Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 39, No. 2, 2008.

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Programa para la adquisición y filtrado de datos a partir del Monitor de Bioactividad LKB-2277

Recibido: 26 de junio de 2006. Aceptado: 12 de febrero de 2007.

Palabras clave: microcalorimetría, perfiles calorimétricos, monitor de bioactividad.Key words: microcalorimetry, calorimetric profiles, bioactivity monitor.

Gilberto Tillán Ochoa

Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Avenida 25 y 158 No. 15202, Playa, Apartado Postal 6414, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: gilberto.tillan@cnic.edu.cu Telef: 208-5240 ext. 333, FAX: (537) 208-7358

RESUMEN. Se presenta un sistema de programas desarrollado en lenguaje DELPHI para Windows, que permite la adquisición de datos utilizando la tarjeta multipropósito Advantech PCL-711B conectada al Monitor de Bioactividad LKB-2277. El sistema de programas digitaliza los datos que utiliza en la conformación de los perfiles calorimétricos de las diferentes especies bacterianas y su interacción con diferentes medios de cultivo utilizados para su crecimiento y posibilita el análisis de su actividad biológica en el tiempo. El paquete de programas realiza la adquisición de datos utilizando hasta cuatro canales simultáneamente. Permite programar el tiempo de adquisición, el intervalo de tiempo para salvar los datos adquiridos, establecer los límites superiores e inferiores para la visualización de las curvas microcalorimétricas, la selección de los canales a utilizar en cada corrida. Además, es posible filtrar digitalmente las señales adquiridas en caso que estas sean ruidosas y no permitan un análisis preciso. Si los experimentos realizados resultan de interés, sus datos pueden ser salvados en ficheros, los cuales pueden ser visualizados para su posterior análisis. Utilizando este sistema se han podido determinar los perfiles calorimétricos de cepas estandar de Escheri-chia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. También ha permitido determinar el efecto de dos tipos de PAMAM dendrímeros (-NH2, -OH) G4 en curvas termogénicas del metabolismo asociado al crecimiento de cepas estándar de Escherichia coli. El sistema garantiza el seguimiento térmico continuo del sistema biológico que sea estudiado, lo cual ofrece un medio para la detección de cambios sutiles en el metabolismo.

ABSTRACT. This paper shows a software system developed in Delphi for Windows for data acquisition using a multipurpose acquisition card Advantech PCL-711B connected to the Bioactivity Monitor LKB-2277. The data obtained from the acquisition is used for having the corresponding profiles using microcalorimetry of the different bacterial strains and their interrelation with the different culture media and their biological activity. The acquisition can be performed in four channels simultaneously. The acquisition time period, the time interval for saving the results, the selection of the channels, the top and the bottom limits for the graphic panel and the digital filtering of the signals can be programmed. It is also possible to show the curves of previous saved data. Using this software it was possible to obtain the calorimetric profiles of different pattern bacterial strains as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. In the present work an LKB-2277 Bioactivity Monitor was used to determine the effect of PAMAM dendrimers (-NH2, -OH) G4 on thermogenic curves of the growth metabolism of Escherichia coli.

INTRODUCCIÓN

La Calorimetría es una técnica experimental en la que, mediante un sensor térmico, se detecta direc-tamente el flujo de calor o, íntimamente relacionado con éste, el gradiente de temperatura de un sistema, respecto a un foco calorífico o fuente térmica, cuando en el primero tiene lugar un proceso físico químico de naturaleza endo o exotérmica.1

La Calorimetría es una magnífica herramienta para el seguimiento y control de la fermentación microbio-lógica, ya que el crecimiento celular siempre va acom-pañado de la producción de calor y las mediciones se pueden realizar continuamente en línea sin introducir ninguna alteración al medio de cultivo. La cantidad de calor que se disipa en un cultivo es igual a la suma de

los cambios de entalpía de todas las reacciones metabó-licas. En otras palabras, el índice de producción de calor es estoicométricamente correlacionado con el índice de consumo del substrato y la formación de producto, incluyendo biomasa.2

Cuando se pone en juego una cantidad de calor tan pequeña que se precisa un calorímetro de gran sensibi-lidad y precisión, se está en presencia de los llamados microcalorímetros. El término Microcalorimetría Bio-lógica suele usarse para designar las aplicaciones de la calorimetría a sistemas de interés biológico. Engloba un amplio conjunto de técnicas calorimétricas diseñadas para propósitos específicos.

La microcalorimetría es la calorimetría para mues-tras pequeñas, es decir, a nivel de los microgramos o en

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ese entorno. Ofrece un medio para revelar fenómenos metabólicos poco conocidos en cultivos bacterianos en crecimiento. Los procesos metabólicos en general están acompañados por la generación de calor, magnitud pre-cisa que puede ser de considerable importancia práctica y teórica. Tales medidas pueden dar información valiosa en cuanto a la estabilidad y estructura de las moléculas involucradas en aquellos. Así, evaluando la producción de calor con calorímetros suficientemente sensibles es posi-ble estudiar procesos metabólicos en las células vivas.

Desde años recientes, la calorimetría biológica tomó cada vez mayor importancia. La microcalorimetría ha de-mostrado su gran poder como un instrumento universal, integral, no destructivo y de gran sensibilidad para la obtención de información termodinámica y para estu-dios fundamentales en el metabolismo del crecimiento de las células y los microorganismos. De esta manera, el metabolismo en células vivas y en microorganismos puede ser estudiado mediante la evaluación de los efec-tos calorimétricos respectivos con microcalorímetros de gran sensibilidad.3

Teniendo en cuenta la importancia de los sistemas de microcalorimetría en el estudio del metabolismo del crecimiento de los microorganismos, se realizó el diseño y la elaboración de un sistema de programas que per-mitiera la adquisición confiable y en tiempo real de las curvas calorimétricas de diferentes microorganismos para el estudio de su crecimiento utilizando diferentes medios de cultivo.

El sistema de programas diseñado para la adquisi-ción, filtraje y almacenamiento de los datos de los experi-mentos realizados utilizando el Monitor de Bioactividad LKB-2277, ha permitido potenciar su funcionamiento y garantiza la visualización en tiempo real de los datos que están siendo adquiridos, así como su procesamiento posterior, al ser almacenados en archivos digitales. Estos pueden ser procesados con otros sistemas estadísticos, y pueden ser mostrados con el propio sistema cada vez que sea necesario.

MATERIALES Y MÉTODOS

El sistema de programas para la adquisición y filtra-do de datos generados por el monitor de bioactividad LKB-22774 fue desarrollado en Delphi sobre Windows.5

Interactúa con una tarjeta multipropósito de adquisición de datos PCL-711B, que dadas sus características de precisión y bajo ruido permite la adquisición de aquellos de hasta cuatro canales. La tarjeta se conecta a la com-putadora utilizando el bus ISA. Tiene una resolución de conversión A/D de 12 bits y acepta hasta ocho entradas analógicas simples.6 Los datos que se adquieren corres-ponden a cultivos de microorganismos bajo diferentes condiciones de crecimiento y permite el análisis de su actividad biológica.

Los algoritmos desarrollados garantizan la adquisi-ción de los datos en tiempo real y la graficación simul-tánea de los mismos generados por los cuatro canales. El programa realiza automáticamente la evaluación inicial del sistema durante el proceso de encendido, garantizando un funcionamiento correcto durante el proceso de adquisición de los datos correspondientes a cada canal.

El control de la unidad electrónica de medición posi-bilita lograr un incremento significativo de la estabilidad de todos los parámetros electrónicos de funcionamiento y permite realizar su control aplicando técnicas compu-tadorizadas de control automático de lazo cerrado.

El paquete de programas permite fijar los parámetros siguientes: tiempo de adquisición, intervalo de tiempo para la salva de datos, los límites superiores e inferiores para la visualización de las curvas microcalorimétricas,

los canales a utilizar en cada corrida, filtraje digital de las señales adquiridas en caso de que estas sean ruido-sas y no permitan un análisis preciso de ellas. También permite visualizar los ficheros salvados previamente cuando no se esté ejecutando una corrida en tiempo real del monitor de bioactividad.

Para el filtrado de los datos se utilizan los promedios móviles, que conforman un filtro pasabajos utilizado comúnmente para el suavizamiento y la disminución del ruido de una serie de datos adquiridos digitalmen-te. Se aplica utilizando una vecindad de un tamaño determinado (en el caso bajo estudio 15) que se mueve a lo largo de la serie de datos, un elemento a la vez. El elemento del medio de la vecindad (en este caso el 8) es reemplazado por el promedio de todos los contenidos en ella. Es necesario salvar el valor de los nuevos ele-mentos y no realizar la sustitución hasta que todos los de la vecindad no hayan sido promediados. Todos los promedios deben realizarse sobre la base de los datos originales de la serie.7

En esta aplicación no se aplica la promediación al principio y al final de la serie de datos para ahorrar código de programación y tiempo de ejecución, por lo que los siete elementos inciales y finales de la serie se mantienen inalterables al completarse el proceso de fil-trado. Esto no introduce ningún tipo de alteraciones en el resultado final del procesamiento de los datos.8

Los filtros de promedios móviles son los más co-munes en el procesamiento digital de señales, siendo óptimos para la reducción del ruido aleatorio sin alterar la señal adquirida.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El sistema de programas fue diseñado teniendo en cuenta un conjunto de opciones que garantizaran su fácil utilización. Estas opciones permiten fijar las condiciones iniciales de medición para la realización de los experi-mentos, la modificación de algunos de estos parámetros, el filtrado de las señales adquiridas, la generación de fi-cheros con los datos adquiridos, así como la visualización de la información que se encuentra almacenada.

Durante la ejecución del experimento el programa muestra en su pantalla principal un conjunto de indi-cadores importantes para el seguimiento de la corrida calorimétrica. El usuario puede ubicar el cursor en una determinada posición dentro del gráfico y el sistema le presenta, para ese punto, el valor del tiempo transcurrido (en segundos) a partir del comienzo de la adquisición, el nivel de voltaje y el número de la muestra.

El sistema permite adquirir a la vez, la información de los cuatro canales del microcalorímetro. Por tanto, en el extremo inferior del panel de graficación, se ofrece in-formación sobre la asociación de los colores de las curvas graficadas con los canales correspondientes.

Entre las opciones del programa se encuentra Inicio (Fig. 1), que permite seleccionar diferentes datos de entrada y de inicio de la corrida calorimétrica. Entre estos datos se encuentran el tiempo de muestreo, para establecer cada qué período se realiza la adquisición de los datos; el intervalo de salva de datos, que permite fijar cada qué período se salvarán en disco los datos adquiri-dos y los canales a utilizar en la corrida actual.

Una vez fijados esos elementos, se pueden seleccio-nar los nombres de los ficheros que contendrán los datos correspondientes a cada canal de adquisición, o abortar la operación y regresar a la pantalla principal. Los datos se visualizan en la medida que van siendo adquiridos.

Los datos son adquiridos durante el tiempo que el usuario determine y esta adquisición finaliza cuando se oprima la tecla Parar adquisición. Esta opción solo está habilitada en el caso que el sistema se encuentre en el

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modo de adquisición en tiempo real y permite detener la adquisición de datos en ese momento, guardando en el disco duro los datos que no se habían salvado todavía por no haberse cumplido el tiempo establecido.

El sistema tiene predefinido un intervalo de -5 a 5 V para visualizar las curvas. La opción Rangos per-mite cambiar estos valores y seleccionar el intervalo óptimo para la visualización de las curvas adquiridas. Mediante esta opción se pueden hacer visibles even-tos que provengan de señales débiles al aumentar su intervalo de visualización.

Los ficheros de datos adquiridos en anteriores se-siones de trabajo pueden ser visualizados mediante la opción Ver ficheros. Cada nombre de fichero se asocia a un canal, y de esta forma será visualizado.

El filtraje digital de las curvas adquiridas se realiza utilizando la opción Filtrar.

Al culminar el trabajo se selecciona la opción Salir. Los datos que no habían sido salvados en los ficheros de almacenamiento son salvados en este momento.

Entre los resultados de la aplicación práctica del pro-grama se encuentra el trabajo: Efectos del dendrímero Starburst PAMAM (-NH2, -OH) G4 en el crecimiento de la E. coli determinado por microcalorimetría.9

Lo dendrímeros son macromoléculas simétricas y esféricas formados por un núcleo, ramas y grupos terminales que forman usualmente una superficie bien

definida. Una superficie grandemente activa le propor-ciona a estas estructuras funciones de transportadores especiales, capaces de transportar grandes concentra-ciones de drogas y sustratos.

La adquisición de los datos se realizó utilizando cuatro canales y el sistema de programas y se pudo calcular la pendiente, el área bajo la curva y la amplitud máxima.

A partir del termograma de crecimiento de E. Coli durante cuatro horas en presencia del dendrímero star-burst PAMAM (Fig. 2) se determinó que después de dos horas de incubación (↓), la tasa de consumo de calor de los canales con el dendrímero PAMAM (OH) G4 es mayor que la del dendrímero PAMAM (NH2) G4.

La figura 3 muestra el termograma de crecimiento de la E. Coli durante 9 h en presencia del dendrímero starburst PAMAM.

Con relación a la referencia de control, el dendríme-ro PAMAM (NH2) G4 disminuye la pendiente (tasa de consumo de calor) en un 23,48 % y la amplitud máxima de la señal en un 48,8 %, el tiempo para la obtención de la amplitud máxima es similar al de referencia. Contra-rio a esto, el dendrímero PAMAM (OH) G4 aumenta la pendiente (tasa de consume de calor) en un 78,3 % y la amplitud máxima de la señal en un 17,4 %, mientras el tiempo para la amplitud máxima se redujo en un 11,2 %. Todos estos resultados evidencian una estimulación en el crecimiento de la E.Coli (Fig. 3).

Fig. 1. Pantalla y menú principal del sistema de programas.

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Fig. 2. Termograma del crecimiento de E. coli durante 4 h en presencia del dendrímero starburst PAMAM (NH2, OH) G4, [canales rojo y verde (NH2)], [canales amarillo y azul, (OH)].

Fig. 3. Termograma del crecimiento de E. coli durante 9 h en presencia del dendrímero starburst PAMAM (NH2, OH) G4, [canal rojo, (NH2)], [canal azul, (OH)].

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CONCLUSIONES

Se desarrolló un sistema de programas en lenguaje DELPHI para Windows, que permite la adquisición de datos utilizando la tarjeta multipropósito Advantech PCL-711B conectada al Monitor de Bioactividad LKB-2277. La implementación del sistema de programas ha potenciado las posibilidades del mismo, ya que permite seguir en tiempo real la evolución del experimento en curso, visualizando las curvas generadas por el termo-grama. Además, hace posible el procesamiento posterior de los datos, ya que estos son almacenados en ficheros que pueden ser visualizados en el momento que el usua-rio lo decida, una vez concluido el experimento. Esto también hace posible la realización de cualquier otro procesamiento de los datos utilizando otros paquetes de programas estadísticos. El sistema de programas digitali-za los datos que utiliza en la conformación de los perfiles calorimétricos de las diferentes especies bacterianas y su interacción con diferentes medios de cultivo utilizados para su crecimiento y posibilita el análisis de su actividad bio-lógica. Utilizando este sistema se han podido determinar los perfiles calorimétricos de cepas estándar de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, así como hacer estudios sobre los efectos de los dendrímeros PAMAM en el crecimiento bacteriano.9

BIBLIOGRAFIA1. Beezer A.E., Willson R.J., Mitchell J.C., Hills A.K., Gaisford

S., Wood E. and Connor J.A. Thermodynamic and kinetic parameters from isothermal heat conduction microcalori-metry. Pure & Appl. Chem., 70, 633-638, 1998.

2. Beezer A.E. Biological Microcalorimetry, London, Academic Press, 343, 1980.

3. Antoce A.O., Dinu L.D., Takahashi K. Microcalorimetry, a convenient technique for the monitoring of microbial growth. Roum. Biotechnol. Lett., 6, 243-251, 2001.

4. LKB-2277 Bioactivity Monitor Literature Reference List.5. Delphi 7 User’s Manual.6. PCL-711B PC-MultiLab Card. User’s Manual. 2001.7. Atmel Corporation 2002. 0940B–AVR–05/02. AVR222: 8. point Moving Average Filter. http://www.atmel.com/dyn/

resources/prod_documents/DOC0940.PDF. (Consultado: 27 de diciembre de 2006).

9. Sato, Hisatake (Miyazaki-gun, JP). 10/¿16?/2001. Moving average filter. http://www.freepatentsonline.com/6304133.html. (Consultado: 27 de diciembre de 2006).

10. Contreras R., Marrero A., Alvarez E., Travieso F. and Tillán G. Starburst PAMAM dendrimers (-NH2, -OH) G4 effects on E. coli growth monitored by microcalorimetry. Revista CENIC Ciencias Biológicas, 36, Número especial, 2005.