea 4‐ gel con urea 8M. Los asteriscos representan las muestras equivalentes reveladas en zimograma.
6.2. Caracterización bioquímica de la catepsina D1 digestiva de las langostas queladas
6.2.1. Condiciones de pH óptimas para la actividad enzimática —hidrólisis de un sustrato
sintético—
Las aspártico proteinasas se caracterizan por trabajar a un pH ácido, y las catepsinas D
digestivas de las langostas queladas no fueron la excepción. El pH óptimo de la catepsina
D digestiva de las langostas queladas mostró dos pH óptimos aparentes para la hidrólisis
del sustrato sintético, con un máximo de actividad a pH 4.0 y otro a pH 5.0 (Figura 16),
estos valores difieren substancialmente de la catepsina D bovina para la cual se presenta
un sólo pico de actividad a pH 4.0. La presencia de dos picos de actividad de las catepsinas
D de langostas responde a un efecto de solubilidad, pues las proteínas presentan una
carga neta de cero si se encuentran en una solución de pH cercano a su punto isoeléctrico
57
y tienden a precipitar, la medición a pH 4.5 se encuentra en un valor muy cercano a su pI,
el cual tiene un valor de 4.69, por lo que en este punto las enzimas podrían estar fuera de
solución y por lo tanto poco disponibles para realizar la hidrolisis. En términos generales
se observa que las catepsinas D de langostas muestran actividad en un rango más amplio
que su homólogo de mamífero (Figura 16).
Figura 16. Efecto del pH en la actividad de las catepsinas D bovina y de langosta. La actividad relativa se expresa como el porcentaje de la mayor actividad detectada en el rango de pH examinado. Se utilizó el sustrato fluorogénico 7‐methoxycoumarin‐4‐acetyl‐GKPILFFRLK‐(DNP)‐d‐R‐amida en buffer de acetato de sodio 50 mM. Cada punto representa la media de tres determinaciones independientes, los asteriscos denotan los conjuntos de datos que resultaron significativamente diferentes p ≥ 0.05.
6.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH de las catepsinas D1
Por otro lado, en la evaluación de la estabilidad de las catepsinas D cuando son incubadas
en condiciones de temperatura durante diferentes periodos de tiempo se encontró que la
catepsina D de langostas es estable por al menos 90 min a 25 °C, sin embargo a 50 °C la
58
catepsina D de la langosta europea mantiene el 80% de actividad después de 30 min y la
langosta americana el 80% de actividad a los 60 min; en comparación, la estabilidad media
de la catepsina D bovina a 50 °C es de 100% después de 90 min. A 60 °C las catepsinas D
de las langostas pierden rápidamente su capacidad proteinolítica, pues a esta temperatura
la catepsina D de la langosta europea pierde el 80% de la actividad en 15 min, la catepsina
D de la langosta americana pierde el 40% de la actividad en 15 min; comparativamente, a
60 °C la catepsina D bovina mantiene el 100% de la actividad después de 15 min (Figura
17).
Figura 17. Estabilidad de la actividad de la catepsina D bovina (a), de langosta europea (b) y langosta americana (c) incubada a diferentes temperaturas. Cada punto representa la media de tres determinaciones independientes, los asteriscos denotan los conjuntos de datos que resultaron significativamente diferentes p ≥ 0.05.
La Figura 18 muestra la estabilidad de la actividad proteinolítica de la catepsina D bovina y
de las langostas queladas cuando es incubada a diferentes periodos de tiempo a pH 2.5,
4.0, 5.0 y 6.0; se observa que la catepsina D bovina es relativamente más estable que las
catepsinas D de langostas, pues ésta mantiene el 100% la actividad después de 90 min de
incubación a pH 4.0 y pH 5.0, a pH 2.5 la enzima bovina pierde el 50% de la actividad a los
30 minutos y el 60% a los 60 min. A pH 2.5 la catepsina D de la langosta europea mantiene
59
el 100% de la actividad a los 90 min, a pH 4.0, 5.0 y 6.0 la actividad se ve reducida cerca
del 40% después de 30 minutos. Mientras que la catepsina D de la langosta americana es
estable a pH 2.5, 4.0, 5.0 durante 90 min, pero esta enzima resultó menos estable a pH 6.0
que la de la langosta europea, pues después de 30 min a pH 6.0 se afectó la actividad
cerca del 50%.
Figura 18. Actividad residual de la catepsina D bovina (a), de langosta europea (b) y langosta americana (c) incubada a diferentes pHs. Cada punto representa la media de tres determinaciones independientes, los asteriscos denotan los conjuntos de datos que resultaron significativamente diferentes p ≥ 0.05.
6.2.3. Efecto de la temperatura sobre los parámetros cinéticos de la catepsina D1 de las
langostas queladas
Se midió la dependencia a la temperatura de los parámetros cinéticos, KM, kcat y la
constante catalítica kcat/KM de las catepsinas D de langostas usando un sustrato
fluorogénico, todas las mediciones fueron realizadas en paralelo con la catepsina D bovina
(Tabla IV).
60
61
A 25 °C, los valores de la afinidad por el sustrato (KM) resultaron ser similares entre las
catepsinas D de langostas y la de mamífero, los valores a temperaturas más bajas (4 y 10
°C) tendieron a aumentar para las tres enzimas evaluadas, sin embargo la magnitud de las
diferencias entre las determinaciones a 4 y 25 °C resultó ser menor para las catepsinas D
de las langostas. Los bajos valores de KM registrados para las langostas repercutieron en
los valores de la constante de especificidad kcat/KM que resultó ser más de 20 veces mayor
para las enzimas de las langostas catalizando a temperaturas cercanas a las fisiológicas de
los mamíferos (25 °C) (Figura 19).
Figura 19. Dependencia a la temperatura de los parámetros cinéticos KM (a) y kcat/KM (b) de las catepsinas D de langostas y bovina. Los asteriscos denotan los conjuntos de datos que resultaron significativamente diferentes (p ≥ 0.05) 6.2.4. Efecto del pH en la hidrólisis de un sustrato proteico por las catepsinas D1
Se usó a la albumina de suero bovina (BSA) como sustrato para caracterizar in vitro el
efecto del pH en la actividad proteinolítica de las catepsinas D bovina, de langosta
americana y europea. Basados en los resultados generados por el software Digital Science
1D se realizó una evaluación del número de péptidos visualizados en PAGE 12%, se
62
encontró que la BSA es degradada por las tres enzimas evaluadas, además se logró
detectar un efecto del tiempo de incubación sobre el número de péptidos generados por
al menos 15 min (Figura 20 a).
Se encontró también que existe un efecto de la concentración del inhibidor pepstatin A
sobre la actividad proteinolítica de las catepsinas D, la figura 20 b muestra los resultados
de la langosta americana (Figura 20 b). Se observó que las tres catepsinas D evaluadas
hidrolizan más enlaces peptídicos de la BSA a pH 3.0. El análisis de las imágenes en base a
los resultados generados por el software Digital Science 1D (Kodak, Rochester, NY) mostró
que las catepsinas D de las langostas queladas generan un mayor número de péptidos que
la catepsina D bovina; también se encontró que las catepsinas D de langostas tienen
actividad proteinolítica a un rango de pH mayor que la catepsina D bovina, pues cuando se
enfrenta al BSA con las enzimas de langostas se observa la generación de péptidos a todos
los pHs analizados (Figura 20 d y e), mientras que la catepsina D bovina parece no tener
actividad a pH 2.2 y 6.0 (Figura 20 c). No se observó hidrólisis del BSA en los carriles
control.
63
Figura 20. Separación de los productos de hidrólisis de la BSA bovina por SDS‐PAGE, 50 µg de BSA fueron incubados con ~2 µg de catepsina D de langosta americana o en su ausencia (cont). (a) las reacciones fueron detenidas a diferentes tiempos y los productos de hidrólisis fueron analizados en SDS‐PAGE. (b) Dependencia de la dosis del inhibidor pepstatin A para digerir la BSA por la catepsina D de langosta americana. (c) Dependencia del pH de la catepsina D bovina, (d) de langosta europea y (e) americana o en su ausencia (cont) para la hidrólisis de la BSA. Los productos de proteólisis fueron analizados en SDS‐PAGE 12% y son indicados por las flechas.
64
6.3. Caracterización del cDNA de las catepsinas D
6.3.1. Detección de mRNA de catepsinas D y L en diferentes tejidos
Para localizar los transcritos de catepsina D1, D2 y L en diferentes tejidos de las langostas
americana y europea, se utilizó el cDNA sintetizado a partir de músculo, gónada y glándula
digestiva como templado en un análisis de RT‐PCR.
En ambas especies se encontró el transcrito de la catepsina D2 tanto en la glándula
digestiva, como en la gónada y en músculo, mientras que los transcritos de catepsina D1 y
de catepsina L se encontraron exclusivamente en la glándula digestiva (Figura 21). Se
utilizó el gen de la proteína ribosomal L38 como control.
Figura 21. Detección del transcrito de la (a) catepsina D1, (b) catepsina D2, (c) catepsina L y (d) L38 rRNA como control, en diferentes tejidos de H. gammarus (H. g.) y H. americanus (H. a.). El RNA total extraído de tejido de la gónada (G), músculo (M) y glándula digestiva (MG) fue usado para sintetizar cDNA.
65
6.3.2. El cDNA de las catepsinas D1 y D2 de las langostas queladas
Se obtuvieron las secuencias de los cDNA de las catepsinas D1 y D2 a partir de la glándula
digestiva de la langosta americana, mientras que para la langosta europea se obtuvo una
secuencia parcial del transcrito de catepsina D1, ya que no se logró obtener la secuencia
del extremo 5´. Las tres secuencias fueron depositadas en la base de datos del GenBank y
tienen los números de acceso EU687261 y EU822806 para la catepsina D1 de langosta
americana y europea respectivamente y FJ943775 para la catepsina D2 de la langosta
americana. La secuencia de nucleótidos y la deducida de aminoácidos de las catepsinas D1
de la langosta americana se muestra en las figura 22.
66
Figura 22. Secuencia de nucleótidos y deducida de aminoácidos del cDNA de la catepsina D1 de la langosta americana H. americanus (número de acceso en el GenBank EU687261). El péptido señal putativo está indicado en negritas, la secuencia del amino terminal y comienzo de la proteinasa madura está subrayado con una línea discontinua. Los residuos de asparagina (N) potenciales para glicosilación están enmarcados. La señal de poliadenilación (AATAAA) está subrayada. Los residuos de ácidos aspárticos (D) del sitio catalítico están dentro de un pentágono. Las secuencias de los péptidos que coinciden con las obtenidas de las bandas de actividad por espectrometría de masa están enmarcadas.
67
La secuencia completa de la catepsina D1 consta de 1292 pb. La metionina inicial se
encuentra en la posición 40, mientras que el codón de término se localiza en la posición
1195‐1197. El cDNA de la catepsina D1 tiene un marco de lectura abierto (ORF) que se
extiende de las posiciones 40 a la 1197, codificando para 386 residuos de aminoácidos con
una masa molecular calculada en 42.6 kDa. Tiene una región no traducida de 95 pb en el
extremo 3´ y una cola poli‐A, que comienza 33 pb después de la secuencia AATAAA, que es
la señal de poliadenilación para eucariotas. Se identificó al péptido señal entre los
residuos 1 a 16, la secuenciación N‐terminal descrita en la sección 6.1 indica que la
proteína madura comienza en el residuo 50, lo que nos lleva a deducir de un péptido de
activación putativo que va de los residuos 17 al 50. Una vez eliminado el péptido señal se
tiene una proteína madura de 336 residuos de aminoácidos para la cual se calculó un
punto isoeléctrico teórico de 4.14 y una masa molecular de 36.4 kDa.
6.3.3. Las secuencias deducidas de aminoácidos de las catepsinas D1 y D2
Las secuencias deducidas de aminoácidos de las catepsinas D1 de ambas especies
muestran una similitud de 98%, y al menos tres péptidos de ambas secuencias coinciden
con los resultados obtenidos por espectrometría de masas que se muestra en la Tabla III.
Un análisis con el programa BLASTX de las secuencias de DNA traducidas a proteínas
reveló que las catepsinas D1 y D2 de las langostas queladas son similares a otras aspártico
proteinasas de otros artrópodos. La secuencia de los aminoácidos cercanos a la posición
del sitio activo fue determinante para identificar a los productos como una aspártico
proteinasa, específicamente como catepsinas D. Los resultados del análisis en BLASTX
68
demostraron que la catepsina D1 de las langostas queladas tiene un 50% de similitud con
la secuencia deducida de aminoácidos de la catepsina D de Apis mellifera y con la
proteinasa aspártica lisosomal de Tribolium castaneum, 48% de similitud con la proteinasa
aspártico de Haemaphysalis longicornis y 49% con la catepsina D de Penaeus monodon
(Figura 23), por mencionar algunas. De manera relevante, sólo el 43% de la secuencia
deducida de aminoácidos de la catepsina D2 de la langosta americana es similar a la
catepsina D1 de la misma especie, sin embargo es 83% similar a la catepsina D de Penaeus
monodon, 69% similar a la catepsina D isoforma 1 de Tribolium castaneum, y 64% similar a
la catepsina D de Bombyx mori (Gui et al., 2006).
69
Figura 23. Comparación de secuencias deducida de aminoácidos de aspártico proteinasas descritas como digestivas (marcadas con un rombo) y no digestivas. Los alineamientos fueron hechos con el programa Clustal X. Las secuencias usadas fueron: catepsina D de Penaeus monodon (ABQ10738.1), aspártico proteinasa de Tribolium castaneum (XP_966517.1), proteína similar a catepsina D de Callosobruchus maculatus (ACO56332.1), aspártico proteinasa de Haemaphysalis longicornis (AB218595), catepsina D de Sitophilus zemais (BAH24176.1), catepsina D de Ancylostoma caninum (AAB06575.1), aspártico proteinasa de Necator americanus (CAC00542.1 and CAC00543.1), catepsinas D de Musca domestica (ppCAD 3, ABL84270; ppCAD 2, ABM69085 and ppCAD 1, ABM69086), proteinasa aspártica de Caenorhabditis elegans (AF208526), catepsinas D de Schistosoma mansoni (SmCD1 AAB63442; SmCD2 ABP48739.1), catepsinas D de Homarus americanus (CD1 ACG70181.1; CD2 ACV53024.1), catepsina D de Bombyx mori (AAP50847), proteinasa aspártica de Aedes aegypti (XP_001657556), pepsina A de Homo sapiens (AAA60061) y catepsina D de Bos taurus (NP_001159993.1). Asteriscos=residuos idénticos o conservados; dos puntos=sustituciones conservativas; puntos= sustituciones semiconservativas. La región del sitio activo está enmarcada, la región del “poly‐proline loop” está sombreada.
70
6.3.4. El efecto del ayuno en la concentración del mRNA de la catepsina D1 y catepsina L
El análisis de las curvas estándar del PCR en tiempo real indicó que en cada reacción de
PCR se obtuvo un sólo producto, sin amplificaciones no especificas. Para cada par de
oligonucleótidos la eficiencia del PCR fue >94% (resultados no mostrados).
Como se observa en las Figuras 24 y 25, el ayuno no afectó a la concentración del mRNA
de la catepsina D y L en la langosta americana, mientras que la realimentación causó un
incremento de 2.5 veces en la concentración del mRNA de la catepsina D y de 3.3 veces en
la concentración del mRNA de catepsina L en la glándula digestiva.
Por el contrario, en la langosta europea se observó una respuesta diferente, el número de
copias de mRNA de catepsina L no se ve afectado por el ayuno ni la realimentación,
mientras que para la catepsina D1 el ayuno causó una disminución al 40% en el mRNA
respecto al grupo control y esta concentración no muestra variación después de la
realimentación.
Figura 24. Cambios en la concentración del mRNA de catepsina D1 en la glándula digestiva a lo largo de un periodo de ayuno medidos por PCR en tiempo real en H. americanus (a) y H. gammarus (b). El número de copias del mRNA de catepsina D fue normalizado con el número de copias del rRNA de L38 del grupo control (no ayunados, día 1). Se graficaron las medias de tres animales de cada grupo, las barras indican el error estándar. Las diferencias fueron determinadas por un análisis de varianza de una vía (ANOVA). Las letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0.05).
71
Figura 25. Cambios en la concentración del mRNA de catepsina L en la glándula digestiva a lo largo de un periodo de ayuno medidos por PCR en tiempo real en H. americanus (a) y H. gammarus (b). El número de copias del mRNA de catepsina L fue normalizado con el número de copias del rRNA de L38 de el grupo control (no ayunados, día 1). Se graficaron las medias (a) y las medianas (b) de tres animales de cada grupo, las barras indican el error estándar. Las diferencias fueron determinadas por un análisis de varianza de una vía (ANOVA). Las letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0.05).
6.3.5. Modelo estructural de la catepsina D1
En la Figura 26 se muestra la posición de los enlaces disulfuro de la catepsina D1 que
fueron determinados en base a la comparación de la secuencia deducida de aminoácidos
(Krieger y Hook, 1992) y de la estructura (Metcalf y Fusek, 1993) de la catepsina D bovina
usando el programa PredictProtein. La comparación de la posición de los residuos de
cisteínas reveló que los tres puentes disulfuro de la catepsina D bovina corresponden en el
arreglo de la catepsina D1. En esta figura también se resaltan algunas de las características
estructurales como el péptido señal, el péptido de activación y las regiones que
conforman estructuras secundarias características de las catepsinas D como el “Y75 flap” y
el “polyproline loop”.
72
Figura 26. Representación de la predicción del arreglo de los enlaces disulfuro de la catepsina D1 de la langosta americana (renglón superior) y la comparación con la catepsina D bovina (renglón inferior). Los residuos de aminoácidos que constituyen el péptido señal están remarcados en negritas, los residuos del péptido de activación están subrayados, los residuos que conforman el “Y75 flap” y el “polyproline loop” están sombreados.
En la figura 27a se muestra que la catepsina D1 madura de la langosta americana tiene la
topología característica de las aspártico proteinasas, una conformación simétrica
bilobulada con el sitio activo localizado en el centro de una hendidura que funciona como
sitio de unión al sustrato (Szecsi, 1992), en esta figura la superposición de la estructura de
la catepsina D1 con la catepsina D bovina, indica las diferencias más importantes de los
modelos de ambas estructuras terciarias, evidenciando algunas particularidades de la
catepsina D1.
Resulta notable que la catepsina D1 tiene dos estructuras tipo “lazo” o “loop” que
teóricamente se cierran sobre la hendidura del sitio de unión al sustrato, una de estas
73
estructuras es conocida como “Y75 flap” (Y75 connota a la tirosina de la posición 75 de la
pepsina porcina que corresponde al residuo tirosina 174 de la langosta) cuya secuencia de
aminoácidos es homóloga a la de la catepsina D bovina; la segunda estructura se trata de
otro “lazo” localizado en la posición análoga al “polyproline loop” de las catepsinas D de
mamíferos, llamada así por que presenta tres residuos de prolina contiguos (Figura 27 b),
aunque en la catepsina D1 esta estructura no contiene ningún residuo de prolina (Figura
27 c). La catepsina D1 también carece del lazo “β‐hairpin” (o “processing loop”) que se
presenta en la catepsina D de mamíferos. Aunque las características estructurales de la
catepsina D1 podrían tener consecuencias en su función, tendrían que llevarse a cabo
análisis más detallados para aseverarlo.
Figura 27. Predicción del modelo molecular que representa la superficie de la catepsina D1 (azul) y la comparación por superposición con la catepsina D bovina (rojo). a) La estructuras “Y75 flap” y “polyproline loop” se representan en verde, el “β‐hairpin loop” en gris, los residuos de aminoácidos del sitio activo en negro. Comparación estructural del “polyproline loop” de la catepsina D bovina (b) con el lazo homólogo de la catepsina D1 (c). Los átomos están representados en colores, carbono en azul claro, nitrógeno en azul oscuro, oxígeno en rojo.
74
6.3.6. Análisis de agrupación de secuencias por cladograma
El análisis de la comparación de las secuencias de amino ácidos de la catepsina D1 de las
langostas con otras catepsinas D recuperadas del GenBank reveló un cambio de los
residuos de aminoácidos en la posición correspondiente al “polyproline loop” de la
catepsina D bovina, este cambio consistió en la sustitución de los residuos de prolina en la
catepsina D1 de las langostas queladas. La ausencia de residuos de prolina en dicha
estructura, además de la ausencia del “processing loop” en las secuencias de catepsinas D
de invertebrados ya había sido notada por otros autores (Padilha et al., 2009). En este
trabajo confirmamos estos hallazgos mediante de la comparación de 12 secuencias de
aspártico proteinasas reportadas como digestivas, provenientes de los siguientes
organismos: Tribolium castaneum (Blanco‐Labra et al., 1996), Callosobruchus maculatus
(Ahn y Zhu‐Salzman, 2009), Sitophilus zeamais (Matsumoto et al., 2009) Haemaphysalis
longicornis (Boldbaatar et al., 2006), Ancylostoma caninum (Harrop et al., 1996), Necator
americanus (Ranjit et al., 2009), Musca domestica (Padilha et al., 2009), Caenorhabditis
elegans (Tcherepanova et al., 2000), Schistosoma mansoni (Brindley et al., 2001) y
catepsina D1 de Homarus americanus (Rojo et al., 2010). En nuestro análisis también se
incluyeron secuencias de catepsinas D consideradas como lisosomales. Se confirma que la
mayoría de las enzimas digestivas, incluyendo a la catepsina D1 de la langosta americana,
carecen del “polyproline loop” que es observado en todas las demás catepsinas D,
incluyendo a la catepsina D2 de la langosta americana y cuyo mRNA fue encontrado en
tejidos no digestivos (Figura 21), lo que sugiere que la ausencia de residuos de prolinas en
el “polyproline loop” podría contribuir con la función digestiva a diferencia de las
75
catepsinas D lisosomales que tienen al menos tres residuos de prolinas en el “polyproline
loop” de donde deriva el nombre.
Como se observa en el cladograma construido a partir de las secuencias deducidas de
aminoácidos de catepsinas D de invertebrados, los organismos se dividen en dos ramas
principales (soportadas por un valor de bootstrap de 93), una que contiene solamente
catepsinas D digestivas (la rama inferior) y otra que contiene a las no digestivas, aunque
en esta última se incluyen algunas digestivas. Todas las enzimas agrupadas en el clado
superior tienen en su secuencia el “polyproline loop” mientras que las del clado de la
parte inferior carecen de él.
Figura 28. Cladograma realizado con secuencias de aminoácidos de catepsinas D digestivas y no digestivas de invertebrados depositadas en GenBank. El dendograma fue generado con el algoritmo “neighbor‐joining”, la conformación de las ramas está soportada estadísticamente por un análisis “bootstrap” basado en 1000 replicas. Los rombos indican a las catepsinas D descritas como digestivas.
76
7. DISCUSIÓN
Las proteinasas digestivas de las langostas queladas
Aunque en investigaciones anteriores a esta se demostró que el pH del jugo gástrico de las
langostas queladas es de naturaleza ácida (Baker y Gibson, 1977) y que la actividad
proteinolítica presente ha sido atribuida a proteinasas de la clase cisteíno (Laycock et al.,
1989) y aspártico (Navarrete del Toro et al., 2006), no existía información respecto a las
características bioquímicas y moleculares de alguna proteinasa de la clase aspártico para
estas especies de langostas, hasta ahora.
Los resultados de la primer parte de esta investigación demuestran claramente que las
proteinasas de las clases cisteíno y aspártico predominan en el jugo gástrico de las
langostas queladas pues en zimogramas revelados a pH cercano al fisiológico (pH 5.0) se
observa una presencia exclusiva de dichas enzimas. Solamente una proteinasa de la clase
serino fue detectada en zimogramas a pH 8.0. Esta característica hace a las langostas
queladas distintas de otros crustáceos, un grupo en el cual generalmente se acepta que la
digestión de la proteína del alimento recae sobre las serino proteinasas (Tang y Wong,
1987).
Navarrete del Toro y col. (2006), reportaron que el pepstatin A es el principal inhibidor de
la actividad proteinolítica del jugo gástrico de la langosta europea; mientras que en este
trabajo encontramos que si bien el pepstatin A inhibe de manera importante a la actividad
proteinolítica (más del 30%), el E‐64 inhibe en mayor medida, pues más del 95% de la
actividad proteinolítica total se redujo en su presencia, por su parte el inhibidor familia‐
77
específico de la catepsina L inhibe también cerca del 95% de la actividad (Figura 8), por lo
que se confirma que la actividad proteinasa encontrada en el jugo gástrico de las
langostas es atribuida a enzimas tipo catepsina L. Otros autores han reportado la
presencia de cisteíno proteinasas en órganos digestivos de langostas queladas como la
glándula digestiva y el “estómago” (Le Boulay et al., 1995) , por ejemplo, Laycock y col.
(1991) describieron el cDNA que codifica para 3 cisteíno proteinasas en la glándula
digestiva de la langosta H. americanus que podrían participar en la digestión del alimento.
De acuerdo a lo anterior y a nuestros resultados, las proteinasas que constituyen el jugo
gástrico de las langostas queladas son del tipo catepsinas, relacionadas con las proteinasas
cisteíno y aspártico con actividad a pH ácido que se encuentra en los lisosomas de los
vertebrados y que participan la digestión de proteína intracelular (Barrett, 1979; Turk et
al., 2000). También se han encontrado proteinasas del tipo aspártico y cisteíno en
invertebrados (nematodos y platelmintos parásitos) en los cuales, además de ser
lisosomales, han sido descritas como responsables de la digestión extracelular en el
sistema digestivo (Tort et al., 1999; Tcherepanova et al., 2000; Brinkworth et al., 2001;
Williamson et al., 2002) en donde participan en una cascada digestiva para degradar a la
hemoglobina de la sangre de sus hospederos (Williamson et al., 2004; Delcroix et al.,
2006; Morales et al., 2008).
Por otro lado, el hecho de que los mRNAs de la catepsina D1 y de la catepsina L se
expresan exclusivamente en la glándula digestiva de las langostas queladas y la presencia
de la enzima madura de catepsina D1 en el jugo gástrico, indica que esta enzima se
secreta en dicha glándula hacia el lumen de los túbulos, después pasa hacia la cámara
78
gástrica y finalmente forma parte del jugo gástrico. Debido a que el pH del jugo gástrico
de las langostas queladas es cercano al pH óptimo en que trabaja la catepsina D1,
sugerimos que esta enzima participa en la digestión extracelular de las proteínas del
alimento.
La presencia de enzimas tipo catepsina ha sido reportada en varias especies de crustáceos
(Le Boulay et al., 1995; Aoki et al., 2004; Hu y Leung, 2007) en los que se incluye a la
langosta americana (Laycock et al., 1989), sin embargo, dichos reportes hacen referencia a
catepsinas de la clase cisteíno. El presente es el primer reporte de una catepsina de la
clase aspártico participante de la digestión extracelular en los crustáceos. La aspártico
proteinasa caracterizada aquí, junto con las cisteíno proteinasas previamente
caracterizadas por Laycock y col. (1991) pueden constituir a las proteinasas ácidas
originalmente descritas por Baker y Gibson (1977) como las responsables de la digestión
de las proteínas del alimento en las langosta americana y europea.
Entre las especies de crustáceos en las que se ha descrito la participación de proteinasas
de la clase cisteíno. además de las langostas queladas (Laycock et al., 1989; Le Boulay et
al., 1995), están el camarón del norte (Aoki et al., 2003b), el camarón blanco (Le Boulay et
al., 1996), el langostino chino (Hu y Leung, 2007) y camarones carídeos (Teschke y
Saborowski, 2005). Aunque el mecanismo de secreción todavía no se conoce a detalle, ya
que se trata de un mecanismo complejo que podría involucrar la participación de
múltiples enzimas. Por otro lado, todavía se requiere una explicación de la forma en la que
una enzima intracelular se modificó y adquirió una función en la digestión extracelular.
79
Un acercamiento certero en la tarea de elucidar el mecanismo de secreción de
proteinasas cisteíno digestivas es el modelo de secreción de proteinasas digestivas del
camarón propuesto por Hu y Leung (2007), dicho modelo también podría aplicarse a
aspártico proteinasas participantes en la digestión; los autores demostraron, usando
sondas de RNA y de proteínas, la presencia de pequeñas vesículas de catepsina L en el
lumen de la glándula digestiva y sugieren que las presencia de la enzima en el tracto
digestivo puede ser resultado de una secreción apócrina junto con holócrina. Los autores
concluyeron que la catepsina L lleva a cabo la digestión de la proteína del alimento de una
manera intra y extracelular. Dado que la glándula digestiva tiene una diferenciación
celular clara, los autores antes mencionados sugieren que la transcripción de las enzimas
se lleva a cabo en un tipo específico de células (las células F) y que son secretadas por otro
tipo de células diferenciadas, las células B que maduran a partir de las células F (Hu y
Leung, 2007).
De manera general se ha observado que, los animales que sintetizan aspártico proteinasas
que participan en la digestión del alimento, sintetizan también cisteíno proteinasas, lo que
sugiere una digestión tipo cascada en la que intervienen estas dos clases de proteinasas
(Boldbaatar et al., 2006; Delcroix et al., 2006). La presencia de proteinasas aspártico y
cisteíno en el jugo gástrico de las langostas queladas podría indicar una digestión del
alimento tipo cascada, sin embargo el papel específico que juega cada una de estas
enzimas en la digestión de las proteínas del alimento en las langostas queladas está aún
por ser establecido, así como el sitio de síntesis y traducción de estas enzimas. Es
necesario realizar más estudios para validar o invalidar este planteamiento, hasta ahora
80
solo podemos aseverar que, los resultados obtenidos demuestran que los mRNA que
codifican catepsina D1 y catepsina L son transcritos en la glándula digestiva y la proteína
madura es una de las enzimas activas a pH ácido que son secretadas hacia el lumen y que
después se encuentran en el jugo gástrico para participar en la digestión del alimento.
Las características bioquímicas de la catepsina D1 de las langostas queladas
Esta sección está enfocada en la discusión de los resultados obtenidos acerca de la
identificación, el aislamiento, y la caracterización de una proteinasa aspártica relacionada
con la digestión del alimento en las langostas queladas, que en esta investigación fue
designada con el nombre de catepsina D1 (CD1).
Recapitulando la sección anterior, en las langostas queladas, la proteinasa aspártica aquí
descrita (catepsina D1), junto con las proteinasas de la clase cisteíno previamente
descritas por Laycock y col. (1989), son las principales, y posiblemente las únicas,
participantes en la digestión de la proteína del alimento, pues parecen ser el
constituyente exclusivo de la actividad proteinolítica encontrada en el jugo gástrico de las
langostas queladas (Figuras 9 y 10), dichas clases de proteinasas podrían estar actuando
en una cascada proteolítica de manera parecida a la descrita en otros invertebrados
(Williamson et al., 2004; Delcroix et al., 2006).
Como se mencionó anteriormente, las proteinasas aspárticas que participan en los
sistemas digestivos de manera extracelular han sido previamente descritas en varios
organismos eucariotas cuyo común denominador es la hematofagia, entre los que se
incluyen a los protozoarios (Goldberg et al., 1991), nematodos (Williamson et al., 2003),
81
platelmintos (Brindley et al., 2001) y artrópodos (Sojka et al., 2008), sin embargo también
se han descrito algunas aspártico proteinasas participando en la digestión en un limitado
número de artrópodos (Matsumoto et al., 2009; Padilha et al., 2009) incluyendo
crustáceos (Navarrete del Toro et al., 2006; Rojo et al., 2010); sin embargo, esta clase de
proteinasas solo ha sido encontrada en langostas queladas, a pesar de que existe vasta
información acerca del sistema digestivo de los crustáceos, y hasta la fecha las
propiedades catalíticas y la función biológica de las proteinasas aspárticas de los
crustáceos no había sido investigada.
Por otro lado, en una comparación de los resultados del presente trabajo con los
reportados por Celis‐Guerrero (2004) para la langosta roja, se observan diferencias
importantes, a pesar de que la langosta roja es considerada como equivalente ecológico
de las langostas queladas pues cubren el mismo nicho ecológico ya que su ciclo de vida y
hábitos son similares, pues entre otras cosas, ambos grupos de langostas han sido
descritas como carnívoros y oportunistas en sus hábitos alimenticios (2004). Las
principales diferencias residen en: primero, en los zimogramas se observa que las
langostas rojas presentan casi el doble de bandas de actividad que las langostas queladas,
lo que resulta más evidente a pH alcalino (Figura 10); segundo, a pesar de que una de las
proteinasas de actividad de la langosta roja resulta inhibida por pepstatin‐A (de ~28 kDa),
el E‐64 no afecta a ninguna de las proteinasas; y tercero, a diferencia de lo observado en
las langostas queladas, en la langosta roja la mayoría de las bandas de actividad resultaron
inhibidas por el pefabloc indicando ser serino proteinasas. Estas diferencias podrían ser
explicadas desde puntos de vista taxonómico y ecológico, pues las langostas rojas y
82
queladas pertenecen a subórdenes diferentes (Achelata y Astacidea, respectivamente), y a
pesar de que llenan el mismo nicho ecológico éstas especies viven a diferentes altitudes
(Celis‐Guerrero et al., 2004; Johnston et al., 2004), donde la temperatura del agua es la
diferencia más conspicua. Un estudio de las características bioquímicas de la aspártico
proteinasa encontrada en la langosta roja podría resultar útil para abundar en este tema.
La catepsina D1 es estructuralmente distinta a otras catepsinas D. La determinación de la
masa molecular por la técnica SDS‐PAGE mostró que la masa de la catepsina D1 de la
langosta americana es similar a la de otras proteinasas aspárticas de mamíferos e
invertebrados (masa molecular de cerca de 40 kDa) (Thornton et al., 1994), pero muestra
algunas diferencias, por ejemplo, en vertebrados, la catepsina D activa es una molécula
dipeptídica (Yonezawa et al., 1988) en donde la forma madura está compuesta por una
cadena pesada (31 kDa) y una ligera (14 kDa) que son distinguibles en una SDS‐PAGE
(Fusek et al., 1992), se presume que estos dímeros se encuentran unidos por un enlace
disulfuro (Partanen et al., 2003). Aunque a primera vista el patrón de migración de la
catepsina D1 de la langosta americana parece confuso, pues se observan dos bandas de
proteína, lo que hace parecer que el aislamiento no se llevó a cabo hasta homogeneidad;
en un análisis más profundo se observó que, en PAGE semi‐nativa esta enzima tiene una
masa molecular aparente de ~34 kDa y muestra actividad proteinolítica (Figura 15a, carril
1 y 1*), y bajo condiciones reductoras (SDS+calor y SDS+DTT+calor) esta banda modifica su
migración a una masa molecular aparente de ~48 kDa y pierde su actividad proteinolítica
probablemente debido al rompimiento de los enlaces disulfuro causando así una
modificación de la molécula que provoca que los sitios activos estén demasiado separados
83
para que las enzimas sean funcionales (Figura 15a, carriles 3, 5, 3* y 5*). Si en una SDS‐
PAGE el buffer de carga tiene una mayor concentración de SDS se observan las dos
conformaciones de esta enzima, en su forma nativa y en su forma desnaturalizada. Estos
resultados nos llevaron a la conclusión de que, a diferencia de las catepsinas D de
vertebrados, la catepsina D1 digestiva de la langosta americana es una enzima
monomérica sin cadenas pesada y ligera, abundaremos más sobre esto en la segunda
parte de esta sección. Las catepsinas D monoméricas parecen ser características de los
invertebrados (Cho y Raikhel, 1992; Harrop et al., 1996; Boldbaatar et al., 2006).
El plegamiento, y por ende la función de una proteína es el resultado de un delicado
balance entre las interacciones internas de la proteína y su ambiente. Cuando el ambiente
es caotrópico (por presencia de calor, presión, ácido, álcali o agentes caotrópicos), la
proteína cambia su conformación y la actividad se ve afectada (Schiffer y Dötsch, 1996). La
urea ocasiona la pérdida de la estructura nativa de las proteínas debido a una intrusión en
la estructura terciaria y consecuente competencia con los puentes de hidrógeno
intramoleculares (Rossky, 2008). En una electroforesis en presencia de urea, las proteínas
migran de acuerdo a su carga neta intrínseca, a pesar del hecho de que se encuentran
desnaturalizadas bajo esa condición (Beynon y Bond, 2001). De esta manera,
esperábamos que la catepsina D1 de la langosta americana mostrara diferencias en el
patrón de migración cuando es expuesta a altas concentraciones de urea, en la figura 15c
se observa que el desdoblamiento de la proteína ocurre de manera gradual dependiendo
de la concentración de urea, ya que aparentemente la catepsina D1 migra más
rápidamente en urea 2 M que en urea 4 y 8 M. A diferencia de la catepsina D bovina, la
84
catepsina D1 de la langosta americana pierde rápidamente su actividad en presencia de
urea pues en un zimograma con urea 2 M no se revelan bandas de actividad; mientras que
la catepsina D bovina, aunque disminuida, mantiene actividad proteinolítica en urea 2 y 4
M. Un alto grado de desnaturalización en presencia de urea se ha relacionado con la
susceptibilidad a la pérdida de conformación en la estructura secundaria de enzimas de
microorganismos de ambientes fríos (Feller et al., 1994), para las cuales se acepta que han
sufrido cambios que les permiten catalizar la proteinolisis a bajas temperaturas (Feller y
Gerday, 2003). Este tema se tratará más detalladamente en los siguientes párrafos.
Una proteinasa aspártica típica muestra un pH óptimo ácido (Davies, 1990; Simões y Faro,
2004), de acuerdo a esto, las catepsinas D de las langostas queladas podrían ser descritas
como proteinasas aspárticas típicas ya que aparentemente hidrolizan el sustrato sintético
a pH 4.0 (Figura 16) y el proteico (BSA) más eficientemente a pH 3.0 (Figura 20), este
resultado demuestra claramente que la actividad de las catepsinas D cambia si el sustrato
varía, ilustrando la dependencia del pH de la catepsina D de acuerdo al sustrato. Es
probable que esta enzima sea la responsable de la alta actividad proteolítica a pH ácido
del jugo gástrico de la langosta europea descrita originalmente por Navarrete del Toro y
col. (2006). Adicionalmente, en este estudio se demostró que, comparado con la catepsina
D bovina, las catepsinas D de las langostas queladas tienen actividad máxima en rango
más amplio de pHs, cuyas máximas actividades se extienden desde pH 3.5 a 5.0 para la
langosta europea y de 3.5 a 4.0 para la langosta americana (Figura 16).
De la misma manera, se observó que la hidrólisis de BSA por las catepsinas D de langostas
se lleva a cabo a todos los pHs evaluados y además generan más péptidos que la enzima
85
bovina como lo indican las flechas de la figura 20 (c‐e), lo que hace a las catepsinas D de
langostas enzimas más versátiles, sugiriendo una menor especificidad de estas enzimas
que podría favorecer la digestión del alimento, aunque esta explicación parecería ser
satisfactoria aún permanece por ser comprobada experimentalmente. Se ha reportado
una menor especificidad en los sitios de hidrólisis en otras proteinasas lisosomales
descritas como digestivas en invertebrados incluyendo a crustáceos (Brindley et al., 2001;
Williamson et al., 2002; Aoki et al., 2004; Ranjit et al., 2009), por lo que, es tentador
sugerir que esto podría tratarse de una adaptación fisiológica relacionada con la digestión
gástrica, como se ha observado en invertebrados hematófagos.
Los resultados descritos en los párrafos anteriores se complementan con los resultados de
termoestabilidad de las enzimas evaluadas. La estabilidad a la temperatura de las tres
catepsinas D estudiadas aquí se resume en la Figura 17. Las determinaciones de
termoestabilidad indican que en las catepsinas D de las langostas queladas, la actividad
proteinolítica se ve afectada a temperaturas moderadas (50 °C). A mayores temperaturas
(60 °C) las enzimas de las langostas se desnaturalizan rápidamente y como consecuencia
pierden la actividad en pocos minutos.
En una revisión acerca de las características de las enzimas con adaptaciones para
catalizar a bajas temperaturas de Gerday y col. (2000), se describieron tres criterios
importantes para tipificar de manera general a dichas enzimas, uno de ellos está
relacionado con la alta flexibilidad de estas moléculas, lo que en teoría permite una mayor
complementariedad con el sustrato a un menor costo energético, lo que le confiere a
estas enzimas una alta actividad específica; pero una alta flexibilidad está generalmente
86
acompañada de una baja estabilidad en la estructura de estas proteínas, los autores
sostienen que, debido a que todas las enzimas de los organismos con adaptaciones para
vivir en ambientes fríos descritas hasta ese momento muestran una termo estabilidad
considerablemente menor que las contrapartes homeotermas, esta característica puede
estar relacionada con una estabilidad estructural limitada, aunque en general existe poca
evidencia experimental. Nuestros resultados apuntan hacia esta explicación.
Todavía no se ha demostrado que exista una relación directa entre estabilidad, flexibilidad
molecular y afinidad por el sustrato pero es muy factible que estas características estén
relacionadas, además de la estabilidad, en el presente trabajo, también se estudiaron
algunas de las características catalíticas de la catepsina D1 digestiva de las langostas
queladas. Ya que, hasta ahora, la mayoría de los reportes de las enzimas de organismos
adaptados al frío muestran modificaciones estructurales que podrían permitir que las
reacciones catalíticas se lleven a cabo a bajas temperaturas (Feller y Gerday, 1997). Aquí
determinamos los parámetros cinéticos en experimentos realizados a bajas temperaturas
para las catepsinas D de las langostas queladas y de manera comparativa hicimos el
análisis en paralelo con la catepsina D bovina, que es considerada el homólogo
endotermo. Encontramos que a 25 °C la afinidad por el sustrato fluorogénico de las
proteinasas de las langostas es similar al determinado para la catepsina D bovina. Sin
embargo, a menores temperaturas se observaron diferencias notables entre las enzimas
de las langostas y la bovina, pues los valores de KM a bajas temperaturas son
significativamente menores para las langostas, indicando que las catepsinas D de
langostas tienen una mayor afinidad por el sustrato a bajas temperaturas respecto a la
87
catepsina D bovina (Figura 19 a). Se sabe que el valor de la KM es dependiente de la
temperatura y se han descrito 5 tipos de correlaciones entre estas dos variables (Simpson
y Haard, 1987), respecto a esta clasificación, las langostas muestran una respuesta en el
valor de KM tipo 2, en la cual el valor permanece relativamente constante a diferentes
temperaturas, esta tendencia coincide con lo observado en enzimas digestivas de otras
especies de organismos acuáticos que habitan aguas frías (Hofer et al., 1975). Nuestros
resultados muestran que, a diferencia de la catepsina D bovina, la afinidad por el sustrato
fluorogénico de las catepsinas D de las langostas es independiente de la temperatura, lo
que podría sugerir que están enzimas están modificadas para digerir el alimento de
manera eficiente en las condiciones ambientales en que se encuentran, en donde la baja
temperatura podría ser un factor poco favorecedor para la digestión extracelular, este
tipo de modificaciones son consideradas adaptaciones enzimáticas y se han observado en
los organismos ectotermos que viven a bajas temperaturas, en los cuales dichas
modificaciones les han conferido la facultad de contrarrestar las condiciones ambientales
(Feller y Gerday, 2003; Mukhin et al., 2007).
El valor de la KM es un buen indicador de la afinidad de una enzima por un sustrato en
particular, pero el valor de la eficiencia catalítica (kcat /KM) es considerado un mejor
indicador cuando se tratan de explicar los posibles cambios a nivel catalítico de las
enzimas digestivas, pues se considera la tasa de reacción cuando se intenta explicar a la
función catalítica con respecto a la actividad a cierta temperatura (Feller y Gerday, 1997),
por lo que un incremento en la relación kcat /KM podría constituir una estrategia útil para
88
evaluar a las enzimas y su actividad a bajas temperaturas como posible consecuencia de
una adaptación al frío (Zecchinon et al., 2001).
Las posibles adaptaciones fisiológicas y bioquímicas de los organismos distribuidos en
ambientes de bajas temperaturas podrían ser muy complejas y por lo tanto difíciles de
elucidar, pero se sabe que las enzimas de dichas especies muestran una alta actividad y
eficiencia catalítica (kcat/KM) a bajas temperaturas comparada con enzimas homólogas de
especies de ambientes templados (Gerday et al., 2000; Carginale et al., 2004), esta
propiedad les permite llevar a cabo las funciones fisiológicas de manera eficiente; por
ejemplo, en la tripsina de peces y la catepsina L de camarones que viven a bajas
temperaturas se ha observado un incremento en la flexibilidad y con ello la afinidad por el
sustrato (Leiros et al., 2000; Aoki et al., 2004).
Generalmente, las enzimas de organismos ectotermos adaptados al frío muestran una
mayor eficiencia catalítica que sus homólogos endotermos dentro de un rango de
temperatura de los 0 a los 30 °C (Feller et al., 1996), bajo esta premisa, las catepsinas D de
las langostas podrían ser consideradas enzimas con modificaciones que les permiten
catalizar a bajas temperaturas, pues tienen valores de kcat/KM mayores que los de la
catepsina D bovina en un rango de temperatura de 4 a 25 °C (Figura 19 b).
Adicionalmente, se observó que el valor de la eficiencia catalítica (kcat /KM) de las
catepsinas D de langostas a temperaturas cercanas a las fisiológicas de estas especies (4 y
10 °C) son notablemente mayores que el valor correspondiente a la enzima pancreática
bovina trabajando a mayor temperatura (25 °C). Para que una enzima pueda ser activa a
bajas temperaturas, tendría que incrementar la capacidad de unirse al sustrato y catalizar
89
la reacción a dichas temperaturas, y a las enzimas de organismos adaptados al frío se les
ha atribuido esta capacidad, que ha sido explicada a través de una supuesta mayor
flexibilidad en las estructuras de dichas enzimas, que podría presentarse en los sitios
activos o en toda la proteína, lo que les permite tener cambios conformacionales
favorecedores de altas tasas de reacción (Somero, 1975; Feller et al., 1994; Feller y
Gerday, 1997; Feller y Gerday, 2003). Los análisis de la secuencia deducida de aminoácidos
de la catepsina D1 que serán descritos en la siguiente sección apuntan a una explicación
de ésta naturaleza, aunque como se mencionó antes, para las catepsinas D de langostas
esta conexión todavía deber ser comprobada a través de estudios experimentales
(Lonhienne et al., 2000).
Por otro lado, algunos autores afirman que las enzimas digestivas de los organismos
adaptados a bajas temperaturas son sujetos de selección pues tendrían que llevar a cabo
el proceso de digestión a una tasa similar que sus homólogos endotermos (D'Amico et al.,
2002; Feller y Gerday, 2003), este escenario ha sido descrito para enzimas digestivas de
otros crustáceos (Gudmundsdóttir, 2005) incluyendo a la langosta americana, especie en
que han sido estudiadas las enzimas digestivas de la clase cisteíno y se describieron las
propiedades bioquímicas que han dado evidencias de que éstas enzimas están tienen
modificaciones que les permiten trabajar a bajas temperaturas, pues los autores
encontraron que de los 10 a los 60 °C parece no haber un efecto de la temperatura en la
eficiencia catalítica (kcat/KM) de las cisteíno proteinasas digestivas de la langosta americana
(Laycock et al., 1989). A partir de estos y de nuestros resultados, es posible proponer que
el frío puede ser una importante presión de selección que ha ocasionado la poco común
90
dominancia de cisteíno y aspártico proteinasas sobre las serino proteinasas en estas
especies.
Las catepsinas D de las langostas queladas mostraron una mayor eficiencia catalítica y
capacidad de catalizar a bajas temperaturas comparada con la catepsina D bovina, este
efecto fue planteado en la hipótesis de este trabajo; los resultados obtenidos resultan
interesantes, pues la catepsina D1 de las langostas queladas son candidatos potenciales
para uso en la industria, ya que las enzimas de organismos adaptados a ambientes fríos
tienen generalmente una mayor demanda para usos en procesos enzimáticos que las de
sus homólogos endotermos (Gudmundsdóttir y Pálsdóttir, 2005).
Las características moleculares de la catepsina D1 de las langostas queladas
Una de las peculiaridades de las langostas queladas es que viven en ambientes marinos
donde la temperatura varía ente los 0 y 25 °C (Cobb y Phillips, 1980; Crossin et al., 1998).
Como ectotermos, su temperatura corporal presenta variaciones que oscilan cerca de 1 °C
con la temperatura del ambiente en donde se distribuyen (Somero, 1969), lo que implica
que sus funciones fisiológicas se llevan a cabo a bajas temperaturas, sin excluir a las
enzimas digestivas (Smalås et al., 1994; Carginale et al., 2004). Así, los organismos que
viven en estas condiciones ambientales presentan adaptaciones enzimáticas variadas, por
ejemplo, 1) incrementos en la concentración de las enzimas presentes en el sistema, 2)
modificaciones el tipo de enzimas presentes y 3) modificaciones en las enzimas
preexistentes (Somero, 1975; Hochachka y Somero, 1984). De este mode, se han descrito
cambios en la estabilidad y la flexibilidad de las moléculas que permiten mantener las
91
funciones metabólicas a bajas temperaturas (Feller y Gerday, 2003). El hecho de que, a
diferencia de la mayoría de los crustáceos, en el sistema digestivo de las langostas
queladas se encuentren proteinasas de la clase cisteíno y aspártico, mismas que son
presentan una alta eficiencia catalítica a bajas temperaturas así como baja estabilidad a
temperaturas moderadas (50 y 60 °C) y en presencia de agentes caotrópicos como la urea,
indican que la catepsina D1 (como se discutió en la sección anterior) de las langostas
queladas presentan adaptaciones que le confieren al organismo algún tipo de ventaja
selectiva.
Sin embargo, la capacidad de catalizar a bajas temperaturas por medio de una
modificación enzimática, debería ser el resultado de alteraciones en la estructura de las
enzimas, y ya que la estructura primaria determina la distribución de posibles estructuras
secundarias y terciarias, es importante conocer la secuencia de los aminoácidos que
constituyen a dichas enzimas, a partir de la cual se pueden hacer inferencias sobre
estructuras a otros niveles e incluso sobre aspectos evolutivos y funcionales por medio de
comparación con estructuras conocidas.
En este trabajo se ha demostrado que existen, al menos dos transcritos diferentes de
catepsinas D en las langostas queladas, el transcrito de la catepsina D2 está presente en
todos los tejidos examinados, lo que sugiere una actividad como enzima lisosomal
homóloga a la de mamíferos; mientras que el transcrito de la catepsina D1 está restringido
a la glándula digestiva, por lo que los genes que codifican estas enzimas (catepsina D1 y
catepsina D2) son entonces parálogos, y por definición los genes parálogos resultan de
una duplicación genética (Koonin, 2005). Se reconoce a la duplicación genética como uno
92
de los principales eventos de evolución genómica, y se acepta que este proceso puede
resultar en innovaciones funcionales, generalmente a través de la apropiación de
características secundarias pre‐existentes (Conant y Wolfe, 2008). La paralogía de
proteinasas aspárticas es un fenómeno que ha sido descrito en diferentes grupos de
organismos, principalmente en mamíferos (Huang et al., 1979; Holm et al., 1984; Muto y
Tani, 1985; Kageyama, 2000), pero también en peces (Borrelli et al., 2006; Brier et al.,
2007; Klomklao et al., 2007) e invertebrados (Mello et al., 2009; Padilha et al., 2009), por
lo que no sería desatinado deducir que un proceso de duplicación genética, fijación y
optimización dio lugar a la aparición de una aspártico proteinasa en el sistema digestivo
de las langostas queladas. Ya que la catepsina D1 muestra características estructurales
únicas (como será descrito posteriormente) que parecen favorecer la catálisis a bajas
temperaturas y que no existen evidencias de la existencia de enzimas homologas en el
sistema digestivo de otros crustáceos, se sugiere que en el sistema digestivo extracelular
de las langostas europea y americana pudieron haberse incorporado proteinasas
lisosomales vía duplicación genética, que subsecuentemente han sufrido mutaciones y se
han fijado en la población debido a una presión de selección. Así, esta nueva característica
genómica le ha permitido a las langostas queladas una digestión de alimento más eficiente
en las condiciones ambientales en las que se distribuyen estas especies.
Los resultados encontrados aquí demuestran que, de la misma manera que las aspártico
proteinasas lisosomales de mamíferos, la catepsina D1 de las langostas queladas es
sintetizada como zimógeno, con un péptido señal de la mitad del tamaño (17 residuos de
aminoácidos) que la catepsina D de mamíferos (con ~40 residuos), pero es similar en
93
tamaño a las aspártico proteinasas digestivas encontradas en otros artrópodos, 20‐23
residuos de aminoácidos (Boldbaatar et al., 2006). Estos zimógenos deben sufrir un
proceso de activación para producir una enzima activa, se sabe que el proceso de
activación de la catepsina D de mamíferos ocurre auto‐catalíticamente al contacto con el
pH ácido de los lisosomas o por acción de otra enzima lisosomal como la catepsina L
(Kageyama, 2002). El mecanismo de activación de las proteinasas aspárticas presentes en
el jugo gástrico de las langostas queladas es aún desconocido, pero dado que el jugo
gástrico de estas langostas es ácido, pH 4.7, y también contiene cisteíno proteinasas, la
activación de las aspártico proteinasas puede ocurrir de manera autocatalítica y/o
asistida, de manera similar a la procatepsina D lisosomal de mamíferos (Tang y Wong,
1987).
Estructuralmente, la catepsina D1 de las langostas americana y europea es similar a otras
proteinasas aspárticas de la familia de las catepsinas D, excepto por tres características
importantes:
• Primero, las catepsinas D de mamíferos tienen dos sitios de glicosilación
correspondientes a los residuos de Asn 67 y 182 de la catepsina D porcina (Nakao et al.,
1984; Faust et al., 1985). Los oligosacáridos asociados a la catepsina D presentan en la
parte terminal un marcador de manosa‐6‐fosfato (M6P) y es el sitio de reconocimiento de
dos receptores que transportan a la procatepsina D a los lisosomas (Fusek y Větvička,
2005). De acuerdo con el modelo estructural de la procatepsina D1 de la langosta
americana, la molécula tiene dos sitios potenciales de glicosilación en las posiciones Asn‐
130 y Asn‐226, que son homólogos a las posiciones Asn‐70 y Asn‐199 de la catepsina D
94
humana (Faust et al., 1985) y a las posiciones Asn‐67 y Asn‐182 de la catepsina D porcina
(Yonezawa et al., 1988). Este resultado sugiere que las catepsinas D1 de las langostas
queladas tienen además una función intracelular, ya que podría contener las señales para
ser transportadas a los lisosomas vía glicosilación.
• Segundo, en los vertebrados, las catepsinas D activas son generadas después de
dos modificaciones postraduccionales; la primera es la remoción del pro‐péptido señal y la
segunda es la hidrólisis de dos residuos de serina en la posición correspondiente a la
estructura llamada β‐hairpin, formando de esta manera una enzima de cadena dipéptidica
(Yonezawa et al., 1988). La catepsina D1 de las langostas queladas tiene la secuencia del
pro‐péptido señal, pero no tiene la secuencia correspondiente al lazo β‐hairpin, siendo
una molécula monomérica, lo que parece ser una característica común de las catepsinas D
de invertebrados (Cho y Raikhel, 1992; Harrop et al., 1996; Boldbaatar et al., 2006) (ver
figuras 23), esto sugiere un mecanismo alternativo de procesamiento postraduccional aun
no descrito.
• Tercero, estudios de cristalografía de catepsinas D han hecho posible la descripción
detallada de las estructuras que componen a las proteinasas aspárticas. Se sabe que en las
proteinasas aspárticas dos estructuras tipo “rizo” se cierran sobre la hendidura del sitio de
unión al sustrato, una de estas estructuras es conocida como “polyproline loop” (llamada
así por que presenta tres residuos de prolina contiguos) y se encuentra solamente en
reninas y catepsinas D. La segunda estructura es conocida como “Y75 flap” (Y75 connota a
la tirosina de la posición 75 de la pepsina porcina que corresponde al residuo tirosina 174
95
de la langosta), la cual es flexible (Fusek et al., 1992), estas dos estructuras están
involucradas en la unión con el sustrato, pues la amplitud de la fisura del sitio activo
depende de estos dominios, y se presume que la unión del sustrato a la cavidad está
directamente afectada por el movimiento de estos dominios y por la conformación de los
rizos que cubren la hendidura (Metcalf y Fusek, 1993). Aunque la secuencia de las
catepsinas D de las langostas queladas es mas similar a catepsinas D que a otras aspártico
proteinasas, esta enzima muestra características únicas, la simulación del modelo
estructural de esta enzima a partir de estructurales previamente descritas muestra que, la
catepsina D1 tiene una estructura tipo “rizo” en la posición homóloga del “polyproline
loop” pero carece de los tres residuos de prolina característicos de las catepsinas D
intracelulares. La ausencia de residuos de prolina en esta estructura podría tener efectos
sobre la especificidad del sitio de unión al sustrato y en general en toda la molécula
(Guruprasad et al., 1995). La ausencia del “polyproline loop” ha sido reportada
previamente para catepsinas D de otros artrópodos y ha sido asociada con el papel en la
digestión extracelular de las catepsinas y también de las pepsinas (Pinho et al., 2009), esta
evidencia fue confirmada por el análisis de alineamiento y comparación de secuencias de
proteinasas aspárticas digestivas y no digestivas de la figura 23, en este análisis se
demostró que en general estas aspártico proteinasas tienen características conservadas
como los residuos de aminoácidos que rodean el sitio activo, pero la mayoría de las
proteinasas con función digestiva carecen del “polyproline loop” como se evidencia en
dicha figura.
96
Adicionalmente en el cladograma realizado, la mayoría de las proteinasas digestivas,
forman un grupo separado de las enzimas no digestivas. Con este análisis se agrupó a las
aspártico proteinasas digestivas de una manera muy evidente, por lo que se podría sugerir
que dichas enzimas tienen características especializadas para cumplir con su función.
Comparativamente, la otra secuencia de aspártico proteinasa de la langosta americana, la
catepsina D2, tiene los residuos de aminoácidos correspondientes al “polyproline loop”
típico de las enzimas aspárticas intracelulares, el hecho de que el mRNA de esta enzima se
encuentra en tejidos no digestivos refuerza esta noción.
Como se discutió en párrafos anteriores, la ausencia de residuos de prolina en sitios
relacionados con el reconocimiento del sustrato es una característica común en aspártico
proteinasas digestivas, adicionalmente la disminución del número de residuos de prolinas
en las estructuras de las enzimas de organismos que se distribuyen en aguas frías, se ha
descrito como una estrategia adaptativa de éstos, pues, los residuos de prolina confieren
una conformación estéricamente restringida en capacidad de rotación, comparados con
otros aminoácidos. La ausencia de prolina en estructuras relacionadas con la unión a los
sustratos podría permitir que el centro catalítico de las enzimas sea más móvil o flexible
(Feller y Gerday, 2003) y como consecuencia afectar a la especificidad de una enzima
como se ha sugerido para otras proteinasas aspárticas (Guruprasad et al., 1995), ésta es
una característica casi ubicua de las enzimas de organismos distribuidos en ambientes
fríos (Feller y Gerday, 1997), probablemente, adaptativamente esto les ha permitido llevar
a cabo la proteólisis de manera eficiente a temperaturas por debajo de sus homólogos
97
endotermos (Feller y Gerday, 2003), por lo que la caracterización y la elucidación de los
procesos adaptativos seguidos por estas enzimas es de especial interés.
Se sabe que en los crustáceos el ayuno ocasiona respuestas biológicas como cambios en la
composición bioquímica del sistema digestivo (Sánchez‐Paz et al., 2003; Sánchez‐Paz et
al., 2006). Considerando este principio, las muestras obtenidas en el bioensayo fueron
analizadas para determinar si el ayuno y la alimentación causan cambios significativos en
la concentración del mRNA de catepsina D1 y de catepsina L en el hepatopáncreas de las
langostas americana y europea. Para la langosta americana se observó que ni el mRNA de
la catepsina D1, ni el de catepsina L variaron a lo largo del ayuno, pero la realimentación
causó un incremento de 2.5 veces en la concentración del mRNA de catepsina D1 y de 3.3
veces en el mRNA de la catepsina L. Este aumento puede ser explicado como una
respuesta a la “necesidad” de digerir la proteína proveniente del último alimento ingerido
durante el primer día del bioensayo, estos resultados coinciden con lo encontrado en
genes de aspártico proteinasas de la trucha arcoíris y la lubina (Salem et al., 2007; Terova
et al., 2007).
Sin embargo, los datos obtenidos para las langostas europeas mostraron un
comportamiento opuesto, con un decremento en la concentración del mRNA de la
catepsina D1 al día 15 de ayuno, sin cambio por realimentación, lo que a su vez concuerda
con lo observado en el mRNA de las proteinasas digestivas del camarón tigre, en el que
Lehnert y Johnson (2002) encontraron que la cantidad de el mRNA en las células
individuales, detectada por hibridación in situ parece no ser afectada en periodos de
ayuno seguidos de realimentación.
98
Esta diferencia en el patrón de cambio de la concentración de catepsina D1 y de catepsina
L a lo largo del periodo de ayuno en especies consideradas equivalentes ecológicas, puede
deberse a alguna característica en las adaptaciones bioquímicas para digerir el alimento
en las condiciones ambientales y retos particulares que enfrentan, aunque las
implicaciones biológicas permanecen aun por ser investigadas.
La regulación en la actividad de las proteinasas digestivas puede ser trascripcional, pos‐
transcripcional o postraduccional; Lehnert y Johnson (2002) reportaron que los genes de
enzimas digestivas parecen no estar bajo control transcripcional, ya que, en el camarón
tigre, éstos no son nunca “apagados” por completo. Nuestros resultados mostraron que
en la langosta americana el ayuno y la realimentación causan cambios en las cantidades
de los mRNAs que codifican para enzimas digestivas, lo que sugiere que estos genes
pueden ser inducibles y su regulación es transcripcional, aumentando la síntesis de mRNA
de estas enzimas y activándolas inmediatamente en presencia de alimento para favorecer
la digestión; por otro lado, en la langosta europea la regulación podría ser post‐
traduccional, por ejemplo, manteniendo la síntesis de estas enzimas en un nivel basal
durante el ayuno y almacenando los zimógenos para activarlos después de alimentarse.
Sin embargo, es importante no perder de vista que los cambios en la concentración de
mRNAs pueden o no resultar en cambios fisiológicamente relevantes en las
concentraciones de las enzimas activas (Sánchez‐Paz et al., 2003), y esta es la situación
observada en la catepsina D1 de la langosta americana, existe un cambio en la
concentración del mRNA mensajero (Figura 24) que no está relacionado con el cambio en
la actividad de catepsina D en el jugo gástrico de langostas bajo la misma condición (Figura
99
14), pues no hay cambios significativos en la actividad de catepsina D en el jugo gástrico a
lo largo de un periodo de ayuno, aunque se observa una tendencia opuesta a la
encontrada en el mRNA mensajero de ésta enzima, pues la actividad tiende a aumentar a
lo largo del periodo de ayuno y disminuye después de la alimentación, probablemente
debido a la acumulación de enzima en el jugo gástrico durante el ayuno, seguido de la
utilización de la misma cuando se alimentan, por lo que su actividad se ve mermada en
dicho punto.
Estudios de la ultraestructura de la glándula digestiva de Penaeus semisulcatus revelaron
que la alimentación favorece la diferenciación de las células F y B. Por lo que los cambios
en la concentración del mRNA de enzimas digestivas causados por la alimentación,
también pueden ser debidos a una diferenciación de células F/B, lo que resulta en un
incremento en la concentración del mRNA de enzimas digestivas, debido a la presencia de
un mayor número de células F/B expresando mRNA de éstas enzimas, más que por un
incremento en la concentración de mRNA en las células individuales (Al‐Mohanna y Nott,
1987).
Nuestros resultados aportan información acerca de los transcritos de catepsinas D de las
langostas queladas, indicando que existen dos isoenzimas; la isoenzima catepsina D1,
junto con la catepsina L tienen un papel como enzimas digestivas. Investigaciones
adicionales aportarían evidencias de: a) el sitio de síntesis de la catepsina D1 y la catepsina
L, b) las modificaciones postraduccionales como glicosilación y almacenaje, c) la regulación
de la transcripción y traducción de las catepsinas D y L, d) la evolución de enzimas
proteinolíticas de crustáceos y e) la participación en una cascada digestiva.
100
Conclusiones
• El sistema digestivo de las langostas queladas es de naturaleza única entre los
crustáceos, pues a pH fisiológico actúan exclusivamente enzimas de la clase
cisteíno y aspártico.
• La aspártico proteinasa que aporta de manera importante en la actividad
proteinolítica del jugo gástrico de las langostas queladas en una enzima tipo
catepsina D, que aquí fue designada como catepsina D1, esta molécula se sintetiza
únicamente en el tejido de la glándula digestiva y su forma activa se encuentra en
el jugo gástrico.
• Las características bioquímicas de las catepsinas D1 podrían considerarse como
típicas de las aspártico proteinasas en cuanto al pH al que actúan, sin embargo
estas enzimas muestran características únicas como un amplio rango de actividad
a diferentes pHs, así como poca estabilidad a temperaturas moderadas y en
presencia de agentes caotrópicos, también presentan una elevada eficiencia
catalítica a bajas temperaturas; estas características apuntan a que las catepsinas
D1 tienen modificaciones para su función en la digestión y además podrían
considerarse como enzimas adaptadas a catalizar en los ambientes fríos en los que
se distribuyen las langostas queladas.
• La secuencia deducida de aminoácidos de la catepsina D1 nos permitió compararla
con otras catepsinas digestivas y no digestivas, se encontró que carecen de
101
residuos de prolina en el sitio conocido como “polyproline loop” (uno de los sitios
involucrados en el reconocimiento del sustrato), esta modificación es consistente
entre las enzimas digestivas, que podría favorecer un aumento en la eficiencia
digestiva.
• La carencia de residuos de prolina en las estructuras de enzimas de organismos
que se distribuyen en ambientes fríos es también una característica consistente, la
cual se piensa que reduce la rigidez molecular de estas enzimas facilitando la
interacción con el sustrato y por lo tanto aumentando la eficiencia catalítica de
dichas enzimas, hacia este escenario apuntan los resultados de la presente
investigación.
• El cambio de la concentración del mRNA de la catepsina D1 en las langostas
queladas a lo largo de un periodo de ayuno y subsecuente alimentación confirma
su papel en la digestión de la proteína del alimento.
102
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