Universidad Autnoma de Baja CaliforniaFacultad de Ingeniera, Arquitectura y Diseo

Produccin de retinol a partir de Beta-caroteno en Phaseolus vulgaris.

Mariana Armburo Garca; Daniel Fernndez Nolasco; Jaime Alejandro Mndez Rodrguez.

Carrera: Bioingeniera Materia: Procesos BiotecnolgicosProfesor: M. C. Dante A. Magdaleno Rodrguez

ContenidoIntroduccin3Hiptesis6Objetivo General6Objetivos Especficos6Justificacin6Antecedentes7Desarrollo Experimental8Materiales y Mtodos8Procedimientos Generales8Cultivo in vitro9Transformacin Gentica9Anexos10Bibliografa12

Introduccin

El frijol (Phaseolus Vulgaris) es entre las leguminosas de grano alimenticias, la especie ms importante para el consumo humano. Su produccin abarca reas diversas, pudindose decir con propiedad que prcticamente se cultiva en todo el mundo. Amrica Latina es, en particular, la zona de mayor produccin y consumo, estimndose que ms del 45% de la produccin mundial proviene de esta regin [1].El frijol constituye la principal fuente de protena, de origen vegetal, para ms de 5.3 billones depersonasen AmricaLatina,frica, el Caribe yAsia [2]. Los granos constituyen productosagrcolas de gran importancia para la alimentacin animal y humana, ya que son fuentes portadoras de energa a travs de su contenido de carbohidratos y grasas, cantidades de protenasapreciables, y en algunos de ellos su contenido es elevado. Adems aportanminerales, vitaminas y carotenoides estos son requeridos en nuestro organismo para la formacin de vitamina A. A continuacin se presenta una tabla donde se muestran los diferentes tipos de frijol y su contenido de Beta-caroteno:

Tabla 1. Contenido de carotenoides en Phaseolus vulgaris [3].Fuentelicopeno- Caroteno- Caroteno

Phaseoulus Vulgaris (red)ND0.28g0.8g

Phaseolus Vulgaris (yellow)NDNDND

Phaseolus Vulgaris (French)ND0.72g0.78g

Los carotenos actan como provitaminas o precursores de la vitamina A. En algunos alimentos su color puede estar enmascarado por el pigmento vegetal verde clorofila, que con frecuencia se encuentra en ntima asociacin con los carotenos. Hay diversos tipos de carotenos, uno de ellos es el beta-caroteno que es la fuente ms importante de vitamina A en las dietas de la mayora de las personas que viven en pases no industrializados.

Los otros carotenos, o carotenoides, tienen poca o ninguna importancia para los seres humanos. A partir del beta-caroteno se promueve la sntesis de retinol, que es la forma principal de vitamina A en las dietas humanas, en su forma cristalina pura, es una sustancia amarillo verdoso, plida; existen otras formas de vitamina A que son el retinal y el cido retinoico, pero tienen configuraciones moleculares algo distintas, menos actividad biolgica que el retinol y no son importantes en las dietas humanas [4].

La conversin de beta-caroteno a vitamina A se realiza en las paredes del intestino delgado. An el intestino ms eficiente puede absorber y convertir tan slo una porcin del beta-caroteno de la dieta; por lo tanto, 6 g de beta-caroteno en el alimento equivale ms o menos a 1 g de retinol. Si no se consumen productos animales y el cuerpo debe depender por completo el beta-caroteno para su provisin de vitamina A, el consumo de beta-caroteno debe ser bastante grande a fin de lograr el nivel de vitamina A necesario al organismo [5].El beta-caroteno es la forma preponderante en los sistemas biolgicos y es a partir de ste que se promueve la sntesis del retinol, forma alcohlica y activa de la vitamina A. El -caroteno participa en la reaccin de oxidacin llevada a cabo por la enzima -caroteno 15-15monoxigenasa para obtener retinal, posteriormente es reducido a retinol por la retinol-deshidrogenasa.4

Figura 1. Conversin de beta-caroteno a retinol.

Para poder llevar a cabo la conversin de beta caroteno en Phaseolus vulgaris es necesario introducir estas dos enzimas para que se pueda llevar a cabo la reaccin, por lo tanto es necesaria una transformacin gentica. Cuando hablamos de transformacin gentica en plantas, nos referimos a la transferencia de genes entre organismos de diferentes especies ocurre en la naturaleza; un ejemplo de esto es Agrobacterium tumefaciens es una bacteria de plantas, es decir, crece a expensas de la propia planta. Esta bacteria tiene unas pequeas molculas de ADN en su interior que son plsmidos [6].Los plsmidos son de vital importancia a la hora de hacer una modificacin gentica, ya que es el lugar donde suelen ir los genes que vamos a introducir en un organismo, Agrobacterium tumefaciens infecta e induce la enfermedad conocida como agalla de la corona en muchas plantas dicotiledneas. La transformacin ha permitido tener lo que se conoce como organismos modelo y aunque hay varios mtodos para transformar plantas, es quiz la transformacin con Agrobacterium tumefaciens el mtodo ms eficaz y conveniente para introducir genes de otro organismo en ellas, ya que es un mtodo biolgico que por lo general presenta pocas copias del transgen en el genoma de la planta, reduciendo as problemas tales como el silenciamiento gnico. Por lo tanto, la transformacin gentica puede saltarse la barrera sexual de tal manera que cualquier gen de cualquier origen puede ser introducido. Es necesario usar herramientas genticas, bioqumicas y moleculares para identificar el gen apropiado y poder expresarlo en el lugar y en el momento deseado [6].

Figura 2. Estructura del plsmido Ti de Agrobacterium.Los genes transferidos de la bacteria a la planta estn en una molcula circular de ADN o plsmido inductor de tumores denominado Ti para el caso de A. tumefaciens. Esta transferencia de ADN ocurre slo despus de que la bacteria se ha adherido a las paredes lesionadas de la clula vegetal. Algunas de las sustancias liberadas de estas lesiones son los flavonoides, que son inductores de los genes que codifican las enzimas que liberan y transportan una seccin del Ti, llamada T-ADN, de la bacteria a la planta, para integrarlo al ADN en el ncleo. Estas clulas transformadas darn origen a plantas completas transformadas o transgnicas, bajo condiciones de seleccin y cultivo de tejidos apropiados. Hiptesis

La transformacin de P. vulgaris L. mediada por A. tumefaciens permitir realizar la incorporacin de los genes que codifican para dos enzimas responsables de la sntesis de retinol a partir de -caroteno, lo cual provocar la produccin de dicho metabolito en las semillas del frijol comn, contribuyendo a la biofortificacin del cultivo y la disponibilidad de retinol para los consumidores. Objetivo General

Inducir la sntesis de retinol partiendo del -caroteno como precursor mediante la actividad de las enzimas -caroteno 15, 15 monooxigenasa y retinol deshidrogenasa en Phaseolus vulgaris L.Objetivos Especficos

Incorporar los plsmidos de inters que contiene las secuencias de -caroteno 15, 15 monooxigenasa (Bcdo) y retinol deshidrogenasa (RDH) en la cepa de Agrobacterium tumefaciens. Realizar las pruebas de seleccin para las cepas transformadas. Obtener callos proliferados a partir de semillas maduras de P. vulgaris. (organogensis indirecta) Realizar la transformacin de P. vulgaris mediante infeccin con A. tumefaciens Comprobar la efectividad de la infeccin en P. vulgaris mediante la seleccin de los callos proliferados. Calcular el rendimiento para estimar la produccin de retinol en la semilla del frijol comn.Justificacin

Un consumo inadecuado de beta caroteno o vitamina A preformada, una deficiente absorcin de la vitamina o una mayor demanda metablica puede llevar a la carencia de vitamina A. De estas tres, la deficiencia alimentaria es en general la causa ms comn de xeroftalma [7].Buenas fuentes de retinol o vitamina A preformada, son: el hgado, aceites de hgado de pescado, yema de huevo y productos lcteos. Sin embargo, en muchos pases no industrializados, la mayora de la gente de bajos recursos obtiene la mayor parte, alrededor de 80 por ciento o ms de su vitamina A, del beta-caroteno de alimentos de origen vegetal [7].El beta-caroteno se utiliza pobremente cuando la dieta tiene un contenido bajo en grasa, y las dietas deficientes en vitamina A frecuentemente lo son en grasa. Ciertas enfermedades intestinales como disentera, enfermedad celaca y esprue limitan la absorcin de vitamina A y la conversin de caroteno. Los sndromes de malabsorcin y las infecciones con parsitos intestinales comunes, por ejemplo scaris, que predominan en los trpicos, pueden adems reducir la capacidad del cuerpo para convertir el caroteno en vitamina A [8]. Sin embargo, la mayora de las personas en los pases en desarrollo dependen principalmente del beta-caroteno para su suministro de vitamina A. En el ojo, la vitamina A es un importante componente visual de la retina, y si hay carencia de vitamina A, la capacidad de ver con luz tenue se reduce. Esta condicin se denomina ceguera nocturna, pudindose complicar y ocasionar xeroftalmia o inclusive ceguera permanente. El cambio principal, en trminos patolgicos, es una metaplasia queratinizante que se observa en varias superficies epiteliales. La vitamina A es necesaria para proteger la superficie del tejido [8].Tambin afecta el crecimiento Se sabe que el cido retinoico desempea una funcin similar a la de las hormonas en el control del crecimiento y el desarrollo de tejidos en el sistema osteomuscular, al igual que lo hace en otras partes. Un mecanismo posible para la influencia en el crecimiento es la demostracin muy reciente de que tanto la vitamina A como el cido retinoico producen liberacin rpida de AMP cclico y secrecin de la hormona del crecimiento humano [9].Por lo tanto es de gran importancia que el beta caroteno sea convertido a retinol, ya que de esta manera el organismo puede aprovecharlo de manera ms eficiente.AntecedentesUn consumo inadecuado de beta caroteno o vitamina A preformada, una deficiente absorcin de la vitamina o una mayor demanda metablica puede llevar a la carencia de vitamina A. De estas tres, la deficiencia alimentaria es en general la causa ms comn de xeroftalma.7Buenas fuentes de retinol o vitamina A preformada, son: el hgado, aceites de hgado de pescado, yema de huevo y productos lcteos. Sin embargo, en muchos pases no industrializados, la mayora de la gente de bajos recursos obtiene la mayor parte, alrededor de 80 por ciento o ms de su vitamina A, del beta caroteno de alimentos de origen vegetal.7 El beta caroteno se utiliza pobremente cuando la dieta tiene un contenido bajo en grasa, y las dietas deficientes en vitamina A frecuentemente lo son en grasa. Ciertas enfermedades intestinales como disentera, enfermedad celaca y esprue limitan la absorcin de vitamina A y la conversin de caroteno. Los sndromes de malabsorcin y las infecciones con parsitos intestinales comunes, por ejemplo scaris, que predominan en los trpicos, pueden adems reducir la capacidad del cuerpo para convertir el caroteno en vitamina A.8 Sin embargo, la mayora de las personas en los pases en desarrollo dependen principalmente del beta-caroteno para su suministro de vitamina A. En el ojo, la vitamina A es un importante componente visual de la retina, y si hay carencia de vitamina A, la capacidad de ver con luz tenue se reduce. Esta condicin se denomina ceguera nocturna, pudindose complicar y ocasionar xeroftalmia o inclusive ceguera permanente. El cambio principal, en trminos patolgicos, es una metaplasia queratinizante que se observa en varias superficies epiteliales. La vitamina A es necesaria para proteger la superficie del tejido.8Tambin afecta el crecimiento Se sabe que el cido retinoico desempea una funcin similar a la de las hormonas en el control del crecimiento y el desarrollo de tejidos en el sistema osteomuscular, al igual que lo hace en otras partes. Un mecanismo posible para la influencia en el crecimiento es la demostracin muy reciente de que tanto la vitamina A como el cido retinoico producen liberacin rpida de AMP cclico y secrecin de la hormona del crecimiento humano.9Por lo tanto es de gran importancia que el beta caroteno sea convertido a retinol, ya que de esta manera el organismo puede aprovecharlo de manera ms eficienteDesarrollo Experimental

Materiales y Mtodos

Procedimientos Generales

Los instrumentos utilizados para manejar las plantas durante todo el procedimiento sern esterilizados en la estufa a 180 C durante dos horas antes del inicio de cada sesin de trabajo. El pH de los medios de cultivo (Tabla I) ser ajustado con NaOH o con HCl antes de someterlo a la autoclave, en donde las condiciones sern 121 C y 1.2 kg/cm2 de presin por 20 minutos. Las semillas utilizadas sern semillas maduras de P. vulgaris L.Cultivo in vitro

Desinfeccin y geminacin de las semillas.Las semillas sern lavadas con agua de llave y desinfectadas con un lavado rpido de 10 segundos de etanol al 70 % (v/v), posteriormente en una solucin de NaOCl al 3% (v/v). Para eliminar residuos las semillas se enjuagaran tres veces con agua estril desionizada. Las semillas se colocaran en un medio de cultivo para germinacin (MG), diez semillas se colocaran en recipientes de cultivo de 250 ml que contendrn 30 ml de MG y se mantendrn a 25C en obscuridad por tres das.Induccin y proliferacin del callo.Los explantes sern obtenidos de semillas germinadas de 3 das de edad, los cotiledones obtenidos se colocaran en un medio de cultivo para la induccin del callo (MIC) el cual se mantendr en una cmara de crecimiento a 25 C, durante los primeros 7 das los recipientes de cultivo se cubrirn con bolsas negras para mantener el cultivo en la obscuridad, al finalizar este periodo el cultivo se someter a 16 horas de luz y 8 horas de obscuridad por 14 das. Los callos de 21 das de edad inducidos por los explantes se cortaran y mezclaran en pequeos fragmentos (0.2 a 0.3 g) y se transferirn a un medio de cultivo para la proliferacin del callo (MPC) por 30 das. Una vez transcurridos los 30 das los callos proliferados se cortaran en fragmentos pequeos (3-5 mm) y se usaran como explante diana para la inoculacin con Agrobacterium.Transformacin Gentica

Descripcin de T-DNA y preparacin de los plsmidos.Se utilizar la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens la cual contiene el plsmido pAL4404 que carece de la regin T-DNA y contiene los genes de virulencia vir. Se construir dos plsmidos complementarios que contengan los genes de resistencia a kanamicina, los vectores que codifican para las enzimas Beta-caroteno 15, 15 monooxigenasa y Retinol deshidrogenasa (Vase Anexo 1) y los sitios de corte especficos para las endonucleasas utilizadas. Para la construccin de los vectores se utilizarn las secuencias mandadas a sintetizar a GenScript [10] (Vase anexo 2).El vector 1 contiene el gen de la enzima Beta-caroteno 15, 15 monooxigenasa regulado bajo el promotor del gen Arcelin 5 (ARC-5) de expresin nica en semilla y con el terminador del virus mosaico de la coliflor (CamV-35S).El vector 2 contiene el gen de la enzima retinol deshidrogenasa regulado bajo el promotor del gen del Arcelin 5 (ARC-5) y con el terminador del virus mosaico de la coliflor (CamV-35S).

Una vez obtenidos los vectores se realizar un PCR para obtener mltiples copias de cada uno (Vase anexo 3). Cada vector se agregar a un plsmido diferente obteniendo dos cultivos para transformacin. El plsmido se abre mediante el corte de las enzimas PacI y AsiSI. T4

La seleccin de cepas transformadas se llevar a cabo mediante el cultivo en agar con kanamicina, tanto para las cepas que contienen el vector 1 y el vector 2.

Preparacin de la suspensin bacterianaLas cepas transformadas de A. tumefaciens sern utilizadas para inocular los fragmentos de callos proliferados. Cada colonia de A. tumefaciens es aislada de los platos de seleccin y son suspendidas en 3ml del medio de cultivo YEP

Anlisis de clulas transformadas de P. vulgaris mediante Northern blot.

El anlisis de las clulas transformadas por Agrobacterium se llevar a cabo utilizando el mtodo de Northern blot (ThermoFisher Scientific).Paso 1: Aislamiento del RNA llevado a cabo por el kit y protocolo de extraccin y purificacin de ThermoFisher Scientific.

Paso 2: Generacin de sondas de RNA producidas por reacciones de transcripcin in vitro utilizando los kits Ambion y MAXIscript de ThermoFisher.Paso 3:Una vez que se aslan las muestras de RNA se desnaturaliza en gel de agarosa con electroforesis para el cual se utiliza el kit NorthernMax.Paso 4: Una vez que se separa el RNA por electroforesis en gel de agarosa, el RNA es transferido a una membrana de nylon positivamente cargada e inmovilizado por hibridacin, para ello se puede utilizar el kit iBlot Dry Blotting System.Paso 5:Para llevar a cabo la hibridacin se utilizarn los siguientes juegos de primers:TransgenesPrimers

Vector 1 BcdoFw: 5GTAGACAAAATCCCATCTTT 3Rv: 5TACCACCGAGTTCAGAAATT3

Vector 2 RdhFw: 5GTAGACAAAATCCCATCTTT3Rv: 5CCTCGAGTATATAAATGTGG3

Vector 1 BcdoFw: 5 ATGGAGATAATATTTGGCCA3Rv: 5TACCACCGAGTTCAGAAATT3

Vector 2 RdhFw: 5 ATGTGGCTGCCTCTGCTTCT3Rv: 5CCTCGAGTATATAAATGTGG3

Vector 1 BcdoFw: 5 ATGGAGATAATATTTGGCCA3Rv: 5 AGGATTTTGGTTTTAGGTCA3

Vector 2 RdhFw: 5 GGAGCTCATATATTTACACC3Rv: 5 AGGATTTTGGTTTTAGGTCA3

Paso 6:Despus de la hibridacin, las sondas que no hibridaron son removida lavando repetidas veces con buffer. La deteccin se lleva a cabo mediante el kit The BrightStar BioDetect.Anexos

Anexo 1.La secuencia del gen que codifica para la enzima Beta-caroteno 15, 15 monooxigenasa fue obtenida de NCBI con el cdigo de acceso AH011710.1.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH011710.1La secuencia del gen que codifica para la enzima Retinol deshidrogenasa fue obtenida de NCBI con el cdigo de acceso X97752.1.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X97752La secuencia promotora utilizada para regular los genes fue obtenida del gen de Arceln 5 en NCBI con el cdigo de acceso Z50202.1.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/z50202#feature_3451281_regulatory_1

Anexo 2.Se utilizarn las siguientes endonucleasas para abrir cada plsmido e incorporar en cada uno cada vector.

Anexo 3. Para amplificar los vectores utilizaremos PCR, con ayuda de un termociclador se establecen las siguientes condiciones:ProgramacinCiclosTemperatura (C)Tiempo (s)

Desnaturalizacin inicial19860

Desnaturalizacin25 9810

Hibridacin254525

Extensin257240

Extensin final172300

En espera14

Primer ForwardTm 1Primer ReverseTm 2

Vector 1CGCGTAGACAAAATCCCA43 CTTAATTAAACTGGATTTTGGTTT44 C

Vector 2CGCGTAGACAAAATCCCA43 CTTAATTAAACTGGATTTTGGTTT44 C

Bibliografa

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