propiedades fisiológicas de péptidos y proteínas de … · conceptos claves en la definición de...

Maria Cristina Añon

UNLPUNLP--CONICETCONICET

CIDCACIDCA

CIDCA CONICET - UNLPLa Plata, Argentina

Propiedades fisiológicas de péptidos y proteínas

de amaranto

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Conceptos claves en la definición de un alimento funcional

Ø el concepto de aportar beneficios para la salud es central

Ø la naturaleza del alimento ser o asemejarse a un alimento tradicional

Ø el nivel de función más allá de la función nutricional

Ø el perfil de consumodebe ser parte de la dieta normal

Doyon y Labrecque 2008



Fronteras del universo de los alimentos funcionales

Alimento básico

Alimento enriquecido

Alimento funcional

medicamento

Necesidades básicas

Equilibrio nutricional +

Reducción de riesgo

Cura

Intensidad funcional

Intensidad mínima

Función aumentada

Efecto fisiológico

Doyon y Labrecque 2008



Componentes presentes en alimentos funcionales

Fibra dietética

Azúcares de baja energía

Ácidos grasos insaturados

Fitoesteroles

Vitaminas y minerales

Antioxidantes

Probióticos



Propiedades Nutricionalesmateria y aas esenciales

Propiedades Funcionalesde hidratación, espumantes, emulsificantes, gelificantes,

etc.

Propiedades Biológicasingredientes potenciales que

promueven la salud del consumidor

Proteínas



Actividades biológicas detectadas

opioide

antihipertensiva

antitumoral

antimicrobiana

inmunomoduladora

antioxidante

antitrombótica

unión de metales

πεπτιδια



Características de los péptidos bioactivos

En general poseen entre 3 y 20 aas, con aas característicos

Actúan como moduladores y compuestos regulatorios

Su actividad es función de la composición de aas y de la secuencia

En la base BIOPEP se encuentran registrados 1968 péptidos bioactivos

de distinto origen



Características de algunos tipos de biopéptidos

Antioxidantes Alta cantidad de His y aa hidrofóbicos

Antitrombóticos Ile, Lys, Asp

Hipocolesterolémicos Baja relacion Met/Gly y Lys/Arg alto contenido de aa hidrofóbicos

Antiobesidad y antitumoral Péptidos largos



• Son péptidos derivados de proteínas de la dieta que ejercen un beneficio a nivel fisiológico

independiente de su función nutricional

Péptidos bioactivos



Liberación de péptidos encriptados

Proceso de digestión in vivo

Hidrólisis enzimática in vitro

Acción de microorganismos

Combinación de procedimientos




Combinación de procedimientos




Combinación de procedimientos hidrólisis



Etapas a seguir en el estudio de biopéptidos

Obtención de péptidos

Búsqueda de la actividad biológica Ensayos de simulación e in vitro

Separación y caracterización del o los péptidos responsables de la actividad

Ensayos de actividad in vivoy en humanos



Amaranto

Pseudocereal – familia Amaranthaceae

Autóctono de América Central

Propiedades agronómicas interesantes

Proteínas de almacenamiento

ü 15- 17% contenido total

ü composición de aminoácidos bien balanceada

ü Principales fracciones: albuminas, 11S globulinas, P-globulina and

prolaminas



Actividad Inhibidora de ACE

Actividad antitumoral

Harina de amaranto

Aislados proteicos

Hidrolizados proteicos

Acción de enzimas in vivo o in vitro

Estrategia de experimental



Actividad antihipertensiva



Inhibidores de ACEInhibidores de ACEcaptopril, enalpril,etccaptopril, enalpril,etc..

aumenta la presión por vasoconstricción

afecta la síntesis y liberación de aldosterona

Se previene la degradación de bradiquina que es vasodilatador

REGULACION DE REGULACION DE LA PRESILA PRESIÓÓN N ARTERIALARTERIAL

Sistema ACE

ACEangiotensina I angiotensina II

decapéptido octapéptido



Actividad antihipertensiva

Longitud de péptidos activos : 2-15 aa

Péptidos activos poseen Pro en el C-terminal y residuos hidrofóbicos en el

extremo N-terminalPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com


IC50415 µM - 600 µM

Curva dosis - respuesta



Ensayos in vivo

Modelos de hipertensión utilizados

Ø ratas genéticamente hipertensas SHR

Ø ratas hipertensas renales SHRr

Ø ratas hipertensas por administración de fructuosa SHRf

Administración del hidrolizado en forma intragástrica y medida de presión carotídea directa



Efecto del hidrolizado en ratas

0 1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Pres

ión

med

iaca

rotíd

ea(m

mHg

)

Tiempo (horas)

Hidrolizado de amarantog=kg de rata

Blanco

0.51.0

1.52.4

SHR La presión arterial disminuye de forma dosis-

dependiente. Máximo efecto a 1,5 g/kg de peso.

El efecto persiste hasta 7 horas, luego la

presión retorna a valores normales.



El hidrolizado posee efecto vasodilatador. Actúa como un antogonista no competitivo

Mecanismo de acción

10-6 10-5 10-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

*

Fu

erz

a(g

ram

os

)

Serotonina (moles/litro)

10-6 10-5 10-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

**

*

*

*Fu

er z

a(g

r am

os

)

Serotonina (moles/litro)

1a. Ringer

2a. Ringer

1a. Ringer

2a. Hidrolizado

Músculo liso de aorta + serotonina o sorotonina e hidrolizado de amaranto

Se registra la respuesta

contráctil del músculo



a) Construir un modelo estructural de globulina 11S de A. hypocondriacus

b) Localizar los péptidos potencialmente anti-hipertensivos encriptados en la secuencia de la

globulina 11S y analizar su exposición al solvente

c) Simular la interacción entre los péptidos encriptados en la globulina 11S, que forman parte de la librería armada, y la enzima convertidora de angiotensina

(ACE)

Selección de péptidos antihipertensivos. Aproximación in silico



Modelo estructural de la globulina 11S de amaranto

(A - S-S – B)6Modelo equivalente al de otras proteinas de almacenamiento del tipo

de globulinas 11 S

Vecchi y Añón (2009)PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com


Actividad antihipertensiva potencial y exposición al solvente de péptidos en la

secuencia de la globulina 11S

61% de los péptidos antihipertensivos se encuentran localizados en el corazón de la molécula proteica y presentan mayor actividad que los de la superficie



Localización de los péptidos seleccionados en la superficie de la molécula de

globulina 11S

IKP LEP



Position Sequence log(EC50) ASA465 RP 1,99 0.48

275 IKP 0,63 0.36428 MF 1,65 0.37320 VY 1,46 0.46144 RF 1,73 0.37294 YL 1,68 0.40293 RY 1,49 0.49276 KP 1,09 0.40

43 LEP 0,28 0.33281 AW 1,14 0.44

Péptidos potencialmente antihipertensivos de globulina 11S

expuestos al solvente



10.6

10.7

10.8

10.9

11

11.1

11.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Free

Ene

rgy

(kca

l/mol

)

Frequency

Clustering Histogram for Captopril

Energía libre de formación del complejo ACE-captopril

Constante de inhibición estimada: 6.35 nMEnergía libre de formación del complejo: -11.18 kcal/mol

El modelo funciona!!!Vecchi y Añón (2009)



gi|122726601|gb|ABM66807.1| 11S globulin [Amaranthus hypochondriacus]MAKSTNYFLISCLLFVLFNGCMGEGRFREFQQGNECQIDRLTALEPTNRIQAEAGLTEVWDSNEQEFRCAGVSVIRRTIEPHGLLLPSFTSAPELIYIEQGNGITGMMIPACPQTYESGSQQFQGGEDERIREQGSRKFGMRGDRFQDQHQKIRHLREGDIFAMPAGVFHWAYHNGDHPLVPVILIDTANHANQLDKNFPTRSYLAGKPQQEHSGEHQFSRESRRGERNTGNIFRGFETRLLAESFGVSEEIAQKLQAEQDDRGNIVRVQEGLHVIKPPSRAWEEREQGSRGSRYLPNGVEETICSARLAVNVDDPSKADVYTPEAGRLTTVNSFNLPILRHLRLSAAKGVLYRNAMMAPHYNLNAHNIMYCVRGRGRIQIVNDQGQSVFDEELSRGQLVVVPQNFAIVKQAFEDGFEWVSFKTSENAMFQSLAGRTSAIRSLPIDVVSNIYQISREEAFGLKFNRP

ETTLFRSSGQGEYRRKISIA

KPIKPVIKPHVIKPLHVIKPGLHVIKPEGLHVIKP

EPLEPALEPTALEPLTALEPRLTALEP

Librerías seleccionadas



-10

-5

0

5

10

15

Captopril KP IKP VIKP HVIKP LHVIKP GLHVIKP EGLHVIKP

Free

Ene

rgy o

f Bind

ing (k

cal/m

ol)

Binding Energy of Docked peptides

averagelowest

Energía libre de formación del complejo ACE-péptido

IKPKi ~ 200 nM

61% electrostática39% vdW + p. hid. +

desolvataciónVecchi y Añón (2009)



Inhibición de la Actividad ACE Péptidos sintéticos – Ensayo in vitro

VIKP

ALEP

captopril Por síntesis química

Vecchi y Añón (2009)



Actividad antitumoral



P r o l i f e r a t i o n (U M R 1 0 6 )

0 , 0

2 5 , 0

5 0 , 0

7 5 , 0

1 0 0 , 0

1 2 5 , 0

0 , 0 0 2 , 0 0 4 , 0 0 6 , 0 0 8 , 0 0 1 0 , 0 0 1 2 , 0 0

m g / m l

% B

asal

IA M IS

P r o l i f e r a t i o n (U M R 1 0 6 )

0 , 0

2 5 , 0

5 0 , 0

7 5 , 0

1 0 0 , 0

1 2 5 , 0

0 , 0 0 2 , 0 0 4 , 0 0 6 , 0 0 8 , 0 0 1 0 , 0 0 1 2 , 0 0

m g / m l

% B

asal

IA M IS

Líneas celularesUMR106

(IC50) [mg/ml]

MC3T3-E1(IC50)

[mg/ml]

Caco-2(IC50)

[mg/ml]

TC7(IC50)

[mg/ml]API 1.0 ± 0.05 2.5 ± 0.06 1.5 ± 0.1 2.5 ± 0.08SPI 10.0 ± 0.1 > 25 - -BSA No se produce inhibiciónBBI No se produce inhibición

Inhibición de la proliferación celular

Se detectaron diferentes

sensibilidades de API para las cuatro líneas

celulares

La hidrólisis mejoro el efecto inhibitorio

APIDH30 UMR106

IC50: 0.5 mg/ml

Barrio y Añon (2009)PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com


Cambios en la morfología celular y proteínas del citoesqueleto

UMR106

UMR106 + API 1mg/ml 24h

Las células, luego de la incubación, exhiben núcleos densos rodeados

de una pequeña cantidad de citoplasma

Se observa desorganización parcial de los filamentos de actina y

alteración en la forma celular

Barrio y Añon (2009)PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com


Necrosis

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.5 1 1.5 2 2.5

mg/ml

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.5 1 1.5 2 2.5

mg/ml

Apoptosis

0

100

200

300

0 0,5 1 1,5 2 2,5

mg / ml

% B

asal

0

100

200

300

0 0,5 1 1,5 2 2,5

mg / ml

% B

asal

Luego de 24 h de incubación API aumenta la proporción

de apoptosis de forma dependiente de la dosis

Análisis citométrico LDH – marcador de necrosis

La actividad de LDH aumenta para concentraciones de API

mayores a 0,5mg/ml

Posible mecanismo de muerte celular

API inhibe la adhesión celular de forma dosis dependienteBarrio y Añon (2009)



Producción de péptidos bioactivos Aproximación tecnológica

Caracterización de péptidos bioactivosSeparación y purificación

Determinación de propiedades fisicoquímicas Evaluación de la bioactividad in vitro e in vivo

Hidrólisis química o enzimática in vivoe in vitro

Ingeniería genética – Biopharming

Tecnología de DNA recombinante (péptidos largos)

Preparación de los péptidos



Consideraciones a tener en cuenta para los alimentos funcionales con

biopéptidos

ü Complejidad de la matriz del alimento. Interacción del o los biopéptidos con otros

componentes

ü Efecto de las condiciones de procesamiento

ü Cambios durante el período de vida útil



Algunos ejemplos

tratamiento térmico

Desnaturalización

Desfosforilación, ej. de caseína

Producto fermentado – cambio del contenido de péptidos



Alimento funcional Alimento funcional conteniendo biopconteniendo biopééptidosptidos

Destino de los biopéptidos

digestión

absorción¿es afectado?

transporte

¿llega en la concentración adecuada ?¿un único punto de acción o puntos múltiples?



Desafíos futuros para obtener alimentos funcionales con biopéptidos

Desarrollar alimentos funcionales sin efectos colaterales de los biopéptidos adicionados y retener

su estabilidad durante el período de vida útil

PROBLEMAS A SORTEAR: degradación durante la digestión, mala absorción, baja concentración en sangre o el tejido específico, modificación de actividad por el

procesamiento o interacción con otros ingredientes

Liberación y obtención Efecto

Sitio de acción



Muchas gracias por la atención !!

CIDCA, La Plata, Pcia. [email protected]

UNLPUNLP--CONICETCONICET

CIDCACIDCA

Alejandra QuirogaMarina Fritz

Bruno Vecchi

Gustavo Rinaldi

Daniel Barrio


mailto:[email protected]


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