7/24/2019 Procedimiento citogentica

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METODOLOGA DE INVESTIGACINCondiciones ambientalesPara la determinacin de los ndices de Fases (IF),ndice Mittico (IM) y duracin del ciclo celular se

registraran condiciones del ambiente de trabajo(tales como temperatura, humedad relativa ypresin atmosfrica) durante el e!perimentoMaterial biolgico"a#ces de esta$uillas enrai%adas de Vitis amaznica,Vitis labrusca, Vitis rupestrisy Vitis rotundifoliadeuna longitud apro!imada de &' &'* cmGerminacin de las mestras+as muestras sern germinadas en cmarash-medas confeccionadas en placas Petri de &* !& mm y desinfectadas con alcohol al .* /,cubrindose luego con papel filtro humedecido enagua'!i"acin+os meristemos radiculares se colocarn adiferentes horas del d#a & a 01, cada hora 2 ensolucin fresca del fijador de 3arnoy (4tanolabsoluto 5 6cido actico glacial en una proporcinde 78&, respectivamente) donde permanecern porespacio de 18 o ms horas a 1 93'Coloracin:e usar orce#na actica clorh#drica de acuerdo almtodo de ;jio < +evan (&=*1) modificado por

;alledo < 4scobar (&==7)'+as ra#ces se transfieren a una solucin > delcolorante (orce#na actica al 1'1 / 5 ?3l &@, =8&vol'), calentndose por pocos segundos hastaobtener el desprendimiento de vapores evitndose la

ebullicin y el calentamiento e!cesivo' +uego sedeja enfriar y se repite el paso anterior tres veces'Aespus de ello se deja enfriar por completo'#re$aracin de la mestra $ara el s%as&

+as porciones radiculares teBidas se colocaran sobreun portaobjetos, cortndose & mm del meristemocon una hoja de bistur#C el resto se descarta,eliminndose el e!cedente de solucin D>E'Finalmente se agregar & o 0 gotas de solucin DE(orce#na actica al 1'1 / 5 ?3l al 1* /, &8& vol'),dejando las muestras en la misma durante &minutos, para luego reali%ar el s$uash con un cubreobjetos'#rensado o s%as&:e procede a colocar el cubreobjetos y se golpeafirme y fuertemente la muestra con una varilla degoma' > continuacin se reali%ara el aplastamientopresionando fuertemente la lmina con el dedopulgar, evitando cual$uier movimiento delcubreobjetos' Finalmente, se envolver la lmina enpapel filtro reali%ando presin con la parte inferiorde la palma de la mano'Obser'acin al microsco$io( conta"e de !ases )Determinacin de los ndices de *ases e ndicesMitticos #arciales +as muestras procesadas de cada hora sernobservadas al microscopio con el propsito de

determinar el ndice de fases (If) mediante el contajede las diferentes fases del ciclo celular (interfase,profase, metafase, anafase y telofase) enapro!imadamente & clulas, registradas ye!presadas en porcentajes' Finalmente la sumatoria

de clulas en divisin (profase, metafase, anafase ytelofase) respecto al total de clulas e!presadas enporcentajes constituye el ndice Mittico (Im)'

Formulas parciales (observacin por cada hora)'

IF( )=N de clulasde cada faseN total de clulas

x100

( )=IFp+IFm+IFa+IFt

Aonde8 IF G ndice de fasesC IM G Indice mitticoCp G ProfaseC m G Metafase, a G >nafase y t G;elofase'

Para facilitar el anlisis de los resultados se proponeusar el softHare de procesamiento de imgenesImage;ool 7'Determinacin de los I! e IM Totales + de LaDracin de Ciclo Cellar+os If(/) totales se obtienen de la divisin de lassumatoria de los porcentajes de cada fase de lamitosis, obtenidos para cada hora, entre el n-merototal de horas'3on estos porcentajes se determina el IM totalmediante la sumatoria de los #ndices de fases endivisin (profase, metafase, anafase y telofase)'

IF( )=IF parcialesde cada fase

N de horas

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( )=IFp+IFm+IFa+IFt

+a proporcin de clulas en las fases de la mitosisrespecto al total de clulas de la muestra (el #ndice

mittico2IM) va a reflejar directamente la duracinrelativa de dichas fases, as# como la propia mitosis'4n un sistema asincrnico, esta informacin esinsuficiente para establecer en trminos absolutos laduracin de cada fase individualmente' Para ello es

preciso, adems, conocer cul es la duracin delciclo celular'Para determinar la duracin del ciclo mittico esnecesario evaluar la duracin en horas para cada

fase en un periodo de tiempo suficiente, durante elcual se observe claramente el inicio y el final de lamitosis en porcentajes significativos de las clulasde la muestra, calculando la duracin total del ciclomediante la sumatoria de los periodos ocupados porla profase, metafase, anafase y telofase'

Para ello se precisa determinar los IF totales'

CC=Valores enhorasde lasfases endivisin y eninterfas

Aonde 33 G 3iclo 3elular

n valor elevado para IM no nos indica $ue ladivisin se produce rpidamente, sino ms bien $uela mitosis, ocupa una gran parte del tiempo total delciclo celular' 4ste mtodo permite determinar losvalores promedio'