PRODUCCIÓN DE BIOPLÁSTICOS A PARTIR DE BACTERIAS EMPLEANDO SUSTRATOS NO

CONVENCIONALES.

Autores Mariana Cardona Betancur. Msc.

Lina María Agudelo Escobar MsC.

Grupo de Biotransformación Escuela de Microbiología

10 de Septiembre de 2012

Contenido

Introducción

Planteamiento del Problema

Producción de bioplásticos empleando bacterias

Objetivos

Metodología

Resultados y Discusión

Conclusiones

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Planteamiento del Problema

LOS PLÁSTICOS

Su producción es de aprox. 260 millones de ton/año.

En su elaboración se consumen anualmente cerca de 270 millones de

toneladas de petróleo y gas.

Poseen tiempo de uso corto, por lo cual representan del 35-55% de los residuos no biodegradables que van a los rellenos

sanitarios.

No son degradados fácilmente por medio de procesos naturales y tardan en

descomponerse hasta 300 años.

El 11% de nuestra basura son desechos plásticos, y esto aumenta un 1% desde

1960.

Hay más de 18.000 piezas de bolsas plásticas que flotan en cada kilómetro cuadrado de los océanos del mundo.

3

…”El mayor porcentaje de este material se convierte directamente en basura al usarse y ser desechado”…

4

Metodologías que permitan la degradabilidad de los plásticos

Origen y Producción Ejemplos

Obtenidos naturalmente biomasa. Celulosa, Almidón, Quitosan

Sintetizados a partir de fuentes renovables.

Poli-ácido láctico(PLA), poli-

ácidos glicoles(PGA), poli-caprolactonas(PCL)

Producidos por microorganismos o modificados genéticamente.

Poli-hidroxialcanoatos(PHAs), poli-3-hidroxibutarato (PHB)

Mezclas de polímeros biodegradables.

Polivinilalcohol (PVOH) +

policaprolactonas (PCL)

Plásticos oxo-degradables

Plásticos bio-degradables

Fuente: European Bioplastic, 2009,

5

Polímeros Biodegradables

Fuente: European Bioplastic, Mayo 2011

Producción mundial de Bioplásticos

Biodegradable

No Biodegradable

Total

Polihidroxialcanoatos (PHAs)

6

Fermentación

Obtención, Extracción y

purificación PHAs

Productos Bioplásticos

Biodegradación (Compostaje)

Agua

Oxígeno

Energía

Moldeo

Reciclaje

Agua

CO2

Sustratos

agroindustriales

Los PHAs son bioplásticos producidos intracelularmente por bacterias, poseen propiedades termoplásticas, son biodegradables, biocompatibles, además, poseen un alto grado de polimerización y de cristalización.

La síntesis bacterial de Polihidroxialcanoatos (PHAs) en diversas especies, más de 300 en total, permite acumular intracelularmente grandes cantidades de polímero (aproximadamente 90% del peso celular) debido al metabolismo y a los requerimientos energéticos empleados por éstas bacterias.

Microorganismos productores de PHAs

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Bacterias que acumulan PHAs

Bacteria % peso seco

Ralstonia eutropha 96

Ralstonia eutropha ATCC 17699 80-90

Rhodobacter 80

Azospirillum 75

Azotobacter 73

Methylocystis 70

Leptothrix 67

Pseudomonas 67

Baggiatoa 57

Rhizobium 57

Fuente: http://www.biopolymer.net

Ralstonia eutropha ATCC 17699

8

Ralstonia eutropha ATCC 17699

Material celular

La bacteria Ralstonia eutropha ATCC 17699 es la más estudiada para la producción de PHAs, debido a su excelente capacidad para acumular una gran cantidad de polímero como el ácido Polihidroxibutirato (PHB) a partir de fuentes de carbono simples como fructosa, glucosa, ácido acético y fuentes de carbono no convencionales como almidones, melazas y suero de leche.

PHAs scl: PHB PHA con 3HV

PHAs mcl: Poly(3HA)

PHAs mcl: PHA con 4HB PHA con HH

Azúcares

Malonil-CoA

(R)-3-Hidroxiacil-CoA

Ácidos

Grasos

Otras Rutas Metabólicas Dependiendo de la fuente de

carbono.

Ruta Metabólica I

Ruta Metabólica II

Ruta Metabólica III

Acetil-CoA

Los scl – PHA tiene propiedades cercanas a los plásticos convencionales, mientras que los mcl – PHA son considerados como elastómeros y gomas.

9

Ruta Metabólica de Ralstonia eutropha ATCC 17699 para la producción de PHAs

Polihidroxialcanoatos (PHAs)

O CH2 O (CH2)n O CH2

CH C CH C CH

CH3 O R O CH3

R = hidrógeno Poly(3-hidroxipropionato)

R = metil Poly(3-hidroxibutirato)

n=1 R = etil Poly(3-hidroxivalerato)

R = propil Poly(3-hidroxihexanoato)

R = pentil Poly(3-hidroxioctanoato)

R = nonil Poly(3-hidroxidodecanoato)

n=2 R = hidrógeno Poly(4-hidroxibutirato)

R = metil Poly(4-hidroxivalerato)

n=3 R = hidrógeno Poly(5-hidroxivalerato)

R = metil Poly(5-hidroxihexanoato)

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Todos los PHAs se caracterizan por tener el mismo monómero con diferente radical alquilo que varía de 1 a 14 carbonos. Los PHAs pueden ser divididos en tres extensos grupos: Short chain length (scl - PHA) Medium chain length (mcl - PHA) Long chain length (lcl – PHA).

Objetivos

Objetivo General

Evaluar la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando sustratos no convencionales.

Objetivos Específicos

Evaluar los sustratos harina de yuca y banano de rechazo para la producción de PHAs a nivel de erlenmeyer y a nivel de 5L.

Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.

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12

Metodología

Separación y Obtención del

Metabolito

Caracterización del PHA

Extracción y

Purificación del PHA.

Cuantificación del PHA.

Activación y Conservación del microorganismo.

Determinación de

la relación C/N

mínima para el

microorganismo.

Producción de PHAs en sustratos

convencionales. Producción de

PHAs empleando banano de rechazo a

diferentes C/N.

Caracterización estructural y termo-

mecánica del polímero.

Producción de PHAs

Obtención y estandarización del inóculo.

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Metodología

Análisis macroscópico de la colonia y microscópico de la bacteria y la formación intracelular del polímero.

Resultados

Por medio del cultivo en caja Petri se realizó un análisis Macroscópico de la colonia bacteriana y por medio del método de siembra en superficie de la caja se realizó un análisis Microscópico del microorganismo para determinar la morfología de la colonia . Se realizó tinción Gram

Se hizó el análisis de la formación y polimerización intracelular del polímero en el tiempo, por medio de Espectroscopía Raman.

Se realizó un análisis cualitativo de la acumulación del polímero por medio de tinciones con Negro Sudán

Análisis Macroscópico de la Colonia

Análisis Microscópico del microorganismo

TFY TSB LB

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200

Bacteria 32 h

Bacteria 24 h

Bacteria 12 h

Bacteria 6 h

Bacteria 3 h

Bacteria 0 h

Inte

ns

ida

d (

u.a

)

Nْ mero de onda (cm-1)

PHB patrَ n

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Resultados

Determinación de los requerimientos nutricionales mínimos para el microorganismo

C6H12O6 + 2,87O2 + 0,744NH3 = 3CH1.77O0,5N0,248 + 4,366H2O + 3CO2

Con base en está ecuación la relación Carbono/Nitrógeno para no limitar el crecimiento celular será: 6,91gC/gN. Al emplear Glucosa como fuente de carbono y Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno la relación C/N determinada fue 3,4562 g C/g N.

Balance Global: CH2O + oO2 + aNH3 = Yx/s CH1.77O0,5N0,248 + wH2O + cCO2

Balance de Carbono: 1 = Yx/s + c Balance de Nitrógeno: a = 0,248Yx/s Balance de Oxígeno: 1 + o = 0,5Yx/s + w + c Electrones disponibles: Гs + o ГO2 = ГxYx/sc

De este modo la ecuación de crecimiento para Ralstonia eutropha ATCC 17699 será: CH2O + 0,4781O2 + 0,124NH3 = 0,5CH1.77O0,5N0,248 + 0,7276H2O + 0,5CO2

1

2

3

4

Luego: De 4: o = 0,4781 De 1: c = 0,5 De 2: a = 0,124 De 3: w = 0,7276

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Metodología

Evaluación de diferentes relaciones C/N para la producción de PHAs

Resultados

Se realizó un diseño experimental multifactorial categórico, empleando el paquete estadístico Statgraphics centurión XVI.I, se evaluaron cinco relaciones Carbono/Nitrógeno (5; 6,9; 10; 20; 40) para dos medios de cultivo empleando fuentes de carbono convencionales como la glucosa y la fructosa. Los treinta experimentos que arrojó el diseño de experimentos fueron llevados a cabo bajo las mismas condiciones operacionales establecidas, 30oC, 150 rpm y 36 horas. La extracción y purificación del polímero, se realizó empleando la metodología descrita. Las variable respuesta fue la concentración de PHA en (g/L).

Producción de PHAs empleando Glucosa y Sulfato de Amonio a diferentes relaciones C/N.

Producción de PHAs empleando Fructosa y Sulfato de Amonio a diferentes relaciones C/N.

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Composición y Preparación del medio de cultivo de Producción empleando sustratos no convencionales

Metal

Jarabe Glucosado

Harina de

yuca

Banano de

Rechazo Potasio (% de K) 0,15±0,001 775,6±10,1

Sodio (mg de Na/kg) 18,0±0,2 1,73±0,08

Calcio (mg de Ca/kg) 16,1±0,8 8,03±0,9

Hierro (mg de Fe/kg) 6,14±0,09 0,0643±0,003

Manganeso (mg de Mn/kg) 0,605±0,006 1,84±0,01

Cobre (mg deCu/kg) Menor de

0,0045

Menor de 0,0045

Magnesio (mg de Mg/kg) 84,3±1,1 41,4±0,1

Niquel (mg de Ni/kg) 0,0254±0,002 Menor de 0,008

Cobalto (mg de Co/kg) 0,0854±0,0013 Menor de 0,01

Zinc (mg de Zn/kg) 0,428±0,008 0,279±0,001

Análisis de Absorción atómica

Determinación de Azucares reductores y glucosa

Análisis Bromatológico

Metal Harina de

yuca

Banano

de

Rechazo % Humedad 79,26 79,20

% cenizas 0,44 0,80

% proteínas 0,95 1,35

% Grasa total 0,04 0,03

% Carbohidratos 19,31 18,62

Calorías Kcal/100g 81,4 80,15

Harina de

yuca

Banano de

Rechazo Azucares Reductores (g/L) 259,16±0,001 50,16±0,4

Glucosa (g/L) 248,29±0,001 31,98±0,02

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Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de Rechazo y harina de yuca.

Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a

diferentes relaciones C/N.

Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y

sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.

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Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de Rechazo y harina de yuca.

Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y

sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.

Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a

diferentes relaciones C/N.

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Metodología

2. Objetivo Evaluar la producción de PHA en reactor de 5L empleando el mejor medio no convencional.

Resultados

Se empleó un biorreactor Bioengineering RALF plus® con un volumen útil de 3 litros, agitado mecánicamente con control de pH y Temperatura. Al reactor se le adicionó agua destilada con la fuente de carbono en una concentración de 20g/L y se esterilizó. Todos los macroelementos y microelementos fueron preparados y suministrados al reactor uno a uno. El reactor se inoculó con un cultivo previamente activado en medio de cultivo TSB. El proceso fermentativo se llevó a cabo a 30oC y 150 rpm durante 36 horas. Para el análisis de los resultados se tomaron 50 mL de muestra cada 6 horas. A cada muestra se le evaluó la concentración de biomasa en g/L, la concentración de biopolímero en g/L y el consumo de sustrato .

20

Resultados

3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.

Análisis Infrarrojos

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

0,0

0,5

1,0

0,0

0,5

1,0

0,0

0,5

1,0

0,0

0,5

1,0

0,0

0,5

1,0

Numero de Onda (cm-1

)

Glucosa

Harina

Fructosa

Banano

PHB comercial

Análisis Raman

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200

PHA empleando

glucosa

PHA empleando

Banano de rechazo

PHA empleando

fructosa

PHB patrَ n

PHA empleando

harina de yuca

Inte

ns

ida

d (

u.a

)

Nùmero de onda (cm-1)

Compatibilidad con el patrón y según base de datos del FTIR del 98%.

21

Resultados

3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.

Análisis Raman Variación en la cantidad de sustrato

22

Resultados

3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.

Análisis DSC Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando diferentes sustratos.

Comparación de las propiedades físicas de algunos PHAs y algunos polímeros convencionales

23

Resultados

3. Objetivo Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el biopolímero obtenido.

Análisis DSC Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando diferentes sustratos.

Tm1

Tm2

Tcc

Tg

-4

-3

-2

-1

0

1

2H

ea

t F

low

(W

/g)

-20 30 80 130 180

Temperature (°C)

Banano––––––– Fructosa––––––– Glucosa––––––– Harina––––––– PHB comercial–––––––

Exo Up Universal V4.2E TA Instruments

Algunas Referencias Bibliográficas

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[1] Plastivida, el plástico a favor de la vida. Degradación de los materiales plásticos. Boletín técnico informativo No. 21.2007. [2] Informe de European Bioplastics. Disponible en: http://www.european-bioplastics.org/com. Acceso el 20 de junio de 2007. [3] LEIA, Centro de desarrollo tecnológico. Bioplásticos. 2009. [4] Macrae RM, Wilkinson JF, The influence of cultural conditions on poly-(3-hydroxybutyrate synthesis in Bacillus megaterium. proc. roy. soc. 1958; 27:73-78. [5] Lemoinge M, Produit de déshydratation et de polymérization de l’acide β-oxybutyrique. Bull Soc Cimi Biol. 1926; 8: 770-782. [6] Lemoinge M, études sur l’autolyse microbienne: origine de l’acide β-oxybutyrique formé par autolyse. Ann inst Pasteur. 1927; 41: 148-165. [7] Naceur M, Gandini A, A monomers polymers and composites from renewable resources. elservier. Gran Bretaña; 2008. [8] Stanier RY, Doudoroff M, kunisawa R, Contopoulou R. The role of organic substrates in bacterial photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 1959; 45:1246-1260. [9] Wilkinson JF, Williamson DM. The isolation and estimation of poly-13- hydroxybutyrate inclusions of bacillus species. J. Gen. Microbiol. 1958; 19:198-209. [10] Macrae RM, Wilkinson JF. 3-hydroxybutyrate metabolism in washed suspensions of Bacillus cereus and Bacillus megaterium. J. Gen. Microbiol. 1958; 19:210 - 222. [11] Dawes EA, Senior PJ. The role and regulation of energy reserve polymers in micro-organisms. Adv Microb. Physiol. 1973; 10:135–266. [12] Wallen II, Rohwedder RK. Poly-β-hydroxyalkanoate from activated sludge. Environ. Microbiol. 1974; 45:576-579. [13] Doi Y, kanesawa Y, kunioka M, Saito T. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate). Macromolecules. 1990; 23 (1): 26–31. [14] Kunioka M, Nakamura Y, Doi Y. New bacterial copolyesters produced in Alcaligenes eutrophus from organic acids, Polymer Commun. 1988; 29: 174–176. [15] Anderson AJ, Dawes AE. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial Polyhydroxyalkanoates. Microbiol Rev. 1990; 54: 450 – 472. [16] Steinbüchel A. polyhydroxyalkanoic acids, in biomaterials. Macmillan, London. 1991; 123–213. [17] Sudesh K, Abe H, Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progress Polimers in polymer science. 2000; 25:1503-1555.

GRACIAS