producciÓn de etanol como biocombustible a partir …

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

PRODUCCIÓN DE ETANOL COMO BIOCOMBUSTIBLE A PARTIR DE LÍQUIDO RESIDUAL DE NIXTAMALIZACIÓN

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO EN ALIMENTOS

PRESENTA: DANIEL ALBERTO RAMÍREZ FLORES

ASESOR INTERNO: M. en C. AUGUSTO TREJO GONZÁLEZ ASESOR EXTERNO: DRA. MA. DEL CARMEN MONTES HORCASITAS

EVALUADORES: M. en C. Sergio Oliva Maheda

Dr. Jorge Yáñez Fernández

México, D.F., Junio de 2009

RESUMEN

El líquido residual de nixtamalización, denominado nejayote, es un efluente del procesamiento del maíz en México. La industria mexicana vierte este desecho sin

tratamiento para disminuir su carga contaminante generando así un problema ecológico en el país. La viabilidad del nejayote como sustrato para la fermentación alcohólica fue

comprobada mediante la inoculación de Zymomonas mobilis CDBB 603. Se observó que la concentración de calcio producto del proceso de nixtamalización no era perjudicial para el

crecimiento de la bacteria, sino al contrario, la producción de etanol es alta sin descalcificar la muestra. La adición de glucosa al líquido es requerida, sin embargo, los

costos de producción se verán afectados. Por tal razón, se procedió a enriquecer con tuna el medio dado que una gran cantidad de este producto se desperdicia en México. Se logró una

producción máxima de etanol de 52.31 g/L en un cultivo en lote sin agitación con una concentración de 543g de extracto de tuna en un litro de nejayote, con un pH inicial de 5.1

a 32.5±0.5ºC

Agradecimientos

A mis papás y a mis hermanos…

Porque no sería quien soy sin ellos…

Porque sé que a veces no es fácil aguantarme

A la Dra. Carmen Montes…

Por darme esa libertad de trabajo, por darme esos

tirones de orejas que necesitaba, porque nunca me colgó de los pulgares

como me merecía y por ser una guía para mí.

A Marcos, a Marlene, a Fabiola, a Jocelyn, a Lina y

a Laura… Por haber compartido tanto tiempo juntos (o tan poco)

A la Maestra Patricia Vázquez…

Porque sé que muy en el fondo le caigo bien (y por

ayudarme siempre a encontrar al Maestro Trejo)

A Ada, Andy, gRaz, Joss y Zai…

Por cuatro años juntos (y todavía nos aguantamos),

por todos los mensajes “ya llegaste?” que muy pocas

veces contestaban

A Jesús Vega Estrada… Porque no hubiera hecho

nada sin tu consejo (aunque no se haya notado)

A la UPIBI, al CINVESTAV y al

Politécnico… Por todo lo que me han

dado, por todo lo que me han enseñado.

A César… A pesar de los pesares,

aguantó bastante

“To all my friends… those who are here and those

who aren’t”

Al Maestro Trejo… Yo no sé qué hubiera sido

sin usted

A Carmen Fontaine… Porque el apoyo que recibí

de ti fue invaluable

A mis evaluadores, Dr. Jorge Yáñez y

M. en C. Sergio Oliva… Muchas gracias por sus

comentarios y sugerencias

A todos los maestros que aportaron, por lo menos, un

poco de paciencia a mi persona

“Porque sólo aquél que sabe lo que es perder entiende la dicha de lo que es ganar”

Daniel Alberto Ramírez Flores

1

Índice General

Índice General 1 Índice de Cuadros 2

Índice de Figuras 2

1. Introducción 3 2. Justificación 12

3. Objetivos 13 4. Hipótesis 13

5. Materiales y Métodos 14

5.1 Caracterización del sustrato 14

5.2 Requerimientos nutrimentales 14

5.3 Tratamiento de descalcificación 15

5.4 Variación de azúcares reductores y tiempo de fermentación 16 5.5 Enriquecimiento 16

5.6 Control de Temperatura 16 5.7 Prueba en Biorreactor 17

6. Resultados y Análisis 18 7. Conclusiones preliminares 27

8. Bibliografía 28 ANEXO. Métodos de Prueba 31

A. Determinación de Azúcares Reductores 31 B. Determinación de Nitrógeno 32

C. Determinación de Etanol 33 D. Determinación de Dureza de Calcio 35

E. Determinación de Alcalinidad 35


2

Índice de Cuadros. Cuadro 1 Propiedades generales del Nejayote 7

Cuadro 2 Descripción Fenotípica de Zymomonas 9

Cuadro 3 Diseño experimental para la determinación de biodisponibilidad de nutrimentos. 15

Cuadro 4 Diseño experimental para evaluar el tratamiento de descalcificación de Nejayote 15

Cuadro 5 Resultados del análisis de materia prima para las fermentaciones 18

Cuadro 6 Resultados de la prueba de requerimientos nutrimentales de Z. mobilis en nejayote 19

Cuadro 7 Resultados de los procedimientos de descalcificación de la muestra de nejayote 20

Cuadro 8 Concentraciones para construir una curva patrón de glucosa 31

Cuadro 9 Concentraciones para construir una curva patrón de etanol 34

Cuadro 10 Cuadro para determinar la alcalinidad de las muestras por método volumétrico 36 Índice de Figuras.

Figura 1 Descalcificación lograda por a) Centrifugación, b) Adición de ácido clorhídrico y centrifugación, c) Adición de ácido sulfúrico y centrifugación y d) Adición de ácido fosfórico y centrifugación.

20

Figura 2 Producción máxima de etanol y tiempo para llevarla a cabo. 21

Figura 3 Evolución del pH durante la fermentación alcohólica por Z. mobilis 22

Figura 4 Efecto del enriquecimiento con tuna sobre la fermentación 23

Figura 5 Comportamiento del pH durante la fermentación sobre tuna 23

Figura 6 Cinética de producción de etanol a 32.5±0.5ºC 24

Figura 7 Cinética de producción de etanol a 32.5±0.5ºC y pH inicial=4.3 24

Figura 8 Cinética de la prueba en biorreactor 25

Figura 9 Curva Patrón de glucosa para determinar concentración por método DNS 32

Figura 10 Curva Patrón de etanol para determinar concentración por método de microdifusión 32


3

1. INTRODUCCIÓN.

El consumo mundial de energía en los últimos años ha ido en aumento debido a las

necesidades de la vida moderna. Durante 2007, el consumo de energía se mantuvo alto en

relación con el 2006 debido a un crecimiento económico poco usual y, a pesar del continuo

aumento de precios, el crecimiento en el consumo fue de 2.4%. Los movimientos en los

precios, divergentes entre los combustibles y las regiones, afectaron el mercado energético

en el 2007: los precios de petróleo crudo aumentaron por sexto año consecutivo, los

precios del gas natural se incrementaron modestamente y por segundo año consecutivo los

precios del carbón cayeron en Norteamérica pero aumentaron en el resto del mundo

(UNIDO, 2008).

Durante el mismo año, se consumieron más de once mil millones de toneladas

equivalentes de petróleo crudo, del cual el 35.6% correspondió en realidad a petróleo crudo.

Se observó un ligero descenso comparado con el consumo de petróleo en 2006 (que fue de

36%), probablemente debido a las fluctuaciones en precios (UNIDO, 2008).

El petróleo es el origen de los combustibles fósiles, los cuales se consideran

recursos no renovables debido a que tardan millones de años en formarse y las reservas se

agotan mucho más rápido que lo que se forman nuevas; el principio de oferta y demanda

sugiere que una vez que las reservas de hidrocarburos o combustibles fósiles bajen, los

precios de los mismos aumentarán; este hecho genera complicaciones pues la cantidad de

petróleo en el mundo, su distribución y precio son causas de conflictos regionales y

globales; adicionalmente, la combustión de estos productos trae consigo problemas

ambientales pues se calcula que se producen cerca de 21.3 billones de toneladas de dióxido

de carbono al año; la fotosíntesis natural que ocurre en las plantas sólo puede absorber la


4

mitad de esa cantidad, así que existe un incremento neto de 10.65 billones de toneladas de

dióxido de carbono atmosférico por año y dado que este gas es uno de los gases causantes

del efecto invernadero se está contribuyendo al calentamiento global (Hamelinck et al,

2005). En México, los recientes reportes de las reservas petroleras indican que aquellas con

las que cuenta la nación alcanzarán para diez años lo cual representa un problema de gran

importancia para el país. En primer lugar, porque una buena parte de la producción de

energía se sostiene gracias al crudo; y en segundo lugar, a que los principales ingresos de

la economía se sostienen, también, gracias a él (Tonda, 2008)

De esta forma, los altos precios y los problemas ecológicos guían a una sola

alternativa: la energía renovable como una fuente que se vuelve factible económicamente

para su explotación. Es por ello que un movimiento global hacia la generación de energía

renovable comienza a establecerse para satisfacer las necesidades energéticas (Hamelinck

et al, 2005).

La Organización de las Naciones Unidas para la Energía (UNIDO) considera que

una de las fuentes modernas de energía es la bioenergía, que se define como la energía

producida por la materia orgánica o biomasa. De acuerdo con Alexander Iller, Director

General Asistente para el Departamento de Desarrollo Sustentable de la Organización de

las Naciones Unidas para la Agricultura y los Alimentos (FAO), el cambio gradual lejos de

los combustibles fósiles ha comenzado y se espera que dentro de los próximos 15 a 20 años

los biocombustibles proveerán el 25% del total de energía del mundo (UNIDO, 2007).

El contenido energético de la biomasa puede ser utilizado de manera simple por

combustión directa o puede ser convertido por procesos termoquímicos en sustancias más

valiosas que usualmente producen mezclas complejas de productos y requieren de altas

temperaturas y presiones. En contraste, existe también la conversión por microorganismos


5

que opera a temperaturas menores (25-60ºC), a presión atmosférica y únicamente producen

algunas sustancias mayoritarias como el etanol. Los combustibles de origen biológico que

pueden sustituir parte del consumo de combustibles fósiles son el bioetanol y el biodiésel,

entre otros (Rosenberg, 1980).

Se consideran varios factores en la producción y uso de los biocombustibles. La

competitividad económica de la bioenergía es uno de ellos; aunque se ha probado que los

combustibles biológicos son competitivos en algunos países como Brasil, donde el

excedente de caña de azúcar permite la producción de bioetanol, la mayoría de los países

del mundo no poseen la capacidad de producción de alimentos para producir algún

biocombustible. La sustentabilidad de la producción es otro factor que ha captado la

atención de las autoridades en energía pues se debe asegurar que estos productos aseguren

el crecimiento social para la población que los produzca.

El factor principal que ha limitado la producción de los biocombustibles es el uso

de cultivos alimenticios como materia prima para los procesos. Actualmente se utilizan

maíz y caña de azúcar; sin embargo, se ha contemplado que la utilización de éstos y otros

productos alimenticios como cereales conllevará al aumento de precios de los mismos y al

daño al suelo debido a un incremento en la demanda de los alimentos con el consecuente

detrimento de la nutrición humana y de las condiciones agrícolas.

El bioetanol es el único de los biocombustibles que se produce actualmente en

pequeña escala (cerca de 14-26 Mton en todo el mundo); es también llamado etanol de

biomasa y se obtiene a partir de cereales y otros cultivos alimenticios. En 2008, La

producción total de bioetanol alcanzó 65 mil millones de litros siendo Estados Unidos el

principal productor de bioetanol (52% de la producción mundial), Brasil representa el

37.3%, La Unión Europea el 4,2%, China el 2,9% y Canadá el 1,4%. La mayoría de la


6

producción en Estados Unidos se obtiene a partir del maíz con unas pocas plantas

productivas que utilizan residuos industriales (tales como celulosa de árboles, suero de

leche y bagazo de caña) u otros cereales (como trigo, sorgo y cebada). (RFA, 2009).

El etanol es empleado en la actualidad como materia prima para numerosos

productos incluyendo el acetaldehído, éter etílico y cloroetano. Es capaz de disolver un

amplio rango de sustancias por lo que es usado como solvente en la fabricación de

fármacos, plásticos, lacas, ceras, perfumes, cosméticos y vulcanizadores para el hule. Su

aplicación como combustible puede ser como mezcla con gasolina o hasta el 100% de

etanol. La adición de etanol a la gasolina incrementa el octanaje y reduce las emisiones

contaminantes. Cerca del 67% de la producción es usada como combustible vehicular; el

resto es usado en la industria alimenticia. (Hamelinck et al, 2005).

La obtención de bioetanol se puede hacer por hidrogenación del etileno o por

tecnologías fermentativas. Las tecnologías fermentativas para azúcar y almidón están muy

bien desarrolladas, pero poseen ciertos límites. Los cultivos que contienen azúcar o

almidón poseen un alto valor alimenticio, y su producción de azúcares por hectárea es muy

baja comparado con las más prevalecientes formas de azúcar en la naturaleza: celulosa y

hemicelulosa; por lo que una alternativa sería utilizar estos sustratos. Algunos materiales

que han sido propuestos también para la producción de etanol son los residuos de las

industrias de transformación, en particular las alimenticias.

La industria alimenticia de la tortilla de maíz en México es origen de enormes

efluentes que dañan en gran medida el ambiente, ya que estos son vertidos sin tratamiento

para disminuir la carga contaminante a las aguas municipales. Este subproducto, llamado


7

nejayote, puede ser un sustrato viable para la producción de etanol a través de la

fermentación por microorganismos.

El contenido de materia orgánica del nejayote ha sido utilizado para obtener ácido

ferúlico y se ha explotado comercialmente para la producción de vainillina (Assaf et al,

2004), asimismo, se ha propuesto la reutilización como suplemento de calcio para la

engorda de cerdos de diferentes variedades. Sin embargo, no se ha realizado ningún

estudio para verificar la viabilidad de este desecho como medio para cultivo de

microorganismos.

Una de las características más interesantes sobre el nejayote es la gran cantidad de

carbohidratos simples y complejos presentes y la concentración de proteína (Cuadro 1).

Cuadro 1. Propiedades generales del Nejayote (Adaptado de Rosentrater, 2006 y Trejo González, et al, 1982) PROPIEDAD VALOR UNIDAD DE MEDIDA pH 6.17-11.6 Aw 0.99-1.00 Calcio 4.68-13.13 % B.S. Carbohidratos 71.93-75.41 % B.S. Almidón 2.57-32.0 % B.S. Otros Polisacáridos 48.8-79.1 % B.S. Fibra Cruda 19.29-92.12 % B.S. Hemicelulosas 8,460 ppm Proteína 3.73-7.42 % B.S. DBO5 190-7,875 mg O2/L DQO 1,670-22,200 mg O2/L Alcalinidad total 180-3,260 mg CaCO3/L

El agua de nejayote (del nahua nextli “ceniza”, “cal”), de acuerdo a la normatividad

mexicana, es el subproducto de la nixtamalización del maíz, constituido por agua, cal y

sólidos que se desprendieron del maíz durante su proceso. México produce

aproximadamente 39 mil toneladas de tortillas de harina de maíz nixtamalizado. El

consumo per cápita de maíz en México es de 325 gramos diarios, un equivalente a 800


8

millones de tortillas al día y por cada tonelada de maíz se utilizan entre 3,000 y 10,000

litros de agua; dado que las herramientas para la transformación del maíz son poco eficaces,

el agua resultante contaminada afecta gravemente los índices ecológicos del país (INEGI,

2004).

El proceso que origina el nejayote, la nixtamalización es un procedimiento

tradicional que no ha sido estandarizado en la industria; por lo tanto, el nejayote obtenido

como subproducto cambia de acuerdo con las condiciones del proceso y su concentración y

proporción de nutrimentos es variable. La cantidad de azúcares simples en el nejayote de

algunos procesos es muy baja, por lo que para poder ser utilizado como sustrato para la

producción de etanol se requiere que sea enriquecida con alguna fuente de carbono.

Una fuente importante de azúcares a lo largo de la historia han sido las frutas y en

México, uno de los frutos más representativos es la tuna, El mercado mundial de tuna es de

20,000 toneladas anualmente de las cuales el 10% de la producción se concentra en

México en tres zonas principalmente: Puebla, el Altiplano Potosino-Zacatecano y el Valle

de México (Méndez y García, 2006). De toda la producción mexicana el 60% se

desperdicia debido a que es un producto frutícola altamente perecedero que se consume

principalmente en estado fresco (Salazar González, 2006). La pulpa de la tuna está

compuesta en general por agua (84 a 90%) y azúcares (10 a 15%). Posee un valor de pH

alto en comparación con otras frutas (5.3 a 7.1) y una acidez muy baja (0.05 a 0.018%

como ácido cítrico). El perfil de azúcares es principalmente reductor predominando la

glucosa y la fructosa en una proporción de 3:2; posee también trazas de sacarosa. Es rico

en vitamina C con trazas de carotenoides, tiamina, riboflavina y niacina, mientras que su

contenido en minerales se caracteriza por una alta concentración de calcio (hasta

59mg/100g) y magnesio (98.4mg/100g) (Piga, 2004).


9

La fermentación alcohólica de los frutos se lleva a cabo de manera natural por

microorganismos, principalmente del género Saccharomyces. Otros organismos

responsables de la producción de etanol son las levaduras del género Kluyveromyces y la

bacteria Zymomonas mobilis.

Zymomonas mobilis, responsable en gran medida de la fermentación del aguamiel

para la elaboración del pulque, ha despertado gran interés en la comunidad biotecnológica

del mundo por su alta velocidad de fermentación (García Garibay, et al; 1993). Es

aerotolerante, fermentativa con un número excepcional de características (Cuadro 2).

Cuadro 2. Descripción Fenotípica de Zymomonas (García Garibay, et al; 1993)

1. Bastón gramnegativo de 1 a 5mm de ancho y de 2 a 6mm de largo 2. Inmóvil o móvil debido a la presencia de 1 a 4 flagelos lofótricos 3. Arreglo celular pleomórfico (Cadenas, rosetas, filamentos) 4. Ausencia de esporas, de cápsulas y de constituyentes de almacenamiento celular 5. Catalasa positiva y Oxidasa negativa 6. Anaeróbico y microaerofílico 7. La utilización de sacarosa es inducible y puede ir acompañada de formación de levanas 8. Las únicas fuentes de carbono que metaboliza son: glucosa, fructosa y sacarosa. 9. Contenido de G+C de 47.5 a 49.5% 10. Talla del genoma 1.5 × 109

Ha sido hallada en hábitats tropicales y subtropicales principalmente, en plantas

ricas en azúcares tales como el agave y la caña de azúcar. Otras fuentes de este organismo

incluyen los granos de cacao fermentados, abejas y miel, cerveza y cidra fermentadas

(Sahm et al, 2006).

Es una bacteria quimioorganotrófica que presenta auxotrofia por el pantotenato de

calcio, y en algunos casos por la biotina. El nitrógeno necesario para el crecimiento puede

proporcionársele por medio de sales minerales, aminoácidos o péptidos. Los nitratos y los

nitritos no son asimilados por la bacteria. El azufre, magnesio y potasio son


10

proporcionados en forma de sales. Los oligoelementos (Mo, Fe, Zn, Mn, etc.) necesarios al

metabolismo de la bacteria se encuentra en estado de trazas en las sales utilizadas en la

preparación del medio de cultivo (García Garibay, et al; 1993). Cerca del 95% de la

glucosa utilizada por este microorganismo es convertido a una mezcla equimolar de etanol

y CO2, y sólo un pequeño porcentaje (<3%) es incorporado a la masa celular. El

catabolismo de las únicas fuentes de carbono, glucosa y fructosa procede a partir de la vía

de Entner-Doudoroff y con una producción neta de un solo mol de ATP por mol de glucosa.

Zymomonas mobilis carece de otras vías para el catabolismo de glucosa; es incapaz de

realizar la gluconeogénesis, y tiene un ciclo de ácidos tricarboxílicos incompleto. La

presencia de piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa permite al microorganismo

realizar una fermentación alcohólica pura (Sahm et al, 2006).

Tiene un rápido crecimiento, un alto catabolismo de azúcar (cerca de 1 mol de

glucosa·min-1·mg-1 de proteína celular), y tolerancia a altas concentraciones de sustrato

(30% de glucosa) y de producto (hasta 13% w/v de etanol), crece de manera óptima entre

25 y 30 ºC, algunas cepas crecen a 38ºC, pero raramente a 40ºC. El crecimiento es lento a

15ºC y ausente en 4ºC. La mayoría de las cepas son capaces de crecer entre pH de 3.8 a 7.5,

sin embargo, el rango óptimo de crecimiento es de 4.5 a 6.5. A pH 3.5, crecen 40% de las

cepas lo cual demuestra una buena ácido tolerancia. Esto no es sorprendente debido a que

el nicho natural de este organismo es en vinos ácidos de palma, cidra y cerveza a pH 4.0.

(Sahm et al, 2006). Algunas ventajas de Z. mobilis sobre las levaduras son (García Garibay,

et al; 1993):

* Velocidades específicas de consumo de sustrato y de producción de etanol elevadas

lo cual es una ventaja a nivel industrial que disminuye los tiempos de fermentación

* Mayor productividad volumétrica de etanol.


11

* Rendimiento de etanol superior y rendimiento de biomasa inferior. Esto da como

resultado una relación estequiométrica más cercana a la ideal.

* No necesita aporte de oxígeno por lo que los costos de equipo para su esterilización

y adición al medio se verían eliminados.

* Mayores posibilidades de manipulación genética.

Aunque la mayor parte de la fuente carbonada es utilizada para la producción de

etanol y de CO2, cantidades no despreciables de subproductos son formadas en presencia

de sacarosa o de mezclas de glucosa y fructosa. A partir de sacarosa la formación de

levanas y de sorbitol provoca una disminución de hasta 20% en el rendimiento de

producción de etanol en comparación con el obtenido de glucosa. Cuando la fructosa es

utilizada como fuente de carbono, los subproductos pueden representar hasta un 9% de la

fuente de carbono inicial, mientras que a partir de glucosa éstos representan un máximo de

4%. Por lo tanto, la glucosa podría ser el sustrato ideal para la producción de alcohol por Z.

mobilis, sin embargo, es necesario recordar que la formación de subproductos depende de

factores tales como temperatura, pH, aireación, método de cultivo, etc. (García Garibay, et

al; 1993)


12

2. JUSTIFICACIÓN.

El creciente interés mundial hacia la producción de combustibles renovables ha

orillado a la utilización de cultivos alimenticios para la fabricación de etanol. Esto ha

resultado en el incremento de los precios de dichos cultivos con el consecuente detrimento

de la nutrición humana.

Por otro lado, la industria de la tortilla de maíz en México es origen de enormes

efluentes que dañan en gran medida el ambiente. Los residuos del proceso de

nixtamalización de la masa son vertidos sin un tratamiento para disminuir la carga

contaminante.

Debido a su alto contenido de materia orgánica, el subproducto de la

nixtamalización de la masa del maíz, denominado nejayote, puede ser un sustrato viable

para la producción de etanol a través de la fermentación por microorganismos


13

3. OBJETIVOS.

3.1 General.

• Evaluar la factibilidad del Nejayote para ser utilizado como sustrato para la

producción de Etanol por Zymomonas mobilis

3.2 Específicos.

• Establecer la concentración de azúcares reductores para la máxima producción de

etanol con Zymomonas mobilis.

• Evaluar la fermentación a nivel laboratorio con control de parámetros fisicoquímicos.

• Determinar la productividad de Zymomonas mobilis cuando es usado como sustrato

una mezcla de nejayote con tuna.

4. HIPÓTESIS.

El nejayote es un sustrato tecnológicamente viable para la producción de etanol a nivel

industrial por Zymomonas mobilis


14

5. MATERIALES Y MÉTODOS.

La cepa de Zymomonas mobilis CDBB 603 fue obtenida de la colección del

CINVESTAV-IPN y propagada en un medio conteniendo 100 g/L Glucosa, 5 g/L Extracto

de Levadura, 1 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4·7H2O. Su crecimiento

durante la propagación fue mantenido durante 24 h a temperatura ambiente.

La muestra de nejayote fue recolectada a partir de un proceso de nixtamalización de

maíz de aproximadamente 24 horas en un baño conteniendo cal, agua y maíz en proporción

3:3:1.

El extracto de tuna utilizado fue obtenido en estado de madurez óptimo por parte de

un productor privado proporcionado por M. en C. Augusto Trejo González; se le eliminó la

cáscara y se licuó; posteriormente se filtró para eliminar semillas.

El parámetro indicador para cada fermentación fue la producción de etanol, misma

que fue evaluado por el método de microdifusión.

5. 1 Caracterización del sustrato.

Se realizó la determinación de azúcares reductores y nitrógeno total para la muestra

de nejayote y la muestra de extracto de tuna. Se obtuvo para la muestra de Nejayote la

alcalinidad total por método volumétrico y la dureza de calcio.

5.2. Requerimientos nutrimentales

Las necesidades nutrimentales de Z. mobilis fueron evaluadas a partir de un medio

reportado por Atkinson (1991) para la producción de etanol a nivel industrial. La bacteria

fue inoculada a nejayote enriquecido con cada uno de los componentes para verificar la

disponibilidad de los mismos para las fermentaciones como se muestra en la cuadro 3.


15

Cuadro 3. Diseño experimental para la determinación de biodisponibilidad de nutrimentos.

Nutrimento Cantidad Prueba A Prueba B Prueba C Prueba D Prueba E Prueba F Nejayote 20 mL + + + + + + Glucosa 100 g/L - + - - - - Extracto de Levadura 5 g/L - - + - - - (NH4)2SO4 1 g/L - - - + - - KH2PO3 1 g/L - - - - + - MgSO4·7H2O 0.5 g/L - - - - - +

5.3. Tratamiento de descalcificación.

Se llevó a cabo una descalcificación del nejayote por tratamiento ácido para

verificar la eficiencia del microorganismo. El diseño se basó en la metodología establecida

por Cazetta et al y aumentada para observar el efecto de diferentes variables sobre el

medio. Los ácidos utilizados fueron inorgánicos (HCl, H2SO4, H3PO4) concentrados. Se

llevaron 50 mL de nejayote a pH 4 y posteriormente se neutralizaron a pH 7 con NaOH

12.12 M. Adicionalmente, 20 mL de cada tratamiento fueron centrifugados a 10,000 rpm

por 10 minutos. Se realizó una fermentación por 48 horas con cada tratamiento,

centrifugado o sin centrifugar y con o sin adición de glucosa en concentración de 100 g/L

como se muestra en la cuadro 4.

Cuadro 4. Diseño experimental para evaluar el tratamiento de descalcificación de Nejayote

Muestra Nejayote [mL] Glucosa [g] Centrifugación Acidificación A1 20 0 No No A2 20 2 No No A3 20 0 Sí No A4 20 2 Sí No Cl1 20 0 No HCl Cl2 20 2 No HCl Cl3 20 0 Sí HCl Cl4 20 2 Sí HCl S1 20 0 No H2SO4 S2 20 2 No H2SO4 S3 20 0 Sí H2SO4 S4 20 2 Sí H2SO4 P1 20 0 No H3PO4 P2 20 2 No H3PO4 P3 20 0 Sí H3PO4 P4 20 2 Sí H3PO4


16

5.4. Variación de Azúcares Reductores y Tiempo de fermentación.

Una vez establecido el procedimiento de fermentación, se inoculó una muestra de

nejayote y se adicionó glucosa en concentraciones de 100 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L y

500 g/L. La fermentación duró 120h con toma de muestra cada 24h y se monitoreó el pH

de cada muestra.

5.5 Enriquecimiento con tuna.

Se observó que la adición de glucosa era necesaria; sin embargo, dado que el

proyecto pretende que no se utilice este sustrato o alguna fuente común del mismo

(cereales), el nejayote fue enriquecido con una cantidad de extracto de tuna sin semilla que

se ajustara a la concentración óptima de azúcares reductores (534g de tuna por litro de

nejayote) y se inoculó para una fermentación durante el tiempo óptimo de producción de

etanol. Se colocó una muestra de nejayote con una concentración de azúcares óptima para

el crecimiento en proporción 60% de glucosa y 40% de fructosa. La toma de muestra fue

cada 24h y se monitoreó el pH de cada muestra

5.6. Control de Temperatura y Variación de pH inicial.

Se colocaron muestras para verificar el efecto de la temperatura en un ambiente

controlado a 32.5ºC±0.5ºC. Las muestras contenían extracto de tuna y nejayote ajustados a

100g/L de azúcares reductores. Una muestra adicional fue colocada para verificar el efecto

del pH inicial con extracto de tuna y nejayote a pH=4.5 siendo ajustado con ácido fosfórico.

5.7. Prueba en Biorreactor.

Se colocó un biorreactor conteniendo 2L de mezcla de tuna y nejayote ajustados a

534g de tuna por litro de nejayote. La muestra se filtró con una malla de 5mm. Se

monitoreó a partir de las 8 horas de inoculado. Se midió la biomasa por densidad óptica y


17

se midieron azúcares reductores, pH y producción de etanol cada dos horas hasta el estado

estacionario. La agitación fue de 100 rpm y no se inyectó oxígeno. Se mantuvo a

32.5±0.5ºC con ayuda de un serpentín.


18

6. RESULTADOS Y ANÁLISIS.

El análisis del Nejayote mostró una concentración muy baja de azúcares reductores

y una concentración de Nitrógeno moderadamente alta (Cuadro 5) así como una alta

concentración de iones alcalinos (2884.56mg de CO3-/L) en su mayoría bicarbonato

(2811.84mg/L) con una baja cantidad de iones carbonato (72.72 mg/L), lo cual le otorgó

un carácter alcalino al medio (pH = 8.4); también se halló una alta concentración de calcio

(475.63 mg/L). La baja concentración de azúcares no concuerda con lo reportado por

Rosentrater (2006) ni por Trejo-González (1982), lo cual se atribuye a una de las

características que han hecho que los estudios para reutilizar el nejayote sean escasos y

poco utilizados, el hecho de que el proceso de nixtamalización no está estandarizado; cada

productor de masa realiza el proceso de acuerdo a su costumbre con lo que se provoca que

el nejayote no tenga las mismas características de un productor a otro y aún en un lote con

otro. Para el caso de esta muestra de nejayote es necesario adicionar una fuente de azúcares

reductores para provocar la fermentación.

Cuadro 5. Resultados del análisis de materia prima para las fermentaciones.

Muestra Nitrógeno Total Azúcares Reductores Nejayote 2.10% 0.021 g/L Extracto de Tuna 0.22% 184 g/Kg

El medio reportado en la bibliografía para Z. mobilis es cubierto casi por completo

por el nejayote. El único nutrimento que el nejayote no es capaz de proporcionar para la

fermentación es la fuente de carbono. La glucosa adicionada al medio B propició el inicio

de la fermentación alcohólica. Los resultados cualitativos, como se muestran en la cuadro 6,

indican que sólo la muestra adicionada con glucosa produjo alcohol como se observó en el

método de microdifusión por la desaparición total del color amarillo del K2Cr2O7, mientras


19

que en las otras pruebas el color se mantuvo totalmente (Ver Anexo); esto era de esperarse

debido a que el análisis del nejayote indicó una baja concentración de azúcares reductores

Cuadro 6. Resultados de la prueba de requerimientos nutrimentales de Z. mobilis en nejayote.

Prueba A Prueba B Prueba C Prueba D Prueba E Prueba F

Producción de etanol Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo

Una vez que se estableció que el nejayote requería la adición de glucosa se procedió

a realizar un tratamiento de descalcificación. La nixtamalización es un proceso de

preparación de la masa de un cereal, comúnmente maíz, en el cual los granos se remojan y

se cuecen en una solución alcalina. Se emplea particularmente el hidróxido de calcio. Los

iones de calcio que el nejayote todavía contiene (475.63 mg de Ca/L, lo cual indica un

agua muy dura) pueden alterar de manera negativa el crecimiento bacteriano de Z. mobilis.

La adición de ácidos fuertes hubiera podido provocar la liberación de carbohidratos

fermentables por hidrólisis ácida de los polisacáridos presentes (principalmente

hemicelulosa), por lo que se verificó también si la hidrólisis sustituía la adición de glucosa.

Tal como se observa en la Cuadro 7, el tratamiento de descalcificación del medio no

permitió la producción de etanol sin adición de glucosa, la liberación de carbohidratos no

fue suficiente o no se llevó a cabo en las condiciones establecidas. La acidificación del

medio sólo tuvo un efecto perceptible cuando se aplicó ácido fosfórico; los demás ácidos

no provocaron la precipitación del calcio en suficiente medida. La descalcificación del

nejayote con ácido clorhídrico tuvo el efecto más perjudicial para la producción de alcohol

pues se observó una reducción de casi 9 veces cuando se separaba el complejo de calcio

formado por el ácido del nejayote por centrifugación. Cuando no se centrifugó la

disminución en la producción fue muy parecida; sin embargo, si el complejo se mantenía

dentro del medio, la concentración de alcohol aumentaba ligeramente (8% más) en el que

fue acidificado con ácido clorhídrico (Muestra Cl4). No se observó el mismo efecto en el


20

caso del ácido fosfórico o el ácido sulfúrico donde la separación del complejo formado

aumentaba de manera consistente la producción de alcohol en comparación con aquella

donde el complejo se había mantenido (entre Muestras S2 y S4, tres veces más; entre P2 y

P4, veinte veces más).

Sin embargo, al comparar con las muestras A2 y A4 se concluye que la separación

del calcio en la muestra de nejayote tiene un efecto perjudicial en la producción de etanol.

Las partículas de calcio que fueron separadas sin tratamiento ácido (Muestra A4)

disminuyen casi a la mitad (49.00%) la producción de etanol.

Cuadro 7. Resultados de los procedimientos de descalcificación de la muestra de Nejayote

Muestra Glucosa Centrifuga Ácido Sólidos Eliminados Producción A1 0 g/L No -

76.22 g/L

≈ 0 A2 100 g/L No - 21.57 g/L A3 0 g/L Sí - ≈ 0 A4 100 g/L Sí - 10.57 g/L Cl1 0 g/L No HCl

87.73 g/L

≈ 0 Cl2 100 g/L No HCl 2.82 g/L Cl3 0 g/L Sí HCl ≈ 0 Cl4 100 g/L Sí HCl 3.07 g/L S1 0 g/L No H2SO4

92.63 g/L

≈ 0 S2 100 g/L No H2SO4 17.42 g/L S3 0 g/L Sí H2SO4 ≈ 0 S4 100 g/L Sí H2SO4 5.76 g/L P1 0 g/L No H3PO4

392.66 g/L

≈ 0 P2 100 g/L No H3PO4 19.56 g/L P3 0 g/L Sí H3PO4 ≈ 0 P4 100 g/L Sí H3PO4 0.95 g/L

Figura 1. Descalcificación lograda por a) Centrifugación, b) Adición de ácido clorhídrico y centrifugación, c) Adición de

ácido sulfúrico y centrifugación y d) Adición de ácido fosfórico y centrifugación.


21

Al cambiar la concentración de azúcares se esperaba una relación donde se hallase

una concentración tal que el microorganismo produjera un máximo de etanol con el

mínimo de glucosa adicionado. Cazetta et al (2007) reporta que la concentración de

azúcares reductores óptima en un medio de melaza de caña y agua de cocimiento de maíz

es de 200 g/L. Sin embargo, la diferencia en las materias primas provoca que la

concentración de producción máxima sea de 100 g/L de glucosa en el nejayote. Esto puede

deberse principalmente a la presión osmótica que se genera en el nejayote. En el

experimento antes mencionado la melaza de caña fue descalcificada antes de realizarse la

fermentación por un procedimiento muy similar al utilizado en el presente proyecto, lo cual

disminuye la presión osmótica del medio y permite que Z. mobilis pueda crecer en un

medio con mayor concentración de azúcares; esto no se realizó debido al análisis anterior

donde se observó que la descalcificación probablemente disminuya la biodisponibilidad de

algún componente del nejayote que permita el aumento en la producción de etanol.

Fig. 2. Producción máxima de etanol y tiempo para llevarla a cabo.

La concentración máxima de etanol obtenida fue de 39.67 g/L en 72 horas en el

medio con 100g/L de azúcares. La concentración de 200 g/L obtuvo también una

concentración máxima en 72 horas pero el hecho de que esta concentración sea 25.28 g/L

(63.75% de la concentración máxima en 100 g/L) hace que sea poco redituable la

producción en esta condición. En el caso de las concentraciones mayores de 300 g/L la

concentración obtenida fue a las 24 h, sin embargo en estos casos alcanza apenas 3g/L

72 h

72 h

24 h 24 h 24 h


22

(3.11 g/L para 300 g/L, 1.55 g/L para 400 g/L y 1.54 g/L para 500 g/L), a pesar de que se

ha reportado que Z. mobilis soporta una concentración de sustrato de 30%. Probablemente

la cantidad de azúcares junto con otros componentes en el medio provocó la muerte celular

en estos casos por lo que el microorganismo no pudo producir más que un mínimo de

etanol. La concentración máxima reportada es de 55.3 g/L en un medio de almidón de

harina de sago adicionado con amiloglucosidasa inmovilizada y células de Z.mobilis. El pH

de dicho medio fue de 4.93 en una temperatura de 32.4ºC y el tiempo de fermentación fue

de 17.24 h (Bandaru et al, 2006). Las fermentaciones realizadas en este proyecto no poseen

control de temperatura por lo que las células deben adaptarse a los cambios en el ambiente,

esto provocó la disminución de la producción y el aumento del tiempo de fermentación. La

producción de etanol representa el 71.73% de la producción máxima reportada en un

tiempo 4 veces mayor.

El pH monitoreado se reporta en la figura 3. Se ajustó el pH del medio antes de la

fermentación a 7 adicionando NaOH 12.12M. Durante el curso de la fermentación el pH

bajó drásticamente a 5 a las 48h. Esta disminución del pH generó un ambiente propicio

para Z. mobilis que 24 h después generó el máximo de etanol, lo cual concuerda con lo

reportado por Bandaru et al, cuyo pH óptimo fue de 4.93.

Figura 3. Evolución del pH durante la fermentación alcohólica por Z. mobilis


23

Los resultados preliminares de fermentación indicaron que el nejayote carece de

una fuente de carbono susceptible a ser fermentada, por lo que se adicionó tuna. Esto tuvo

un efecto benéfico en la fermentación pues se aumentó el rendimiento de la misma un

12.70%. Sin embargo, se observa que se puede llevar a cabo la fermentación con la tuna

sin adicionar el nejayote, pero el tiempo de proceso es 50% mayor. El tiempo de

fermentación se disminuyó 24h con la adición de tuna consiguiéndose 44.71 g/L de etanol

en la muestra de tuna con nejayote.

Figura 4. Efecto del enriquecimiento con tuna sobre la fermentación.

Figura 5. Comportamiento del pH durante la fermentación sobre tuna

Se adicionó el nejayote para aprovechar la disminución en tiempo que representa,

sin embargo, se deberá realizar un análisis costo-beneficio para verificar que el nejayote es

una materia prima que se justifique.

La temperatura a la que se llevaron a cabo las fermentaciones fue ambiental, es

decir que tuvo fluctuaciones de la misma a lo largo del tiempo; esto se debió a que el


24

proyecto originalmente se dirigiría a los productores de nejayote quienes no tendrían un

control sobre la temperatura; sin embargo, una vez que se observó que el nejayote no podía

ser fermentado sin adición de carbohidratos se concluyó que el proyecto ya no podía tener

esta finalidad. La temperatura de crecimiento de Z. mobilis se encuentra en el rango de 25 a

30ºC (Sahm et al, 2006); sin embargo, Cazetta et al hallaron que la producción máxima de

etanol es de 32.5ºC, por lo que se procedió a controlar la temperatura de fermentación con

esta medida. La cinética de la fermentación se encuentra en la figura 6.

Figura 6. Cinética de Producción de Etanol a 32.5±0.5 ºC Figura 7. Cinética de Producción de Etanol a 32.5±0,5 y pHinicial = 4.3

El efecto del control sobre la temperatura es evidentemente positivo en cuanto al

tiempo de fermentación pues se disminuyó de 48 a 16 horas lo cual resulta en una tercera

parte de la prueba anterior. La producción de etanol se aumentó en un 16% del resultado

anterior (52.31 g/L). La productividad con respecto al producto fue de 3.26 g×L-1×h-1

mientras que con respecto a la biomasa ésta fue de 0.35 g×L-1×h-1.


25

Se observó anteriormente que el pH necesario para la fermentación es de 4 por lo

que se procedió a realizar una prueba similar con este pH como inicial. Los resultados se

muestran en la figura 7. La disminución del pH inicial tuvo un efecto negativo en el

crecimiento de la bacteria y por lo tanto de la producción de etanol. La esterilización del

medio pudo generar algunos compuestos que alteraran ligeramente el pH aumentándolo.

La bacteria tardó en adaptarse al medio, consumió los azúcares pero sólo para mantener la

viabilidad celular. Al iniciar el crecimiento, la cantidad de azúcares es muy similar en

ambas pruebas, por lo que cabe esperar que la producción máxima de etanol sea parecida.

Se detuvo la fermentación dado que el tiempo de fermentación ya se había reducido sin

alterar el pH inicial del medio.

La prueba en biorreactor resultó muy similar a la prueba en matraz al controlar la

temperatura como se observa en la figura 8. Dado que se observó que la máxima

producción de etanol sucede a las 10 horas, se tomaron muestras a partir de 8 horas hasta la

disminución de azúcares.

Figura 8. Cinética de la prueba en Biorreactor


26

La producción de etanol se vio disminuida ligeramente a un 95% de la producción anterior,

llegando a una concentración de 49.5 g/L. Durante esta prueba, la productividad de etanol fue de

3.09 g×L-1×h-1 y con respecto a la biomasa fue de 0.27 g×L-1×h-1. En comparación con el

experimento anterior, estos valores disminuyeron a 94.78 y 79.14% respectivamente. Esta

disminución se atribuye en parte a la inclusión de agitación en el medio que pudo dar lugar

al rompimiento de células y la difusión de oxígeno en el medio, el cual disminuye la

cantidad de alcohol en el medio por la acumulación de acetaldehído; Sahm et al reportan

que el crecimiento es inhibido por oxígeno a concentraciones de glucosa mayores180 mM;

sin embargo, la difusión de oxígeno no justifica una disminución tan drástica en el

crecimiento celular, por lo que podemos suponer que ésta se debió al rompimiento de

células; dado que la disminución en la productividad de etanol es mínima, el rompimiento

de células provocó que la medición de biomasa disminuyera.


27

7. CONCLUSIONES

• El nejayote crudo por si mismo no es un sustrato viable para la producción de etanol por

Z. mobilis.

• La adición de glucosa permite la producción de etanol en el nejayote.

• La descalcificación del Nejayote a través de un proceso de acidificación tiene un efecto

perjudicial para la producción de etanol.

• La descalcificación con ácido fosfórico separa hasta 82.55% del contenido de sólidos del

nejayote con una disminución del 9.3% de la producción de etanol.

• La adición de glucosa sigue siendo requerida para la fermentación del medio aún después

de un tratamiento ácido.

• La concentración de glucosa adecuada para la máxima producción de etanol es de 100

g/L en un tiempo de 72 h cuando no se tiene control sobre temperatura y pH.

• La adición de Tuna al Nejayote aumenta la producción, obteniéndose 12.70% más de

etanol.

• Es posible utilizar sólo la tuna para realizar la fermentación, pero el tiempo requerido

para alcanzar el máximo es 50% mayor.

• Se logró una disminución total del tiempo de fermentación hasta el 22% del tiempo

inicial (de 72 a 16 horas).

• Se logró un aumento en la producción de etanol de un 252% (de 21.57 g/L a 52.31 g/L).

• La máxima productividad de etanol por Z. mobilis se obtiene cuando el nejayote es

enriquecido con tuna en un cultivo por lote sin agitación y con pH inicial de 5.1 a 32±1ºC

con una concentración de azúcares reductores de 100g/L.


28

8. BIBLIOGRAFÍA.

1. Assaf Torres A., Macías Ochoa R., De la Torre Martínez M. 2004. Method for the

recovery of Ferulic Acid. Biokab S.A. de C.V.

2. Atkinson B., Mavituna F. USA 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology

Handbook. 2nd Edition. Stockton Press.. p. 320

3. Bandaru V. V. R., Somalanka S. R., Mendu D. R.., Madicherla N. R., and Chityala A.

2006. Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago

starch by co-immobilized amyloglucosidase and cells of Zymomonas mobilis using

response surface methodology. J. Enzyme and Microbial Technology. 38, pp. 209-214.

4. Cazetta M. L., Celligoi M. A. P. C., Buzato J. B., Scarmino I. S. 2007.Fermentation of

molassesby Zymomonas mobilis: Effects of temperature and sugar concentration on

ethanol production. Bioresource technology. 98 pp. 2824-2828.

5. Food and Agriculture Organization. Roma 1993. El maíz en la nutrición humana.

Colección FAO: Alimentación y Nutrición. pp. 15, 63

6. Fundación Centro Canario del Agua. Procedimientos recomendados para la

determinación analítica de ciertos parámetros en las aguas desaladas.

7. García Garibay M., Quintero Ramírez F., López-Munguía Canales A. España 2002.

Biotecnología Alimentaria. 3ª edición. Limusa Editores. pp. 617-628.

8. Hamelinck C.N., van Hooijdonk G., Faaij A. P. C. 2005. Ethanol from lignocellulosic

biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long term. Biomass and

Bioenergy 28, pp. 384-410


29

9. Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática. 2004. Censo Económico de

Industrias Manufactureras. Documento en línea disponible en

www.inegi.org.mx/inegi/default.aspx?c=13392&s=est. Última visita 17/02/2009

10. Maqueda García F y Maqueda García T. (2004) Análisis y tratamiento de agua para

proceso industrial. Manual de Prácticas. IPN. pp. 20-25

11. Méndez Gallegos S. y García Herrera J. 2006. La tuna: Producción y Diversidad.

Biodiversitas 68, pp. 2-4

12. NMX-FF-034/1-SCFI-2002. Productos alimenticios no industrializados para consumo

humano – Cereales – Parte 1: Maíz Blanco para tortillas de maíz y productos de Maíz

Nixtamalizado – Especificaciones y Métodos de prueba.

13. Piga A. 2004. Cactus Pear: A fruit of nutraceutical and functional importance.

Journal of Professional Association for Cactus Development. 6. pp. 9-22

14. Pimienta Barrios E. 1990. El nopal tunero. Serie Libros Tiempos de Ciencia.

Universidad de Guadalajara. Guadalajara. p. 246.

15. Renewable Fuels Association. Statistics. Annual world ethanol production by country.

Documento en línea. Disponible en: [http://www.ethanolrfa.org/industry/statistics].

Última visita: 17 de mayo de 2009.

16. Rosenberg S. L. 1980. Fermentation of pentose sugars to ethanol and other neutral

products by microorganisms. Enzyme Microbiology Technology 2, pp. 185-193.

17. Rosentrater K. A. 2006. A review of corn masa processing residues: Generation,

properties and potential utilization. Waste Managment 26. 284-286.


30

18. Salazar González B. E. 2006. Producción de vino de tuna. Informe técnico en la

opción de proyecto terminal. UPIBI-IPN.

19. Sahm H., Bringer-Meyer S., Sprenger G.A. (2006) The Genus Zymomonas en

Prokaryotes. 5, pp. 201-221

19. Trejo-Gonzalez A., Feria Morales A., Wild-Altamirano C. 1982. The role of lime in

the alkaline treatment of corn for tortilla preparation. En: Feeney, R.E. and Whitaker,

J.R. (Eds), Modification of Proteins. Advances in Chemistry, Ser. No. 198, pp. 245–

263.

20. Tonda J. 14 de febrero de 2008. Petróleo, 2008: ¡Primera llamada!. En La Jornada.

Cd. de México Mex.

21. United Nations Industrial Development Organization. 2007. Sustainable Bioenergy: a

framework for decisions makers. Colección UN-Energy.

22. United Nations Industrial Development Organization. 2008. Bioenergy Strategy:

Sustainable Industrial Conversion and Productive Use of Bioenergy. Colección UN-

Energy.


31

ANEXO. Métodos de Prueba

A. Determinación de azúcares reductores.

Reactivo de DNS.

En un litro de agua desionizada se disuelven los siguientes reactivos en el orden indicado y

se adiciona el siguiente hasta después de la disolución completa del reactivo adicionado

anteriormente.

1. Hidróxido de Sodio 20 g

2. Fenol 4 g 3. Sulfito de Sodio 1 g

4. Tartrato de Sodio y Potasio 400 g 5. Ácido Dinitrosalicílico (DNS) 20 g

Una vez disueltos todos los reactivos anteriores se adiciona 1 litro de agua desionizada, se

mezcla perfectamente y se guarda en un frasco ámbar a temperatura ambiente. Se realiza la

valoración del reactivo DNS mediante una curva tipo de glucosa como estándar.

Solución Patrón de Glucosa

Se pesa 0.1 g de glucosa y se disuelve en 100 mL de agua destilada (1 g/L). Se prepara la

curva diluyendo la solución en agua destilada a 1 mL de acuerdo a la cuadro 8.

Cuadro 8. Concentraciones para construir una curva patrón de glucosa Tubo Concentración

[g/L] Solución Patrón

[mL] Agua Destilada

[mL] 1 0.00 0.00 1.00 2 0.10 0.10 0.90 3 0.25 0.25 0.75 4 0.50 0.50 0.50 5 0.75 0.75 0.25 6 1.00 1.00 0.00


32

Se mezcla el tubo vigorosamente y se coloca en un baño maría durante cinco minutos en

ebullición constante. Se enfrían los tubos en un baño de hielo y se les adiciona 5 mL de

agua desionizada. Se agita y se lee absorbancia a 550 nm. Se grafica concentración de

glucosa vs. Absorbancia a 550 nm. Los resultados se muestran en la figura 9.

Figura 9. Curva patrón de glucosa para determinar concentración por método de DNS.

B. Determinación de Nitrógeno Total.

Se toma 1 mL de nejayote o 0.500 g de extracto de tuna pesados en un papel libre de

nitrógeno y se transfiere a un matraz Kjeldahl de digestión. Se añaden 0.7 g de óxido de

mercurio, 15 g de sulfato de potasio en polvo y 40 mL de ácido sulfúrico concentrado. Se

calienta en forma suave el matraz en posición inclinada hasta que deje de hacer espuma;

después se mantiene una ebullición enérgica durante dos horas. Se deja enfriar. se agregan

aproximadamente 200 mL de agua y 25 mL de solución de tiosulfato de sodio (80 g/L) y se

mezcla. Se añaden perlas de ebullición y con mucho cuidado se deja caer por la pared del

matraz 100 mL de solución de hidróxido de sodio (450 g/L) para hacer el contenido

fuertemente alcalino. Antes de mezclar las capas de ácido y álcali, se conecta el matraz a

un aparato de destilación incorporando un condensador y un protector contra salpicaduras.

Se conecta al extremo del condensador un tubo de salida, el cual debe estar sumergido por


33

debajo de la superficie de un volumen pipeteado de ácido estándar que se coloca en un

receptor cónico. Se mezcla el contenido del matraz de digestión cinco gotas de una

solución indicadora de rojo de metilo (0.5 g/100 mL de etanol) y se titula con hidróxido de

sodio 0.1 M. Se efectúa también una titulación testigo, 1 mL de ácido clorhídrico 0.1 M o

de ácido sulfúrico 0.05 M equivalen a 0.0014 g de nitrógeno.

C. Determinación de etanol.

- Preparación de Soluciones para la determinación.

o Solución Saturada de Carbonato de Sodio.

Pesar 40 g de Carbonato de Sodio. Diluir en 100 mL de agua destilada a 40ºC. Dejar

enfriar y almacenar en frasco de vidrio a temperatura ambiente

o Solución de Dicromato de Potasio en Ácido Sulfúrico 10 N

Diluir en frío 27 mL de ácido sulfúrico en 100 mL de agua destilada. Permitir que la

solución enfríe. Adicionar 0.145 g de Dicromato de Potasio a la solución. Almacenar en

frasco ámbar a temperatura ambiente. Esta solución debe prepararse máximo con una

semana de anticipación.

o Solución estándar de etanol 10 g/L.

Medir 0.123 mL de etanol para espectroscopía y diluir en 10 mL de agua destilada.

Almacenar a temperatura ambiente en frascos de vidrio.

- Procedimiento para determinación.

Adicionar en un tubo ancho 0.5 mL de solución de Carbonato de Sodio.


34

Adicionar en un tubo angosto que quepa en el tubo ancho 1 mL de solución de Dicromato

de Potasio. Se coloca el tubo angosto dentro del tubo ancho. Se agregan 0.1 mL de muestra

en el tubo ancho diluyendo en el carbonato de sodio perfectamente. Se tapa el dispositivo

con un tapón de goma y se coloca en un baño maría a 45ºC durante 1 hora.

Se saca el tubo angosto y se agrega 0.5 mL de agua destilada y se mide la absorbancia a

450 nm.

Para cada determinación se coloca un blanco positivo y un blanco negativo. El blanco

negativo llevará 0.1 mL de agua destilada como muestra. El blanco positivo llevará 0.1 mL

de solución estándar de etanol.

Se prepara una curva tipo a partir de la solución estándar de etanol de acuerdo con la

cuadro 9 y se mide la concentración de etanol y se grafica absorbancia a 450 nm vs etanol

como se observa en la figura 10.

Cuadro 9. Concentraciones para construir una curva patrón de etanol. Tubo Concentración [g/L] Solución [mL] Agua destilada [mL]

1 0.0 0.00 0.10 2 1.0 0.01 0.09 3 2.0 0.02 0.08 4 3.0 0.03 0.07 5 4.0 0.04 0.06 6 5.0 0.05 0.05 7 6.0 0.06 0.04 8 7.0 0.07 0.03 9 8.0 0.08 0.02

10 9.0 0.09 0.01 11 10.0 0.10 0.00

Figura 10. Curva Patrón de Etanol para determinar concentración por método de microdifusión


35

D. Determinación de Dureza de Calcio.

Se toman 100 mL de la muestra a analizar y se coloca en matraces Erlenmeyer de 250mL.

Se añadirá 2mL de solución de NaOH o una cantidad suficiente para alcanzar un valor de

pH entre 12 y 13 en la muestra. Se añade una pequeña cantidad con una espátula

(aproximadamente 20mg) de Murexida preparada (1g de Murexida en 50g de Na Cl); el

espacio de tiempo entre la adición del indicador y la titulación posterior deberá ser lo más

pequeña posible, añadiendo el indicador inmediatamente antes de la titulación. Se valora

con una solución de EDTA 0.02N (0.01M), el punto final de la valoración coincidirá con el

viraje de coloración rosa a púrpura, se confirmará con el punto de viraje con la adición de

una gota de EDTA 0.02N.

E. Determinación de Alcalinidad.

Colocar 50 mL de la muestra en un matraz Erlenmeyer, se añaden a dicha muestra 2 gotas

de solución indicadora de fenolftaleína al 1%. Si la muestra cambia de color a rosa se

valorará con Ácido Clorhídrico 0.01N. El punto final de la valoración concidrá con la

desaparición de la coloración rosa pasando a incolora, coincidiéndo con el valor de pH 8.3

comprobándose el valor mediante un potenciómetro. Éste es el volumen 1.

A la misma muestra se añaden 6 gotas de solución indicacora de Anaranjado de metilo al

5%. Se valora volumétricamente con HCl 0.01N. El punto final de la valoración coincidirá

con un pH entre 4.3 y 4.7. Éste es el gasto 2.

Los cálculos se realizarán de acuerdo a las ecuaciones 1 y 2.

Ecuación 1:

P = (Volumen 1×Normalidad de HCl×Meq de CO3 [0.03]×106)/Volumen de muestra


36

Ecuación 2

M = (Volumen 2×Normalidad de HCl×Meq de CO3 [0.061]×106)/Volumen de muestra

Se aplicará la cuadro 10 para expresar los resultados.

Cuadro 10. Cuadro para determinar la alcalinidad de muestras por método volumétrico. Resultado de la titulación Alcalinidad de hidróxidos

como OH2- Alcalinidad de Carbonatos

como CO32-

Alcalinidad de Bicarbonatos como HCO3

-

P = 0 0 0 M P < ½ M 0 2P T – 2P

P = M P ó M 0 0 P > ½ T 0 2P 0 P = ½ T 2P – T 2(T – P) 0

La alcalinidad total se presentará como la suma de las alcalinidades expresadas

individualmente.

producciÓn de etanol como biocombustible a partir …

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