procedimientos y técnicas para la realización de estudios...

MVZ. Claudia Sixtos

Asesor técnicoDivisión Animales de Compañía

Laboratorios Virbac México S.A. de C.V.

Estudio coproparasitoscópico. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

Procedimientos y técnicas para la realización de estudios coproparasitoscópicos

PUBLICACIÓN TRIMESTRAL No. 24

INTRODUCCIÓN

La ciencia de la parasitología tuvo un gran avance a partir del invento del microscopio y de los descubrimientos de Leevwenhoeck en el siglo XVIII.

Las enfermedades parasitarias han producido a través de los tiempos más muertes y daño económico a la humanidad que todas las guerras. Generalmente en los países con poco desarrollo socioeconómico, las enfermedades causadas por los parásitos se presentan con mayor frecuencia, esto se favorece por las condiciones climáticas y por la falta de medidas higiénicas en los habitantes.

Publicación Trimestral de Actualización Científica y Tecnológica No.24 Realizado por VIRBAC MÉXICO S.A. de C.V. División Animales de Compañía2

...Los parásitos intestinales...son importantes agentes de enfermedad en

animales de compañía.

¿Sabía usted que...?

El impacto de las enfermedades parasitarias en el mundo es muy importante, ya que afectan directamente la salud, la esperanza de vida, y la productividad de millones de personas y animales.

Los parásitos intestinales son una causa importante de enfermedades en los animales de compañía y trasmisores de enfermedades zoonóticas hacia los dueños de las mascotas. Estos parásitos pueden ser detectados al examinar muestras fecales con las diferentes técnicas, como son: frotis directo, sedimentación, flotación y ELISA fecal. La técnica de flotación es la más utilizada en la práctica clínica en animales de compañía.

El control y la prevención de parasitosis en animales de compañía y seres humanosrequiere la adopción de medidas para prevenir la transmisión entre animales y hacia los seres humanos, así como para reducir la contaminación ambiental con huevos, quistes y larvas. Las medidas recomendadas por lo general son:

Desparasitación de perros con tratamientos preventivos apropiados.Reducción del número de animales sin dueño, así como de animales de compañía mal cuidados.Prevención de la defecación de los animales de compañía en pavimentos o áreas públicas.Fomentar el concepto de responsabilidad de los dueños de animales de compañía.Educar al dueño de mascota sobre el potencial zoonótico de los parásitos de perros y gatos.

El peligro que para la salud pública representan las infestaciones de parásitos es poco conocido por los dueños de los animales de compañía, quienes, por consiguiente carecen de nociones sobre las formas de adoptar medidas necesarias para minimizar este riesgo. Los veterinarios deben informar a sus clientes sobre el riesgo zoonótico, los ciclos de vida de los parásitos, los modos de transmisión hacia los seres humanos, los riesgos especiales que corren los niños que tienen el hábito de geofagia, así como de los riesgos asociados con los cachorros y las hembras lactantes.

El veterinario se encuentra en una posición clave para controlar los parásitos en los animales de compañía de sus clientes y para aconsejar a los mismos sobre las medidas que pueden tomar para reducir los riesgos.

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RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRASSe necesitan de 2 a 5 gr. de heces para la realización de estudios coproparasitoscópicos mediante las técnicas de flotación. Las heces se pueden obtener por la expulsión natural, teniendo cuidado de que esta no se contamine con larvas o huevos presentes en el medio (la muestra debe tomarse inmediatamente después de que el perro defeque y tomando únicamente heces de la parte superior y no las que están en contacto con el suelo). Cada muestra debe rotularse para permitir su identificación posterior.

Otro método de recolección es mediante el uso de la cucharilla rectal o bien de un termómetro, en estos casos, un posible resultado negativo no tiene ningún valor diagnóstico (debido a que la muestra es muy pequeña), sin embargo un resultado positivo puede implicar un alto nivel de parasitismo.

Nota: Las muestras fecales diarréicas de animales con gran carga parasitaria, pueden contener pocos estadios parasitarios, debido a un efecto de dilución por un mayor contenido de agua en las heces.

La recolección de las heces debe hacerse en un recipiente que no contenga aire (puede ser una bolsa de plástico o un envase con tapadera). La muestra debe almacenarse en un lugar fresco y seco, alejada de la luz solar directa. La muestra siempre debe examinarse lo más pronto posible. Cuando esto no es factible y la muestra requiere ser almacenada por varias horas o incluso por un día, esta se debe refrigerar. Sin embargo los trofozoitos de Giardia y Trichomona, así como algunas larvas, no sobreviven en refrigeración (cuando se sospecha de estos parásitos la muestra debe ser examinada inmediatamente), pero no afectará a la mayoría de huevos y otras fases de otras especies parasitarias.

Algunos medios químicos permiten la conservación de las muestras durante un tiempo mayor sin correr el riesgo de que las formas parasitarias se deformen o se destruyan; la solución más común es la Formalina al 10% (se disuelven 10ml de formaldehído en 90 ml de agua y se guarda en un frasco de plástico o vidrio hermético, no metálico). Se debe mezclar 3 gr. de heces con 10 ml de formalina al 10%.

Las muestras de heces diarréicas deben ser examinadas en un plazo no mayor a 1 hora y no deben ser refrigeradas.

NÚMERO DE MUESTRASPara tener un mejor resultado es necesario la realización de coproparasitoscópicos seriados. Lo óptimo es la toma de 3 muestras (mínimo) en días alternos, esto se debe a la eliminación irregular de huevos, ya que las hembras de los parásitos no ovopositan diariamente, por lo tanto la toma y examen de una sola muestra no tiene un 100% de exactitud.

MUESTRAS INADECUADASResultan inadecuadas para el examen todas aquellas muestras que:

Se han mantenido por más de 24 hrs a temperatura ambiente.Han sido obtenidas después de un estudio radiográfico en el que se utilizó sulfato de bario.Fueron obtenidas con la posibilidad de contaminación (tomadas directamente del suelo, parques o jardines).

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...El veterinario es pieza clave en el control de parásitos en animales de compañía, y la reducción de riesgo para los seres humanos.


TÉCNICAS COPROPARASITOSCÓPICASExamen macroscópicoDespués de recolectar las muestras fecales es muy importante observar su consistencia, color, olor, la presencia de sangre o de moco, entre otros factores, siempre en relación con una buena anamnesis para evitar errores.

Examen microscópicoAl realizar el estudio de una laminilla con un frotis directo de heces, una flotación, o un extendido de sangre, es conveniente hacerlo a profundidad para obtener un diagnóstico confiable.

Una laminilla fecal preparada es tridimensional: tiene largo, ancho y profundidad. Los parásitos más pequeños como Giardia o coccidias pequeñas, se encontraran en la primera capa. La siguiente capa hacia abajo contendrá los huevos grandes (gusanos redondos, gusanos planos) ooquistes y larvas en caso de estar presentes.

Se debe examinar el portaobjetos completo con el objetivo de 10X, los parásitos pequeños u otros objetos deben examinarse en el objetivo de 40X. Nunca se debe utilizar el objetivo 100X para observar las laminillas de flotación fecal.

MÉTODOS DIRECTOSEl examen directo es el más antiguo que se conoce por los datos históricos que se tienen en relación a los primeros microscopios, Antonio Van Leevwenhoek en el siglo XVIII, fue de los primeros en utilizarlo, al encontrar y observar en sus propias heces trofozoitos de Giardia lamblia.

Toma de muestra fecal, evitando la contaminación ambiental. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

Cucharilla Rectal. Cortesía MVZ Carlos Lorenzana / Virbac®

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Frotis directo de heces

El método tiene entre sus características, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, además de lo económico que resulta realizarlo, pues no requiere mucho material. Este método es muy utilizado para el diagnóstico de los protozoarios intestinales. En la práctica ha demostrado su eficacia cuando se utiliza lugol, para la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas, aunque en la práctica veterinaria se utilizan para el diagnóstico de estos últimos las técnicas, de flotación y sedimentación. Este método tiene una fuerte limitante: la muestra utilizada es tan pequeña, que es poco representativa.

Procedimiento: En un portaobjetos se colocan, por separado (en cada extremo), una gota de solución salina fisiológica y otra de lugol.Con uno o dos aplicadores de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina, haciendo una suspensión homogénea.Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.Se coloca el cubreobjetos.Se efectúa la misma operación en la gota de lugol.Se observa al microscopio.

Método de Graban (técnica de la cinta scotch)Es un método cualitativo y muy útil para el diagnóstico de Dipylidium caninum. Consiste en la utilización de una cinta engomada trasparente, que se coloca alrededor del ano y de la zona perineal.

Procedimiento: Se corta un trozo de cinta de aproximadamente 5-6 cm, se impregna de material presente de las zonas mencionadas y finalmente se adhiere a un portaobjetos y se observa al microscopio con el objetivo de 10X.

Se puede utilizar una gota de lugol, este se coloca levan-tando un extremo de la cinta, después se fija nuevamente a la laminilla. De esta manera se aclara la muestra y se obtiene un efecto de contraste con los huevos.

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Frotis directo de heces. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac® Método de Graban. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

Método de Graban. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

Frotis directo de heces. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac® Método de Graban. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

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MÉTODOS DE FLOTACIÓNLos métodos de flotación fecal se utilizan para separar los parásitos en todos sus estadios (huevos, ooquistes, quistes, larvas) de otros objetos, basados en sus diferentes densidades. La densidad es el peso de un parásito u otro objeto por unidad de volumen, se expresa en forma de gravedad específica.

Para obtener un resultado preciso al realizar una flotación fecal, es necesario utilizar la solución correcta. La densidad (gravedad específica) de las diferentes soluciones está determinada por la cantidad de sal o azúcar que contienen. La densidad de la mayoría de las soluciones está entre 1.18 y 1.20; y la densidad de la mayoría de los parásitos comunes del perro es menor a 1.18.

Solución salina saturada (Koffoyd y Barber)Este método cualitativo es muy común en la práctica diagnóstica veterinaria, da muy buenos resultados, es fácil de preparar y se conserva por largo tiempo.

Este método es muy útil para la identificación de protozoarios, nematodos y algunos cestodos, tomar en cuenta que en esta solución no flotan algunos huevos como los de Dipylidium y Taenia solium.

Preparación de la solución salina saturada:

Cloruro de sodio (Na Cl)...........331 gr.Agua corriente.............................1 lt.

Calentar mezclando continuamente hasta disolver la sal evitando la ebullición.

Procedimiento:Separar de la muestra 2-5 gr. de heces en un recipiente (mortero, taza).Agregar 15 ml de solución salina saturada.Disolver muy bien las heces con una cucharilla o un abate lenguas. Hasta que quede una pasta uniforme.Pasar la mezcla por un colador en un recipiente limpio.Llenar un tubo de ensayo con el líquido filtrado hasta el borde dejando un menisco convexo.Eliminar con un palillo las burbujas o sustancias que flotan.Colocar un cubreobjetos y esperar 15-30 min como máximo. Si se pasa de este tiempo, los huevos colapsan o se rompen debido a la acción osmótica.Retirar cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos.Observar al microscopio con el objetivo de 10X.

El método de flotación con solución salina debe realizarse como se describió anteriormente, el uso de solución salina fisiológica no sirve para ésta técnica ya que no tiene la densidad requerida.

La solución presenta como defecto una cristalización rápida, debido a la evaporación de la solución.

Solución sacarosaEsta solución se recomienda para el diagnóstico de helmintos y no es recomendable para el diagnóstico de Giardia.

Preparación de la solución sacarosa:

Azúcar..............................456 gr.Agua destilada..................355 mlFenol o Formol 10%.......... 6ml

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...Para obtener un resultado preciso al realizar un estudio coproparasitoscópico con métodos

de flotación fecal, es necesario utilizar la solución correcta.


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Calentar mezclando continuamente hasta disolver el azúcar evitando la ebullición, agregar el fenol (o formol 10%) como conservador.

Procedimiento:Mezclar 2-5 gr. de heces en 15 ml de solución sacarosa.

Disolver muy bien las heces con una cucharilla o un abate lenguas. Hasta que quede una pasta uniforme.

Pasar la mezcla por un colador en un recipiente limpio.

Colocar en un tubo de ensayo con el líquido filtrado.

Centrifugar a 1500 rpm durante 10 min.

Colocar el tubo de ensayo en una rejilla y agregar más solución sacarosa hasta el borde dejando un menisco convexo.

Eliminar con un palillo las burbujas u objetos flotantes.Colocar un cubreobjetos y esperar 10-20 min.

Técnica de flotación con solución. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®

Técnica de flotación con solución. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac® Técnica de flotación con solución. Cortesía MVZ Claudia Sixtos / Virbac®





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Retirar cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo sobre u portaobjetos.

Observar al microscopio para detectar los parásitos.

Solución con sulfato de zincEn esta técnica solo se obtienen resultados cualitativos. Es recomendable para la identificación de quistes de protozoarios los cuales no sufren alteraciones en sus estructuras.

Preparación de la solución de sulfato de zinc al 33%Sulfato de zinc (ZnSO4)....................331 gr.Agua............................................... 1 lt.

Procedimiento:Mezclar 1-2 gr. de heces frescas con 15 ml de solución de sulfato de zinc al 33% en un recipiente (mortero, taza).Disolver muy bien las heces con una cucharilla o un abate lenguas. Hasta que quede una pasta uniforme.Pasar la mezcla por un colador en un recipiente limpio.Llenar un tubo de ensayo con el líquido filtrado hasta el borde dejando un menisco convexo.Eliminar con un palillo las burbujas o sustancias que flotan.Colocar un cubreobjetos y esperar alrededor de 10 min.Retirar cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo sobre una laminillaObservar al microscopio con el objetivo 20X.

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Técnica de FaustLa técnica de Faust, muestra una buena concentración de quistes de protozoarios, así como huevos y larvas de helmintos.

Esta técnica tiene una gran ventaja, las formas parasitarias se encuentran con facilidad, debido a que se eliminan la gran mayoría de residuos y material orgánico que es tan común en las heces de los carnívoros.

Su limitante es que es poco eficaz para huevos pesados como los de Taenia spp.

Procedimiento:Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una suspensión homogénea con 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de agua destilada.Filtrar la suspensión a través de un colador o una gasa doblada en cuatro, en un recipiente limpio.Colocar en un tubo de ensayo la mezcla filtradaCentrifugar el filtrado a 1500 rpm por 3 min.Decantar el líquido sobrenadante (dejando solo el sedimento) y volver completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento.Repetir el procedimiento 3-5 veces hasta que el líquido sobrenadante esté limpio.Decantar nuevamente el líquido sobrenadante reemplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zinc al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 3 minuto a 1500 rpm.Colocar el tubo de ensayo en una rejilla y agregar más solución de sulfato de zinc al 33% hasta el borde dejando un menisco convexo.Colocar un cubreobjetos y esperar 10-20 min. mezclar 1-2 gotas de lugol, colocar en una laminilla.Observa en el microscopio.

...La técnica de Faust tiene la gran ventajade eliminar la mayoría de residuos orgánicos.


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Método de Mc MasterEsta técnica es utilizada para determinar el número de huevos por gramo de heces y también se utiliza para de larvas de nematodos y ooquistes de coccidias.

Procedimiento:Pesar 3 gr. de heces.Colocarlas en un tubo de ensayo.Agregar 28 ml de solución sacarosa.Agitar fuertemente hasta homogenizarla.Pasar la solución por un colador o cedazo (exprimir el sedimento).Completar el tubo con la misma solución sacarosa.Agitar nuevamente y tomar con un gotero o pipeta parte de la solución.Humedecer con agua corriente la cámara de MacMaster para evitar la presencia de burbujas, y llenarla con la solución.Esperar unos minutos para que se nivelen por completo los huevos, ooquistes y/o larvas.Observar al microscopio y hacer el conteo separando por géneros parasitarios, de las áreas demarcadas en la cámara.Contar mínimo dos cámaras.

Cálculo de recuento:Huevo por gramo= Recuento total x 100 No. De cámaras

Cada cámara presenta 0.15 cm de profundidad por 1 cm2 (se examina o 15 cm cúbicos). Por lo tanto los 30ml de la suspensión total (2 gr. de heces y 28 ml de solución sacarosa) tendrán 200 cámaras pero, como se requiere solamente el número total de huevos por gr., se multiplica por 100 cámaras.

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BIBLIOGRAFÍA

-Dryden MW. Payne, Ridley R, et al. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Vet Ther 2005

-Payne PA, Dryden MW. Accurate evatuation of fecal samples critical to patient. DVM Best Practices. 2005

-David ED, Linquist WD. Determination of the specific gravity of certain helminth eggs using sucrose density gradient centrigugation. J Parasitol 1982

-Vélez, R.A. Guías en Parasitología Veterinaria. Exitodinámica Editores. Medellín Colombia. 1983

-Quiroz, R. H. Parasitología y enfermedades parasitarias de animales domésticos. Editorial Limusa. 1984

-Kirkpatrick C.E., Feline Giardiasis: a review, J. Sm. Anim., Vol. 27, 69-80, (1986).

-Mehlhor, H y piekarski, G. Fundamentos de parasitología: Parásitos del hombre y de los animales domésticos. Acribia, Zaragoza. 1993

-M. Cordero del Campillo, F. A. Rojo Vazquez. Parasitología Veterinaria. España. Interamaricana McGraw-Hill. 1999

Es importante recordar que algunas veces es conveniente la preparación del paciente antes de realizar el estudio coproparasitoscópico.

Por ejemplo:En caso de que las heces sean demasiado compactas puede aplicarse un laxante suave; es recomendable eliminar dietas altas en componentes indigestibles como fibra excesiva o huesos, así como contrastes radiológicos.

La realización de estudios coproparasitoscópicos deberían realizarse en la clínica diaria ya que son sencillos y económicos de realizar, a demás nos ayudan a conocer los tipos de parásitos prevalentes en nuestra región, y de esta manera establecer adecuados programas de desparasitación.

CONCLUSIÓN

Los exámenes coproparasitoscópicos nos permitenel hallazgo e identificación de huevos, larvas, quistes de los parásitos así como de sus formas adultas.

Aunque existe una serie de técnicas para su diagnóstico, es preciso recordar que cada especie de parásito, o cada grupo necesita una determinada modalidad, por lo que es recomendable realizar una historia clínica previa.

Los datos necesarios para un estudio coproparasitoscópico son:

- Procedencia del paciente.- Sistema de cría.- Signos que presenta el paciente (y/o animales que conviven con él).- Resultados de otros análisis (p.ej. hemograma, en caso de haberlos realizado).- Tratamientos a los que ha sido sometido.- Otros estudios realizados. (p. ej. Radiografías con medio de contraste).

Es preciso tener en cuenta que un examen coproparasitoscópico negativo carece de valor predictivo, por muchas razones. El análisis puede ser negativo, sin embargo, el paciente puede estar parasitado. Es por esto, que es conveniente recordar que son precisos al menos tres exámenes coproparasitoscópicos sobre muestras obtenidas en días alternos para descartar la presencia de parásitos intestinales patentes.

La coprología solo es útil para los parásitos patentes que son eliminados en las heces en cualquiera de sus formas (huevos, larvas, adultos, quistes, etc). Solo es posible el diagnóstico en la fase patente de la infección parasitaria; el periodo prepatente, sea o no sintomático y el pospatente, son negativos.

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Huevo de Ancylostoma caninum. Cortesía Lab. Virbac®

Quiste de Giardia.Cortesía Lab. Virbac®

Huevo de Capilaria spp.Cortesía Lab. Virbac®

GUÍA PRÁCTICA DE LOS PARÁSITOSDEL PERRO

Publicación Trimestral de Actualización Científica y Tecnológica para Médicos Veterinarios.

VIRBAC MÉXICO, S.A. DE C.V.Lote 30, Manzana I

Parque Industrial Guadalajara El Salto Jalisco C.P 45690

www.virbac.com.mx

Tel (01.33) 50.00.25.00 Fax (01.33) 50.00.25.15

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Resultados profesionales.

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