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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE

AEROBIOS MESÓFILOS EN ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)

AOAC Official Method 2002.07

CODIGO P-SA-80

FECHA DE EMISIÓN

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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS EN ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)

AOAC Official Method 2002.07

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN

PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS EN ALIMENTOS –

INDICADOR DE COLOR (SimPlate) AOAC Official Method 2002.07

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1. OBJETIVO

Establecer el Procedimiento para el Recuento de Microorganismos Mesofilos aerobios por la metodología ®Official Method 2002.07 Técnica de Indicador de Color Metodología SimPlate® para muestras de Alimentos de Consumo Humano. 2. ALCANCE

El procedimiento permite la identificación de microorganismos Mesofilos en muestras de Alimentos para Consumo Humano, aplica a todas las muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en el Laboratorio de Salud Pública. 3. DEFINICIONES Bacterias mesófílas aerobias: En este grupo se incluyen las bacterias, capaces de

desarrollarse entre 15 y 45 °C, con un rango óptimo de 35 °C en las condiciones establecidas.

Sistema SimPlate: Es un método usado para la detección y cuantificación de microorganismos mesofilicos aérobicos totales. Se basa en tecnología de detección binaria la cual detecta la presencia microorganismos mesofilicos aerobios totales por cambio de color en el medio.

ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de

referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa,

que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas

morfológicas, bioquímicas y moleculares.

4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Publica del Meta cumplir con los lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES

Los microorganismos mesofilos son aquellos que se desarrollan entre 15 y 35 ºC y que tienen una temperatura óptima decrecimiento y proliferación en un ambiente o medio que tenga una temperatura de 37°C. En este grupo se encuentran los microorganismos patógenos es decir los causantes de enfermedades, pues la temperatura corporal es idónea para el desarrollo de este tipo de microorganismos.



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Existe un grupo de aerobios mesofilos (los aerobios son los microorganismos que se desarrollan en presencia de oxigeno). En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En los análisis de alimentos la cantidad de este tipo de microorganismos en el alimento, refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Cuando se realizan análisis microbiológicos a los alimentos y se hace el recuento de microorganismos, y se obtiene un recuento elevado puede traducirse o significar:

Excesiva contaminación de la materia prima.

Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.

La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.

La inmediata alteración del producto. Dentro de estos microrganismo mesófilos están los Coliformes e indican fallas de higiene de los manipuladores, re contaminación después del proceso y aún de contaminación fecal. 6. REFERENCIAS

AOAC Official Method 2002.07 – Indicador de Color

Certificación Microval (según ISO 16140) Certificado Nº 2009LR26 7. DESARROLLO

7.1 FUNDAMENTO

La tecnología de enzimas múltiples de IDEXX (Multiple Enzyme Technology®) patentado, que detecta bacterias viables en el agua comprobando la presencia de enzimas clave que se sabe existen en esos organismos. Se vale de sustratos de enzimas múltiples que producen cambio de color al ser metabolizados por la bacteria que se encuentra en el agua. La muestra y el medio se añaden a una placa SimPlate, se incuban a 35°C y luego se examinan para determinar el cambio de color morado ha rosado, rojo, crema. El número de pocillos fluorescentes de la placa corresponde al Número Más Probable (NMP) de bacteria total en la muestra original. Los valores NMP generados por el método SimPlate se correlacionan con el método Pour Plate utilizando Agar de recuento de placa totales incubadas a 35°C durante 48 horas como se describe en Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th edition (Métodos Estándar para el Análisis de Agua y Agua de Desecho).



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7.2 MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos

Incubadora a 35±1°C

7.2.2 Reactivos e Insumos Agua destilada estéril

Reactivo SimPlate TPC-CL, color indicado Simple

Platos de SimPlate

7.2.3 Cepas de Referencia

Cepas ATCC Escherichia coli 25922 o 11775 Cepas ATCC Klebsiella neumoniae o variicola 31488 - (Coliformes Totales) Cepas ATCC Pseudomonas aeruginosa 10145 0 27853 - (No coliformes)

7.3 PROCEDIMIENTO 7.3.1 Controles y/o curvas de calibración

Llene tres viales con 10 ml de agua estéril, e inocule con un asa estéril los siguientes controles microbiológicos:

Frasco 1: Control positivo: Cepa ATCC Escherichia coli Frasco 2: Control negativo: Cepa ATCC Pseudomonas aeruginosa Frasco 3: Control para Coliformes Totales: Cepa ATCC Klebsiella pneumoniae 7.3.2 Condiciones Generales

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.4 Descripción del Método

Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra en SimPlate* TPC - Indicador de Color para la Detección de microorganismos Mesofilos en muestras de Alimentos para Consumo Humano.



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Re suspender el vial que contiene el reactivo con 9 ml de agua estéril desionizada

Nota: NO cuente esta reconstitución como una dilución. Preparar la muestra en condiciones asépticas, pesando 10g de muestra y adicionar

90ml de Agua peptonada al 0,1% de diluyente, (dilución1:10) Homogenizar (stomacher) durante 30 segundos y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. Ver P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

Transferir por duplicado, alícuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en vial resuspendido de SimPlate TPC.

Tapar y agitar el recipiente, asegurarse de que el reactivo se disuelva completamente. Mezclar por 15 a 20 segundos en el vortex y verificar la completa disolución del

reactivo. Transferir del contenido del vial (muestra + reactivo) a una plato de SimPlate de la

siguiente manera:

Se vierte la mezcla en el centro de la placa.

Incline ligeramente el plato de SimPlate para ayudar a distribuir el líquido en los pozos.



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Si es necesario puede realizar golpes suaves a la placa sobre una superficie dura para eliminar cualquier burbuja de aire que pueda haber quedado atrapados en los pozos. Verter el exceso de medio sujetando la tapa contra la placa a cada lado de la cavidad hacia la esponja.

Observe el color de fondo de los pozos. Se define como el color de la mezcla de muestra /

medio en el interior de los pocillos. No invierta el plato SimPlate. Llevar los Platos

SimPlate CEc a incubación a 35± 1ªC por 24 a 28 horas.

7.4.1 Lectura Recuento de Mesofilicas:

Realizar la lectura de Recuento de Aerobicos Mesofilicos observe el cambio de color del liquido en los pocillos contando el numero de pozos con cambio de color con respecto al color base: (morado) el cambio de color mas comun producido por microorganismos es ROSA pero puede virar a Naranja, rojo, café y blanco.y cuente el numero de pozos con cambio

Para determinar la concentración por plato, ejecute los siguientes cálculos (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de Simplate para determinar el número total de microrganismos por plato

Reportar asi: Recuento de Mesofilicos = X UFC en 1 ml

(X = Numero hallado en la Tabla)

7.4.2 Cálculos

Para determinar la población por placa, lleve a cabo los siguientes cálculos:

Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución y contar el número de pozos positivos.



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NOTA:

Si no hay pocillos positivos y la esponja es positivo la población es 1.

Si no hay pozos positivos y la esponja es negativo de la población es < 1

Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.

Utilice la Tabla de Conversión SimPlate para determinar el número total de microorganismos por placa.

Reportar asi: Recuento de Mesofilos = X UFC góml

(X = Numero hallado en la Tabla)

7.4.3 Obtención Resultados

Con la interpretación de cálculos, los resultados según correspondan se registran en:

Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-75.

Los resultados del control del método se registran en Control de calidad análisis microbiológico F-SA-101

8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados Para demostrar la capacidad del laboratorio de detectar mesofilicos con el método

Simplate en el Estándar internacional, realizar los siguientes controles con materiales de Referencia y analizarlos en las mismas condiciones que la muestra.

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo y se procesa como una muestra (actividad 7.5).

Control Negativo de Reactivo Servir 100ml de agua destilada estéril en el Reactivo Simplate Pasar al plato e incubar.

Control Positivo Mesofilicos 100ml de agua destilada + 1 ul de Cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 31438 o E coli ATCC 25922 mezclar. Tomar 1 ml y sembrarlo en 9ml de medio simplate,



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NOTA: Para cada una de las cepas bacterianas del American Type Culture Collection (ATCC),

Siembre el cultivo en placas de Tripticasa Soya Agar (TSA) o agar sangre debidamente marcadas e incúbelas a 35±0,5°C durante 18–24 horas.

Para cada cepa bacteriana, recoja una muestra de la colonia con una asa de siembra estéril de 1μl inoculé y mezcle en un tubo de ensayo marcado que contenga 100 ml de agua desionizada estéril. Cierre la tapa y agite bien

Las muestras así obtenidas serán sus controles.1

MATERIAL DE REFERENCIA RESULTADO PREVISTO PARAMETRO

EVALUADO

E. coli ATCC

25922

Color Rosa, Rosado, café o

blanco en el líquido de los

pozos Mesofilicas

Klebsiella

pneumoniae o

variicola

ATCC

31438

Color Rosa, Rosado, café o

blanco en el líquido de los

pozos Mesofilicas

Agua Desionizada

Estéril

Color morado en el líquido de

los pozos

Control Negativo del

reactivo

Registrar en los formatos

F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos F-SA-34 Control Interno de Equipos F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos. F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico



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Criterio de Aceptación o Rechazo

CRITERIO LECTURA RANGO DE ACEPTACION ACCION PARA

INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS

Control Negativo No debe presentar cambio de color ni Fluorescencia en ningún pozo

Coliformes Totales = 0 microorganismos Escherichia coli = 0 microorganismso

Repetir Análisis Verificar.

Control Positivo Coliformes totales Cepa ATCC 31438 Klebsiella pneumoniae

Verificar el Crecimiento en el control Positivo el cambio de color en los pozos pasando de amarillo a color naranja claro al rojo oscuro y SIN presentar fluorescencia al exponerse a la luz UV

Coliforfes Totales = >738 UFC

Repetir siembra de cepas ATCC y repetir

el Análisis

Control Positivo Cepa Escherichia coli ATCC 25922

Verificar el Crecimiento en el control Positivo el cambio de color en los pozos pasando de amarillo a color naranja claro al rojo oscuro y CON presencia de fluorescencia al exponerse a la luz UV

Escherichia coli = >738 UFC


el Análisis

Control Negativo Coliformes Cepa ATCC Pseudomona aeruginosa ATCC 10145 ò ATCC 27853

No debe presentar cambio de color ni Fluorescencia en ningún pozo

Coliforfes Totales = 0 microorganismso Escherichia coli = 0 microorganismso


el Análisis

Reactivos vigentes Vigencia del reactivo dentro de la fecha

Reactivo Vigente a la fecha de utilización

Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes

Temperaturas de Incubadoras

Temperatura ajusta a 35± 1ªC por 24 a 28 horas

Temperatura 35± 1ªC por 24 a 28 horas

Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada.

Mantenimiento de equipos

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos

Control de Esterilización de Material

Verificar la fecha de esterilización de Material, verificar el cumplimiento de los controles de esterilización.

Fecha de esterilización de Material. Controles de esterilización.

Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla con los controles de esterilización.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101



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9. REGISTROS

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-18 Hoja de Vida de

Equipos

Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico







F-SA-46 Control De

Temperatura, Limpieza y

Desinfección de Equipos

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-64 Identificación de Sustancias

Químicas

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental





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Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Profesional del Laboratorio

Físico




10. ANEXOS 10.1 Tabla SimPlate



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10.2 ANEXO 2 N. RESPONSABLE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO

1 INICIO

2 ANALISTA

Verificar la identificación y numeración de las muestras que ingresan con cada Acta de toma de Muestra.

3 ANALISTA

Realizar el registro de la muestra que ingresa en el Libro Análisis Resultados Microbiológicos de Alimentos

Registro de Resultados Análisis Microbiológico de

Alimentos

4 ANALISTA

Marcar los platos SimPlate con el número de la muestra a analizar

5 ANALISTA

Adicionar 9ml de agua destilada estéril al Vial mezclar para disolver el medio

Registro de Control de uso cabina de Flujo

Laminar

6

ANALISTA

Trasferir 1ml de la muestra a analizar

7 ANALISTA

Mezclar por 15 a 20 segundos en vortex hasta verificar la completa disolución del reactivo

Registro Control de Limpieza y

desinfección de equipos

8 ANALISTA

Retirar la tapa de la placa Simplate y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa. Tapar la placa Distribuir la muestra en todos los pocillos, verificando que no quede aire, vaciar el exceso de medio en la esponja blanca del plato, verifique que todos los pozos están llenos antes de eliminar el exceso de medio.

Marcar los platos SimPlate con el número de la muestra a analizar

Registrar en Libro Resultados Microbiológicos de Alimentos.

Verificar identificación y numeración de las muestras

INICIO

Adicionar 9ml de agua destilada estéril al Vial mezclar para disolver el medio

Transferir 1ml de Muestra a analizar .

Mezclar por 15 a 20 segundos en vortex hasta verificar la completa disolución del reactivo

Retirar la tapa de la placa Simplate y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa Cerrar la placa. Distribuir la muestra en todos los pocillos, vaciar el exceso de medio en la esponja blanca del plato, verifique que todos los pozos están llenos antes de eliminar el exceso de medio



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N. RESPONSABLE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO

9 ANALISTA

Llevar la placa Simplate a incubación a 35°C ± 1°C por 24 a 28 horas.

Registro Control de Temperaturas de Incubadoras

10 ANALISTA

Realizar la lectura de Recuento de Mesofilos dado por el numero de pozos con cambio de color del liquido en los pocillos respecto al color base:

11 ANALISTA

Para determinar la concentración por plato, ejecute los siguientes cálculos (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de Simplate, anexo No 1, para determinar el número total de microrganismos por plato

12 ANALISTA

Registre el dato obtenido en el libro de Análisis Microbiológico de Alimentos y en el Sistema Integral de Información en Salud modulo Laboratorio

Registro de Resultados

Microbiológico de Alimentos

Sistema Integral de

Información en Salud modulo Laboratorio

13 ANALISTA

FIN

11. HISTORIAL

VERSIÓN

VIGENCIA

IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS

1

24/06/2016

Versión inicial

FIN

Registre el dato obtenido en el libro de Análisis Microbiológico de Alimentos en el Sistema Integral de información de Salud modulo Laboratorio

Realizar Lectura de Coliformes Totales / E. coli por separado

Llevar la placa SimPlate a incubación a 35°C ± 1°C por 24 a 28 horas

Realizar la lectura (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de SimPlate, Anexo 1, para determinar el número total de microrganismos por plato

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