programa de posgrado en alimentos del...el objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial...
TRANSCRIPT
PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL
CENTRO DE LA REPÚBLICA (PROPAC)
Universidad Autónoma de Querétaro
Facultad de Química
“POTENCIAL NUTRACÉUTICO DE CULTIVOS DE
ARÁNDANO (Vaccinum sp.) SELECCIONADOS EN MÉXICO”
TESIS
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de Maestro en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Presenta
Q. F. B. Martha Laura Cervantes Ceja
Director de Tesis
Dr. Octavio Paredes López
Santiago de Querétaro, Qro., Octubre, 2009.
i
RESUMEN Las frutillas son fuente importante de nutracéuticos, entre de los que se encuentran los compuestos fenólicos (flavonoides, antocianinas, ácidos fenólicos y estilbenos). Asimismo existen reportes que corroboran la actividad biológica de los fenólicos, entre las que se pueden citar: antioxidante, antiinflamatoria y anticancerígena. Dentro de las frutillas sobresale el arándano (Vaccinium spp.) por su elevada concentración de antioxidantes, es capaz de crecer en diferentes regiones, como México específicamente en el estado de Michoacán, particularmente USA el principal productor. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial nutracéutico de cultivares de arándano cultivados en Michoacán, como un primer paso para la selección de materiales con mensajes nutracéuticos sobresalientes y de importancia comercial. Nosotros determinamos la composición fisicoquímica (métodos AOAC), identificación de compuestos fenólicos por espectrofotometria, HPLC y GC/MS, y la capacidad antioxidante (DPPH y ABTS+), y la actividad antioxidante por medio de ensayo con cultivo celular. Nuestros resultados demuestran que Sharpblue tuvo la más alta concentración de sólidos solubles (14%). Biloxi fue el cultivar más ácido (pH 2.85), la más alta concentración de fenólicos en extracto acuoso (14.22 mg EAG/g fd) y metanólico (25.19 mg EAG/g fd), flavonoides (4.78 mg EQ/g fd) y antocianinas totales (12.24 mg EC3G/g fd). Biloxi además mostró la mayor capacidad antioxidante por DPPH (17.3 y 27. TEAC µmol/mg fd, extracto acuoso y metanólico, respectivamente) y ABTS (16.5 y 26.1 TEAC µmol/mg fd,extracto acuoso y metanólico). En los extractos hidrolizados la antocianina predominante fue cianidina, el flavonoide principal quercetina. Biloxi fue el material con mayor contenido de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante en los extractos acuoso y metanólico. En los extractos ASE (accelerated solvente extraction), la principal antocianina fue cianidina-3-O-rutinosido, el flavonoide más abundante fue quercetina, el ácido fenólico predominante ácido ferulico y el principal estilbeno fue desosirapontigenina. Los extractos ASE fueron evaluados para la actividad antioxidante mediante la determinación de la inhibición de la generación de radicales libres en las células HL-60. Sharpblue, Biloxi y Misty exhibieron efecto antioxidante con valores de IC50 de 0.66, 1.1 y 1.8 mg/mg, respectivamente. en otras palabras Sharpblue fue el mejor. La potencial actividad antioxidante de los arándanos evaluados sugiere ser tan bueno o incluso mejor, que otras muestras de otros países. Palabras clave: Potencial antioxidante, Antocianinas, Flavonoides, Estilbenos, Ácidos fenólicos, Arándano.
ii
SUMMARY Berries are an important source of nutraceuticals, such as phenolic compounds (flavonoids, anthocyanins, phenolic acids, and stilbenes). Some studies have reported the biological activity of phenolics as antioxidant, anti-inflammatory, and anticarcinogenic agents. Among berries, blueberry (Vaccinium spp.) is recognized for its high concentrations of antioxidants. This fruit is grown in different regions of Mexico, mainly in the state of Michoacán; particularly the main producer worldwide is the USA. The objective of this study was to evaluate the nutraceutical potential of blueberry crops (Sharpblue, Misty and Biloxi) grown in Michoacán, as a first step in the selection of materials with outstanding nutraceutical messages and commercial importance. We assessed the physicochemical composition by AOAC, the identification of phenolic compounds by spectrophotometry, HPLC and GC/MS, and the antioxidant capacity by DPPH and ABTS, and the antioxidant activity by the cell-based assay. Our results demonstrate that Sharpblue had the highest content of soluble solids (14%). Biloxi showed the lowest pH (2.85), the highest concentrations of phenolics in aqueous (14.22 mg GAE/g dry matter) and methanolic (25.19 mg GAE/g dm) extracts, as well as flavonoids (4.78 mg EAG/g dm) and anthocyanins (12.24 mg EC3G/g dm). Biloxi also showed the highest antioxidant capacity by DPPH (17.3 and 27.0 TEAC µmol/mg dm, aqueous and methanolic extract, respectively) and ABTS (16.5 and 26.1 TEAC µmol/mg dm, aqueous and methanolic extract, respectively). In the hydrolyzed blueberry extracts, the main anthocyanin was cianidin, and the main flavonoid was quercetin. Biloxi was the material with the major phenolics content and antioxidant capacity by the aqueous and methanolic procedures. In the ASE (accelerated solvent extraction) extracts, the main anthocyanin was cianidin-3-O-rutinoside, the most abundant flavonoid was quercetin, the predominant phenolic acid was ferulic acid, and the main stilbene was desoxyrhapontigenin. The ASE extracts were evaluated for antioxidant activity by determining the inhibition of ROS generation in the HL-60 cells. Sharpblue, Biloxi and Misty exhibited antioxidant effect with IC50 values of 0.66, 1.1 and 1.8 mg/ml, respectively. In other words, Sharpblue was the best. The potential antioxidant activity of evaluated blueberries suggests to be as good or even better, as other samples from other countries. Key words: Antioxidant potential, Anthocyanins, Flavonoids, Stilbenes, Phenolic acids, Cultivar, Blueberry.
iii
DEDICATORIAS
A Dios
por permitirme experimentar
nuevos caminos y por poner
en ellos personas magnificas
para recorrerlos……pero sobre todo
por concederme la oportunidad
de realizar este sueño y un paso más en mi existir
Dedico este trabajo a los seres que me han dado la vida
quienes con su amor, esfuerzo y sacrificio,
me han dado un inmenso impulso
para realizar cada uno de mis sueños
y las ganas de seguir siempre adelante,
con inmenso amor y admiración:
Martha Ceja Juárez
Y
Jesús Cervantes Álvarez
A mis hermanitos que han sido mis compañeros en mí existir,
gracias por llenar mi vida de alegría,
con todo respeto, admiración e inmenso cariño:
Dan, Pau y Meliss
iv
AGRADECIMIENTOS
Inmenso agradecimiento al Dr. Octavio Paredes López
por su apoyo, consejos, asesoría y por compartirme su conocimiento,
pero sobre todo por su amistad.
Dra. Ma. Elena Valverde González
Gracias Male por ser revisora de mi trabajo,
pero sobre todo por el tiempo dedicado para el mejoramiento del mismo
Dra. Agnes M. Rimando
Por brindarme su apoyo excepcional para el presente trabajo,
y por acogerme en su laboratorio
sin duda fue una inolvidable y magnifica experiencia!!
(Thank you so much!!)
Dra. Rosalía Reynoso Camacho
Por compartir sus conocimientos y sus valiosas observaciones
para mejorar el presente trabajo de investigación
Dra. Ana Tztzqui Chávez Bárcenas
Por sus consejos tan acertados para mejorar y enriquecer el trabajo
Dra. Ma. Guadalupe F. Loarca Piña
Le agradezco sus atinadas recomendaciones para el presente trabajo
Dr. José López Medina
Por todo su apoyo, por compartirme su conocimiento
y por la donación del material con el que se realizó el presente trabajo
Dr. Gerardo Martínez Soto
Por todas las atenciones y las facilidades otorgadas en el
Laboratorio de Análisis Proximal de Alimentos
del Instituto de Ciencias Agrícolas
v
A Fabi por su amistad y por su grata compañía!
A Talia por su disposición y ayuda para el desarrollo del presente trabajo
Gloria Hervey y Katherine Martin,
por el apoyo brindado para el desarrollo y aprendizaje de algunas técnicas empleadas, en Oxford!
A Yola por apoyo generoso en toda ocasión, además de su trato amable
A Margarita por su apoyo y su amistad.
A Carmelita y Laurita, por todas sus atenciones y disposición
A todos aquellos que en su momento me brindaron su apoyo para realizar este sueño realidad!
vi
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del
Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigaciones y
de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato y la
Universidad Autónoma de Querétaro, bajo la asesoría y dirección del Dr.
Octavio Paredes López. La Dra. Agnes M. Rimando del laboratory of Natural
Products Utilization Research del U.S. Department of Agriculture, Agricultural
Research Service (USDA-ARS), Campus Universidad de Mississippi, colaboró
en esta investigación.
vii
INDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN i
SUMMARY ii
DEDICATORIAS iii
AGRADECIMIENTOS iv
INDICE GENERAL vii
INDICE DE CUADROS xii
INDICE DE FIGURAS xiii
I INTRODUCCIÓN 1
ll REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2
2.1 Frutillas 2
2.1.1 Entorno mundial de las frutillas 3
2.1.2 Producción de arándano a nivel mundial 4
2.1.3 Arándano 5
2.2 Nutracéuticos 7
2.2.1 Clasificación de compuestos nutracéuticos 9
2.2.2. Efectos de los nutracéuticos 11
2.3 Compuestos fenólicos 14
2. 3.1 Clasificación de los compuestos fenólicos 14
2.3.1.1 Ácidos fenólicos 16
viii
2.3.1.2 Estilbenos 17
2.3.1.3 Antocianinas 19
2.3.1.4 Diferuloilmetanos 21
2. 3.1.5 Flavonoides 22
2.3.1.6 Taninos condensados 23
2.3.2 Actividad biológica de los compuestos fenólicos 24
2.3.3 Compuestos nutracéuticos presentes en el arándano 27
2.4. Ensayos para evaluar la actividad biológica 28
2.4.1 Generalidades 28
2.4.2 Ensayos de capacidad antioxidante por métodos
químicos 29
2.4.2.1 Método DPPH 30
2.4.2.2 Método ABTS 31
2.4.3 Actividad antioxidante por ensayo biológico 32
lll JUSTIFICACIÓN 34
IV OBJETIVOS 35
1. OBJETIVO GENERAL 35
2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 35
V MATERIALES Y MÉTODOS 36
5.1 Materiales 37
5.2 Métodos 37
ix
5.2.1. Caracterización fisicoquímica 37
5.2.1.1 Determinación de la composición química 37
5.2.1.2 Sólidos solubles 37
5.2.1.3 Acidez titulable 37
5.2.1.4 pH 38
5.2.1.5 Determinación de color de las frutas 38
5.2.2. Determinación de compuestos nutracéuticos en
arándanos 39
5.2.2.1 Compuestos fenólicos 39
5.2.2.1.1 Extractos crudos para compuestos fenólicos totales 39
5.2.2.1.2 Determinación de fenoles totales 39
5.2.2.1.3 Determinación de flavonoides totales 40
5.2.2.1.4 Determinación de antocianinas totales 40
5.2.2.1.5 Extracción, hidrólisis de antocianinas e identificación por
HPLC 40
5.2.2.1. 6 Caracterización de Flavonoides por HPLC 41
5.3 Determinación de la capacidad antioxidante 42
5. 3.1 Método DPPH 42
5.3.2 Método ABTS+ 43
5.4 Obtención de extracto ASE para determinación de
fenólicos 44
5.5 Fraccionamiento 44
5.6 Actividad antioxidante en cultivo celular 45
5.7 Identificación y caracterización de compuestos fenólicos 46
x
en los extractos ASE y fracciones
5.7.1 Caracterización de antocianinas por HPLC 46
5.7.2 Caracterización de ácidos fenólicos y flavonoides por HPLC 46
5.7.3 Extracción y cuantificación de estilbenos por GS/MS 47
5.8 Análisis estadístico 48
VI RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49
6.1 Caracterización fisicoquímica de los arándanos 49
6.1.1 Características fisicoquímicas y proximales 49
6.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en
arándanos 53
6.2.1 Fenoles totales 53
6.2.2 Flavonoides totales 56
6.2.3 Antocianinas totales 57
6.3 Actividad antioxidante por DPPH y ABTS+ 58
6.4 Correlaciones 61
6.4.1 Correlación fenoles totales y capacidad antioxidante 61
6.4.2 Correlación ABTS+ y DPPH 63
6.5 Caracterización de antocianinas por HPLC 65
6.6 Caracterización de flavonoides por HPLC 67
6.7 Fraccionamiento 69
xi
6.8 Caracterización de compuestos fenólicos en los extractos
ASE de arándano 69
6.8.1 Caracterización de antocianinas por HPLC 69
6.8.2 Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos por HPLC 72
6.8.3 Caracterización de estilbenos por CG/MS 75
6.9 Evaluación de potencial antioxidante por medio cultivo
celular 77
6.9.1 Actividad antioxidante de los fenólicos en arándano 79
VII CONCLUSIONES 82
VlII PERSPECTIVAS 84
IX REFERENCIAS 85
X APÉNDICE 112
xii
INDICE DE CUADROS
Pág.
1. Nutracéuticos presentes en frutillas 2
2. Producción mundial de frutillas 3
3. Producción mundial de arándano 4
4. Clasificación de compuestos nutracéuticos según funciones fisiológicas 9
5. Clasificación de compuestos nutracéuticos según fuente alimenticia 11
6. Contenido de fenoles en arándano 28
7. Composición fisicoquímica de los arándanos 49
8. Contenido de compuestos fenólicos totales en extracto acuoso y
metanólico de arándano 54
9. Contenido de flavonoides totales en arándano 56
10. Contenido de antocianinas totales en arándano 57
11. Actividad antioxidante por DPPH Y ABTS de cultivares de arándano 59
12. Caracterización del contenido de antocianinas en los cultivares de
arándano 66
13. Caracterización del contenido de flavonoides en arándanos 68
14. Caracterización de antocianinas en extractos ASE de arándanos y en las
fracciones (mg/g de peso seco) 71
15. Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos en extractos ASE de
arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco) 74
16. Caracterización de estilbenos en extracto ASE de arándanos y en
fracciones (mg/g de peso seco) 76
17. Actividad antioxidante de extractos ASE de cultivares de arándano y
fracciones 78
xiii
INDICE DE FIGURAS
Pág.
1. Clasificación de fitoquímicos en base su estructura química 10
2. Clasificación de compuestos fenólicos 15
3. Estructura de ácidos fenólicos 17
4. Estructura de los estilbenos 19
5. Estructuras interconvertibles de las antocianinas 21
6. Estructura de los flavonoides 23
7. Estructura básica de los taninos condensados 24
8. Reducción del DPPH por un antioxidante 30
9. Formación del radical estable de ABTS con persulfato de potasio 31
10. Reacción fluorescente en ensayo DCFH 33
11. Esquema general de trabajo 36
12. Escala Hunter 38
13. Contenido de compuestos fenólicos totales en cultivares de
arándano 55
14. Correlación entre fenoles totales con capacidad antioxidante
(DPPH y ABTS+) en extracto acuoso y metanólico de
arándano 62
15. Correlación entre ABTS+ y DPPH 64
16. Cromatograma obtenido por HPLC de las antocianinas analizadas
en arándano del cultivar Biloxi detectadas a 520 nm. 67
17. Cromatograma obtenido por HPLC de flavonoides analizados en
arándano del cultivar Biloxi detectados a 260nm 68
1
I INTRODUCCIÓN
México se caracteriza por una inmensa riqueza biótica, asimismo ocupa
uno de los primeros lugares en biodiversidad a nivel mundial. De manera
trascendente en el estado de Michoacán existe una gran variedad de ecosistemas
y biodiversidad, principalmente por la presencia de cadenas montañosas, por los
contrastes altimétricos del relieve y la gama de climas, que incluyen desde los más
cálidos del país hasta los semifríos en las zonas altas de Mil cumbres y de la
Meseta Tarasca. Por otro lado, el régimen de humedad predominante es el
semihúmedo, aunque también existen zonas muy húmedas, así como algunas
secas. Debido a las características mencionadas anteriormente, Michoacán es uno
de los principales estados productores de frutillas o berries de la República. Entre
los principales géneros de frutillas cultivados se encuentran Rubus, Fragaria,
Ribes y Vaccinium.
Las frutillas constituyen una parte importante de la dieta en los países
desarrollados, principalmente por que son una fuente importante de nutracéuticos,
entre los cuales se encuentran los compuestos fenólicos como ácidos fenólicos,
antocianinas, flavonoides y estilbenos, compuestos con actividad antioxidante,
anticarcinogénica, antimutagenica, antineurodegenerativa y antiinflamatoria,
propiedades biológicas benéficas para la salud.
Dentro del género Vaccinium se encuentra el arándano o blueberry en
inglés, destaca por sus características antiinflamatorias, antioxidantes, nutritivas y
medicinales. Esta fruta es muy apreciada por los países del hemisferio norte,
principalmente USA y algunos países de Europa.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial nutracéutico de
cultivares de arándano seleccionados de la meseta tarasca de Michoacán, México,
para utilizarlos en futuros programas de comercialización y mejoramiento.
2
II REVISIÓN DE LA LITERATURA
2.1 Frutillas Las frutillas son consideradas como frutas finas en los países europeos y
del hemisferio norte, por lo que tienen gran valor económico. Dentro de este grupo
se encuentran la frambuesa, zarzamora, arándano, fresa, mora y grosella. Dentro
de los géneros: Rubus, Fragaria, Ribes y Vaccinium.
Las frutillas como frambuesa (Rubus sp), zarzamora (Rubus occidentales)
y fresa (Fragaria anaassa) se consumen la dieta de los países desarrollados.
Estos frutos han atraído la atención debido al potencial benéfico que tiene a la
salud humana. Contienen gran cantidad de compuestos nutracéuticos con
propiedades biológicas, como actividad antioxidante, anticarcinogénica,
antineurodegenerativa y antiinflamatoria (Seeram y col., 2006b). El contenido de
compuestos nutracéuticos en frutillas se encuentra en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Nutracéuticos presentes en frutillas
Nutracéutico Arándano Frambuesa Zarzamora Fresa
Fitoquímicos
Antocianinas,
ácido elágico,
luteina,
proantocianidinas,
resveratrol y
zeaxantina
Antocianinas,
ácido
elágico,
luteína y
zeaxantina
Antocianinas,
ácido elágico,
luteína y
zeaxantina
Antocianinas,
ácido
elágico,
luteína y
zeaxantina
Vitamina A mg/100g
78 41 308 17
Vitamina C mg/100g
14 32 30 85
Folatos µg/100g
9 26 36 35
K mg/100g 112 186 233 220
Fibra g/100g 3.5 8 7.6 3 (Smith y col., 2004)
3
La actividad biológica que se atribuye a las frutillas se debe al alto
contenido de diversos fitoquímicos como flavonoides (antocianinas y flavonas),
taninos, ácidos fenólicos y lignatos (Seeram, 2006a).
Las frutillas se consumen como fruta fresca, en bebidas, yogurts,
gelatinas y mermeladas. Además sus extractos se utilizan en forma de suplemento
por el beneficio potencial para la salud humana. Sin embargo, resulta difícil
encontrarlos presentes en la dieta de países subdesarrollados ya que estos frutos
tienen alto costo para el consumidor (Seeram y col., 2006b).
2.1.1 Entorno mundial de producción de las frutillas
A nivel mundial existe una producción de aproximadamente 1 millón de
frutillas, dentro de las cuales se encuentran arándano, zarzamora, frambuesa,
fresa, entre otras. Los principales países productores son Irán, Rusia, Vietnam,
USA, Polonia. En el Cuadro 2 se muestra la producción mundial de frutillas.
Cuadro 2. Producción mundial de frutillas
PAÍS PRODUCCIÓN
Írán 211, 800 ton
Rusia 184 000 Ton
Vietnam 106, 000 Ton
USA 98, 974 Ton
Polonia 52, 539 Ton (FAO/STAT, 2008)
México ocupa el décimo primer lugar con una producción de frutillas de
7,191 ton anuales. Los estados productores son Michoacán, Jalisco, Guanajuato,
estado de México e Hidalgo. Las principales frutillas que se cultivan son zarzamora,
4
fresa, frambuesa y actualmente en los estados de Michoacán y Jalisco se están
realizando pruebas en el cultivo de arándano.
En el estado de Michoacán se genera el 96 % de la producción de frutillas
del país, se cultivan aproximadamente 5 mil hectáreas; la mayor parte de las cuales,
se encuentra en los municipios de Los Reyes, Tocumbo, Peribán, Ziracuaretiro,
Uruapan, Ario de Rosales, Zitácuaro y Tacámbaro. En el estado de Jalisco
empiezan a producirse frutillas en los municipios de Sayula, Mazamitla y
Jocotepec; compañías de California se cultivan frambuesa, fresa, zarzamora y
empiezan a abrir el cultivo del arándano (SAGARPA, 2007). Las exportaciones de
frutillas frescas y congeladas mexicanas se realizan desde Octubre a Enero, en
estos meses se alcanza precios elevados en el mercado debido a la escasa oferta
de los otros países (SAGARPA, 2008).
2.1.2 Producción de arándano a nivel mundial
Los principales países productores de arándano son USA y Canadá, que
generan aproximadamente el 80.3% de arándano cultivado (Vaccinium
corymbosum), ya que si se considerará el arándano silvestre (V. angostifollum) el
porcentaje asciende aproximadamente a 85%, asimsmo si se valorará arádano
procesado se alcanzaría un porcentaje de aproximadamente 89%. Otros de los
principales países productores de arándano son Europa, Argentina, Chile, Oceanía.
En el Cuadro 3 se ilustra la producción de arándano a nivel mundial (USDA, 2007).
Cuadro 3. Producción mundial de arádano
PAÍS Fresco (Ton) Porcentaje USA/ Canadá 178,000 80.3 Europa 22,500 10.18 Argentina 9,000 4.07 Chile 6,500 2.94 Oceanía 5,050 1.4 Total 221,050 100
(USDA, 2007)
5
En el estado de Michoacán, el cultivo de arándano es reciente, se considera
que de la producción total de frutillas el rádano representa el 2%. Las evaluaciones
experimentales del cultivo empezarón hace aproximadamente cinco años, por lo
tanto las plantaciones tienen entre ds y cuatro años. Se cultivan aproximadamente
20 Ha; Este cultivo presenta rendimientos altos de hasta 5,000 kg/Ha, el cual es
superior al rendimiento de USA y Canadá, para cultivos jóvenes como estos se
reportan rendimientos de 1,500 - 2,000 kg/Ha. Se contempla que para el sexto año
de producción se alcanzara un rendimiento de 20,000 kg/Ha, mismo que es superior
al de los países del hemisferio Norte que solo alcanzan un promedio de 10,000
kg/Ha. El cultivo de arándano presenta gran rentabilidad y su mayor cotización la
alcanza en los meses de Octubre – Abril, que es cuando los principales países
productores no lo tienen, lo cual es una ventaja competitiva muy valiosa (SAGARPA,
2008).
2.1.3 Arándano El arándano, mejor conocido en el mercado como blueberry por su nombre
en inglés, pertenece al género Vaccinium sección Cyanococcus en la tribu
Vaccinieae de la subfamilia Vaccinioideae y la familia Ericaceae (Stevens, 1969).
Es considerado un fruto falso ya que deriva del ovario inferior, a diferencia de los
frutos verdaderos que derivan del ovario superior. El fruto es una baya casi
esférica y dependiendo de la especie o cultivar puede variar de 0.7 a 1.5 cm de
diámetro. Cuando el fruto está inmaduro es de color verde, después rojizo púrpura
y finalmente de color azul claro y hasta negro al llegar a la madurez. La epidermis
del fruto está cubierta por secreciones cerosas que le dan una terminación muy
atractiva (Stevens, 1969). Dentro del género Vaccinium las especies más
conocidas se agrupan según sus características de crecimiento y requerimientos
agroclimáticos:
• Arbusto alto o highsbush (arbustivo del norte; V. corymbosum y
arbustivo del sur; hidribos interespecificos).
• Arbusto bajo o lowbush (V. angostifolum)
• Ojo de conejo o rabbiteye (V. ashei)
6
Existen distintas especies de arándanos nativas de América del Norte.
La mayor extensión cubierta por este frutal corresponde al arándano bajo, que
crece también silvestre en las regiones frías de Norteamérica. Es una planta
arbustiva que mide entre 10 cm a 4 m de alto. Las especies menores son
conocidas como "lowbush blueberries" y las especies mayores como "highbush
blueberries".
Los grupos predominantes dentro de las especies menores de arándano
“lowbush blueberries” son V. angustifolium, V. myrtilloides. Los tallos miden menos
de 0.5 m de altura (Luby y col., 1991). El mejoramiento de las especies menores
de arándano inició con la selección de clones silvestres en distintas épocas del
año por el departamento de agricultura de USA (The United Status Departament of
Agricultura, USDA). También se realizaron selecciones por medio de
características fenotípicas, como son: largo del fruto, sabor, color, productividad,
resistencia a enfermedades, fácil propagación, entre otras. Todos los programas
de mejoramiento de las especies menores de arándano comenzaron con V.
angustifolium en 1975 hasta 1988 (Aalders y col., 1975; Hall y col., 1988). Los
primeros cultivares ‘Augusta’, ‘Blomidon’, ‘Fundy’ presentaron dificultades de
aceptación en la industria debido a los elevados gastos de la propagación (Hall,
1988).
Las especies menores de arándano contiene cantidades sobresalientes
de compuestos como fitoesteroles, ácidos fenólicos, flavan-3-ol, antocianinas, y
oligomeros de proantocianidinas los que protegen de los estados de iniciación,
promoción y progresión de la carcenogenesis (Kraft y col., 2005).
Las especies mayores de arándano “highbush blueberies” llegan a medir
hasta 2 m de altura. El cultivar más común es V. corymbosum. Este es un cultivar
importante con producción comercial en aproximadamente 17 estados en USA
(Hanson y Hancock, 1990). La domesticación y mejoramiento tradicional de las
especies mayores de arándano comenzaron en el periodo de 1888-1937 por
Frederick Vermon Coville continuaron con (Ballington, 1984). El arándano alto
7
(highbush blueberries) cultivado comercialmente presenta un tiempo de floración
hasta la maduración del fruto de 90 días y tolera pH ácidos (Hanson y Hancock,
1990).
Dentro del grupo arándano arbustivo del sur “southern highbush
blueberry” predomina V. corymbosum, que tiene parentesco con V. angustifolum
y en algunos casos con V. ashei y V. tenellum (Lyrene, 1990).
El mejoramiento del arándano arbustivo del sur comenzó en la
Universidad de Florida por R.H. Sharpe en 1948, los primeros cultivares
mejorados fueron “Sharpblue”, “Flordablue” y “Avonblue”, desarrollados por
Sharpe y Sherman en 1976-1977 (Lyrene, 1990).
Los cultivares de arándano ojo de conejo “Rabbiteye blueberry”
generalmente miden de 2 a 4 m de altura. La especie que predomina dentro de
este grupo es Vaccinium ashei, muy común en regiones como Carolina del Sur,
Florida del Norte y el centro de Kansas (Luby y col., 1991).
El mejoramiento genético del arándano ojo de conejo “Rabitteye”
comenzó en 1948 en la Universidad de Florida por Sharpe (Sharpe y Darow,
1959). Tolera pH alto, resiste sequía, presenta mayor producción que el arándano
arbustivo alto del sur, así como mayor resistencia poscosecha y el periodo de
desarrollo del fruto llega a ser de 90 a 120 días (Lyrene, 1990).
2.2 Nutracéuticos
Históricamente los alimentos son evaluados por su valor nutricional, lo
cual está esta asociado con los componentes esenciales para mantener la vida de
un organismo. Estos componentes se clasifican como macro y micro-nutrientes y
representan el 99% y el 1% de la dieta total, respectivamente.
Boucher en 1999 define “Alimentos que proveen beneficio para la salud
más allá de la nutrición básica” como nutracéuticos.
8
Delgado-Vargas y Paredes López, (2000) definen a un alimento
nutracéutico como “Cualquier sustancia que puede ser considerada un alimento o
parte de un alimento y provee beneficios médicos o a la salud, incluyendo la
prevención y tratamiento de enfermedades”.
Los alimentos considerados como nutracéuticos o funcionales han sido
presentados como sustancias GRAS (Generalmente Reconocidos como Alimentos
Seguros, por sus siglas en inglés), se han identificados un gran número de
alimentos y cultivos con potencial nutracéuticos como son: cereales, especias,
condimentos, verduras, frutas entre otros (Guzmán-Maldonado y Paredes-López,
1999; Wildman, 2006; Szajdek y Borowska, 2008; Maiani y col., 2009). La
existencia de compuestos nutracéuticos podría considerarse como parámetro de
calidad para frutos (Beel Kwilder y col., 2005). Existen numerosos reportes del
efecto benéfico de una dieta rica en alimentos de origen vegetal sobre la salud, ya
sea como antiviral, antitumoral, anticarcinogénico, reduciendo riesgos de
enfermedades crónico degenerativas o mejorando la respuesta del sistema
inmune (Cui y Chisti, 2003; Kaneno y col., 2004). Los alimentos de origen vegetal
contienen diferentes combinaciones de fitoquímicos (Boucher, 1999; Raskin y col.,
2002; Hannum, 2004). Los fitoquímicos que más se han estudiado son los
compuestos fenólicos, que son producto del metabolismo secundario de las
plantas, y forman parte esencial del crecimiento y sobrevivencia de las mismas
(Hannum, 2004).
Actualmente existe gran interés en identificar y caracterizar el perfil de
antioxidantes de frutas y vegetales, por lo que es una necesidad llevar a cabo
estudios del perfil de nutracéutico de frutas y vegetales, con el fin de considerarlo
en programas de fitomejoramiento, así como en la selección de estrategias de
cosecha y post-cosecha (Asami y col., 2003; Mass y col., 1991; Wang y col.,
2002).
9
2.2.1 Clasificación de compuestos nutracéuticos
Una de las formas de clasificación de los nutracéuticos está basada en el
mecanismo de acción, es decir en las propiedades fisiológicas demostradas, como
son; antioxidantes, antiinflamatorias, anticancerígenas, entre otras. La clasificación
se muestra en el Cuadro 4 (Wildman, 2001). También pueden clasificarse de
acuerdo a su naturaleza química, colocando en categorías a los compuestos
según los grupos funcionales que presentan, a partir de esta clasificación se
obtienen subclasificaciones (Wildman, 2006). En esta última forma de clasificación
se encuentran los carotenoides, compuestos fenólicos, alcaloides, compuestos
que contienen nitrógeno, compuestos organosulfurados (Figura 1). Los grupos
más ampliamente estudiados son los compuestos fenólicos y los carotenoides
(Liu, 2004). Otra forma de clasificación de los compuestos nutracéuticos se basa
en la fuente alimenticia (Cuadro 5), esta clasificación es importante cuando se
tiene interés en un compuesto nutracéutico en particular o en compuestos
relacionados (Wildman, 2001).
Cuadro 4. Clasificación de compuestos nutracéuticos según funciones
biológicas
Función Fisiológica
Compuestos
Antioxidante Flavonoides, Antocianinas, carotenoides,
vitamina C
Antimutagénica Estilbenos, ácidos fenólicos.
Anticarcerígena Antocianinas, ácidos fenólicos
Antiinflamatoria Resveratrol, antocianinas
(Parr and Bolwell, 2000)
10
Achidroxicinámico
Fitoquímicos
a- Carotenoß- Caroteno
ß- Criptoxan tinaLuteína
ZeaxantinaAstaxantina
Licopeno
Compuestos organosul forados
Compuestos que contienen nitrógeno
AlcaloidesComp. Fenól icos
Carotenoides
Ácidos Fenól icos
IsotiocianatosIndolesCompuestos al ifáticos sulfuradosTaninosCumarinasEsti lbenosFlavonoides
Flavonoles(Catequinas)
FlavonasFlavonoles
AcHidroxibenzoico
Flavononas IsoflavonoidesAntocianinas
GálicoProtocatecuicoVani licoSiringico
P-cumaricoCafeicoFerul icoSinápico
QuercetinaCanferolMairicetinaGalanginaFisetina
ApigeninaCrisinaLuteolina
CatequinaEpicatequinaEpigalocatequinaGalato
EriedietiolHespiri tinaNaringenina
CianidinaPelargonidinaDelfinidinaPeonidinaM alvidina
GenisteinaDaidceinaGlici teinaFormononetina
En la Figura 1 se muestra la clasificación de fitoquímicos con base a su
estructura química.
Figura 1. Clasificación de fitoquímicos en base a su estructura química (Liu, 2004)
11
Mientras que en el Cuadro 5 se presenta la clasificación de los compuestos
nutracéuticos según su fuente alimenticia.
Cuadro 5. Clasificación de compuestos nutracéuticos según fuente alimenticia
Componente Fuente alimenticia Función demostrada
β- Caroteno Frutas color
amarillo intenso Previene el daño oxidativo
Licopeno Tomate Reduce riesgos de cancer de
prostata
Lactobacilos Leches
fermentadas
Efectos benéficos sistema
intestinal e inmune
Ácidos grasos Atún, pescado
Reduce riesgo de
enfermedades
cardiovasculares
Terpenos, triterpenos
Cítricos Anticancerígenos
Fitoesteroles Soya, semillas Inhibe absorción de colesterol
diertario
Compuestos “allium”
Cebolla, ajo Anticancerígeno, antioxidante
(Parr and Bolwell, 2000)
2.2.2 Efectos de los nutracéuticos
La prevención de enfermedades sobre todo las crónico degenerativas
mediante el consumo de frutas puede atribuirse, en parte al contenido de
compuestos fenólicos. Las plantas interactúan con su medio ambiente biótico
sintetizando compuestos fenólicos como metabolitos secundarios. Los
compuestos fenólicos tienen diferentes funciones, tales como: dar color a las hojas
12
y frutos, atraer o repeler insectos y proteger a las plantas de herbívoros.
Numerosos estudios han sugerido que el contenido de fitoquímicos de frutas y
vegetales y la correspondiente actividad antioxidante contribuyen a un efecto
protector oontra enfermedades crónico degenerativas (Parr y Bolwell, 2000).
Existen diferencias en los constituyentes bioactivos de las frutillas, los
cuales se encuentran en diferentes concentraciones o pueden estar presentes o
nodependiende del genéro (Burns y col, 2008). En extractos de frutillas
(Amelanchier alnifolia, Viburnum trilobum, Prunus virginiana y Shepherdia
argentea) nativas de Norte América se ha reportado que los compuestos no
polares, tales como terpenos, han mostrado una fuerte inhibición de aldosa
reductasa, enzima involucrada en diabetes (Burns y col., 2008).
Existen reportes sobre una asociación del consumo de vegetales con la
disminución de cáncer (Duthie, 2007). El proceso de desarrollo de cáncer es
dinámico e involucra muchos factores con una progresión gradual que conduce a
una propagación incontrolada y crecimiento de células cancerígenas a través del
cuerpo llamada metástasis. Los tres pasos críticos en este proceso para diversos
tipos de formación de cáncer en humanos son iniciación, promoción y progresión
(Pan y col., 2008).
A nivel mundial, aproximadamente 10 millones de personas anualmente
son diagnosticadas con cáncer (Bingham y Riboli, 2004) y el cáncer demanda la
vida de alrededor de 7 millones de personas cada año. Los tipos de cáncer más
comunes a nivel mundial (excluyendo el cáncer de piel) son pulmón (12.3% de
todos los tipos de cáncer), mamá (10.4%) y cáncer colorectal (9.4%). Las
evidencias de estas variaciones se deben principalmente a factores del medio
ambiente y a estilos de vida, más que a factores genéticos (Bingham y Riboli,
2004). Estudios epidemiológicos han demostrado que del 32-35% de esta
enfermedad se puede atribur a la nutrición y que los factores dietarios pueden
ayudar a modificar estos procesos (Pan y col., 2008). Se ha demostrado que la
efectividad de un número de componentes bioactivos dietarios tienen la habilidad
de prevenir el cáncer y otras enfermedades crónicas, asimismo se ha encontrado
13
que varios compuestos bioactivos poseen propiedades antimutagénicas y
anticarcinogénicas (Kellof y col., 2000). Estos estudios soportan la aceptabilidad
de los compuestos bioactivos alimenticios como agentes quimopreventivos. Un
agente quimopreventivo es una sustancia sintética o naturale que bloquea, retarda
ó inhibe el proceso de carcinogénesis (Pan y col., 2008).
Por otro lado, en fracciones de extractos de arándanos silvestres
(Vaccinium angustifolium Ait.) recolectados en USA y algunas regiones de Europa
se han encontrado inhibidores de topoisomerasa (Alwerdt y col., 2008). Tales
inhibidores constituyen una clase de agentes quimopreventivos por que inhiben la
vía de carcinogénesis, por su acción antiproliferativa evitan la diferenciación
celular.
El cáncer es un proceso altamente complejo, iniciando con una célula
cancerosa vía ADN dañado, acumulación de mutaciones, promoción de la
proliferación celular, expansión tumoral y finalmente llevando a un fenotipo
maligno con subsecuentes invasiones y metástasis en otros sitios del cuerpo.
Diversos sistemas en in vitro e in vivo han sido utilizados para determinar el
efecto antimutagénico y anticarcinogénico de las frutillas y sus principales
componentes nutracéuticos (Duthie, 2007). Las frutillas inhiben la iniciación de la
tumoración por influencia en el metabolismo del carcinógeno; promueven la
apoptosis, reducen la inflamación e inhiben la angiogénesis (Duthie, 2007).
La mutagénesis en algunos casos es un evento esencial y temprano en el
proceso carcinogénico. La acumulación de mutaciones en la regulación de genes,
por ejemplo, división celular, apoptósis y reparación de ADN, resulta en la creación
de una célula capaz de crecer de forma no controlada e invasiva. Los fitoquímicos
presentes en frutillas pueden bloquear la mutagénesis por carcinógenos químicos
a mutagénesis endógena.
La topoisomerasa II provee una estrategia muy útil para seleccionar
agentes quimopreventivos que pueden ser efectivos en los estados de promoción
y progresión de cancer. (Cho y col., 2000, Shureiqi y col., 2000).
14
2.3 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos o polifenoles son originados a partir de una de
las principales clases de metabolitos secundarios en plantas, la fenilalanina. Las
plantas y alimentos contienen una enorme variedad de derivados fenólicos,
incluyendo fenoles simples, fenilpropanoides, derivados del ácido benzoico,
flavonoides, estilbenos, taninos, lignanos y ligninas, suberinas y cutinas. Miles de
diferentes compuestos fenólicos se han identificado en la dieta humana, como por
ejemplo: el ácido clorogénico (café, zanahorias), ácido ferúlico (cereales,
vegetales monocotiledones), flavonas y flavonoles (cebolla, vegetales verdes, té y
manzanas), catequinas y otros (Stahl, y col., 2002).
Los compuestos fenólicos actúan como antipatógenos, contribuyen con la
pigmentación de las plantas y son atrayentes de polinizadores. El contenido de
compuestos fenólicos en frutillas como el arándano varía dependiendo del
cultivar, condiciones de crecimiento, grado de maduración y manejo después de la
cosecha. En las células de las plantas, los fenoles se encuentran en
compartimentos por lo que necesitan ser liberados por algún mecanismo antes de
que puedan ser absorbidos. Por otro lado, los fenoles de bajo peso molecular son
solubles en agua, los de alto peso molecular pueden ser insolubles en agua,
también tienen la característica de reaccionar de manera irreversible con ellos
mismo y con las proteínas. Los polifenoles procedentes de tejidos crudos pueden
someterse a oxidación directa o por enzimas como la polifenol oxidasa (Stahl y
col., 2002).
2.3.1 Clasificación de los compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son los antioxidantes más abundantes en la
dieta humana. Son metabolitos secundarios de plantas con aproximadamente
8,000 variantes en su estructura presentan anillo(s) aromático (s) con uno o más
grupos OH. La clasificación de compuestos fenólicos en base a su estructura y
composición química se muestra en la Figura 2. Los fenólicos están subdivididos
15
en grupos por el número de anillos aromáticos y por los elementos estructurales
que ligan esos anillos (Han y col., 2007):
1.- Ácidos fenólicos: Se distinguen dos clases dependiendo de la estructura:
derivados de ácido benzoico (ácido gálico) y derivados de ácido cinámico (ácido
cafeico, ferúlico y cumárico).
2.- Los flavonoides: Incluyen las flavonas, flavones, isoflavonas, flavanonas,
antocianinas y flavoles. Están subdivididos en función a su estructura química
3.- Estilbenos: Se caracterizan por tener en su estructura como núcleo 1,2-
difeniletileno con sustituyentes hidroxilo y anillos aromáticos, el más representativo
del grupo es el trans-resveratrol.
4.- Taninos: Polifenoles solubles en agua, se dividen en dos grupos hidrosolubles
y condensados. Presentan por lo general dos grupos galotaninos y elagitaninos.
5.- Diferuloilmetanos: Son un pequeño grupo de compuestos fenólicos
estructuralmente tienen dos anillos aromaticos sustituidos por grupos OH, algunos
contienen cadenas alifáticas, la cucumarina es ejemplo de este grupo. (Han y col,
2007).
Figura 2. Clasificación de compuestos fenólicos
(Han y col., 2007)
16
Los compuestos fenólicos son ampliamente consumidos en la dieta
humana. Las principales fuentes de fenólicos incluyen algunas frutas, vegetales y
bebidas como jugos y vino tinto. En cuanto a la ingesta total de fenólicos en la
dieta, los ácidos fenólicos forman aproximadamente una tercera parte y los
flavonoides son los dos tercios restantes. Los flavonoides más abundantes en la
dieta son flavanoles (catequina), antocianidinas y sus productos de oxidación. Las
principales fuentes de polifenoles son jugo de fruta, vino, té, café, chocolate y
cerveza y en menos medida vegetales, leguminosas deshidratadas y cereales
(Han y col., 2007).
Se ha estimado que en personas que consumen al menos raciones al día
de frutas y vegetales consumen diariamente 1g de compuestos fenólicos. La
Academia Nacional de Ciencias de USA recomienda consumir al menos cinco
raciones de frutas o vegetales al día para un buen funcionamiento del organismo y
para prevención de enfermedades crónico degenerativas (Bermudez y Tucker,
2003).
2.3.1.1 Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos están ampliamente distribuidos en las plantas y su
biodisponibilidad en la dieta es un factor importante para los posibles beneficios a
la salud de humanos y animales (Amarowics y col., 2009; Sailendra, 2006). Entre
los ácidos hidroxicinámicos el más representativo es el ácido cafeíco se encuentra
generalmente como ácido clorogénico (Clifford, 1999). Forma hasta un 70% del
total de ácidos hidroxicinámicos en frutas (Macheix y col., 1990).
El ácido elágico es un compuesto bioactivo con potentes efectos
protectores en ciertos tipos de cáncer (Mass y col., 1991; Stoner y col., 2007).
Además, se ha mostrado que los elagitaninos de frambuesas contribuyen
significativamente en la actividad antioxidante y propiedades de vasodilatación
(Mullen y col., 2002).
En estudios realizados en ratas se ha mostrado que el ácido caféico y el
17
ácido clorogénico son absorbidos en el intestino delgado (Sailendra y col., 2006).
En la Figura 3 se muestra la estructura de los ácidos fenólicos.
Figura 3. Estructura de ácidos fenólicos (Lafay, 2008)
Algunas investigaciones sobre el ácido elágico revelan que puede formar
complejos con el ácido gálico y con los taninos forma elagitaninos los cuales no
son absorbidos por humanos, pero una vez hidrolizados a ácido elágico son
absorbibles, este fenómeno se presenta en algunas frutillas. (Lafay, 2008).
Los ácidos hidroxibenzoicos presentan generalmente un esqueleto C6-C1
que deriva directamente del ácido benzoico, los más comunes son: ácido p-
hidroxibenzoico, ácido salicílico, ácido gálico, ácido elágico.
Entre los ácidos hidroxicinámicos los más representativos son el ácido
cumárico, ácido cafeíco, ácido ferúlico y ácido sinápico que pueden formar
conjugados que dan lugar a ácido tartárico, ácido quínico (Lafay, 2008).
2.3.1.2 Estilbenos
Los estilbenos presentan en su estructurar un núcleo de 1,2-difeniletileno
con grupos aromáticos sustituidos por hidroxilos, existen como monómeros,
dímeros, trímeros y polímeros llamados viniferitas (Cassidy y col., 2000; Han y
18
col., 2007; Kundu y Surh., 2008). Los estilbenos y sus análogos han sido
encontrados en arádano, uvas, fresas, arándano rojo, cacahuates y vinos de uva
(Wang y col., 2002; Rimando y col., 2004; Rimando y Barney, 2005; Lyons y col.,
2003). Los estilbenos reportados en el arándano son: resveratrol, piceatannol,
pterostibeno, cuya estructura se muestra en la Figura 4 (Rimando y col., 2004).
Los estilbenos presentan actividad biológica importante como es antioxidante,
antienvejecimiento, alguicida, antiinflamatoria, protegen el sistema cardiovascular,
presentan efectos quimiopreventivos y quimioterapauticos; dichos efectos han
sido demostrado en sistemas in vitro e in vivo (Bhat, 2001; Potter y col., 2002;
Rimando y col., 2004; Rimando y Barney, 2005; Aggarwal and Shishodia, 2006;
Mizuno y col., 2008; Joseph y col., 2008; Shakibaei y col., 2009).
El resveratrol se ha sido relacionado a una baja incidencia en
enfermedades del corazón en poblaciones que consumen vino de manera
frecuente (Hegsted, 1998, Renaud, 1992). El resveratrol también posee actividad
preventiva contra cáncer, esto se ha demostrado en los tres estados de
carcenogénesis: iniciación del tumor, promoción y progresión. (Shakibaei y col.,
2009). El resveratrol es un fuerte antioxidante que inhibe la producción de
especies reactivas de oxígeno. Se ha demostrado que el pterostilbeno tiene
actividad similar a la del resveratrol sobre líneas celulares cancerígenas.
(Rimando, 2002). El pterostilbeno aislado de Dracaena loureiri tiene efecto
antagonista sobre ciclooxigenasa I y II las cuales son enzimas claves en el
proceso de inflamación. Adicionalmente, el pterostilbeno reduce niveles de
glucosa en plasma y tiene actividad similar al del hipoglucemiente metformina, el
mecanismo de acción aún no ha sido elucidado enteramente, sólo se conoce que
no existe estimulación de células B del páncreas por lo que no aumenta la
producción de insulina (Rimando y col., 2004).
19
Figura 4. Estructura de los estilbenos (Rimando y col., 2004)
El piceatannol o astringinina es un análogo del resveratrol, se ha
comprobado que inhibe células preoneoplásicas (células que pueden formar
tumores) en cultivos celulares de mama de ratón, es un potente antioxidante, así
como un antiarrítmico. (Hung, 2001).
El piceatannol aislado de Rheum undulatum presenta efectos
antialérgicos en modelos experimentales de alergia tipo II, la cual involucra
anticuerpos mediados por hipersensibilidad citotóxica. (Matsuda y col., 2000).
Existen numerosos reportes de que los estilbenos presentan actividades
biológicas in vivo, así como en in vitro (Rimando y col., 2002; Shakibaei y col.,
2009).
2.3.1.3 Antocianinas
Antocianina es una palabra que proviene del griego (anthos = flores y
ciano = azul). Forman un grupo de aproximadamente 500 compuestos que
presentan color rojo, púrpura y azul de muchas frutas y vegetales, son solubles en
agua, pertenecen al grupo de flavonoides. Generalmente en las frutillas son
responsables de los colores rojo, violeta y azul. Las frutas rojas, vegetales y vino
20
tinto son las fuentes más ricas en antocianinas para humanos (Delgado-Vargas y
col., 2000; McGhie y col., 2007). Se estima un consumo de antocianinas de 200
mg por día en países del hemisferio Norte y europa. Las frutillas que contienen
concentraciones elevadas de antocianinas, pueden proporcionar 100-300 mg en
una porción de 100g de fruto fresco (Kahkonen y col., 2003).
Químicamente, las antocianinas son derivados glucosilados,
polihidroxilos, polimetoxilos del 2-fenilbenzopireno y contienen dos anillos
benzoilos (A y B) separados por una anillo heterocíclico (C). Las variaciones
estructurales de las antocianinas se deben a las diferencias en el número de
grupos hidroxilo en la molécula, el grado de metilación , la naturaleza y número de
moléculas de azúcares a la molécula de aldehído (aglicona) y la posición de ésta,
así como a la naturaleza y número de ácidos aromáticos y alifáticos unidos a los
azúcares.
Las antocianinas mas comunes son cianidina, delfidina, pelargonidina,
petunidina y malvidina (Hosseinian y Beta, 2007). Las antocianinas son
compuestos reactivos, se degradan rápidamente o reaccionan con otros
constituyentes en mezclas y forman compuestos coloreados u obscuros. La
pérdida de pigmentación de las antocianinas puede ocurrir en presencia de
oxígeno, algunas enzimas o por exposición a altas temperaturas. Por otro lado el
pH tiene un marcado efecto sobre la estabilidad de las antocianinas y sobre el
color de medios que contienen esos pigmentos (Jackman y col., 1987).
En soluciones acuosas las antocianinas existen como un número de
diferentes formas moleculares que están un equilibrio dinámico. Originalmente las
antocianinas existieron en soluciones acuosas como tres formas moleculares
interconvertibles, pero después incrementó a cuatro formas interconvertibles, y
recientemente se reportan ocho estructuras moleculares, las cuales son producto
de la isomerización las últimas cuatro estructuras (Asenstorfer y col., 2003). En la
Figura 5 se muestran las cuatro principales formas interconvertibles de las
antocianinas.
21
Figura 5. Estructuras interconvertibles de las antocianinas (Clifford, 2000)
En la preparación y manufactura de alimentos se debe considerar la vida
de anaquel de los productos las antocianinas están expuestas a diferente pH,
temperatura, humedad del medio ambiente, por lo que es probable que puedan
variar en la estructura, por medio de isomerización o rompimiento de enlaces
pueden llegar a formar otro tipo de compuestos. Asimismo en el paso a través del
tracto gastrointestinal; las antocianinas están expuestas a pH ácido, lo cual puede
afectar su absorción y disponibilidad (McGhie y col., 2007).
En cuanto a los beneficios potenciales a la salud, se sabe de la reducción
de riesgos de enfermedades del corazón, mejora la vista y sus efectos
anticarcinogénicos, antimutagénicos y antiinflamatorios (Pascual, 2008). Muchos
de los beneficios a la salud han sido atribuidos a las propiedades antioxidantes de
antocianinas (Elisia y col., 2007).
2.3.1.4 Diferuloilmetanos
Los compuestos diferuloilmetanos son un reducido grupo de compuestos
fenólicos con dos anillos aromáticos sustituidos con grupos hidroxilos y ligados por
22
una cadena alifática con grupos carbonil (Schaffer y col., 2007). El componente
más sobresaliente de este grupo es la cucurmina que presenta efectos preventivos
en enfermedades como diabetes, obesidad y cáncer. También, se han identificado
múltiples actividades en el proceso de señalización celular, como modulación de la
quinasa AMP que se utiliza ampliamente en la terapia de obesidad (Han y col.,
2007; Schaffer y col., 2007). Existe un estudio llevado a cabo por Du y col. (2006)
en el cual demostrarón el efecto inhibitorio del crecimiento de células de cancer de
colon humano (HT-29), por medio de la inhibición de la expresión de la
Ciclooxigenasa- 2 (COX-2).
2.3.1.5 Flavonoides
Los flavonoides son conocidos como potentes antioxidantes y presentan
diferentes estructuras químicas, su habilidad para atrapar radicales libres de
hidróxidos o peróxidos ha sido demostrado repetidamente in vitro. Los flavonoides
presentan un esqueleto de carbonos C6-C3-C6, las estructuras son sumamente
variadas y se han identificado aproximadamente 5000 flavonoides en plantas
(Harborne, 2000) (Figura 6). Estos presentan efecto antioxidante debido a que
quelan metales, inhibiendo la producción de radicales libres. (Hannum, 2004:
Aron y Kennedy, 2009). Los flavonoides son los compuestos fenólicos más
abundantes en la dieta humana y están principalmente divididos en (Pietta, 2000,
Marchand, 2002):
a) antocianinas, glucosilados derivados de antocianidinas, dan color a
flores y frutos.
b) antoxantinas, un grupo de compuestos coloreados divido en diferentes
categorías: flavonas, flavanas, flavonoles, isoflavonas y sus glucosidos. Los
flavonoles están representados por miricetina, fisetia, quercetina y kaempferol
(Han y col., 2007). Entre los posibles efectos que brindan al organismo están la
modulacipon de enzimas de detoxificación que tienen cierta relación con la
proliferación celular, además de actividad antioxidante.
23
Figura 6. Estructura de los flavonoides (Aronn y Kennedy, 2008)
2.3.1.6 Taninos condensados
Los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular intermedio (más
de 30,000 Da). Son moléculas que pueden formar complejos insolubles con
carbohidratos y proteínas.
Se han clasificado en dos grupos: hidrolizables y no hidrolizables o
condensados. Los hidrolizables constan de unidades de ácido gálico que por
condensación dimérica forman ácido hexahidroxidifénico (gasoil) y que se
esterifíca como poliol. Contienen generalemente 18 unidades de glucosa que
pueden condensarse a otra molécula gasoil y así formar polímeros de alto peso
molecular y son hidrolizables por acción química o enzimática (Figura 7). Los no
hidrolizables, llamados también proantocianidinas, son polímeros de alto peso
molecular y estructuralmente más complejos, formados por unidades de catequina
(flavan-3-ol) con una molécula leucoantocianidina (flavan-3,4-diol) como precursor,
24
condensados entre el C4 del heterociclo (Parr y Bolwell, 2000; Santos and
Scalbert, 2000).
Son los responsables de la astringencia en los alimentos debido a la
precipitación de las enzimas en la saliva. Alimentos como los siguentes contienen
taninos; tés, vinos, granos, frutas (manzanas, plátanos, uvas, ciruelas, peras,
duraznos, sorgo, mijo, cebada, chícharos y fresas, arándanos). En los alimentos
se encuentran predominantemente los taninos condensados, mientras que los
hidrolizables sólo en cantidades traza. También se les han atribuido efectos
antimutagénicos, anticarcerogénicos y antimicrobianos (Parr y Bowell, 2000).
Figura 7. Estructura básica de los taninos condensados (Parr y Bolwell, 2000)
2.3.2 Actividad biológica de los compuestos fenólicos
En los últimos años las enfermedades crónico degenerativas, tales como:
diabetes I y II, enfermedades cardiovasculares, cáncer, arterosclerosis. El estrés
oxidativo se considera importante en estas alteraciones fisiológicas.
La estructura química básica de los polifenoles los hace excelentes
antioxidantes, hacen frente a los radicales libres producidos por el estrés oxidativo
por medio de reacciones del tipo óxido-reducción (Olsson, 1998).
Para neutralizar y combatir las especies reactivas de oxígeno (ROS)
existen estrategias antioxidantes, ya sea por el incremento de enzimas
25
antioxidantes endógenas o mejorando las defensas no enzimáticas por medio de
mecanismos farmacológicos o dietarios. Existen numerosos reportes de que los
polifenoles dietarios poseen una potente capacidad antioxidante por mecanismos
endógenos o exógenos, los primeros son producidos por el organismo como
mecanismo de defensa intrínseco y los segundos son ingeridos en la dieta
(Scarlbert y col., 2005; Han y col., 2007; Maiani y col., 2009).
Se ha demostrado el efecto neuroprotector de los fenoles, especialmente
en el contexto antioxidante. El resveratrol tuvo un impacto en las deficiencias
cognitivas activando la fosforilación de la proteína cinasa; además, in vitro se ha
demostrado que puede disminuir la expresión de adhesión de células vasculares
(Bastianetto y col, 2007). Los polifenoles dietarios pueden tener efecto modulador
en ciertos procesos bioquímicos involucrados en la carcinogénesis. Por ejemplo,
las antocianinas poseen efecto antiinflamatorio que también es una propiedad
quimiopreventiva (Shih y col., 2005); el resveratrol inhibe enzimas involucradas
con la proliferación celular y la replicación del ADN (Sun y col., 1998).
Existen estudios que indican que el genotipo, especie, variedad,
condiciones de cultivo, de almacenamiento, entre otras, determinan el contenido
de compuestos bioactivos en los frutos, además estos factores pueden tener
influencia en la capacidad antioxidante de los frutos (Wang y Stretch., 2001;
Benvenuti y col., 2004).
Se ha demostrado que el resveratrol de frutillas tiene efectos
antiinflamatorios porque es un buen inhibidor de lipooxigenasas, estas enzimas
son responsables de la síntesis de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos
que intervienen en el proceso inflamatorio (Bhat y col., 2001). De manera
importante se ha obseervado que flavonoides y antocianinas tienen efectos
antiinflamatorios (Hale y col., 2008: Lotito y Frey, 2006).
26
También hay reportes sobre la actividad anticarcenogénica de los
polifenoles dietarios. Se suponen dos mecanismos, uno de supresión y otro de
bloqueo, ésto depende del punto de acción. Algunos fenoles llevan a cabo ambos
mecanismos. (Sheu y col., 1998).
Los constituyentes nutracéuticos presentes en arándano son reconocidos
por que son efectivos en las etapas de promoción y progresión en el desarrollo de
tumores. Por ejemplo, el resveratrol presenta la habilidad de prevenir la activación
de carcinógenos y estimula la destoxificación e inhibe daño oxidativo al DNA, lo
cual reduce la respuesta inflamatoria y bloquea el proceso de metástasis para la
progresión de tumoraciones (Bhat y col., 2001; Kundu y col., 2008; Santos-
Cervantes y col., 2007; Stevenson, 2007; Surh, 2003).
Liu y col. (2005) reportaron que las antocianinas de frambuesa negra
pueden reducir el desarrollo de tumores inhibiendo la angiogénesis, una etapa
crítica en el proceso de desarrollo de cáncer. Por su parte Seeram y col. (2006b)
reportaron la evaluación de los efectos antiapoptóticos y antiproliferativos de
frutillas como arándano, zarzamora, arándano rojo, fresa, frambuesa roja,
encontraron que al incrementar la concentración de los extractos de los frutos se
incrementa la inhibición de la proliferación celular.
Lacueva y col. (2005) reportaron que las antocianinas presentes en
arándano tienen importantes efectos en la progresión de enfermedades crónico
neurodegenerativas. Joseph y col. (2003) llevaron a cabo la evaluación de un
suplemento de arándano que mostró potentes efectos benéficos en la enfermedad
de Alzheimer.
Las antocianinas y sus agliconas presentan efectos benéficos en diabetes
ya que pueden interferir en la absorción de glucosa (inhibir el transporte activo)
logrando la protección de las células pancreáticas. Por otro lado, cianidina,
delfinidina y pelargonidina estimulan la producción de insulina en roedores
(Pascual and Sanchez, 2008).
Las frutillas presentan también afectos antimicrobianos debido a los
27
fenólicos presentes en las misma, por ejemplo el arándano rojo es reconocido por
la prevención de enfermedades urinarias ya que impide que ciertas bacterias se
adhieran; asi mismo, el arándano presente efectos benéficos en desordenes
gastrointestinales (Howell y col., 2005; Nohynek y col., 2006).
2.3.3 Compuestos nutracéuticos presentes en el arándano
El arándano es reconocido por sus propiedades benéficas sobre la salud,
existen numerosos estudios convincentes de este potencial (Seeram, 2006 b;
Seeram, 2008; Seeram, 2008a). Contiene compuestos fenólicos, como
antocianinas, flavonoides, proantocianidinas, ácidos fenólicos y estilbenos (Neto,
2007). Existen publicaciones sobre la actividad antimutagénica y anticarcínogénica
de arándano los cuales se corroboraron utilizando ensayos biológicos (Neto,
2007a). Los efectos biológicos de los compuestos fenólicos han sido reportados in
vitro e in vivo (Manach, 2004; Manach, 2005).
Las antocianinas están presentes en concentraciones elevadas en el
arándano, cabe resaltar que no solamente poseen capacidad antioxidante, sino
también tienen ciertos efectos fisiológicos sobre supresión de cáncer (Wang y
Stretch, 2002; Stone-Zafra y col., 2007). Las antocianinas predominantes en
arándano son: cianidina, delfinidina y malvidina (Szajdek y Boroswska, 2008;
Koponen y col., 2007). El flavonoide sobresaliente es miricetina (Hakkinen y col.,
1999). Otros de los compuestos importantes dentro del grupo de los polifenoles
son los estilbenos, a los cuales se les han atribuido efectos antimutagénicos,
antioxidantes, antiinflamatorios, entre otros. Los estilbenos reportados en el
arándano son: resveratrol, piceatanol, pterostilbeno (Rimando y col., 2004;
Rimando y Barney, 2005 ). Los extractos acuosos ricos en fenólicos de los
cultivares arándano ‘Centurion’ y ‘Maru’ presentron potencial antioxidante en in
vivo (Molan y col., 2008). Los miembros del género Vaccinium son fuentes ricas de antocianinas,
28
flavonoides, proantocianidinas o taninos condensados. (Kalt y col., 2000). Las
frutillas del género Vaccinium son ampliamente reconocidas por su capacidad
antioxidante. (Laplaud, 1997). En el Cuadro 6 se muestra en contenido de
compuestos fenólicos y su capacidad antioxidante reportado para V. ashei y V.
corymbisum.
Cuadro 6. Contenido de fenoles en arándano
Cultivar/ especie
Ácidos fenólicos
mg/100g
Antocianinasmg/100g
Fenoles totales mg/100 g
Capacidad antioxidante
TEAC µMol/g
Arándano ojo
de conejo(V.
ashei)
556.14 113.55 261 5.33 - 27.60
Arándano alto
(V.
corymbosum)
399.28 84.12 585 8.24 - 14.83
(Los valores mostrados son en fruto fresco. Seeram, 2006a; Seeram, 2006b; Seeram, 2008, Sellapan y
col., 2002).
2.4 Ensayos para evaluar actividad biológica 2.4.1 Generalidades
La oxidación de productos del metabolismo también causa daño al ADN,
proteínas, carbohidratos y lípidos, contribuyendo al envejecimiento y al desarrollo
de enfermedades relacionadas con este proceso, como son enfermedades
cardiovasculares, debilitamiento del sistema inmune, disfunciones cerebrales y el
cáncer. Existen reportes de la relación entre el consumo de frutas y vegetales y
una baja incidencia de cáncer, fenómeno asociado a la presencia de antioxidantes
en los alimentos mencionados, los cuales pueden proteger del daño que provocan
los radicales libres al ADN, principal fuente de mutaciones y por consecuencia
pueden causar cáncer (Collins y Horváthova, 2001). Un antioxidante es una
29
sustancia orgánica o enzima capaz de contrarrestar los efectos de la oxidación en
tejidos animales (Huang y Prior, 2005).
Por otro lado, un antimutágeno es un compuesto que actúa como agente
protectore en el proceso de carcinogénesis en humanos, actúa contra la
promoción o progresión de las etapas de este proceso, o tal vez destruyendo o
bloqueando el daño al ADN por los mutágenos presentes fuera de la célula,
evitando así mutaciones a nivel celular (Horn y Ferráo, 2003).
Asimismo, un antiinflamatorio es un compuesto que tiene efecto inhibitorio
de los componentes involucrados en el proceso de inflamación, inhiben la
actividad de la enzima ciclo-oxigenasa (COX), resultando en la disminución de la
formación de prostaglandinas y tromboxanos. Las prostaglandinas estan
involucradas en la producción del dolor, inflamacipon y fiebra (Bhat y col., 2001).
Además, la definición de un anticancerígeno es una sustancia que inhibe
las etapas de iniciación, promoción y progresión de la carcenogénesis o
desarrollo de un tumor (Stevenson, 2007; Surh, 2003).
2.4.2 Ensayos de capacidad antioxidante
La mayoría de los ensayos para determinar la capacidad antioxidante
cosisten en la oxidación de un sistema lipídico, se calienta y en el cuál se
monitorea el consumo de oxígeno, la pérdida de sustrato o formación de producto.
Los ensayos en los que se miden los sustratos a los productos pueder dar
resultados que variables dependiendo de la especificidad (Fukumoto y Mazza,
2000).
Entre los métodos que implican atrapar radicales libres supeóxido,
peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso, radicales hidroxilo, radicales peróxilo
están los que utilizan compuestos “azo” para generar radicales libres peróxilo
como los métodos TRAP (por sus siglas ne inglés, Total Radical- Traping
Antioxidant Parameter) y ORAC (por sus siglas en inglés, Oxygen- Radical
Absorbance Capacity). Otros métodos utilizan radicales libres como ABTS o 2,2-
30
azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfanato) y DPPH o 2,2-difenil-1-picrilhidrazil que
pueden ser expresados como TEAC (por sus siglas en inglés Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity) (Sanchéz y col., 2003).
2.4.2.1 Método DPPH
El radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) es uno de los pocos
radicales orgánicos estables, posee un color violeta y se encuentra disponible de
manera comercial. El ensayo se basa en la reducción del DPPH por los
antioxidantes mediante la pérdida del color del radical, monitoreando el cambio en
la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro (Prior y col. 2005). Los
resultados pueden expresarse como TEAC comparando cantidades estándar del
antioxidante sintético Trolox. (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2- ácido
carboxílico, an análogo de la vitamina E). El TEAC se expresa en la concentración
milimolar de una solución de Trolox que tiene una capacidad antioxidante
equivalente a una solución 1 mM de la sustancia que se está evaluando (Antilovich
y col., 2002) La reacción del antioxidante y el DPPH se muestra en la Figura 8.
Figura 8. Reducción del DPPH por el antioxidante (Moon y Shibamoto, 2009)
31
2.4.2.2 Método ABTS El radical 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfonico) (ABTS+) es
un antioxidante que posee un color verde-azul; se requiere previa generación para
poder llevar a cabo la reacción química. Este radical se reduce por los
antioxidantes presentes en el medio, presentándose pérdida del color del ABTS,
monitoreando el cambio en la absorbancia a 734 nm en un espectrofotómetro
(Prior y col. 2005). Los resultados pueden expresarse como aquivalentes TEAC
comparando cantidades estándar del antioxidante sintético Trolox (6-hidroxi-
2,5,7,8- tetrametilcromano-2- ácido carboxílico, análogo de la vitamina E) (Scalbert
y col., 2005). El método ABTS es aplicable tanto para fase acuosa como para fase
lipídica, es decir por este método se puede calcular la capacidad antioxidante de
sustratos de carácter hidrofílicoy lipofilíco. Es un radical que se produce por
oxidación del ABTS por persulfato de potasio, para formar el radical estable
(Figura 9). La capacidad antioxidante de productos naturales como carotenoides,
fenólicos, y algunos antioxidantes del plasma son determinados por la reacción de
decoloración del ABTS (Moon y Shibamoto, 2009).
Figura 9. Formación del radical estable de ABTS con persulfato de potasio (Moon y Shibamoto, 2009)
32
2.4.3 Actividad antioxidante por ensayo biológico
La investigación acerca de los antioxidantes ha ido en aumento, desde la
decada de los 90´s y se han desarrollado una gran variedad de métodos para
medir la capacidad antioxidante de los alimentos, compuestos y suplementos (Liu
y Finley, 2005). De acuerdo con Wolfe y col. (2008) los protocolos de capacidad
antioxidante in vitro no reflejan las condiciones de la célula y no consideran la
biodisponibilidad, el consumo y el metabolismo de los compuestos antioxidantes.
Asimismo los métodos químicos para determinar la capacidad antioxidante no
incluyen compuestos apropiados para llevar a cabo la reacción, los organismos
biológicos son sumamente complejos y los compuestos antioxidantes podrían
operar por un mecanismos de acción diferentes, no se conoce totalmente la acción
de las enzimas digestivas y otra enzimas sobre los antioxidantes, así como las
posibles interacciones entre las enzimas y otros componentes con los compuestos
antioxidantes presentes en los alimentos. Debido a estas limitaciones Wolfe y col.
(2008) desarrollaron un método para determinar la actividad antioxidante celular
(CAA por sus siglas en inglés Cellular Antioxidant Activity), este método puede
revelar más información que los métodos químicos in vitro por que toma en cuenta
algunos aspectos de la célula (metabolismo, difusión, distribución). Los ensayos in
vivo con animales y humanos son los mejores, pero estos modelos son muy caros
y para llevarse a cabo requieren largos periodos de tiempo, por lo tanto no son
convenientes para el tamizaje inicial de antioxidante en alimentos (Liu and Finley,
2005).
El ensayo de actividad antioxidante celular mide la habilidad de los
antioxidantes para prevenir la formación del compuesto fluorescente
diclorofluoresceina (DCF). El DCFH-DA (2´,7´-diclorofluorescina diacetato)
compuesto no fluorescente penetra la membrana celular, en el citosol las
esterasas citoplasmaticas, lo convierten en DCFH (compuestos no fluorescente
y más polar), este compuesto es oxidado por los radicales libres (ROS) que son
producidos cuando la célula se expone a un agente inductor como por ejemplo
2,2-azinobis(2-amidinopropano)-dihidrocloro (ABAP) (genera radicales libres), los
radicales libres generados provocan que el DCFH transfiera un proton y se forme
33
DCF; de esta manera hay producción de DCF (fluorescente) a partir de DCFH (no
fluorescente) (línea celular HepG2 o HL-60) (Figura 10). La disminución en la
fluorescencia comparado con un control es indicativo de la actividad de los
compuestos antioxidantes en la célula (Agnihotri y col., 2009; Takamatsu y col.,
2003; Wolfe y Liu, 2007; Wolfe y col., 2008).
Figura 10. Reacción fluorescente en ensayo DCFH (Moon y Shibamoto, 2009)
Es importante remarcar que la estructura de los antioxidantes tiene
influencia en el potencial antioxidante que presentan, asimismo en los alimentos
existe una compleja mezcla de compuestos que presentan efectos de interacción
entre ellos y pueden aumentar el efecto antioxidante o inhibirlo (Huang y col.,
2005; Liu y Finley, 2005).
El ensayo de actividad antioxidante celular es usado para determinar la
actividad antioxidante de compuestos puros (fenólicos y carotenoides), frutos y
vegetales ( y Liu, 2005). Los resultados obtenidos a partir de este ensayo pueden
ser usados para predecir los resultados in vivo además de que es un excelente
método de tamizaje comparado con los tradicionales métodos químicos (Agnihotri
y col., 2009; Wolfe y col., 2008).
34
III JUSTIFICACIÓN
El cultivo de arándano en México es reciente, por ello es necesario
conocer el potencial nutracéutico de los materiales, así se tendrá la posibilidad de
cultivar aquellos que compitan exitósamente con los que se desarrollan en otros
países. De esta manera, la identificación de cultivares con mensajes nutracéuticos
sobresalientes ayudaría a incrementar su valor agregado.
35
IV OBJETIVOS
1. OBJETIVO GENERAL.
Determinar el potencial alimentario y nutracéutico de cultivares de arándano
seleccionados en la zona de la Meseta Tarasca en Michoacán, México.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1. Evaluar la composición química y las características fisicoquímicas de
arándanos cultivados en México.
2. Extraer y caracterizar los compuestos fenólicos presentes en los
materiales.
3. Estimar la capacidad antioxidante in vitro.
4. Obtener fracciones del material sobresaliente en compuestos fenólicos y
capacidad antioxidante.
5. Evaluar la capacidad antioxidante por medio de cultivo celular en los
arándanos y en las fracciones obtenidas.
6. Identificar y caracterizar los compuestos activos en los materiales
usados en el ensayo anterior.
36
V MATERIALES Y MÉTODOS
Esquema general de trabajo
Fraccionamiento del cultivar Biloxi
Figura 11. Esquema general de trabajo
Colecta de los materialesColecta de los materiales
Tres cultivares de arTres cultivares de aráándano ndano
CaracterizaciCaracterizacióónnfisicoqufisicoquíímicamica
CaracterizaciCaracterizacióón n nutracnutracééuticautica
EvaluaciEvaluacióón del potencial n del potencial nutracnutracééuticoutico
CapacidadCapacidadAntioxidanteAntioxidante
in vitroin vitroABTSABTSDPPHDPPH
Fenoles totalesFenoles totalesFlavonoides Flavonoides AntocianinasAntocianinasEstilbenosEstilbenos
ÁÁcidos fencidos fenóólicoslicos
CapacidadCapacidadantioxidanteantioxidante
Ensayo Ensayo DCFHDCFH --DADA
CultivoCultivocelularcelular
37
5.1 Materiales.
Se colectaron los materiales de tres cultivares de arándanos comerciales
(Biloxy, Misty y Sharpblue) cultivados en el municipio de Los Reyes, Michoacán.
Se colectó aproximadamente 1 kg de cada cultivar. Los arándanos se limpiaron,
congelaron con nitrogeno líquido y se almacenaron a -70°C hasta su posterior
liofilización. Posteriormente, se procedió a pulverizarlos, después se almacenaron
-70°C protegidos de la luz.
5.2 Métodos.
5.2.1. Caracterización fisicoquímica de los arándanos.
5.2.1.1 Determinación de composición química
A los arándanos se les determino el contenido de proteínas (12.1.07),
lípidos (31.4.02), cenizas (32.1.05), humedad (4.1.06), carbohidratos (16.267), y
fibra dietaria (985.29) dietaria por la metodología oficial descrita por la AOAC
2000, cada uno de los parámetros fisicoquímicos se determinaron por triplicado.
5.2.1.2 Sólidos solubles La determinación de sólidos solubles de los arándanos se realizó por
medio de un refractómetro (Atago Model PR-1. Tokio).
5.2.1.3 Acidez titulable La acidez titulable de los arándanos se determinó según el método oficial
(939.05) de la AOAC 2000. La acidez titulable se reporta en miliequivalentes de
ácido cítrico por gramo de muestra. La determinación se realizó por triplicado.
38
5.2.1.4 pH
El pH de los arándanos se determinó a partir de una suspensión de 10 g
de arándanos molturados y 100 ml de agua destilada a 25 °C, recientemente
hervida (Método 02-52, AOAC 1998). La suspensión se agitó en un vortex 15 s
cada 5 min a una velocidad alta hasta completar un tiempo de 20 min. Como
siguiente paso se determinó el pH a la suspensión en agitación. La determinación
se realizó por triplicado.
5.2.1.5 Determinación de color de los arándanos
El color de los arándanos se determinó utilizando un Colorímetro Mod.
DP-400 (Kónica Minolta Sensing, Inc. NJ, USA). Se obtuvieron los parámetros de
color L, a y b, en la escala Hunter lab (Figura 12). El valor L representa la
luminosidad del color en un rango de 0 (negro) a 100 (blanco); a representa la
escala de rojo (positivo) al verde (negativo) y b la escala del amarillo (positivo) al
azul (negativo). El color se expresa en función de la luminosidad (L) y el croma (C)
[ a2 + b2)1/2]. Las Lecturas se realizaron por triplicado.
Figura 12. Escala Hunter (HunterLab. Inc., 2008)
39
5.2.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos. 5.2.2.1 Compuestos fenólicos 5.2.2.1.1 Extractos crudos para determinación de compuestos fenólicos
totales. Los extractos crudos se realizaron por triplicado de la siguiente manera, 1
g de arándano liofilizado se incorporó en tubos de polipropileno de 50 ml, se les
adicionó 20 ml de metanol ó agua y se dejaron en agitación a 200 rpm durante 24
hr. Posteriormente se centrifugaron a 13000 rpm por 10 min; el residuo sólido se
resuspendió nuevamente en 20 ml de metanol ó agua, se mantuvo en agitación
por 24 hr y posteriormente se centrifugó. Los dos extractos se combinaron y
protegieron de la luz, posteriormente se concentraron en rotavapor. Enseguida se
resuspendió el extracto en 2 ml de metanol o agua. Se almacenó a -20° C hasta
su utilización (Aparicio-Fernández y col., 2006).
5.2.2.1.2 Determinación de fenoles totales Los fenoles totales se determinaron por triplicado para extractos
metanólicos y acuosos, según el método de Folin-Ciocalteu, descrito por Singleton
y Rossi (1965). Se realizó a partir de 50 μl del extracto crudo y se adicionaron 200
μl de agua y 250 μl del reactivo de Folin Ciocalteu (50% v/v) mezclando
vigorosamente. Al transcurrir 3 min se adicionaron 500 μl de Na2CO3 (7.5% w/v) y
se mezclaron vigorosamente, enseguida se llevaron las muestras a incubación
durante 15 min a 45°C.
La absorbancia se registró a 760 nm usando un espectrofotómetro
Beckman DU 640. Los cálculos se realizaron a partir de una curva estándar de
calibración de ácido gálico y los resultados se expresaron en miligramos-
equivalentes de ácido gálico por g de extracto seco.
40
5.2.2.1.3 Determinación de flavonoides totales. La cuantificación de flavonoides totales se desarrolló por medio de la
técnica empleada por Lock (2006). Se pesó 1 g de cada muestra liofilizada en
tubos de polipropileno de 50 ml, y se les adicionaron 2 ml de etanol 80 %, se
sonicaron 30 min a 60°C; posteriormente se centrifugaron durante 10 min a 13000
rpm. Una vez centrifugadas las muestras, se les retiró el sobrenadante y fue
transferido a otro tubo. Posteriormente se tomaron 100 µl del extracto, se les
adicionaron 200 µl de acetato de potasio (1M), 200µl de nitrato de aluminio al 10
% y 500 µl de etanol al 80 %; se dejó reposar durante 40 min y se registró su
absorbancia a 415 nm en la región UV visible. La cuantificación de flavonoides
totales se realizó por triplicado. Los cálculos se realizaron a partir de una curva
estándar de calibración de qurcetina y los resultados se expresaron en mg
equivalentes de quercetina por g de extracto seco.
5.2.2.1.4 Determinación de antocianinas totales
Las antocianinas totales se determinaron por triplicado según el método
descrito por Abdel-Aal y Hucl (1999). Se obtuvo un extracto metanólico a partir de
1 g de arándano liofilizado, posteriormente se le adicionaron 5 ml de etanol-HCl 1
N (85:15 v/v) y se mezclaron vigorosamente (200 rpm). El pH de la solución se
ajustó a 1 con HCl 4 N. La mezcla se agitó por 12 horas a temperatura ambiente,
protegida de la luz, después se centrifugó por 15 min a 13 000 rpm. El
sobrenadante se colocó en un matraz volumétrico de 10 ml y se aforó con etanol
acidificado.
La absorbancia se registró a 535 nm. Para calcular las antocianinas
totales se utilizó el coeficiente de extinción molar (25,965 cm-1 M-1), el peso
molecular de la cianidina-3-glucósido (C3G) (449.2) y los resultados se expresan
como mg de cianidina 3-glucósido por gr de arándano liofilizado.
5.2.2.1.5 Extracción, hidrólisis de antocianinas e identificación por HPLC
La extracción de antocianinas se realizó por triplicado utilizando el método
descrito por Romani y col. (2004). Los extractos se obtuvieron a partir de la adición
41
de 15 ml de metanol al 70% ajustando a un pH 2 con ácido fórmico y agitando a
80 rpm durante 3 hr. Este proceso se realizó tres veces y todos los extractos se
combinaron y evaporaron a sequedad en rotavapor, el residuo finalmente se
resuspendió en 2 ml de H2O/CH3CN/MeOH/HCOOH (45:22.5:22.5:10 v/v/v/v). La
hidrólisis se llevó a cabo por el método propuesto por Takeoka y col. (1997), a 1
ml del extracto se le adicionó 1 ml de HCl 2 N en un baño de agua hirviendo por
60 min y enseguida se enfrió en baño de hielo. Las antocianinas se extrajeron dos
veces con 2 ml de acetato de etilo, se concentraron a sequedad en rotavapor y se
resuspendieron en 1 ml de ácido fórmico al 10%. Por último, el extracto se
centrifugó a 13 000 rpm por 10 min para su inmediato análisis.
Para el análisis en HPLC se utilizó una columna EPS C-18 (7x 57 mm),
Rocket (Deerfield, IL. USA). El solvente A fue agua al 5% con ácido fórmico y el
solvente B acetonitrilo al 5% con ácido fórmico. El gradiente lineal que se utilizó
en la elusión de antocianinas fue: 5% B en 5 min 10% B en 10 min 18% B en 20
min, finalmente la columna se lavó con 95% B por 30 min y se equilibró con 100%
de A por 3 min. El volumen de inyección fue de 20 µl con un flujo de 1 ml/min. El
tiempo total de cada corrida fue de 40 min, la longitud de onda utilizada para
detectar antocianinas fue de 520 nm.
5.2.2.1.6 Caracterización de flavonoides por HPLC
Los flavonoides fueron analizados por triplicado a partir de extractos
metanólicos hidrolizados, por el método reportado por Graham (1991). 1 ml de
extracto fue evaporado en rotavapor a 40 °C. El residuo se diluyó con 3 ml de HCl
2 N y se llevó a 95 °C por 2 hr, se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los
compuestos orgánicos fueron extraídos a partir de la solución acidificada con 4 ml
de acetato de etilo, se separó la fase orgánica del resto de la mezcla. El acetato
de etilo fue removido utilizando rotavapor a 40 °C. El residuo se resuspendió en 1
ml de metanol al 80% y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min, enseguida se
utilizó para el análisis por HPLC.
42
Para los análisis de HPLC se utilizó un Detector PDA, Módulo de
separación 2690 (Waters Co. Milford, MA, USA), y una columna de separación
Platinium EPS C-18 (7 x 57mm) Rocket (Deerfield, IL. USA). El solvente A fue
agua pH 2.8 ajustada con ácido acético y el solvente B acetonitrilo. El volumen de
inyección fue de 30 µl con un flujo de 2.5 ml/min. Para la elución de flavonoides el
gradiente lineal utilizado fue: 10% B en 2.5 min, 12% B en 6 min, 23% B en 18 min
y 35% B en 24 min, al final la columna fue lavada con 95% B durante 3 min y
equilibrada con 100% de A durante 3 min, el tiempo total de corrida fue 30 min.
Las longitudes de onda que se utilizaron para la detección de flavonoides son 260
nm y 342 nm.
5.3 Determinación de la capacidad Antioxidante 5.3.1 Método DPPH
La capacidad antioxidante se realizó a los extractos metanólicos y
acuosos. Se utilizó el método original de Brand-Williams y col. (1995) modificado
por Fukumuto y Mazza (2000) en micro placa.
A una placa de 96 pozos se añadieron 22 µl de extracto [expresada
como 100 μM equivalentes de (+) Trolox], ó BHT (1000 μM) y 200 µl de solución
de DPPH a 150 μM, preparada en metanol al 80%. El extracto y los estándares se
prepararon por triplicado, usando un rango de concentración de 0-500 µl. Se utilizó
ácido gálico y BHT como controles positivos y DPPH en metanol al 80% como
control negativo, utilizando metanol al 80% como blanco. Se registraron las
lecturas de la placa cada 10 min de 0 a 90 min a 520 nm en un espectrofotómetro
(Benchmark PLUS, BIORAD S.A de C.V.). La placa se mantuvo cubierta para
protegerla de la luz y a temperatura ambiente entre las diversas lecturas.
43
5.3.2 Método ABTS+
Este método lo desarrolló Re y col. (1999). En un vial se mezclaron 5 ml
de ABTS (7 mM) y 88 μL de la solución de persulfato de potasio (140 mM), se
cubrió el vial con papel aluminio; la nueva solución (A) se almacenó en un lugar
oscuro durante 12 horas a temperatura ambiente para la formación del radical.
Una vez transcurridas 12 hr se mezclaron 1000 μL de la solución A, que
contiene el ABTS•+ y 4.5 ml de etanol. Esta nueva solución B presentó una
absorbancia entre 0.7 y 1, se verificó este valor en el espectrofotómetro UV-VIS a
una longitud de onda de 734 nm.
En una placa de 96 pozos se añadieron 20 µl de extracto y 230 µl de
solución de ABTS preparada en etanol. El extracto y los estándares se prepararon
en triplicado, usando un rango de concentración de 0-500 µl.
Se registraron las lecturas de la placa a los 6 min 734 nm en un
espectrofotómetro (Benchmark PLUS, BIORAD S.A de C.V.). La placa se mantuvo
cubierta, para protegerla de la luz y a temperatura ambiente entre las diversas
lecturas.
Cálculo de capacidad antioxidante expresada como equivalentes de Trolox (TEAC)
Según Van den Berg (1999) los resultados también se pueden
expresar comparando con un estándar de antioxidante sintético Trolox (análogo
hidrosoluble de la vitamina E). Para esto, se hicieron diferentes concentraciones
de Trolox para hacer una curva estándar, se aplicó el mismo tratamiento para las
muestras y los controles. Los resultados se expresaron como equivalentes de
capacidad antioxidante de Trolox (TEAC).
44
TEAC muestra = A muestra/( m* [ muestra ])
Donde:
TEAC es la capacidad antioxidante de la muestra expresada en
equivalentes de Trolox, A muestra es la absorbancia de la muestra a los 30 min, m es
la pendiente de la curva de calibración de Trolox y [muestra] es la concentración
de la muestra en µM
5.4 Obtención de extracto ASE para determinación de fenólicos
La obtención del extracto se realizó según la metodología descrita por
Rimando y col. (2004) y Rimando y Barney (2005). Se utilizó un aparato ASE
(siglas en inglés Accelerated Solvent Extraction) esta técnica involucra la
extracción por medio de solventes líquidos, bajo ciertas condiciones de
temperatura y presión. (ASE apparatous Dioed Corporation, Sunnyvale, CA). Se
realizó un extracto a partir de 10 g de arándano liofilizado con aproximadamente 2
g de arena purificada, la cual se utilizó para empacar el cartucho de extracción
(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Las condiciones de extracción fueron las
siguientes: temperatura 40 °C, presión 1000 psi, iempo 5 min. Disolvente de
extracción metanol: acetona: agua: ácido acético (40:40:20:0.1), con cuatro ciclos.
Los solventes orgánicos se eliminaron utilizando rotavapor a 40 °C. El residuo
obtenido se secó en un concentrador aplicando vacío (ThermoFisher SCIENTIFIC.
Thermo Savant). El extracto obtenido se guardó a 4 °C hasta su utilización.
5.5 Fraccionamiento
Una vez realizadas las determinaciones de compuestos fenólicos totales,
flavonoides totales, antocianinas totales y la capacidad antioxidante por los
45
métodos químicos ABTS+ y DPPH se seleccionó el material con mayor contenido
en compuestos fenólicos y mayor capacidad antioxidante y se fraccionó, utilizando
un sistema rápido de cromatografía en columna (biotage Flash). Se utilizaron
como solventes fase A metanol al 1% y como fase B metanol al 100%. El
gradiente usado fue 0% B hasta 100% B. Inicialmemte la columna se lavó con
metanol y se obtuvieron 40 subfracciones de 21 ml cada una, posteriormente se
examinaron por medio de una cromatografía en capa fina, después se combinaron
las subfracciones comunes, en base a los resultados obtenidos en la
cromatografia en capa fina.Enseguida Se concentraron en rotavapor,
posteriormente se secaron en un concentrador aplicando vacío. (ThermoFisher
SCIENTIFIC. Thermo Savant).
5.6 Actividad antioxidante en cultivo celular
Se utilizó la metodología de Rosenkranz y col. (1992). El ensayo de
capacidad antioxidante con cultivo celular se realizó por triplicado. Se utilizaron los
extractos ASE de los cultivares de arádano y las fracciones de Biloxi. El ensayo de
actividad antioxidante que se llevó a cabo utilizando el compuesto fluorecescente
diacetato diclorofluoresceina (DCFH-DA) y un cultivo celular HL-60, el cual se
cultivó en un medio RPMI 1640 con suero bovino fetal y 60 mg/ml del antibiótico
amikacina a 37°C en un ambiente de humedad de 95% y 5% de CO2. Para el
ensayo se tomaron 125 ul de la suspensión celular (1 x 10 6 células/ml) y se
adicionaron a una microplaca de 96 pozos. Después del tratamiento con diferentes
concentraciones de las muestras por 30 min, las células se trataron con el
estimulante PMA (forbol acetato miristato 100 ng/ml) por 30 min. DCFH-DA se
adicionó por 15 min. Los niveles de DCF producido se monitorearon a una longitud
de onda de 485nm (excitación) y 530nm (emisión) en un espectrofotometro
PolarStar. La habilidad de los materiales para inhibir los oxidantes exógenos se
midió por la oxidación del compuesto DCFH-DA (no fluorescente) a DCF
(fluorescente) en las células HL-60. Se utilizó como control positivo con PMA
46
(Forbol 12-miristato de 13-acetato). La disminución en el nivel de fluorescencia se
relaciono con el grado de actividad del compuesto que estaba a prueba. Se
calculó el valor de concentración media inhibitoria (CI50), el cual se obtuvo a partir
de una curva dosis-respuesta por medio del porcentaje de producción de DCF
contra la concentración del Trolox como control positivo.
5.7 Identificación y caracterización de compuestos fenólicos en los extractos ASE y fracciones
5.7.1 Caracterización de antocianinas por HPLC
La determinación de antocianinas y antocianidinas se llevó a cabo a partir
del extracto ASE, se utilizó 1 mg de extracto y se disolvió en 100 µl de agua:
metanol 80:20 (v:v) con 0.1% HCl y fue analizado por HPLC. Se utilizó un HPLC
Agilent Technologies 1200 Series y una columna Agilent Zorbax SB-C18 5 µm, 4.6
x 250 mm. La fase A fue agua con pH 1.68 acidificada con ácido fórmico y la fase
B agua: acetonitrilo: ácido fórmico 50:45:5 (v: v: v). El volumen de inyección fue de
20 µl y el flujo de 0.9 ml/min. El gradiente utilizado para la identificación de
antocianinas y antocianidinas fue: 20% B en 0 min, 25% B en 10 min, 33% B en 20
min, 100% B en 45 min, 0% B en 46 min. Las longitudes de onda utilizadas fueron;
520 y 530 nm.
5.7.2 Caracterización de ácidos fenólicos y flavonoides por HPLC
La determinación de ácidos fenólicos y flavonoides se llevó a cabo a partir
del extracto ASE, se utilizó 1 mg de extracto y se disolvió en 100 µl metanol y fue
analizado por HPLC. Se utilizó un HPLC Agilent Technologies 1200 Series y una
columna Inertsil ODS-2 5 µm, 4.6 x 250 mm. La fase A fue agua al 1% con ácido
fórmico y la fase B metanol al 1% con ácido fórmico. El volumen de inyección fue
47
de 20 µl y el flujo de 1 ml/min. El gradiente utilizado para la identificación de
antocianinas y antocianidinas fue: 5% B en 3 min, 70% B en 45 min, 100% B en 48
min, 0% B en 53 min. Las longitudes de onda utilizadas fueron; 254, 280, 320 y
370 nm.
5.7.3 Extracción y cuantificación de estilbenos por CG-MS
Los estilbenos se extrajeron y cuantificaron a partir del extracto ASE
descrito previamente. La extracción se realizó con 1 ml de acetato de etilo (tres
veces), enseguida se evaporó a sequedad bajo una corriente de nitrógeno, el
residuo se recuperó con acetato de etilo y se paso a un vial ámbar para GC/MS,
después se secó en un concentrador aplicando vacío (ThermoFisher SCIENTIFIC.
Thermo Savant), el residuo obtenido posteriormente se derivatizó y analizó
mediante GC/MS. El análisis de estilbenos se realizó mediante la metodología
publicada por Soleas (1995), modificada por Rimando y col. (2004). Se partió de 1
mg de extracto ASE, se diluyó en un 100 µl de bis8-trimetilsilil)trifluoroacetamida:
dimetil formamida 1:1 (v:v) en un vial para cromatografía de gases de 2ml, el vial
se calentó a 75 °C durante 40 min posteriormente se enfrió a temperatura
ambiente, la muestra se analizó en cromatógrafo de gases acoplado a masas
(JEOL GCMate II System. EE.UU., Inc. Peabodu,MA) Se manejaron las siguientes
condiciones de operación: la temperatura inicial de 150 °C, aumentando 25 °C/
min hasta alcanzar 260 °C, a partir de ahí se manejo un incremento de 1 °C/min,
cuando la temperatura alcanzó 270 °C se aumentaron 60 °C/min hasta lograr una
temperatura de 320 °C, la cual se mantuvo durante un tiempo de 2 min. Se utilizó
una columna de 30m x 0.25 mm, 0.25 µm, ZB-50 (Phenomenex, Torrance, CA).
Se usó un gas de ultrapureza de helio (nexAir, Batesville, MS) a una velocidad de
flujo de 1ml /7min. El análisis de resveratrol, pteroestilbeno, desoxirapontigenina,
trimetoxiestilbeno y pinoestilbeno se llevó a cabo utilizando tiempos de retención
de 18.22, 16.17, 15.72, 8.32, 17.32, respectivamente. El resveratrol se monitoreó
usando m/z 444, la desoxirapontigenina y pinoestilbeno usando m/z 386, el
pteroestilbeno y el trimetoxiestilbeno usando m/z 328.
48
5.8 Análisis estadístico
Los experimentos de fenoles, flavonoides y antocianinas totales y la
capacidad antioxidante por DPPH Y ABTS se realizaron por triplicado en tres
experimentos independientes. Se realizaron análisis de correlaciones entre fenoles
totales, DPPH y ABTS. Las caracterizaciones de fenólicos por HPLC Y CG/MS se
realizaron por duplicado. La actividad antioxidante se llevó a cabo por duplicado.
Se analizaron diferencias para todas las determinaciones mediante el método de
Tukey
49
VI RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Caracterización fisicoquímica de los arándanos 6.1.1 Características fisicoquímicas y proximales
Entre las características importantes que pueden determinar la calidad
interna de los arándanos se encuentran aquellas que involucran la composición
del fruto, como son la concentración de sólidos solubles (°Brix), la acidez titulable
(ácido cítrico), pH, color; además de otras características fisicoquímicas. En el
Cuadro 7 se representa la caracterización fisicoquímica de los tres cultivares de
arándano (Vaccinium sp) evaluados.
Cuadro 7. Composición fisicoquímica de los arándanos
Parámetro fisicoquímico Biloxi Misty Sharpblue
Color
L* 11.93a 19.09b 9.68a
a* 0.82a 1.44b 1.36b
b* -5.10a -5.27a -2.51b
pH 2.85a 3.1a 2.99a
Acidez titulable 2.88±0.14 a 1.31±0.01 b 1.45±0.032 b
° Brix 12.2a 13.5a 14.0a
Composición Proximal
Humedad 85.5±0.5a 92±1.5b 87±1.5a
Cenizas 0.34±0.01a 0.2±0.01a 0.21±0.01a
Proteína 0.29±0.01a 0.22±0.02a 0.21±0.17a
Fibra 2.70±0.2a 1.7±0.2 b 2.30±0.2a
Lípidos .64±0.02a 0.7±0.2a 0.5±0.2a
Carbohidratos 12.17±2.02a 10.8±1.8b 15.3±2a
Los resultados mostrados son en 100 g de arándano deshidratado.
Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar.
Letras diferentes por fila indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba
de Tukey).
50
Las características fisicoquímicas están estrechamente relacionadas con
el grado de madurez de los frutos y con el grado de aceptación de los mismos,
debido a esto son importantes.
La determinación de color se llevó a cabo en aproximadamente 20 g
arándano utilizando un Colorímetro Minolta DP-400. Los valores fueron
expresados por medio de las parámetros de la escala de Hunter L*, a* y b*. Es
importante mencionar que el color es un factor determinante en la aceptabilidad
de los arándanos, ya que estas frutillas se relacionan con un intenso color azul,
indicativo del grado de madurez. Los valores de luminosidad (L*) de los tres
cultivares van desde 9.68 a 19.09 y son indicativos de una baja luminosidad, Misty
fue la que mostró un mayor valor para dicho parámetro, seguida de Biloxi y
Sharpblue, los valores de a* y b* muestran el color azul que caracteriza a los
arándanos, la más azul fue Misty sucesivamente Biloxi y Sharpblue, los valores
para los parámetros de la escala de Hunter son similares a los que reportan
Giovanetti y Buratti (2009) para arándanos de Italia, tanto cultivado como silvestre
y coincide con los valores reportados por Silva y col. (2005) para arándanos
cultivados en Mississippi y Michigan, USA.
Los valores de pH registrados para los arándanos son ácidos, esto se
debe a que en los frutos más del 90% del volumen celular lo ocupa la vacuola, la
cual usualmente es muy ácida, presenta pH inferior a 5 (Nanos y Kader, 1993); los
resultados encontrados en los frutos maduros de arándano fueron de pH´s entre
2.85 y 3.11. El valor de pH más elevado fue registrado para Misty y los menores
para Sharpblue y Biloxi, y son similares a la acidez reportada para V. corymbosum
con un valor de 3.1 (Rodriguez y col., 2007; Ochmian y col., 2009). Debido al pH
que presentan los arádanos se pueden clasificar dentro del grupo de frutos ácidos,
que tambien concuerda con sus exigencias de un suelo ácido con un pH entre 4.5
y 5.5 (Darnell, 2000; Rodríguez y col., 2007).
La acidez titulable (% ácido cítrico) de los cultivares de arándano
analizados fluctuó entre 2.88% para Biloxi y 1.315% para Misty. Por lo tanto, se
51
puede apreciar que existe efecto significativo del cultivar en la concentración de
ácidos orgánicos. La explicación de esta variación no es muy clara; los ácidos
orgánicos presentan funciones muy variadas, la concentración de los mismos se
puede ver afectada por la resppiración aeróbica y anaeróciba un ejemplo de las
condiciones anaeróbicas es el ciclo de ácidos tricarboxílicos, que en muchos frutos
conforma el segundo depósito de energía más importante, seguido de los
carbohidratos. Por otro lado, los ácidos orgánicos son base e intermediarios de los
productos para la síntesis en el metabolismo primario y secundario del fruto
(Osterloh y col., 1996). Kays en el 2004 confirma que los precursores inmediatos
de los ácidos orgánicos no son solamente otros ácidos orgánicos sino también los
carbohidratos y pueden tener un papel importante en el aumento de la
concentración. Los principales ácidos orgánicos del arándano son el cítrico y el
málico, los cuales varían en concentración en función de la variedad (Green, 1979;
Whiting, 1958).La relación inversa entre acidez y pH se esperaba ya que el pH
esta directamente influenciado por la concentración de ácidos orgánicos presentes
en las frutillas (Hoshino y Bridle, 1980).
La concentración de sólidos solubles representa la concentración de
sacarosa u otros carbohidratos presentes en los frutos, este parámetro se
relaciona con la dulzura y madurez óptima de los frutos. Los valores encontrados
muestran una variación de 12.2 a 14.0 °Brix, correspondiendo el primer valor al
cultivar Biloxi y el segundo a Sharpblue. Estos valores son más elevados a los que
reportan para arándanos cultivados en USA Kalt y McDonald (1996) encontraron
una concentración de 10 °Brix, esta diferencia se puede deber a varios factores,
algunos relacionados a procesos bioquímicos.
Ellis y Gray (1986) encontraron en plantas sometidas a bajas
temperaturas (-6 °C) una activación de diversas enzimas, como la ribulosa 1-5
bifosfatocarboxilasa, que participa en la síntesis de diversos carbohidratos en las
plantas, por lo que incrementa la concentración de sólidos solubles. Es importante
mencionar que la activación enzimática de alguna vía metabólica puede depender,
tanto de factores endógenos de la planta (genotipo, es decir genes que codifiquen
52
para la síntesis de ciertas enzimas involucradas en el proceso), como de factores
exógenos: condiciones de cultivo, medio ambiente, condiciones climáticas,
localización geográfica, enfermedades, estrés, maduración, condiciones de
cosecha y almacenamiento, entre otros factores (Moyer y col., 2002; Sellapan y
col., 2002; Wang y col., 2009), que pueden afectar la orientación de la plantación,
arquitectura de la planta, inclinación de las hojas, densidad de cloroplastos,
estomas (fenotipo) como señalan Azcón-Bieto y Talpon, 1993.
La composición proximal proporciona un panorama general del valor
nutricional de los alimentos (Kirk, 1993), en el Cuadro 6 se muestran los valores
encontrados.Para las muestras evaluadas la humedad presentó valores que
fluctuaron entre 85.5% y 92%, para Biloxi y Misty, respectivamente. El contenido
de cenizas fue de 0.2% y 0.34%, el primer valor para Misty y el segundo para
Biloxi. El contenido de proteína fluctúo entre 0.21% y 0.29%, el valor más elevado
fue para Sharpblue. Los valores del contenido fibra fueron 1.7% y 2.70% (Misty y
Biloxi, respectivamente). El contenido de lípidos fluctuó entre 0.5% y 0.7% el
primer valor lo mostró Sharpblue y el segundo para Misty. Los valores de
carbohidratos variaron entre 10.8% y 15.3% (Misty y Sharpblue, respectivamente).
La caracterización fisicoquímica no mostró diferencias significativas entre cada
variedad. Los valores obtenidos para los parámetros evaluados en la composición
proximal son similares a los que reportan Skupién, (2006) y Starast y col. (2007)
para cultivares de arándano (Vaccinium corymbosum L.) de Europa, además la
composición proximal y fisicoquímica de los arándanos cultivados en Michoacán
fue similar a la reportada en la base de datos de el Departamento de Agricultura
de USA (USDA, United States Department of Agriculture, 2004).
53
6.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos 6.2.1 Fenoles totales
El contenido de compuestos fenólicos totales de los frutos deshidratados
de arándano procedentes de Los Reyes, Michoacán (Cuadro 8) para los extractos
acuosos fluctuó entre 10.56 y 14.22 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g, el
contenido más alto de compuestos fenólicos fue para el cultivar Biloxi y el más
bajo para Misty, la media de los fenoles en el extracto acuoso fue de 12.56 mg
EGA/g. El contenido de compuestos fenólicos en los extractos metanólicos fue de
19.57 y 25.19 mg EGA/g en Misty y Biloxi, respectivamente y la media fue de
21.59 mg EGA/g. Los arándanos analizados muestraron concentraciones
sobresalientes de compuestos fenólicos, Wolfe y col. (2008), quienes encontraron
una concentración de 4.29 mg EAG/g en fruto deshidratado, de arándano cultivado
en Damariscotta, Maine, USA.
La concentración de fenoles totales en los extractos acuosos y
metanólicos fue variable, cabe destacar que Biloxi mostró diferencias significativas
respecto a Misty y Sharpblue, se observo que el cultivar, es un factor que influye
de manera significativa en la concentración de los fenoles en los frutos de
arándano. Esto coincide con lo que reportaron Wang y Lin (2000), al evaluar el
contenido de fenoles totales en fresa, frambuesa y zarzamora, tanto en el fruto
como en las hojas de la planta de diferentes cultivares.Por otro lado, Moyer y col.
(2002), también reportaron que la concentración de fenólicos varía
significativamente de acuerdo al cultivar de arándano (Vaccinium spp).
54
Cuadro 8. Contenido de compuestos fenólicos totales en extracto acuoso y metanólico de arándano
COMPUESTOS FENOLICOS TOTALES mg EAG/g
Cultivar Acuoso Metanólico Biloxi 14.22 ± 1.10 aA 25.19 ± 0.79 aB
Misty 10.56 ± 0.34 bA 19.57 ± 0.90 bB
Sharpblue 12.90 ± 0.75 aA 20.01 ± 0.65 bB
Media 12.56± 0.73 21.59 ± 0.78
mg GAE/ g fd: miligramos equivalentes de ácido gálico/g de fruto deshidratado.
Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado;
Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey). Letras diferentes por renglón indican diferencias estadísticamente significativas
(P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey) por extracto.
Respecto al tipo de extracto, la concentración más alta de fenoles totales
se obtuvo en los extractos metanólicos (Figura 13). Cabe mencionar que
estadísticamente se encontraron diferencias significativas. Se puede deducir que
los arándanos contienen mayor proporción de compuestos de carácter hidrófobo
que hidrófilo, esta característica se ve afectada por la estructura química y los
diferentes grupos funcionales a los cuales están enlazados los compuestos
fenólicos (azucares, otros ácidos orgánicos, entres otros); también el grado de
polimerización se relaciona con la hidrofobicidad (Parr y Bolwell,2000; Wang y
Weller, 2006).
55
Figura 13. Contenido de compuestos fenólicos totales en cultivares de arándano El contenido de fenoles totales es expresado en mg GAE/g fd. Cada barra representa la media del
ensayo y la línea vertical de representa la Desviación Estándar.
Letras diferentes en las barras son estadísticamente diferentes ( p ≤ 0.05 por la prueba de Tukey)
Además se ha reportado que el arándano tiene los más altos valores en
antioxidantes fenólicos, comparado con otras frutillas consumidas principalmente
en USA. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que en efecto el
arándano cultivado en Michoacán, México puede ser un excelente alimento, que
puede brindar efectos benéficos a la salud; especialmente por el alto contenido de
compuestos fenólicos que presenta (Szajdek y Borowska, 2008: Wolfe and Liu,
2008; Amarowicz y col.,2009).
56
6.2.2 Flavonoides totales
El contenido de flavonoides totales por método espectrofotométrico
fluctuó entre 2.35 y 4.78 mg equivalentes de quercetina/g en fruto deshidratado, el
valor más alto se encontro en el cultivar Biloxi, mientras que Misty presentó el
valor más bajo, ambos cultivares presentaron resultados similares de fenoles
totales. El valor medio de los cultivares analizados fue 3.42 mg EQ/g (Cuadro 9).
Los valores obtenidos son comparables con los que reporta la USDA en su base
de datos (2003), 2.70 mg EQ/g, es importante mencionar que tanto Biloxi y
Sharpblue mostraron concentraciones más altas.
Cuadro 9. Contenido de flavonoides totales en arándano
FLAVONOIDES TOTALES
Cultivar mg EQ/g
Biloxy 4.78 ± 0.69 a
Misty 2.35 ± 0.66 b
Sharpblue 3.15 ± 0.62 b
Media 3.42 ± 0.65 mg GAE/ g fd: miligramos equivalentes quercetina/g de fruto deshidratado.
Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado;
Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar.
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de
Tukey).
Estadísticamente Biloxi mostró diferencias significativas respecto a Misty,
pero no con Sharpblue (Figura 2). Se puede considerar que el cultivar es un factor
que afecta la concentración de flavonoides, como también se observó para los
fenoles totales. De modo similar, McGhie y col. (2005) determinaron que la
concentración de flavonoides en manzana (Malus spp.) esta altamente afectada
por el tipo de cultivar. Por otro lado Liu y col. (2002), reportaron que la variabilidad
en el contenido de fenoles totales y flavonoides de frambuesa cultivada en
Genova, NY se debe al tipo de cultivar y a los flavonoides.
57
6.2.3 Antocianinas totales
El contenido de antocianinas totales por método espectrofotométrico fue
de 6.24 y 12.24 mg equivalentes de cianidina-3-glucósido (C3G)/g, el contenido
más alto lo presentó cultivar Biloxi que también presentó el valor más alto de
fenoles y flavonoides totales. Mientras que Misty presentó el más bajo. El valor de
la media fue 8.77 mg EC3G/g fd (Cuadro 10). Estadísticamente Biloxi mostró
diferencias significativas respecto a Misty y Sharpblue.
La concentración de antocianinas totales de los arándanos cultivados en
Michoacán, son más altos que los que reporta Moyer y col. (2002) para miembros
del género Vaccinium cultivados en Oregón, USA 4.3 mg EC3G/g. Hosseinian y
Beta (2007) reportaron una concentración más baja para arándano silvestre nativo
de Manitoba, Canadá 5.58 mg EC3G/g. Sin embargo, Nicoué y col. (2007),
reportaron concentraciones más altas para cultivares de arándano procedentes de
Quebec, Canadá (21.1- 28.9 mg EC3G/g). Estas diferencias en antocianinas
pueden explicarse en función de la intensidad lumínica presente en cada una de
las regiones, la cual afecta la síntesis de compuestos en las plantas (Timberlake y
Henry, 1986).
Cuadro 10. Contenido de antocianinas totales en arándano
ANTOCIANINAS TOTALES
Cultivar mg EC3G/g
Biloxy 12.24± 1.83 a
Misty 6.24 ± 0.84 b
Sharpblue 7.85 ± 0.43 b
Media 8.77 ± 1.03
mg EC3G/ g fd: miligramos equivalentes de cianidina-3-glucósido/g en fruto deshidratado.
Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado; Los valores representan las
medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey).
58
6.3 Actividad antioxidante por DPPH y ABTS+
Los valores de capacidad antioxidante, reportados como equivalentes de
Trolox (TEAC)/mg, para los ensayos con DPPH y ABST+ (Cuadro 11) fueron muy
similares para ambos ensayos; lo que sugiere que ambos métodos pueden ser
útiles para determinar la capacidad antioxidante en arándanos aún cuando tienen
mecanismo similares de acción, pero utilizan diferente radical.
En el ensayo de DPPH, los valores obtenidos para los extractos acuosos
fluctuaron entre 11.6 μmol ET/mg en Misty y 17.3 μmol ET/mg en Biloxi. El valor
medio fue de 14.4 μmol ET/mg. Mientras para DPPH en los extractos metanólicos
los valores oscilaron entre 20.3 y 27.0 μmol ET/mg, el valor más alto se encontro
en el mismo cultivar Biloxi, mientras que Misty presentó el más bajo. La media fue
de 23.6 μmol ET/mg. Los resultados obtenidos fueron más altos a los que
reportaron Seeram y col. (2008), en jugo de arándano obtenido a partir del fruto
completo (13.3 y 17.1 μmol ET/mg). Asimismo, Netzel y col. (2006) reportaron
contenidos más bajos a los encontrados, 10.35 μmol ET/mg, en el cultivar Biloxi
producido en Australia. Por otro lado, Ogawa y col. (2008) reportaron resultados
comparables ó ligeramente más altos con los obtenidos (28 μmol ET/mg), en
arándano liofilizado. Con el ensayo de DPPH se obtubieron los valores más altos
en Biloxi (para ambos tipos de extractos), pero estas diferencias no son
estadísticamente significativas respecto Misty y Sharpblue. Con el extracto
metanólico se obtuvieron los valores más altos para los tres cultivares, dichas
diferencias son significativas estadísticamente.
En el ensayo de ABTS+ los valores para los extractos acuosos oscilaron
entre 11.2 μmol ET/mg, en Sharpblue y 16.5 μmol ET/mg en Biloxi. El valor medio
fue 13.6 μmol ET/mg en los extractos metanólicos, los valores obtenidos
fluctuaron entre 18.5 μmol ET/mg en Misty y 26.1 μmol ET/mg en Biloxi. La media
fue de 22.3 μmol ET/mg. Los resultados obtenidos son más altos a los que
reportaron Ogawa y col. (2006) (14 μmol ET/mg). Asimismo, los valores
59
encontrados son más altos que los encontrados por Sellapan y col. (2002), en el
híbrido de la especie V. corymbosum L. cultivado en Georgia, USA, (20.60 μmol
ET/mg) y para el cultivar Sharpblue (14.83 μmol ET/mg). Con el ensayo de ABTS+
los valores más altos (para ambos tipos de extractos) se observaron en Biloxi.
Estas diferencias son estadísticamente significativas en Misty y Sharpblue, lo cual
sugiere que el cultivar tuvo influencia en la capacidad antioxidante de ambos tipos
de extract. Con el extracto metanólico de los tres cultivares se obtuvo la mayor
capacidad antioxidante; las diferencias observadas en para ambos métodos con
respecto al tipo de extracto son indicativas de que el poder de extracción de cada
solvente es variable, y que los fenólicos antioxidantes presentan diferente
solubilidad; de la misma manera, los compuestos antioxidantes presentan
diferente grado de reacción con los radicales libres usados en ambos ensayos.
Por ejemplo, el radical DPPH presenta mayor solubilidad en solventes orgánicos,
especialmente etanol; esto es una limitante cuando se interpreta el papel de los
antioxidantes hidrófilos (Wojdlo y col. 2007).
Cuadro 11. Actividad antioxidante por ABTS+ y DPPH de cultivares de arándano
DPPH ABTS+ TEAC µmol/mg fd TEAC µmol/mg fd
Cultivar Acuoso Metanólico Acuoso Metanólico
Biloxi 17.3± 0.89 aA
27.0 ± 1.1 aB
16.5 ± 1.1 aA
26.1 ± 1.5 bB
Misty 11.6 ± 2.2 bA
20.3 ± 3.5 bB
13.3 ± 1.1 bA
18.5 ± 5.6 aB
Sharpblue
14.3 ± 3.2 bA 23.6 ± 2.5 bB 11.2 ± 1.5 bA 22.3 ± 3.1 aB
Media
14.4 ± 2.09 23.6 ± 2.3 13.6 ± 1.2 22.3 ± 3.4
TEAC; Actividad antioxidante expresada en equivalentes de Trolox µmol/mg de fruto deshidratado.
Los resultados mostrados son en 1 mg de arándano deshidratado. Los valores representan las
medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por columna indican
diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey) por frutilla. Letras
diferentes por renglón indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de
Tukey) por extracto.
60
De manera importante, la actividad antioxidante de los flavonoides
depende de la estructura y sustitución de grupos hidroxilo en el anillo B, existen
reportes que indican que los flavonoides y antocianinas con mayor número de
grupos OH en el anillo B presentan una actividad antioxidante más fuerte. Las
antocianinas presentan el siguiente orden de poder antioxidante según el número
de OH del anillo B; delfinidina (3´,4´,5´-OH) > cianidina (3´,4´OH) > pelargonidina
(3´, 4´- OH). Por esta razón, las agliconas de flavonoides y antocianinas son
importantes en la capacidad antioxidante en los arándanos, además del contenido
total de fenólicos, flavonoides y antocianinas (Noda y col. 2002; Ogawa y col.
2008). Es importante mencionar que el DPPH presenta mayor selectividad por los
grupos OH que el ABTS+ (Nanjo y col. 1999), por lo tanto DPPH no reacciona con
flavonoides que no contengan grupos OH en el anillo B, así como con los ácidos
fenólicos que sólo contengan un grupo OH (Roginsky y Lissi, 2005; Von Gadov y
col. 1997; Yokozawa y col., 1998). El ensayo DPPH mostró valores más altos
respecto a ABTS+, se puede decir que los extractos de los arándanos pueden
contener antioxidantes fenólicos con grupos OH en el anillo B. Esto coincide con lo
que reporta Duthie y Crozier (2000) que estudiaron la actividad antirradical de
flavonoides en relación a su estructura y concluyeron que en gran medida la
posibilidad de reacciones antirradicales depende de los sustituyentes hidroxilo que
contenga específicamente el anillo B.
61
6.4 Correlaciones 6.4.1 Correlación fenoles totales y capacidad antioxidante
En las Figuras 14 A, B, C, D se ilustran las correlación entre fenoles
totales de extracto acuoso y metanólico con DPPH y ABTS+. Sin embargo, se
esperaba una correlación positiva y significativa, lo cual no ocurrió. Se observa
una correlación lineal y débilmente significativa para fenoles totales en extracto
acuoso y DPPH, donde el coeficiente de correlación fue r = 0.25. Se aprecia que la
dispersión de los valores obtenidos es muy notoria, lo cual se refleja en el
coeficiente de correlación.
Se observa una correlación lineal negativa y significativa para fenoles
totales en extracto metanólico vs. DPPH, el coeficiente de correlación fue r = -
0.79, lo cual indica que las muestras que tuvieron una menor concentración de
fenoles totales mostraron un mayor potencial antioxidante. Es importante recordar
que en los extractos crudos existe una mezcla de antioxidantes y existen efectos
de interacción (sinergismo y antagonismo) entre los compuestos de la planta
(Harborne, 1980; Halvorsen, 2002), este hecho puede estar vinculado a los
resultados obtenidos. Para fenoles totales extracto acuoso vs. ABTS+ el coeficiente
de correlación fue r = 0.85, como se esperaba es la correlación fue significativa.
Esta correlación lineal, positiva y significativa fue observada por Sellapan y col.
(2002), para arándano cultivado en Georgia, reportaron una r = 0.98.
Para fenoles totales de extracto metanólico vs. ABTS+ se encontró una
correlación significativa y positiva, el coeficiente de correlación fue similar a la
correlación que se observó entre fenoles totales extracto acuoso vs. ABTS+, r =
0.85. Esta correlación es comparable a la se reportaron en otras plantas y frutos.
Dudonné y col. (2009) evaluaron algunas plantas de interés industrial usando
diferentes ensayos como DPPH, ABTS+, FRAP, ORAC y encontraron una
correlación positiva y significativa entre fenoles y capacidad antioxidante (DPPH,
ABTS+, FRAP), los coeficientes de correlación fueron r = 0.93, 0.96 y 0.90,
respectivamente.
62
DPPH- Fenoles totales extracto acuoso
B DPPH - Fenoles totales extracto metanólico
C ABTS+ - Fenoles totales extracto acuoso
D ABTS+ - Fenoles totales extracto metanólico
Figura 14. Correlación entre fenoles totales con capacidad antioxidante (DPPH y ABTS+) en extracto acuoso y metanólico de arándano
Y = 8.87695 x + 0.38272 r = 0.25
Y = 39.6901 x - 0.98836 r = - 0.79
Y = - 1.3454 x + 1.2547 r = 0.85
Y = 6.72039 x + 0.7994 r = 0.85
63
Por su parte Prior y col. (1998) reportaron un coeficiente de correlación
significativo para diferentes cultivares del genero Vaccinium usando el ensayo de
ORAC, r = 0.85. De los resultados obtenidos, se puede decir que la correlación
entre fenoles totales y capacidad antioxidante es significativa, a excepción de
fenoles totales en extracto acuoso vs. DPPH. La significancia de esta correlación
concuerda con Cao y Prior (1997) que observaron que los fitoquímicos
responsables de la capacidad antioxidante en frutillas son, principalmente
flavonoides, antocianinas y ácidos fenólicos. Diversos estudios sugieren una
relación directa entre el contenido de fenólicos y la capacidad antioxidante,
Kähkönen y col. (1999) estudiaron un grupo de plantas con potencial nutracéutico
(frutillas, vegetales, semillas), encontraron que las frutillas contenían una mayor
concentración de compuestos fenólicos y poseían a su vez la mayor capacidad
antioxidante del grupo de plantas analizadas, además los flavonoides y ácidos
fenólicos como elágico y ferúlico estaban en mayor proporción. Sin embargo,
Heinonen y col. (1998) no encontraron correlación entre fenólicos y capacidad
antioxidante en vinos y licores de frutas, lo cual puede indicar que los valores
obtenidos en cada uno de los métodos se pueden diferir según la reacción química
de cada método y los constituyentes de los alimentos analizados.
6.4.2 Correlación ABTS+ y DPPH
La correlación entre ABTS+ vs. DPPH se ilustra en la Figura 15. El
coeficiente de correlación fue débil r = 0.53 este valor indica una correlación
media. Los resultados muestran se puede considerar que ambos métodos pueden
estimar la capacidad antioxidante de los arándanos. Dudonné y col. (2009)
obtuvieron un coeficiente de correlación de 0.9 al comparar ABTS+ contra DPPH
en varias plantas con potencial nutracéutico de interés industrial.
64
ABTS+ - DPPH
Figura 15. Correlación entre ABTS+ Y DPPH
Es importante considerar ciertos aspectos agronómicos a los que
debieron ser sometidas las plantas que analizamos; como por ejemplo el sistema
de riego empleado, estrés ambiental, temperatura y nutrientes del suelo, clima,
disponibilidad de riego, luz solar; factores que puuden influir en la capacidad
antioxidante de los arándanos cultivados en Michoacán (Parr y Bowell, 2000). Por
ejemplo, se ha comprobado que si la planta se expone en mayor grado a la luz
solar, se incrementa la síntesis de antocianinas (Pascual y Sanchez, 2008).
Y = 6.6792 x + 0.78457 r = 0.53
65
6.5 Caracterización de antocianinas por HPLC
El contenido de antocianinas totales por HPLC en los arándanos fue de
7.17 a 16.32 mg/g , los valores son para Misty y Biloxi, respectivamente. El valor
medio fue 10.83 mg/g. Al comparar los resultados de antocianinas totales
(espectofotométrico) con el contenido por HPLC se observaron concentraciones
más altas para el método espectrofotométrico, el factor de correlación fue
significativo(r = 0.90).
Los resultados obtenidos son superiores a los que reporta Hosseinian y
Beta (2007) para arándano cultivado en Canadá. Por otro lado, Nocoué y col.
(2007) reportan valores entre 21.1 y 28.9 mg/g de peso seco para V. angostifolium
y V. mystilloides. Para arándano cultivado en Europa reportaron contenidos más
altos entre, 21.4 y 49.8 mg/ g de peso seco (Gao y Mazza, 1999). Se detectaron
las seis antocianinas principales (cianidina, pelargonidina, petunidina, delfinidina,
peonidina, malvidina) por HPLC (Figura 18). Las principales antocianinas fueron
cianidina, malvidina y peonodina.
Cabe destacar, en el presente trabajo se identificó pelargonidina, trabajos
previos no reportan concentraciones de esta antocianina en frutos del género
Vaccinium (Nicoué y col., 2007). Se puede decir que los arándanos cultivados en
Michoacán presentan características bióticas y abióticas que tuvieron cierta
influencia en la síntesis de esta antocianina, asimismo en las concentraciones más
altas o bajas de las otras cinco antocianinas evaluadas en el estudio. Siriwoharn y
col. (2004) encontraron gran variabilidad en el contenido de antocianinas en
zarzamora (Rubus L); además está influenciado por cultivar.
66
Cuadro 12. Caracterización del contenido de antocianinas en los cultivares de arándano.
Cultivar Cianidina (mg/g)
Delfinidina (mg/g)
Petunidina(mg/g)
Peonidina(mg/g)
Pelargonidina(mg/g)
Malvidina (mg/g)
Total(mg/g)
Biloxi 7.77± 0.48a 1.90± .0.32a 0.34 ± 0.17a 2.64 ± 0.23a 0.19 ± 0.02a 3.48 ± 0.42a 16.32a
Misty 3.54 ±
0.48b 0.88 ± 0.22b 0.49 ± 0.14a 0.85 ± 0.06b 0.08 ± 0.02a 1.33 ± 0.25b 7.17b
Sharpblue 4.31 ±
0.17b 0.87 ± 0.09b 0.89± 0.08b 1.26 ± 0.06b 0.1± 0.01a 1.57 ±0.11b 9.00b
Media 5.20 ± 0.37 1.21 ± 0.21 0.57 ± 0.13 1.58 ± 0.11 0.12± 0.016 2.12 ± 0.26 10.83
Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado;
Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey).
El cultivar Biloxi mostró las concentraciones más altas para las
antocianinas analizadas, seguida de Sharpblue y Misty. Estadísticamente las
diferencias encontradas entre cada variedad para el contenido de cada una de las
seis principales antocianinas son significativas (Cuadro 12). Los valores para la
concentración de cianidina fluctuaron entre 3.54 y 7.77 mg/g, malvidina mostró
concentraciones entre 1.33 y 3.48 mg/g, Peonidina 0.85 y 2.64 mg/g, petunidina
0.34 y 0.89 mg/g, pelargonidina 0.08 y 0.19 mg/g, (Misty y Biloxi,
respectivamente); delfinidina 0.87 y 1.90 mg/g, el valor más bajo para Sharpblue y
el más alto para Biloxi Los valores encontrados fueron comparables con los que
reportan Ogawa y col. (2008) para Vaccinium spp cianidina 0.44 mg/g y peonidina
4.08 mg/g.
67
Figura 16. Cromatograma obtenido por HPLC de las antocianinas analizadas en arándano del cultivar Biloxi detectadas a 520nm. (1) Cianidina; (2)
Pelargonidina; (3) Petunidina; (4) Delfinidina; (5) Peonidina; (6) Malvidina.
6.6 Caracterización de flavonoides por HPLC
El contenido de flavonoides totales por HPLC fue de 4.4 a 8.98 mg/ g, el
más alto para Biloxi y el más bajo para Misty (Cuadro 13). La media fue de 6.19
mg/g. Los resultados obtenidos son más altos a los encontrados por el método
espectrofotométrico, estadísticamente se encontraron diferencias significativas
entre ambos métodos.
Los flavonoides analizados por HPLC fueron quercetina, kaempferol y
miricetina (Figura 19). El flavonoide sobresaliente en los cultivares de arándano
fue quercetina, lo valores fluctuaron entre 2.7 y 4.38 mg/g, los valores son más
altos a los que reportan Sellapan y col. (2002), 9.85- 14.60 mg/100g de fruto. El
kaempeferol mostró concentraciones entre 0.6 y 2.7 mg/g, estos valores son más
altos con lo que reporta Hakkinen y col., (1999; 1999a), 3.72 - 3.17 mg/100g de
fruto congelado. La miricetina no fue encontrada en el cultivar Sharpblue, esto
coincide con lo que reporta Määttä- Riihinen y col. (2004) y Sellapan y col. (2002).
Los valores mostrados para miricetina fluctuaron entre 1.1 y 1.9 mg/g, los cuales
son similares a los que reporta Kader y col. (1996).
68
Cuadro 13. Caracterización del contenido de flavonoides en arándanos
Cultivar Quercetina(mg/g)
Kaempferol(mg/g)
Miricetina(mg/g)
Total (mg/g)
Biloxi 4.38 ± 1.8a 2.7 ± .0.32a 1.9 ± 0.5a 8.98a
Misty 2.7 ± 0.7b 0.6 ± 0.2b 1.1 ± 0.14a 4.4 b
Sharpblue 3.9 ± 0.5a 1.3 ± 0.1b ND 5.2b
Media 2.99 ± 1.0 1.5 ± 0.62 1.0 ± 0.21 6.19
Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado
ND: no detectado
Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey).
Figura 17. Cromatograma obtenido por HPLC de los flavonoides analizados en arándano del cultivar Biloxi detectados a 260nm. (1) Quercetina; (2)
Kaempferol; (3) Miricetina
69
6.7 Fraccionamiento
Se seleccionó el cultivar de arándano con el contenido más alto de
compuestos fenólicos y con mayor capacidad antioxidante y se obtuvieron
fracciones. El material que mostró dichas características fue Biloxi, esto se
corroboro por medio de análisis estadístico, que indico que efectivamente había
diferencia significativa respecto a Misty y Sharpblue. El fraccionamiento se realizó
por medio de una cromatografía en columna (Biotage Flash), se obtuvieron 40
subfracciones. Por medio de una cromatografía en capa fina se eligieron las
comunes (presentaron similitud en el patrón cromatográfico)y se combinaron, se
obtuvieron cinco fracciones; la fracción 1 (F1) (1-8), fracción 2 (F2) (9-17), fracción
3 (F3) (18-27), fracción 4 (F4) (28-40), fracción 5 (F5) (metanol con el que se lavo
la columna). Las fracciones obtenidas fueron caracterizadas por HPLC y GC/MS y
también utilizadas para realizar el ensayo de actividad antioxidante utilizando un
cultivo celular.
6.8 Caracterización de compuestos fenólicos en los extractos ASE de arándano 6.8.1 Caracterización de antocianinas por HPLC
Las antocianinas en los extractos ASE de arándano y en las fracciones
utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante se muestran en el Cuadro 14.
La antocianina predominante fue cianidina-3-O-rutinosido, se encontraron
concentraciones entre 37.48 y 56.75 mg/g de peso seco, el valor más bajo para
Misty y el más alto para Sharpblue, para las fracciones la concentración fluctúo
entre 21.1 y 21.64 mg/g, el valor más bajo fue para la F1 y el más alto para F2 y
F3. La segunda antocianina predominante fue malvidina-3-O-glucósido, las
concentraciones fueron de 28.19 y 49.09 mg/g, el primer valor para Misty y el
70
segundo para Sharpblue, en las fracciones fue detectada en F1 5.88mg/g y F2
5.95 mg/g. Peonidina-3-O-galactósido fue la siguiente antocianina predominante
las concentraciones fluctuaron entre 31.99 y 36.44, para Misty y Sharpblue,
respectivamente. Los resultados obtenidos son similares a los que reporta
Hosseinian y Beta (2007) para arándano silvestre de Canadá, a excepción de la
Cianidina-3-O-rutinosido, que no fue detectada. Martinelli y col. (1992) reportaron
que las antocianinas de los miembros del género Vaccinium presentan en su
estructura mayoritariamente glucosa, galactosa.
En el contenido total de antocianinas fue más alto en el extracto ASE, en
comparación con el método espectrofotométrico y el extracto hidrolizado en el que
se determinaron las seis antocianinas principales. Los valores del contenido total
de antocianinas en el extracto ASE fluctuaron entre 149.0 y 228.3 mg/g para Misty
y Sharpblue, respectivamente.
Sin embargo, en el método del extracto hidrolizado se lograron identificar
las seis antocianinas principales en los arándanos y en el método del extracto
ASE no fue posible identificarlas. De manera importante, se logró identificar la
pelargonidina, estudios previos reportan que no han encontrado dicha antocianina
en arándano (Martenilli y col., 1992; Hosseinian y Beta, 2007; Nicoué y col.,
2007). También en el extracto hidrolizado se detectaron delfinidina, malvidina,
pelargonidina, petunidina en el extracto ASE no fue posible identificarlas. Cabe
mencionar que las diferencias entre ambos métodos son estadísticamente
significativas. En cuanto al cultivar se encontraron diferencias significativas. En el
extracto ASE, Sharpblue mostró el mayor contenido de antocianinas, en el
extracto hidrolizado el contenido más alto lo mostró Biloxi; esto se puede deber a
las condiciones de extracción de ambos métodos y las condiciones usadas en el
HPLC.
71
Cuadro 14. Caracterización de antocianinas en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco)
ND; No detectado
Los valores representan la media de dos replicas.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey).
Del-3-glu; Delfinidina-3-O-glucósido, , Cia-3-gal; Cianidina-3-O-galactósido, Cia-3-glu; Cianidina-3-
O-glucósido, Cia-3-rut; cianidina-3-O-rutinosido, Peo-3-gal: Peonidina-3-O-galactósido, Peo-3-glu;
Peonidina-3-O-glucósido, Mal-3-glu; malvidina-3-O-glucósido.
Antocianina Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 F3 F4 F5
Delfinidina ND ND ND ND ND ND ND ND
Del-3- glu 29.64a 16.26b 37.55a 8.7c 7.12c 3.54d ND ND
Cianidina 9.83b 12.27a 15.39a 9.18b 9.43b ND ND ND
Cia-3-gal 16.26a 5.87b 15.23a 1.7c 4.88b 6.25b 26.66d ND
Cia-3-glu 20.66a 16.90a 17.86a 16.0a ND ND ND ND
Cia-3-rut 44.06a 37.48b 56.75c 22.1d 21.64d 21.64d ND ND
Peonidina ND ND ND ND ND ND ND ND
Peo-3-gal 32.87a 31.99a 36.44a 27.05b 26.35b ND ND ND
Peo-3-glu ND ND ND ND ND ND ND ND
Mal-3-glu 33.42a 28.19a 49.09b 5.88c 5.95c ND ND ND
Malvidina ND ND ND ND 16.84a ND ND ND
Petunidina ND ND ND ND ND ND ND ND
Pelargonidin ND ND ND ND ND ND ND ND
Total 186.8a 149.0b 228.3c 90.7d 92.24d 31.44e 26.66e ND
72
6.8.2 Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos por HPLC
Los flavonoides y ácidos fenólicos en los extractos ASE de arándano y en
las fracciones utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante se muestran en
el Cuadro 15. El flavonoide sobresaliente en los extractos ASE fue quercetina,
75.12 mg/g fd, el segundo fue miricetina (16.37 a 57.68 mg/g) el valor más alto fue
para Sharpblue ye el más bajo para Biloxi. No fue posible comparar los resultados
obtenidos ya que los reportes que existen son de fruto fresco, en el presente
estudio se analizó arándano liofilizado en polvo. Sellapan y col., (2002) analizaron
arándanos frescos y obtuvieron 6.72-6.98 mg/100 g de fruto miricetina., 2.52-3.17
mg/100g de kaempferol 9.70-14.60 mg/100 de quercetina.
Cabe mencionar que no fue posible detectar catequina y epicatequina, ya
que al parecer se traslaparon al momento de ser analizadas en el HPLC. Se
probaron diversas condiciones en el cromatógrafo, pero como tienen un espectro
de UV muy similar, no fue posible distinguir ambos compuestos. Catequina y
epicatequina son enantiómeros y pueden sufrir reacciones de isomerización
durante la extracción, las cuales se favorecen en pH ácidos, el arándano se
caracteriza por ser un fruto ácido, también puede haber rompimiento de enlaces y
degradación de moléculas (Lea, 1979). En cambio en las fracciones de Biloxi, si
fue posible detectar catequina en F2 (9.77 mg/g) y epicatequina (2.04-4.09 mg/g
F1 y F2, respectivamente) debido a que en el fraccionamiento se rompieron
enlances de dímeros, trímeros o polímeros de catequinas y fueron disponibles
para su identificación en el cromatógrafo. Por otro lado en F1 se detectó
kaempferol, en el extracto ASE de Biloxi no fue detectado. También se detectó
miricetina en F1, F2, F3 en concentraciones de 4.35-4.44 mg/g y quercetina se
detectó en F1 (6.8 mg/g ps) y F2 (6.7 mg/g).
El ácido fenólico más sobresaliente en los extractos ASE fue el ácido
ferúlico en concentraciones de 74.99 y 79.0 mg/g el valor más bajo fue para Biloxi
y el más alto para Misty. El segundo ácido fenólico sobresaliente fue el ácido
cafeico, 69.23 y 71.06 mg/g ps en Biloxy y Sharpblue, respectivamente. No fue
73
posible comparar los resultados obtenidos ya que los reportes de ácidos fenólicos
en arándano son de fruto fresco y se analizo arándano liofilizado en polvo.
Ayaz y col. (2005) reportaron el contenido de ácidos fenólicos en
arándano fresco cultivado en Turquía, los principales ácidos fenólicos reportados
son: cinámico, gálico, protocatecuico, siringico y cafeico, los valores que reportan
son menores a los encontrados en el presente trabajo. Por su parte Mattila y col.
(2006) reportaron los ácidios ferúlico y cafeico como los mayoritarios en el
arándano, lo cual coincide con nuestros resultados. Sellapan y col. (2002)
analizaron un grupo de híbridos de la especie V. Corymbosum incluyeron
Sharpblue y reportaron el ácido cafeico como el mayoritario en dicho cultivar, que
también coincide con los resultados obtenidos. Por otro lado, Mattila y
Kumpulainen (2002) analizaron el contenido de ácidos fenólicos en algunos
vegetales y frutos como en fresa y frambuesa roja reportaron a los ácidos p-hidroxi
benzoico y p-coumárico como ácidos mayoritarios.
En las fracciones el ácido fenólico predominante fue el gálico, el cual no
se detectó en el extracto de Biloxi, mostro concentraciones de 6.5 mg/g ps en F1 y
6.9 mg/g ps en F2, la identificación del ácido gálico y otros compuestos fué por el
proceso de purificación en la cromatografía, de esta manera hubo rompimiento de
enlaces entre los compuestos que formaban complejos y de los ácidos fenólicos
que formaban conjugados, los compuestos fueron disponibles para la detección en
el cromatógrafo. En las fracciones también se identificaron los ácidos cafeico,
ferúlico y elágico. Las diferencias encontradas fueron estadísticamente diferentes.
74
Cuadro 15. Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco)
ND: No detectado
Los valores representan la media de dos replicas.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey).
Compuesto Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 F3 F4 F5
Kaempferol ND ND ND 2.97 ND ND ND ND
Miricetina 16.37a 57.49b 57.68b 4.4c 4.36c 4.35c ND ND
Quercetina 75.12a ND ND 6.8b 6.7b ND ND ND
Catequina ND ND ND ND 9.77c ND ND ND
Epicatequina ND ND ND 2.04a 4.09a 3.55a ND ND
Ácido cafeico 69.23a 71.05a 71.06a 1.70b 1.69b 1.68b ND ND
Ácido sinápico ND ND ND ND ND ND ND ND
Ácido ferúlico 74.99a 79.0a ND 2.19b 2.19b 2.20b ND ND
Ácido elágico 16.37a 13.45a 13.09a 3.75b 3.72b 3.66b ND ND
Ácidop-coumárico ND ND ND ND ND ND ND ND
Ácido vanílico ND ND ND ND ND ND ND ND
Ácido siríngico ND ND ND ND ND ND ND ND
Ácido gálico ND ND ND 6.5a 6.9a ND ND ND
75
6.8.3 Caracterización de estilbenos por CG/MS
Los estilbenos detectados en los extractos ASE de arándano y en las
fracciones utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante basado en cultivo
celular se muestran en el Cuadro 16. En los cultivares de arándano el estilbeno
predominante fue desorapontigenina con valores entre 18.86 y 39.03 µg/g de peso
seco, el valor más alto para Biloxi y el más bajo para Misty, no existen trabajos
previos donde reporten la desoxirapontigenina en frutos del género Vaccinium.
Asimismo, el cis- trimetoxiestilbeno fue detectado en Sharpblue (2.101
µg/g) igualmente no existen estudios previos que indiquen la presencia de este
estilbeno en arándano.
Pteroestilbeno se encontró en concentraciones de 5.58 y 6.26 µg/g para
Sharpblue y Misty, respectivamente. El pteroestilbeno no fue detectado por
Rimando y col. (2004) en arándano cultivado en Carolina del Norte, USA. Sin
embargo, Adrian y col. (2000) reportaron en uva niveles de pteroestilbeno de 0.2-
4.7 µg/g y Pezet y Pont, (1998) reportaron concentraciones de pteroestilbeno las
variedades de uva Gamay y Pinot Noir de 14–74 ng/g y 120 y 530 ng/g de fruto
fresco.
Se encontraron concentraciones de resveratrol entre 0.15 a 0.39 µg/g de
peso seco, el valor más bajo para Sharpblue y el más alto para Biloxi. Los
resultados de resveratrol mostraron valores dentro del rango que reportaron
Rimando y col. (2004) (327-853 ng/g de fruto seco) para arándano cultivado en
Corvallis, Oregon, USA; también, son similares a las que reportaron Rimando y
Barney (2005) para frutos del género Vaccinium de Idaho, Washington y Wyoming,
USA (0.26 y 4.67 µg/g de frutillas liofilizada). El pteroestilbeno se detectó en
concentraciones más altas de las que reportaron en dicho estudio, dichos autores
reportaron 0.25 y 0.61 µg/g de frutillas liofilizada.
En F1, F2, F3 se detectaron pinoestilbeno, pteroestilbeno,
desoxyrapontigenina y resveratrol. El más sobresaliente fue pteroestilbeno, 0.84-
3.374 µg/g, para F2 y F1, respectivamente. Valores entre 1.301 y 1.505 µg/g (F1 y
F2, respectivamente se observaron de resveratrol). Pinoestilbeno no se detecto en
76
Biloxi, pero si en las fracciones en concentraciones de 0.674 y 0.884 µg/g (F3 y
F1, respectivamente). Finalmente la desoxirapontigenina fluctuó entre 0.122 y
0.218 µg/g, el más bajo para F3 y el más alto para F1. Los resultados obtenidos no
son comparables ya que no existen trabajos previos donde describan un
fraccionamiento en extracto de arándano para identificación de estilbenos.
Cuadro 16. Caracterización de estilbenos en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (µg/g de peso seco)
ND: No Detectado
Los valores representan la media de dos replicas.
Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la
prueba de Tukey).
Compuesto Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 F3 F4 F5
t-Trimetoxiestilbeno ND ND ND ND ND ND ND ND
c-Trimetoxiestilbeno ND ND 2.101a ND ND ND ND ND
Trimetoxiestilbeno ND ND ND 4.23a ND ND ND ND
Pinoestilbeno ND ND ND 0.884a 0.683a 0.674a ND ND
Pteroestilbeno 6.06a 6.26a 5.58a 3.374b 0.845c 0.854c ND ND
Desoxirapontigenina 39.03a 18.86a ND 0.218b 0.157b 0.122b ND ND
Resveratrol 0.39a 0.19b 0.15b 1.301c 1.504c 1.361c ND ND
77
6.9 Evaluación de potencial antioxidante por medio cultivo celular
El potencial de la actividad antioxidante evaluado por medio de un cultivo
celular se reporta como concentración inhibitoria 50 (CI50) (µg/ml), que representa
la media de la máxima concentración inhibitoria de la sustancia que se está
analizando (Cuadro 17). Los extractos de los arándanos y las fracciones utilizadas
en el ensayo basado en células fueron obtenidos en un aparato de extracción
automática (ASE, siglas en ingles Accelerated Solvent Extraction). En este aparato
se presento una extracción más alta y eficiente de compuestos nutracéuticos en
comparación con la extracción manual (Papagiannnopoulos y col., 2001). La
actividad antioxidante de los extractos (obtenidos en el aparato ASE) y las
fracciones fue evaluada utilizando el cultivo celular HL-60 (células de la línea
promielocítica humana) y el compuesto fluorescente DCFH-DA (diacetato 2´,7´-
dicloro- fluoresceína). Este método se basa en examinar directamente la habilidad
del material que se está probando para penetrar las células e inhibir la oxidación
provocada por los radicales libres de DCFH a DCF. DCFH-DA es un compuesto
no fluorescente que se difunde dentro de las células. Las esterasas
citoplasmáticas hidrolizan DCFH-DA a DCFH que es oxidado a DCF (2´,7´-
diclorofluoresceína) y fluórese. La actividad antioxidante de las muestras es
determinada midiendo el nivel de DCF producido comparado con controles.
Los valores de CI50 que mostraron los extractos ASE de arándano fueron
de 0.66 a 1.8 µg/ml (a una concentración de 10 mg/ml) el valor más bajo fue para
Sharpblue y el más alto para Misty. Comparando estos resultados con los de la
capacidad antioxidante por DPPH Y ABTS+, Misty mostró la menor capacidad
antioxidante en los ensayos químicos y también la menor actividad antioxidante en
el compuesto fluorescente. Biloxi mostró una fuerte actividad antioxidante ya que
el valor de CI50 fue 1.1 µg/ml, Sharpblue mostró una potente actividad
antioxidante para el ensayo DCFH, estadísticamente mostró diferencias
significativas.
78
Cuadro 17. Actividad antioxidante de extractos ASE de cultivares de arándano y fracciones
1 (5mg/ml), 2 (10mg/ml), 3 (2 mg/ml), NA, No Activo.
Los valores representan las medias de dos réplicas
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey).
Los valores encontrados para la CI50 son más bajos a los que reportan
Lalancette y col. (2009) para jugo de arándano (116 µg/ml); para el ensayo
utilizaron la línea celular L-929 de fibrosarcoma. Por otro lado, Wolfe y Liu (2007)
evaluaron la capacidad antioxidante de arándano, arándano rojo, manzana, uva
roja y manzana verde y obtuvieron valores de la concentración efectiva cincuenta
(CE50) (también evalúa la media del efecto máximo de un compuesto) para
arándano entre 3.44 y 10.81 mg/ml. Wolfe y col. (2008) reportaron la actividad
Muestra Actividad antioxidante
[CI50 µg/ml]
Biloxi 1.1 1 a
Misty 1.8 1 a
Sharpblue 0.66 1 b
F 1 NA
F2 2.5 2 c
F 3 0.3 3 d
F 4 0.3 3 d
F5 6.2 2 e
Trolox 0.28 3 d
79
antioxidante de los frutos más comúnmente consumidos en USA, para arándano
silvestre, reportaron CE50 (2.53 – 6.77 mg/ml), arándano cultivado, 5.95- 27.0
mg/ml. En ambos estudios utilizaron las células de hepatocarcinoma humano
HepG2.
Los valores de CI50 para las cinco fracciones de Biloxi fluctuaron entre 0.3
y 6.2 µg/ml. La fracción 1 no mostró actividad antioxidante en el ensayo. Las
fracciones 3 y 4 mostraron valores de CI50 0.3 µg/ml, comparables con el
antioxidante Trolox CI50 0.28 µg/ml, utilizado como control en el mismo ensayo.
La fracción 2 mostró una CI50 2.5 µg/ml (10mg/ml), indicativa de una considerable
actividad antioxidante. La fracción 5 mostró el más alto valor de CI50 6.2 µg/ml
(10 mg/ml). Las diferencias encontradas para las fracciones fueron significativas.
No existen trabajos previos que describan un fraccionamiento de arándano y una
evaluación de la actividad antioxidante para una posible comparación.
6.9.1 Actividad antioxidante de los fenólicos en arándano
Los valores de la actividad antioxidante celular para los extractos ASE de
arándano fueron de CI50 entre 0.66 y 1.8 μg/ml, el valor más bajo para Sharpblue y
el más alto para Misty, ambos extractos se analizaron a una concentración de 10
mg/ml. Estadísticamente las diferencias encontradas para los tres cultivares son
significativas. Es evidente que Sharpblue mostró mayor actividad antioxidante
respecto a Biloxi y Misty. Esto se debe a las diferencias en solubilidad, peso
molecular y polaridad, que presentó cada cultivar de arándano, reflejándose en la
biodisponibilidad y absorción de la mezcla de compuestos en las células. Estudios
previos reportan que los flavonoides presentan alta actividad antioxidante, lo cual
se refleja en los resultados obtenidos. Los flavonoides son absorbidos e
incorporados en células Caco-2, HepG2, HL-60 miricetina, quercetina y
kaempferol son absorbidos (Takamatsu y col., 2003; Yokomizo y Moriwaki, 2006).
Biloxi presentó mayor concentración de fenólicos como flavonoides y
80
estilbenos en comparación con Sharpblue; sin embargo Biloxi presentó menor
actividad antioxidante respecto a Sharpblue. Una posible explicación es que la
actividad antioxidante está determinada por la estructura que presentan los
compuestos (Yazaki y col., 2008). Wolfe y Liu, (2007) reportaron que algunos
flavonoides como catequina y epicatequina, ácido ferulico y resveratrol tienen baja
actividad antioxidante en el modelo de estudio con células HepG2. Los resultados
obtenidos en este trabajo coinciden de cierta manera, ya que Biloxi mostró mayor
concentración de ácido ferulico, quercetina, resveratrol y los análogos del
resveratrol desorapontigenina y pteroestilbeno; sin embargo, la actividad
antioxidante fue menor. Por otro lado, pudo haber existido una serie de reacciones
en la mezcla de fenólicos antioxidantes dando, lugar a compuestos que no fueron
absorbidos por las células utilizadas en el ensayo. Otro factor que pudo haber
influido es la actividad prooxidante que presentan algunos fenólicos como los
flavonoides, antocianinas, ácidos fenólicos y estilbenos que pueden llegar a
producir compuestos que dañan los componentes celulares como ADN, existen
estudios en mamiferos y bacterias que indican efectos de mutagenicidad y
genotoxicidad de los flavonides, dichos efectos son dependientes de la
concentración (Trueba, 2003).
Lalancette y col. (2009) analizaron la actividad antioxidante en células HL-
60 de algunos frutos, vegetales y compuestos puros; incluyeron kiwi, fresas,
melocotón, arándano, brocoli y zanahorias, así como α-tocoferol, ácido cafeico,
ácido gálico y quercetina. Encontraron efecto prooxidante en el brócoli y la
zanahoria, asimismo encontraron alto contendió de fenólicos en ambos vegetales.
Aplicaron un tratamiento térmico en ambos vegetales y volvieron a realizar en
ensayo, sorprendentemente después de dicho tratamiento aumento la actividad
antioxidante. Esto lo corroboraron en otras dos líneas celulares humanas WS-1, A-
549 y DLD-1. Una posible explicación a dicho fenómeno es que al aplicar
temperatura alta puede producir isomerización, rompimiento de enlaces o
formación de nuevos flavonoides u otros compuestos fenólicos diferentes a los
que originalmente existieron y que tengan mayor permeabilidad y actividad celular
(Rodríguez y col., 2008).
81
Las fracciones de Biloxi presentaron en el siguiente orden decreciente
actividad antioxidante F3, F4 > F2 > F5. Sorprendentemente, F1 no mostró
actividad antioxidante en el ensayo, a pesar de que fue la fracción que mostró el
más alto contendido de fenólicos como antocianinas, flavonoides, ácidos fenólicos
y estilbenos, esto se puede deber a los efectos prooxidantes de la mezcla de
fenólicos presentes o simplemente los fenólicos no lograron penetrar las células
HL-60. En F3 y F4 se observó el mismo valor de CI50 0.3 μg/ml a una
concentración de 2 mg/ml, comparando este valor con el que presentó el Trolox
0.28 μg/ml que fue el control positivo. En el ensayo F3 y F4 se observó una fuerte
actividad antioxidante; sin embargo la composición de fenólicos en ambas fue
totalmente diferente, por ejemplo el contenido de antocianinas, flavonoides, ácidos
fenólicos y estilbenos en F3 fue más alto; en F4 solo se detecto cianidina-3-O-
galactósido (26.66 μg/ml de peso seco), esta fracción presentó el valor más alto
de esta antocianina, por lo tanto se puede decir que a la cianidina-3-O-galactósido
se atribuyó la fuerte actividad antioxidante. F2 mostró un alto contenido de
fenólicos en comparación con F3 y F4; sin embargo la actividad antioxidante fue
menor, esto se puede deber a los factores ya mencionado previamente, efectos
prooxidantes, posibles reacción en la mezcla de compuestos o a que los fenólicos
no se difundieron dentro de la célula. Como era de esperarse en F5 no se observó
actividad antioxidante ni se detectó ningún fenólico y fue el metanol con el cual se
lavó la columna usada en la obtención de fracciones.
82
VII CONCLUSIONES
Con el cultivar Biloxi se obtuvo una capacidad antioxidante más elevada y
la mayor concentración de fenólicos que con Misty y Sharpblue, lo que puede ser
indicativo de que están relacionadas la capacidad antioxidante y la concentración
de fenólicos.
La capacidad antioxidante de frutos de arándano determinada por DPPH
o por ABTS mostró resultados equivalentes, por lo que pueden utilizarse
indistintamente bajo las condiciones ensayadas en el presente trabajo. Estando
esta capacidad fuertemente correlacionada con la concentración de compuestos
fenólicos; esto se observó en ambos tipos de extractos (agua y metanol), lo que
indica que estos compuestos son los principales responsables del poder
antioxidante.
En todos los cultivares se detectó pelargonidina, este es el primer trabajo
en el que se describe a este compuesto dentro del perfil de antocianinas de los
miembros del género Vaccinium.
Sharpblue mostró mayor actividad antioxidante en el cultivo de células
HL-60, seguida de Biloxi y Misty; dicha actividad pudo haber estado influenciada
por la presencia de antocianinas como cianidina-3-O-glucosido y estilbenos como
resveratrol.
Sorprendentemente en la fracción 1 no se encontró actividad antioxidante,
a pesar del alto contenido de compuestos fenólicos, lo cual sugiere un posible
efecto prooxidante de los fenolicos o simplemente no lograron difundirse dentro
del citosol celular.
83
Las fracciones 3 y 4 presentaron mayor actividad antioxidante. La
fracción 3 alta concentración de antocianinas, flavonoides y estilbenos,
específicamente resveratrol; esto permitió identificar cierta relación con el
potencial antioxidante. En la fracción 4 sólo se detectó cianidina-3-O-galactósido,
lo cual indica que es la responsable del potencial antioxidante de dicha fracción.
Los arándanos son cultivados en Michoacán, México durante todo el año,
además mostraron un mayor potencial antioxidante comparado con los arándanos
cultivados en otros países.
El elevado potencial antioxidante de los arándanos cultivados en
Michoacán, México, los convierte en frutos altamente nutracéuticos, debido
principalmente a las sobresalientes concentraciones de compuestos fenólicos
antioxidantes.
84
VIII PERSPECTIVAS
Establecer estrategias de mejoramiento para incrementar los niveles de
fenólicos en el arándano. Realizar bioensayos de actividad anticancerígena, antimutagénica y
antiinflamatoria en cultivos celulares para establecer las dosis a las cuales se
obtiene el efecto; así se tendría la posibilidad de utilizar dichos extractos como
suplementos nutracéuticos.
Realizar ensayos de biodisponibilidad de fenólicos antioxidantes por
medio de sistemas in vivo con el fin de establecer posibles dosificaciones.
Usar esta investigación como base para tratar de seleccionar materiales
con mayor potencial nutracéutico. Lo anterior generaría un mayor valor agregado a
los arándanos producidos en México; simultáneamente la comercialización de este
tipo de arándanos tendría mayores oportunidades.
85
IX REFERENCIAS
Aalders, l. E., and Hall, I. V. 1975. A study of variation in fruit yield and related
characters in two diallels of the lowbush blueberry, Vaccinium
angustifolium Ait. Can. J. Genet. Cytol. 17:401-404.
Abdel-Aal, E. S. M., and Hucl, P. 1999. A rapid method for quantifying
anthocyanins in blue aleurone and purple pericarp wheats. Cereal Chem..
76:350-354.
Adom, K. K., and Liu R. H. 2005. Rapid peroxyl radical scavenging capacity (PSC)
assay for assessing both hydrophilic and lipophilic antioxidants. J. Agric.
Food Chem. 53: 6572-6580.
Adrian, M., Jeandet, P., Douillet, B. A., and Bessis, B. 2000. Stilbene content of
mature Vitis vinifera berries in response in UV-C elicitation. J. Agric. Food
Chem. 24:207-211.
Aggarwal, B. B., and Shishodia, S. 2006. Resveratrol in Health and Diseases. CRC
Press.
Agnihotri, V. K., Elsohly, H. N., Khan, S. I., Smillie T. J., Khan, I. A., and Walker,
L.A. 2009. Antioxidant constituents of Nymphaea caerulea flowers.
Phytochem. 69: 2061-2066.
Alwerdt, L, Seigler l., González de M. E., Yousef, G. Gad., and Lila, M. A. 2008.
Influence of alternative liquid chromatography techniques on the chemical
complexity and bioactivity of isolated proanthocyanidin mixtures. J. Agric.
Food Chem. 56:1896-1906.
86
Amarowicz, R., Carle, R., Dongowski, G., Dorazzo, A. M., Galensa, R., Kammerer,
D., Maiani, G., and Piskula, M.K. 2009. Influence of postharvest
processing and storage on the content of phenolic acids and flavonoids in
foods. Mol. Nutr. Food Res. 53:115-128.
Antilovich, W., Prenzler, M. P. D., Patsalides, E., Mcdonal, S., and Robards, K.
2002. Methods for testing antioxidant activity. Analyst. 127:183-198.
AOAC. 2000. Official Methods of Analysis 16th ed. Harla, Association of Official
Analytical Chemists. St. Paul, MN, EUA.
Aparicio-Fernández. X., García, G. T., Yousef, G. G., Lila, M. A., González, de M.
E., and Piña, G. L.2006. Chemopreventive activity of polyphenolics from
black jamada bean (Pharsalus vulgaris) on HeLa and HaCat cells. J. Agric.
Food Chem. 54:2116-2122.
Aron, M. P., and Kennedy A. J. 2008. Review. Flavan-3-ols: nature, occurrence
and biological activity. Mol. Nutr. Food Sci. 52:79-104.
Asami, D. K., Hong, Y. J., Barret, D. M., and Mitchel, A. E. 2003. Comparison of the
total phenolic and ascorbic content of freeze-dried and air-dried Marion
berry, strawberry, and corn grown using conventional. Organic, and
sustaintable agricultural practices. J. Agric. Food Chem. 51; 1267-1241.
Asenstorfer, R. P., Illand, P. G., Tate, M. E., and Jones, G. P. 2003. Charge
equilibrium and pKa of malvidin-3glucoside by electrophoresis. Anal.
Biochem. 318:291-299.
Azcón- Bieto, J., and Talón, M. 1993. Bioquímica y fisiología vegetal. Editorial
Interamericana McGraw Hill. 73: 135-142.
87
Ayaz, F. A., Hayirlioglu, S., Gruz, J., Novak, O., and Strnad, M. 2005. Separation,
characterization and quantitation of phenolic acids in a little- known
blueberry (Vaccinium arctostaphylos L.) fruit by HLPC-MS. J. Agric. Food
Chem. 53: 8116-8122.
Ballington, J. R., Ballinger, C. M., Mainland, W. H., Swallow, E. P., Maness, G.,
Galleta, J., and Kushman, L. J. 1984. Ripening period of Vaccinium
species in southeastern North Carolia. J. Am. Soc. Hort. Sci. 109:392-396.
Bastianetto, S., Brouillette, J., and Quirion, R. 2007. Neuroprotective effects of
natural products: interaction with intracellular kinases, amyloid peptides
and a possible role for transthyretin. Neurochem. Res. 1258-1265.
Beel, Kwilder, J., Jonker, H., Meester, P., Hall, R. D., Van der Meer, I. M., and Rice
de Vos, C. H. 2005. Antioxidants in raspberry: On-line links antioxidant
activity to diversity of individual metabolites. J. Agric. Food Chem. 53; 3313-
3320.
Benvenuti, S., Pellati, F., Melegari, M., and Bertelli, D. 2004. Polyphenols,
anthocyanins, ascorbic acid and radical scavening activity or Rubus, Ribes
and Aronia. Food Chem. Tox., 69:64-69.
Bermudez, O. I. and Tucker, K. L. 2003. Trends in dietary patterns of latin
American populations. Cad. Saúde Pública, Río de Janeiro. 19(Sup.1):
S87-S99.
Bhat, P., Krishna, M., Kosmeder, J. W. and Pezzuto, J. M. 2001.
Biological effects of resveratrol. Mary Ann Liebert Inc. vol. 3 num. 6:1041-
1064.
88
Bingham, S., and Riboli, E. 2004. Diet and cancer - The European prospective
investigations into cancer nutrition. Nature. 4: 206-215.
Boucher, F. 1999. Los productos nutraceúticos. Oportunidades para los recursos
naturales autóctonos. El papel de los investigadores. Fascículo técnico
No. 18. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura Centro
Regional Andino.
Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E. and Berset, C. 1995.Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity. Food Sci Tech 28: 25-30.
Burns, K., T., Dey, M., Rogers, B. R., Ribnicky, M. D., Gipp, M., D., Cefalu, T.,
Raskin, I., y Lila, M. A. 2008. Phytochemical composition and metabolic
performance-enhancing activity of dietary berries traditionally used by
native North Americans. J Agric. Food Chem. 56:654-660.
Cao, G., and Prior, R. L.1997. Comparison of different analytical methods for
assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem. 44:
1309-1315.
Cassidy, A., Hanley, B., and Raventos, L. R. M. 2000. Review. Isoflavones, lignans
ans stilbenes-origins metabolism and potential importance to human
health. J. Sci. Food Agric. 80:1044-1062.
Cho, K. H., Pezzuto, J. M., Bolton, J. L., Steele, V. E., Kelloff, G. J., Lee, S. K., and
Constantinuo, A. 2000. Selection of cancer chemopreventive agents
based on inhibition of topoisomerase II activity. Eur. J Cancer. 36:2146-
2156.
89
Clifford, M.N. 2000. Anthocyanins-nature, occurrence and dietary burden. J. Sci.
Food Agriculture. 80:1063-1072.
Clifford, M. N. 1999. Chlorogenic acids and other cinnamates: nature, occurrence
and dietary burden. J Sci Food Agric. 79:362-372
Collins, A. R., and Horváthova, E. 2001. Oxidative DNA damage, antioxidants
DNA repair: applications of coment assay. Colloquium “Biochemical and
biomedical aspects of oxidative modification” Biochem. Sco. Trans.
29:337-341.
Cui, J., and Chisti, Y. 2003. Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor:
physiological activity, uses, and production. Biotechnology Advances
21:109-122.
Darnell, R. C. 2000. Blueberries. Temperature fruit crops in warm climates. Kluwer
Academic Publishers, London. pp. 429-444, 463.
Delgado-Vargas F., Jiménez A.R., Paredes-López O. 2000. Natural pigments:
carotenoids,anthocyanins, and betalains – characteristics, biosynthesis,
processing and stability. Crit. Rev. Food Sci Nutr. 40: 173-289.
Delgado-Vargas, F., y Paredes-López, O. 2000. Chemical and colorants as
nutraceutical. CRC Press. Boca Ratón. pp 266-265.
90
Du, B., Jiang, L., Xia, Q., and Zhong, L. 2006.Synergistic inhibitory effects of
cucurmin and 5-fluorouracil on the growth of the human colon cancer cell
line HT-29. Int. J. Exp. Clin. Chem. 52:23-28.
Duddoné, S., Vitrac, X., Coutiére P., Woillez, M., and Mérillon, J.J. 2009.
comparative study of antioxidant propierties and total phenolic content of
30 plant extracts of industrial interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD and
ORAC assays. J. Agric. Food Chem. 57: 1768-1774.
Duthie, G. G., and Crozier, A. 2000. Plant derived phenolic antioxidants. Curr.
Opin. Lipid. 11: 43-47
Duthie, S. J. 2007. Berry phytochemical, genomic stability and cancer: Evidence for
chemoprotection at several stages in the carcinogenic process. Mol Nutr.
Food Res. 51:665-674.
Elfalleh, W., Nizar, N., Nidhal, M., Ines, T., Abdessalem, M., Yassine, Y.,
Belgacem, L. Ferdaous, F. 2009. Physico-chemial properties and DPPH-
ABTS scavenging activity of some local pomegranate (Punica granatum)
ecotypes. Int. J. Food Sci. Nutr. 1: 1465-3478.
Elisia, I., Chu., H., Popovich, G, David, H., and Kitts, D. David. 2007. Antioxidant
asseement of an anthocyanin-enriched blackberry extract. Food Chem.
101:1052-1058.
Ellis, R., and Gray, J. C. 1986. Ribulose biphosphate carboxylase-oxugenase.
Phylos. Trans. R. Soc. London Ser. B. 313: 303-469.
91
FAO/STAT, (2008). Production Yearbook, Food and Agricultural Organization of
the United Nations. Roma, Italia.
Fukumoto, L., and Mazza, G. 2000. Assessing antioxidant and prooxidant activity
of phenolic compound. J Agric. Food Chem. 48 (8) : 3597-3604
Giovanelli, G., and Buratti, S. 2009. Comparison of polyphenolic composition and
antioxidant activity of wild italian blueberries and some cultivated varieties.
Food Chemistry. 112: 903-908.
Graham, T. L. 1991. A rapid high-resolution high performance liquid
chromatography profiling procedure for plant and microbial aromatic
secondary metabolites. Plant Physiol. 95: 584- 593.
Green, A. 1979. The biochemistry of fruits and their products. Soft fruits. In Hulme
A.C. ed. Vol. 2. London, New York. pp. 375-410.
Guzmán-Maldonado, S. H. and Paredes López, O. 1999. Biotechnology for the
improvement of nutritional quality and food crop plants. In Molecular
Biotechonology for Plant Food Production. Paredes-López, O. (ed.)
Technomic Publishing Lco., Inc. Lancaster PA, pp. 553-620.
Häkkinen, H. S., Karenjampi, O. S., Heinonen, M., Mykkanen, M. H., y Torronen, R
A. 1999. Content of the flavonols quercetin, myricetin and kaempferol on
25 edible berries. J. Agric. Food Chem. 47: 2274-2279.
Häkkinen, S., Heinonen, M., Kärenlampi, S., Mykkänen, H., Ruuskanen, J., and
Tőrrőnen. 1999a. Screening of selected flavonoids anh phenolic acids in
92
19 berries. R. Food Res Int.32:345-353.
Hale, S. B., Lau, C. F., and Joseph, A. J. 2008. Berry fruit supplementation and the
aging brain. J. Agric. Food Chem., 56: 636-641.
Hall, I. V., A. R. Jamison, and Brydon, A. D. 1988.’Cumberland’ and ‘fundy’ low
bush blueberries. Can. J. Plant Sci.68:553-55.
Halvorsen, B. L. K., Myhrstad, I., Barikmo, E., Hvattum, S.F., Remberg, S.F., Wold,
A. B., Haffner, H., Baugerod, L. F., Andersen, O., Moskaug, D. R., and
Blomhoff, R. 2002. A systematic screening of total antioxidants in dietary
plants. J. Nutr. 132: 461-471.
Han, X., Shen, T., and Lou, H. 2007. Dietary polyphenols and their biological
significance. Int J Mol. Sci. 8:950-988.
Hannum, M. S. 2004. Potential impact of strawberries on human health: A review
of the science. Crit Review Food Sci Nutri. 44:1-17.
Hanson, E. J., and Hancock, J. F. 1990. Highbush blueberry cultivars and
production trends. Fruit Var. j. 44:77-81.
Harborne, J.B. 1980. Plant phenolics. Encyclopedia of Plant Physilogy. Vol. 8. Bell
EA. Springer, Berlin. P. 328-420.
Harborne, J. B., and Williams, C. A. 2000. Advances in flavonoid research since
1992. Phytochem. 55: 481-504.
Hegsted, D. M. and Ausman, L. M. 1998. Diet, alcohol and coronary heart disease
in man. J. Nutr. 118: 1184-1189.
93
Heinonen, I. M., Lentonen, P. J., and Hopia, A. I. 1998. Antioxidant activity of Berry
and fruit wines and liquors. J Agric. Food Chem. 46: 25-31.
Horn, C., and Ferráo, V. V. 2003. Antimutagenic activity of extacts of natural
substances in the Salmonella/ microsome assay. Mutagenesis. 18:113-
118.
Hoshino, W., and Bridle, P. 1980. Analysis of acidity in citric acids. In: J. Walford
(Ed.) Development in Food Colours. Appl. Sci. Publ. London, England. P
46-89.
Hosseinian, F. S., and Beta, T. 2007. Saskatoon and wild blueberries have higher
anthocyanins contents than other Menitoba berries. J. Agric. Food Chem.
55: 10832-10838.
Howell, A. B., Reed, J. D., y Krueger, C. G., Winterbottom, R., Cunningham, D.,
and Leahy, M. 2005. A type cranberry proanthicyanidins and uropathigenic
bacterial antiadhesion activity. Phytochem. 66:2281-2291.
Huang, D., and Prior, R. L. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity
assays. J. Agric. Food Chem. 53:1841-1856.
Hunter Associates Laboratory, Inc. 2008. Applications note. Hunter L, a, b color
scale. 8:1-4.
Jackman, R. L., Yada, R. Y., Tung, M.,and Speers, R. A. 1987. Anthocyanins as
food colorants- A Review-. J Food Biochem. Soc. 11: 201-270.
94
hepatic S9 and hepatocytes in vivo or in vitro induction. Mutagenesis.
19:245-250.
Joseph, J. A., Denisova, N.A., Arendash, G., Gordon, M., Diamond, D., Hale, S.B.,
and Morgan, D. 2003. Blueberry supplementation enhances signaling and
prevents bahevioral deficitis I an Alzheimer disease. Nutr. Neurosci. 3:153-
162.
Joseph, J. A., Fisher, D. R., Cheng, V., Rimando, A. M., and Hale, S. B. 2008.
Cellular and Behavioral Effects of Stilbene Resveratrol Analogues:
Implications fro Reducing the Deleterious Effects of Aging. J. Agric. Food
Chem. 56: 10544-10551.
Kader, F., Rover, B., Girardin, M., and Metche, M. 1996. Fractionation and
identification of phenolic compounds in Highbush blueberries (Vaccinium
corymbosum, L.). Food Chem. 55: 35-40.
Kähkönen, M., P., Hopia, H. J., Vuorela, J. P., Rauha, K., Pihlaja, T., Kujala T. y
Heinonen M. 1999. Antioxidant activity of plant extracts containing
phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 47: 3954-3962.
Kahkonen, M. P., Heinamaki, J., Ollilainen, V., and Heinonen, M., 2003. Berry
anthocyanins: Isolation, identification and antioxidant properties. J. Agric.
Food Chem. 64: 923-933.
Kalt, W., and McDonald, J. E. 1996. Chemical composition of lowbush blueberry
cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science.
121:142-146.
95
Kalt, W., McDonald, J. E., and Donner, H. 2000 Anthocyanins, phenolics, and
antioxidant capacity of processed lowbush blueberry products. J. Food
Sci. 5: 390-393.
Kaneno R., Fontanari L. M., Santos S. A., Di Stasi L. C., Rodrigues Filho E. and Eira
A. F. 2004. Effects of extracts from Brazilian sun-mushroom (Agaricus
blazei) on the NK activity and lymphoproliferative responsiveness of Ehrlich
tumor-bearing mice. Food Chem. Toxicol. 42:909-916.
Kays, S. 2004. Posthavest biology. Exon Press, Athens (Georgia). pp. 568.
Kelloff, G. J., Crowell, J. A., Steele, V. E., and Lubet, R. A. 2000. Progress en cancer
chemoprevention: Development of diet-derived chemopreventive agents. J
Nutr. 130:467-471.
Kirk, R.S. 1993. Analysis of Food. En: Encyclopedia of Food Science, Food
Technology and Nutrition. Macrae, R., robisnon, R.K. and Sadler, M. J.
(eds). Academic press, New York, NY. pp. 183-188.
Koponen, J.M., Happonen A.M., Mattila P.H., and Törrönen, R. 2007. Contents of
anthocyanins and ellagitannins in selected foods consumed in finland. J.
Agric. Food Chem. 55:1612-1619.
Kraft, T. F. B., Schmidt, B. M., Yousef, G. G., Knight, C. T. G., Cuendt, M. y Kang,
K. 2005. Chemopreventive potentia of wild, lowbush blueberry fruits in
multiple stages of carcenogenesis. J. Food Sci. 70: S159-S166.
96
Kundu, K. J., and Surh, J. Y. 2008. Cancer chemopreventive and therapeutic
potential of resveratrol: Mechanism perspectives. Cancer let. 269:243-261.
Lacueva, A. C., Hale, S. B., Galli, L. R., Jáuregui, O., Raventos, R. M., and Joseph,
J. A. 2005. Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally
and may enhance memory. Nutr. Neusosci. 8:111-120.
Lafay, S., and Izquierdo, G. A., 2008. Bioavailability of phenolic acids. Phytochem.
Rev. 7:301-311.
Lalancette, K. G., Pichette, A., and Legault, J. 2009. Sensitive cell- based assay
using DCFH oxidation for the determination of pro- and antioxidant
propiesties of compounds and mixtures: Analysis of fruit and vegetable
juices. Food Chem. 115: 720-726.
Laplaud, P. M., Lelubre, A., and Chapman, M. J.1997 Antioxidant action of
Vaccinium myrtillus extract on human low-density lipoproteins in Vitro:
Initial observations. Fundam. Clin. Pharm. 11: 35-40.
Lea, A. G. H. 1979. The procyanidins of white grapes and wines. J. Enol. Vitic. 30:
289-300.
Liu, H. R. 2004. Potential of phytochemicals in cancer prevention: Mechanism of action. J. Nutr. 134:3479S-3485S.
Liu, H. R., and Finley, J. 2005 Potential cell culture models for antioxidant
research. J. Agric. Food Chem. 53:4311-4314.
Liu M., Li, X. Q., Weber, C., Lee C. Y., Brown, J., and Liu R. H. 2002. Antioxidant
and antiproliferative activities of raspberries. J. Agric. Food Chem. 50:
2926-2930.
97
Liu, Z., Schwimer, J., and Liu, D. 2005. Black raspberry extract and fractions
contain angiogenesis inhibitors. J. Agric. Food Chem. 53:3909-3915.
Liu, M., Xin, Q. Li, Courtney, W., Chang, Y. L., Brown, J., and Liu, H. R. 2002.
Antioxidant and Antiproliferative Activities of Raspberries. J. Agric. Food
Chem.50: 2926-2930.
Lock, O., Cabello I., and Doroteo, V. H. 2006. Analysis of Flavonoids In Plants.
IUPAC Publications.
Lotito, S. B., and Frei, B. 2006. Dietary flavonoids attenuate tumor necrosis factor
alpha-inducen adhesion molecule expression in human aortic endothelial
cells: structure- function relationships and activity after first pass
metabolism. J. Biol. Chem. 281:37102-37110.
Luby, J. J., Ballington, J., Draper, A. D., Pliszka, K., and Austin, A. E. 1991.
Bueberries and cranberries (Vaccinium), Acta Hort. 290:391-456.
Lyons, M., Yu, Ch., Tomas, B. R., Cho, S., Reiboldt W., Lee, J., and Van Breemen
R. B. 2003. Resvaratrol in raw and baked blueberries and bilberries. J.
Agric. Food Chem. 57: 5867-5870.
Lyrene, P.M. (1990). Low-chill highbush blueberry. Fruit Var. J.44:82-86.
Määttä- Riihinen, K. K., Kamal-Eldin, A., Mattila, P.H., Paramás, G.A., and
Törrönen, R.A. 2004. Distribution and contents of phenolic compounds in
eighteen scavdinavian Berry species. J. Agric. Food Chem. 52: 4477-
4486.
98
Macheix, J. J., Fleuriet, A., and Billot, J. 1990. Fruit phenolics. CRC Press, Boca
Raton, FL.
Maiani, G., Castón, P. M.J., Catasta, G., Toti, E., Cambrodón, G. I., Bysted, A.,
Lorencio, G. f., Alonso, O. B., Knuthsen, A., Valoti, M., Bőhm, V., Miebach,
M. E., Bensnilian, D., and Schlemmer, U. 2009. Carotenoids: Actul
knowledge on food sources intakes, stability and bioavailability and their
protective role in humans. Mol. Nutr. Food Res. 53:1-25.
Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., and Jimenez, L. 2004
Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 79: 727–
747.
Manach, C., Williamson, G., Morand, C., Scalbert, A., Faria A., Oliveira J., Neves
P., Gameiro P., Santos-Buelga C., Freitas V., and Mateus N. 2005.
Antioxidant Properties of Prepared Blueberry (Vaccinium myrtillus)
Extracts. J. Agric. Food Chem. 53: 6896-6902.
Marchand, L. L. 2002. Cancer preventive effects of flavonids: a review. Biomed.
Pharmacother. 56:296-301.
Martinelli, E. M., Scilingo, A., and Pifferi, G., 1992. Computer-aided evaluation of
the relative stability of Vaccinium myrtillus anthocyanins. Anal. Chim. Acta.
259: 109-113.
Mass, J. L., Galleta, G. J., and Stoner, G. D. 1991. Ellagic acid an anticarcinogen
in fruits, especially in strawberries: A review. HortScience 26(1): 10-14.
Matsuda, H., Kageura, T., Morikawa, T., Toguchida, I., Harima, S. and Yoshikawa,
M. 2000 Effects of stilbene constituents from rhubarb on nitric oxide
production in lipopolysaccharide-activated macrophages. Bioorg. Med.
99
Chem. Lett. 10: 323–327.
Mattila, P., Hellstrom, J., y Törrönen, R. 2006. Phenolic acids in berries, fruits and
beverages. J Agric. Food Chem.54: 7193-7199.
Mattila, P., y Kumpulainen, J. 2002. Determination of free and total phenolic acids
in plant-derived foods by HPLC with diode array detection. J.Agric. Food
Chem. 50: 3660-3667.
McGuie, K., Hunt, M., and Barnett, L. E. 2005. Cultivar and growing region
determine the antioxidant polyphenolic concentration nd composition of
apples grown in New Zealand. J. Agric. Food Chem. 53: 3065-3070.
McGhie, K. Tony, and Walton, C. Micaela, M. 2007. The bioavailability and
absorption of anthocyanins: Mol Nutr Food Res. 51: 702-713.
Mizuno, C. S., Schrader, K. K., and Rimando, A. M. 2008. Alguicidal Activity of
Stilbene Analogues. J. Agric. Food Chem., 56:9140-9145.
Molan, A. L., Lila, M. A., and Mawson, J. 2008. Sateity in rats following blueverry
extract consumption inducen by appetite- suppressing mechanism
unrelated to in vitro or in vivo antioxidant capacity. Food Chem. 107: 1039-
1044.
Moon, J. K., and Shibamoto, T. 2009. Reviews. Antioxidant assays for plant and
food components. J.Agric. Food Chem. 57:1655-1666.
100
Moyer, A. R., Hummer, E. K., Finn, E. C., Frei B., and Wrolstad, E.R. 2002.
Anthocyanins, phenolic and antioxidante capacity in diverse small fruits:
Vaccinium, Rubus and Ribes. J. Agric. Food Chem. 50: 519-525.
Mullen, W., Lean, M. E., Crozier, A. 2002. A. Rapid characterization of
anthocyanins in red raspberry fruit by high-performance liquid
chromatography coupled to single quadrupole mass spectrometry. J
Cromatogr. A. 966: 63-70
Nanjo, F., Mori, M., Goto, K., and Hara, Y. 1999. Radical scavenging activity of te
catechins and their related compounds. Biosc. Biotech. Biochem. 63:
1621-1623.
Nanos, G. D., and Kader, A. A. 1993. Low O 2- induced changes in pH and energy
charge in pear fruits tissue. Postharv Biol Tech. 3:285-291.
Neto, C. C. 2007 . Cranberry and its phytochemicals: a review of in vitro anticancer
studies. J. Nutr. 137: 186S–193S.
Neto, C. C. 2007a. Cranberry and blueberry: evidence for protective effects against
cancer and vascular diseases. Mol. Nutr. Food Res. 51: 652–664.
Netzel, M., Netzel, G., Tian, Q., Schwartz, S., and Konczak, I. 2006. Sources of
antioxidant activity in australian native fruits identification and
quantification of anthocyanins. J. Agric. Food Chem. 54: 9820-9826.
Nicoué, E. E., Savard, S., and Belkacemi, L. 2007. Anthocyanins in wild blueberry
of Quebec: extraction and identification. J. Agric. Food Chem. 55: 5626-
5635.
101
Noda, Y., Mori, T., and Packer, L. 2002. Antioxidante activities of pomegranate fruit
extract and its anthocyanins: delphinidin, cyanidin and pelargonidin:
determination of their polyphenolic and volatile constituents. J. Agric Food
Chem. 53: 10074-10079.
Nohynek, J. L., Alakomi, L. H., Kahkonen, P. M., Heinonen, M., Helander, M.,
Clanderntey, O. K., and Pimia, P. R. 2006. Berry phenolcs: antimicrobial
propierties and mechanismi of action aganst severe human pathogens.
Nutr. Cancer. 54:18-32.
Ochmian, I., Grajkowski, J., and Skupién, K. 2009. Influence of substrate on yield
and chemical composition of highbush blueberry fruit Cv. “Sierra”. J. Fruit
Orn. Plant Res. 17:89-100.
Ogawa, K., Sakakibara, H., Iwata, R., Ishii, T., Sato, T., Goda, T., Shimoi, K., and
Kumazawa, S. 2008. Anthocyanin composition and antioxidant activity of
the crowberry (Empetrum nigrum) and other berries. J. Agric Food Chem.
56: 4457-4462.
Olsson, L. C., Veit, M., Weissenbock, G., and Bornman, J. F. 1998. Differential
flavonoid response to enhanced UV-B radiation in Brassica napus.
Phytochem. 49:1021-1028
Osterloh, A., Ebert, W., Held, H., Schulz, H., and Urban, E. 1996. Storage fruits
and tropical fruits. Ulmer Verlag Stuttgart. P. 253.
Pan, M. H., Ghai, G., and Ho, C. T. 2008. Food bioactives, apoptosis, and cancer.
Review. Mol. Nutr. Food Res. 52: 000-000.
102
Papagiannopoulos, M. and Mellenthin, A. 2001. Accelerated Solvente Extraction in
the investigation of polyphenols in the brewing process. The Royal Society
of Chemistry, Cambridge. pp.199-201.
Parr, A. J., and Bolwell, G. P. 2000. Review. Phenols in the plant and in man. The
potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the
phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 80: 985-1021.
Pascual, T. S., and Sánchez, B. M. T. 2008 Anthocyanins: from plant to health.
Phytochem. Rev. 7:281-299.
Pezet, R., and Pont, V. 1988. Mise in evidenceof pteroestilbene of grapes Vitis
vinifera. Plant Physiol. Biochem. 26:603-607.
Pietta, P. 2000. Flavonoids and antioxidants. J. Nat. Prod. 63:1035-1042.
Potter, G. A., Paterson, L.H., Wanogho, E., Perry, P.J., Butler, P.C., Ijaz, T.,
Ruparelia, K.C., Lamb, J. H., Farmer, P. B., Stanley, L. A., and Burke, M. D.
2002. The cancer chemopreventive agent resveratrol is converted to the
anticancer agent piceatannol by the cytrochrome P450 enzyme CYPIBI. Br.
J. Cancer. 86:774-778.
Prior, R.L., Cao, G., Martin, A., Sofic, E., McEwen, J., O´Brien, C., Lischner, N.,
Ehlenfeldt, M., Kalt, W., Krewer, G. and Mainland, M. 1998. Antioxidant
capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity
and variety of Vaccinium species. J. Agric. Food Chem. 46: 2686-2693.
Prior, R. L., Wu, X., and Schaich, K. 2005. Standarized methods for the
determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary
supplements. J. Agric. Food Chem. 55:680-687.
103
Raskin I., Ribnicky D. M., Komarnytsky S., Nebojsa I., Poulev A., Borisjuk N., Brinker
A., Moreno D. A., Ripoll Ch., Yakoby N., O´Neal J. M., Cornwell T., Pastor I.
and Fridlender B. 2002. Plants and human health in the twenty-first century.
TRENDS in Biotechnology 20:522-531.
Re, R., Pelegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., and Rice-Evans, C.
1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cátion
decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26: 1231-1237
Renaud, S., and De Lorgeril, M. 1992. Wine, alcohol, and the French paradox for
coronary heart disease. Lancet 339, 1523.
Rimando, A. M., and Barney, D. L. 2005. Resveratrol and naturally occurring
analogues in Vaccinium species. Acta Hort. Proc. 6: 137-143.
Rimando, A. M., Cuendet, M., Desmarchelier, C., Mehta, R. G., Pezzuto, J., and
Duke, S. O. 2002. Cancer chemopreventive and antioxidant activities of
pterostilbene, a naturally occurring analogue of resveratrol. J. Agric. Food
Chem. 50: 3453- 3457.
Rimando, M. A., Kalt, W., Magee, B. J., Dewey, J., and Ballington, R. J. 2004.
Resveratrol, Pterostilbene and Piceatannol in Vaccinium Berries. J. Agric.
Food Chem., 52:4713-4719.
Rodriguez, A. G., Riveros, C.J., Fischer, G., Moreno, L.G., and Cuenca, M.C.
2007. Caracterización fisicoquímica y organoléptica del fruto de agraz
(Vaccinium m.) almacenado 1 a 2 °C. Rev. Fac. Nac. Agr. Med. 60: 4179-
4193.
104
Rodríguez, R. A., Marín, R. F. Ocaña, A., and Rivas-Soler, C. 2008. Effect of
domestic processing on biotive compunds. Phytochem. Rev. 7: 345-384.
Roginsky, V., and Lissi E. A. 2005. Review of methods to determine chain-
breaking antioxidante activity in food. Food Chem. 92: 235-254.
Romani, A., Cignolini, P., Galardi, C., Nulinacci, N., Benedetteli, S. Y and Heimler,
D. (2004). Germoplasm characterization of Zolfinino landraces (Phaseolus
vulgaris L) by flavonoid content. J Agric. Food Chem. 52:3838-3842
Rosenkranz, A. R., Schmaldienst, S., Stuhlmeier, K. M., Chen, W., Knapp, W., and
Zlabinger, G. J. 1992. A microplate assay for the detection of oxidative
products using 2´,7´´-dichlorofluorescin-diacetate. J. Immunol. Methods.
156:39-45.
SAGARPA. 2007. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación, Anuario: 2007.
SAGARPA. 2008. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación, Anuario: 2007.
Sailendra, N. Nichelametla and Todd G. Taruscio. 2006. A review of the Effects
and mechanisms of polyphenolics in cancer. Crit Review Food Sci Nutri.
46:161-183.
Sánchez-Moreno, C., Cao, G., Ou, B., and Prior, R. 2003. Anthocyanin and
proanthocyanidin content in selected white and red wines. Oxygen radical
105
absorbance capacity comparison with nontraditional wines obtained from
highbush blueberry. J. Agric. Food Chem. 51: 4889-4896.
Santos B., C., and Scalbert, A. 2000. Proanthocyanidins and tannin like
compounds nature, occurrence, dietary intake, and effects on nutrition and
health. J. Agric. Food Chem. 80: 1094-1117.
Santos-Cervantes, M. E, Ibarra, Z. M. E., Loarca, P. G., Paredes-López, O., and
Delgado-Vargas, F. 2007. Antioxidant an antimutagenic activities of
Randia echinocarpa fruit. Plan Foods Human Nutr., 62:71-77.
Scalbert, A., Manach, C., Moran, C., and Rémésy, C. 2005. Dietary polyphenols
and the prevention of diseases. Crit. Rev. Food Sci. Nutrit. 45: 287-306.
Schafer, S., Podstawa, M., Visioli, F., Bogani, P., Muller, W. E., and Eckert, G. P.
2007. Hydroxytyrosol- rich olive mill wastewater extract protects brain cells
in vitro and in vivo. J Agric. Food Chem. 55:5043-5049.
Seeram, N. P. 2006. Berries. In Nutritional Oncology, 2nd ed.; Heber, D.,
Blackburn, G., Go, V. L. W., Milner, J., Eds.; Academic Press: London,
U.K. pp. 615-625.
Seeram, N. P. 2006a. Impact of berry phytochemicals on human health: Effects
beyond antioxidation. In Lipid Oxidation and Antioxidants: Chemistry,
Methodologies and Health Effects; ACS Symposium Series 956; Ho, C. T.,
Shahidi, F. S. Eds.; Oxford University Press: New York, Chapter 21.
Seeram, N.P. 2008. Berry Fruits for Cancer Prevention: Current Status and Future
Prospects. J. Agric. Food Chem56: 630–635.
106
Seeram, N, P., Adams, L. S., Zhang, Y., Lee, R., Sand, D., Scheuller, H. S., and
Heber, D. 2006b. Blackberry, black raspberry, blueberry, cranberry, red
Raspberry, and Strawberry extracts inhibit growth and stimulate apoptosis
of human cancer cells in vitro. J. Agric Food Chem. 54: 9329-9339.
Seeram, N.P., Aviram, M., Zhang Y., Henning, S.M., Feng, L., Dreher, M. and
Heber, D. 2008a. Comparison of antioxidante potency of Commonly
consumed polyphenol-rich beverages in the United States. J. Agric Food
Chem. 56: 1415-1422.
Sellappan, S., Akon, C. C., and Krewer, G. 2002. Phenolic compounds and
antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and blackberries. J.
Agric Food Chem. 50:2432-2438.
Shakibaei, M., Harikumar, B. K., and Aggarwal, B. B. 2009. Resveratrol addiction:
To die or not to die. Mol. Nutr. Food Res. 53:115-128.
Sharpe, R. H., and Darrow, G. M. 1959. Breeding blueberries for the florida
climate. Blueberry research-fifty years for progress. N. J. Agr. Expt. Sta.
pp.44-48
Sheu, S. Y, Lai, C. H., and Chiang, H. C. 1998. Inhibition of xanthine oxidase by
purpurogallin and silymarin group. Anticancer Res. 18:263-267
Shih, P. H, Yeh, C.T., and Yeh, G. C. 2005. Effects of anthocyanidin on the
inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human gastric
adenocarcinoma cells. Food Chem. Toxicol. 43:1557-15666.
Shureiqi, I., Reddy, P., and Brenner, D. E. 2000. Chemoprevention: general
perspective. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 33:157-167.
107
Silva, J. L., Marroquin, E., Matta, F. B., Garner, J. O., and Stojanovic, J. 2005.
Physicohemical, carbohydrate and sensory characteristics of highbush
and rabbiteye blueberry cultivars. J. Sci. Food Agric. 85: 1815- 1821.
Singleton, V. L., and Rossi, A. 1965. Colorimetry of total phenolics with
phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol.Vitic.
16:144-158.
Siriwoharn, T., Wrolstad, R. E., Finn, C.E., and Pereira, C.B. 2004 Influence of
cultivar, maturity, and sampling on blackberry (Rubus L. Hybrids)
Anthocyanins, polyphenolics, and antioxidant properties. J Agric Food chem
52: 8021-8031.
Skupién, K. 2006. Chemical composition of selected cultivars of highbush
blueberry fruit (Vaccinium corymbisum L.). F. Hort. 18: 47- 56.
Smith, S. H., Tate, P. L., Huang, G, Magee, J., Meepagala, K. M., Wedge, D. E.,
and Larcom, L. L. 2004. Antimutagenic Activity of Berry Extracts. J. Med.
Food. 4:450–455.
Soleas, G. J., Goldberg, D. M., Diamandis, E. P., Karumanchiri, A., and Yan, J.
1995. A derivatized gas chromatographic-mass spectrometric method for
the analysis of both isomers of resveratrol in juice and wine. Am. J. Enol.
Vitic. 48: 346-352.
Stahl, W., Van den Berg, H., Arthur, J., Bast, A., Dainty, J ., Faulks, M. R., Gartner,
C., Haenen, G., Hollman, P., Holst, B., Kelly, J. F., Williamson, G., and
108
Astley, B. 2002. Bioavailability and metabolism of antioxidants. Mol
Aspects Med. 23:39-100.
Staras, M., Karp, K., Vool, E., Moor, U., and Tonutare, P. 2007. Chemical
composition and quality of cultivated and natural blueberry fruit in Estonia.
Veg. Crops Res. b. 66: 143-153.
Stevens, P. F. 1969. Taxonomic studies in the Ericaceae. PhD. Thesis. University
of Edinburg.Edinburg, Scotkand. UK.
Stevenson, D. E., y Huso, R. D. 2007. Review. Polyohenolic phytochemicals-just
antioxidants or much more? Cell. Mol. Life Sci. 64:2900-2916.
Stone-Zafra, S., Yasmin, T., Baghci, M., Chatterjee, A., Vinson, J.A.. and Bagchi D.
2007. Reserach article. Berry anthocyanins as novel antioxidant in human
health and disease prevention. Mol. Nutr. Food Res. 51:675-683.
Stoner, G. A., Wang, L. S., Zikri, N., Chen, T., Hecht, S. S., Sardo, C. C., y
Lechner, J. F.. 2007. Cancer prevention with freeze-dried and berry
components. S. Cancer Biol. 17: 403-410.
Sun, N., Woo, S. H., Cassady, J. M., and Snapka, R.M. 1998. DNA polymerase
and topoisomerase II inhibitors from Psorealea corylifolia. J. Nat. Prod.
61:362–366.
Surh, Y. J. 2003. Cancer chemoprevention with dietary phytochyemicals. Reviews
Nature., 3:768-780
Szajdek, A., and Borowska, E. J. 2008. Biocative compounds and health promoting
propierties of berry fruits. A review. P. Foods Hum. Nutr. 63: 147-156.
109
Takamatsu, S., Galal, A.M., Ross, S.A., Ferreira, D., Elsohly, M., Rahim A.,
Ibrahim, S., and El-Feraly, S. 2003. Antioxidant effect of flavonoids on
DCF production in HL-60 cells. Phytother. Res. 17:963-966.
Timberlake, C. F., and Henry, B. S. 1986. Plant pigments as natural food colors.
Endeavour. 10: 31-36.
Trueba, P. G. 2003. Los flavonoides: antioxidants o prooxidantes. Rev. Cubana
Invest. Biomed. 22: 48-57.
U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service. (2003). USDA
database for the flavonoid content of selected foods.
U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service. (2004). USDA
agriculture database.
U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service. (2007). USDA
agriculture database.
Van den Berg, R., Haenen, G. R. M., Van den Berg, H., and Bast, A. 1999.
Applicability of an improved trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)
assay for evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures.
66:511-517.
Von-Gadiv, A., Joubert, E., and Hansmann, L.. 1997. Comparison of the
antioxidant activity of aspalathin with that of other plant phenols of roobies
tea (Aspalathus l.), α-tocopherol, BHT and BHA. J. Agric. Food Chem.
45:632-638.
110
Wang, L., and Weller, C. L. 2006. Recent advances in extraction of nutraceuticals
from plants. Trends Food Sci. Tech. 17:300-312.
Wang, S. Y., Chen, C. T., and Wang, C.Y. 2009. The influence of light and maturity
on fruit quality and flavonoid content of red raspberries. Food Chem. 112:
676-684.
Wang, S. Y., and Lin H. S. 2000. Antioxidant activity in fruits and leaves of
blackberry, raspberry and strawberry varies with cultivar and
developmental stage. J. Agric. Food Chem. 48: 140-146.
Wang, S. Y., and Stretch, A. W. 2001. Antioxidant capacity in cranberry is
influenced by cultivar and storage temperature. J. Agric. Food Chem.
49:969-974.
Wang, S. Y., Zheng, W., and Galleta, G. J. 2002. Cultural system affects fruit
quality and antioxidant capacity in strawberries. J. Agric Food Chem. 50:
6334-6542.
Whiting, G. C. 1958. The non-volatile acids of some berry fruits. J. Sc. Food Agric.
9: 244-248.
Wildman, E. C. Robert. 2001. Handbook of nutraceuticals and functional foods.
CRC Press. Boca, Ratón. pp 8-25.
Wildman, E. C. Robert. 2006. Handbook of nutraceuticals and functional foods.
Second edition. CRC Press. Boca, Ratón. pp 25.
Wojdlo, E., Oszmianski, J., and Czemerys, R. 2007. Antioxidant activity and
phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 105: 940-949.
111
Wolfe, K. L., and Lui, R. H. 2007. Cellular antioxidant activity, foods and dietary
supplements. J. Agric. Food Chem. 55: 8896-8907.
Wolfe, K. L., and Lui, R. H. 2008. Structure activity telationship of flavonoids in the
cellular antioxidant activity assay. J. Agric. Food Chem. 56:8404-8411.
Wolfe, K., Kang, X., He, X., Dong, M. M., Zhang, Q., and Liu, H.R. 2008. Cellular
antioxidant activity of common fruits. J. Agric. Food Chem. 56:8418-8426.
Yazaki, K., Sugiyama, A., Morita, M., and Shitan, N. 2008. Secondary transport as
an efficient membrane transport mechanism for plant secondary
metabolites. Phytochem. Rev. 7:513-524.
Yokomizo, A., and Moriwaki, M. 2006. Effects of uptake flavonoids on oxidative
stress induced by hydrogen peroxide in human intestinal Caco-2 cells.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 26, 1317-1324.
Yokozawa, T., Chen, C. P., Tanaka, T., Nonaka, G., and Nishioda, I. 1998. Study
on the inhibitory against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Bioc. Pharm.
56: 213-222.
112
X APÉNDICE
Concentración (µg/ml)
Concentración (µg/ml)
Concentración (µg/ml) Figura A.1 Effecto de las muestras de arándano y el estándar Trolox en el % de producción de DCF en las células HL-60. Cada punto en la gráfica representa la media ± la DS de la determinación por duplicado. (A) Trolox CI50 = 0.28 µg/ml, (B) cultivar Sharpblue CI50= 0.66 µg/ml, (C) F2 CI50= 2.5 µg/ml.