PRODUCCIÓN Y PROPIEDADES DE LOS SURFACTANTES OBTENIDOS A TRAVÉS DEL Bacillus subtilis CULTIVADA EN LOS LÍQUIDOS RESIDUALES

DE LA YUCA COMO SUSTRATO

Resumen

La producción y las propiedades de los biosurfactantes, sintetizados por la cepa de LB5a usando las aguas residuales de la yuca como sustrato que fueron investigados. El microorganismo fue capaz de crecer y producir surfactante en las aguas residuales de la yuca, reduciendo de la tensión superficial del medio a 26,6 nM/m y dando una concentración de surfactante en bruto de 3.0 g/L después de 48 hr. La superficie del compuesto activo retenido conserva sus propiedades durante la exposición a elevadas temperaturas (100 °C), alta salinidad (20 %NaCl) y un amplio rango de valores de pH.

El surfactante es capaz de formar una emulsión estable con diversos hidrocarburos. La caracterización química preliminar revelo que el surfactante reveló que el tensoactivo tiene una composición de lipopéptidos con valor CMC de aproximadamente 33 mg/L. Las aguas residuales de la yuca ha demostrado ser un sustrato adecuado para la biosíntesis de biotensoactivo, proporcionando no sólo el crecimiento de bacterias y la acumulación de producto, sino también un agente tensoactivo que tiene propiedades interesantes y útiles con potencial para muchas aplicaciones industriales.

1. Introducción

Los Biosurfactantes son compuestos de superficie activa producidos por microorganismos. La mayoría de surfactantes microbianos son moléculas complejas, comprenden diferentes estructuras que incluyen lipopéptidos, glicolípidos, polisacárido, proteínas complejas, ácidos grasos y fosfolípidos. En las últimas décadas, los biosurfactantes han ganado la atención porque presentan algunas ventajas, tales como la biodegradabilidad, bajas toxicidad, aceptabilidad ecológica, capacidad de ser producida a partir de fuentes renovables, y sustratos más baratos (Desai y Banat, 1997: Rosenberg y Ron, 1999). El campo de aplicación industrial de biotensoactivo incluye la recuperación mejorada de petróleo, extracción de petróleo crudo, lubricantes, biorremediación de contaminantes, cuidado de la salud, procesamiento de alimentos (Banat et al 2000). Entre las muchas clases de biosurfactantes, los lipopéptidos de Bacillus subtilis, son particularmente interesantes debido a su alta actividad superficial y potencial terapéutico (Besson y Michel, 1992: Sandrich et al 1990).

Aunque los biosurfactantes exhiben tales ventajas importantes, no han sido aún utilizados ampliamente en la industria debido a los costos de producción

relativamente altos, una estrategia posible para reducir los costos es la utilización de sustratos alternativos tales agrodesechos industriales. El principal problema relacionado con el uso de sustratos alternativos como medio de cultivo es encontrar un residuo con el equilibrio correcto de nutrientes que permite el crecimiento celular y la acumulación de producto. La melaza, hidrolizado de turba, y los efluentes de proceso de patata son ejemplos de sustratos alternativos que se han sugerido para la producción de biosurfactante por B. subtilis.

El establecimiento de los residuos de medio a base para la producción de biosurfactante también se enfrenta a otro problema, una vez que el tipo y las propiedades del producto final dependen de la composición del medio de cultivo

El Agua residual de la yuca es un residuo rico en carbohidratos, genera en grandes cantidades durante la producción de harina de yuca un ingrediente muy común que se utiliza en la cocina brasileña. Los principales nutrientes presentes en los residuos de yuca son el azúcar y sales minerales. El desechable de este residuo causa problemas medioambientales debido a su alta carga orgánica, sin embargo, es un sustrato muy atractivo para los procesos biotecnológicos.

El trabajo previo mostró que este residuo podría ser un sustrato potencial para la producción de biosurfactante.

En este estudio, se presenta la producción de yuca biosurfactante utilizando aguas residuales de B. subtilis LB5a.

Las propiedades y caracterización química inicial del producto obtenido también se presentan.

2. Métodos

2.1 microorganismos

La B. Subtilis LB5a de la colección de cultura de laboratorio de bioquímica (Nitschke y 2003 pastore), fue mantenido sobre la sustancia nutritiva agar (Difco) inclinaciones en 4°C.

2.2 preparación de sustrato

El efluente de yuca obtenido de la fabricación de la harina de yuca fue recogido y almacenado a -18°C hasta que se necesite. El medio se preparó por calentamiento de los residuos hasta la ebullición para facilitar la eliminación de material sólido insoluble. Después de enfriar, el sustrato se centrifugó a 8000 g durante 20 min (modelo Beckman J2-21).

El sobrenadante se distribuye en frascos y se esteriliza en autoclave a 1 atm. Y 121 ° C durante 15 min. El PH natural del medio fue de 5,9 y no se ajustó. El mismo lote de aguas residuales de yuca se utilizó para todos los experimentos y su composición se ha resumido tabla 1.

2.3 inóculo y condiciones de cultivo

Las cepas bacterianas se sembraron en estrías en un medio inclinado de agar nutriente y se incubó durante 24 horas a 30 ° C. Dos bucles de cultivo se inocularon en 20 ml de caldo nutritivo en un Matraz Erlenmeyer de 50 ml y se incubaron en un agitador a 150 rpm a 30 ° C durante 8-12 horas hasta alcanzar un número de células de 108 ufc / ml. Una parte de alícuota de 5 ml de inóculo se transfirió a 75 ml de medio de efluentes de yuca contenidos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incubó a 30 ° C y 150 rpm en un agitador rotatorio. Se recogieron muestras a intervalos de tiempo definidos y sometidos a análisis.

2.4 mediciones analíticas

El número de células viables: Las muestras se sometieron a diluciones en serie y recuento de viables se realizaron por la técnica de propagación placa.

Hidratos de carbono: carbohidratos totales se estimaron utilizando el ensayo fenol –sulfuro. El azúcar presente en el sustrato de yuca (glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa) se midieron por HPLC usando unas aguas de alto rendimiento de cromatografía líquida equipado con un detector de índice de refracción de una YMC una Pack Polyamine II columna (4,6 x 250 mm). Una mezcla de acetonitrilo: agua (75:25) fue utilizado como disolvente con un caudal de 1 ml / min a 25 ° C. Las muestras se identificaron comparando los tiempos de retención con los de los estándares de hidratos de carbono.

Superficie medida de la actividad. Muestras de cultivo se centrifugaron a 8.000 g durante 20 min para eliminar las células y el sobrenadante se sometió a mediciones de actividad de la superficie. Tensión superficial e interfacial se determinaron con un tensiómetro de Krüss procesador (modelo K12 T Krüss, Alemania), utilizando el método de la placa. La tensión interfacial se realizó frente a hexadecano. CMD-1 y CMD-2 se realiza mediante la medición de la tensión superficial de 10-veces y 100 veces de caldo de cultivo diluido en agua destilada. La CMC se determina por medidas de la tensión superficial de muestras seriadas de caldo diluido como anterior informó (Sheppard y Mulligan, 198), el factor de dilución obtenido (CMC-1) se relaciona con la concentración de tensoactivo en bruto (3 g / l después de 48 h). Desviación estándar máxima admitida para mediciones de la actividad de superficie era 0,20.

Aislamiento biotensoactivo: El tensoactivo se obtuvo de caldo exento de células mediante el ajuste del pH del caldo a 2,0 utilizando HCl 6N y mantenerla a 4 º C durante la noche.

El precipitado así obtener fue expulsado a 8.000 g durante 20 min, secado y pesado. Para la purificación adicional, el tensoactivo crudo se disolvió en agua destilada a pH 7,0 y se secó a 60 º C. El producto seco se extrajo con cloroformo metanol (65, 15), se filtró y el disolvente evapored. El producto así obtenido se utilizó para TLC, la composición bioquímica y la emulsificación análisis.

Caracterización química de biosurfactante. Prelimiary caracterización del biotensoactivo hecho por la delgada La cromatografía de capa (TLC). Los componentes de cloroformo / metanol extracto fueron separados en placas de gel de sílice 60 (Merck) utilizando como sistema disolvente CHCl3: CH3OH: H2O (65:15:1). Los componentes fueron detectado por pulverización de la placa con agua destilada y calentando a 110 ° C durante 5 min (Makkar y cameotra, 1997a) surfactina

(Sigma) se utilizó como estándar.

El análisis bioquímico. El contenido de proteína de tensoactivo se estimó utilizando el método de Biuret y el contenido de lípidos por la método de Bligh y Dyer (1959). El análisis de aminoácidos. La composición de aminoácidos de la tensoactivo se determinó en un analizador de amino ácido pickering tras la hidrólisis total de la muestra en HCl 6 N a 105 ° C durante 24 h,

Los estudios de estabilidad. Los estudios de estabilidad se realizaron utilizando caldo exento de células obtenido después de 48 h de cultivo. caldo

Las muestras se calentaron en un baño de agua hirviendo durante el tiempo diferente intervalos y se enfrió a temperatura ambiente. La estabilidad del pH se realizó mediante el ajuste el caldo a valores diferentes. Para estudiar el efecto de sal de adición de biosurfactivo, diferentes concentraciones de NaCl fueron añadido a muestras de caldo y se mezcla hasta disolución completa.

Los valores de tensión superficial y CMD de cada tratamiento fueron realizó como se describió anteriormente.

Actividad de emulsificación se realiza de acuerdo a

Cooper y Goldenberg (1987), 6 ml de hidrocarburo se añadió a 4 ml de solución acuosa de biotensoactivo (I mg / ml). en un tubo de tapón de rosca, y vórtex a alta velocidad durante 2 min. La estabilidad de la emulsión se determinó después de

24 h, y el índice de emulsificación (E24) se calculó dividiendo la altura medida de la capa de emulsión dividiendo la altura medida de la capa de emulsión de la altura total de la mezcla de la capa de emulsión por el total de la mezcla altura y multiplicando por 100.

Análisis estadísticos. los datos se presentan en términos de promedios aritméticos de al menos tres se replica y las barras de error indican las desviaciones estándar. Los análisis se llevaron a cabo utilizando el software MicroCal origing,versión 6.0