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PRÓLOGO Esta Guía Teórico-Práctica se propone brindar los conocimientos básicos

metodológicos utilizados actualmente en el diagnóstico clínico y en el área de la investigación científica.

Consideramos además que puede ser de utilidad como fuente de consulta para el graduado.

En esta nueva edición buscamos integrar más estrechamente los contenidos teóricos de la asignatura con los contenidos prácticos. Es clave para formar las competencias profesionales el “saber hacer reflexivo”, con marcos teóricos que sustenten las prácticas y que permitan analizar con criterio sus resultados. Los contenidos específicos de Inmunología están desarrollados en trabajos prácticos que acompañan las unidades del programa de la asignatura. Se enseñan diferentes metodologías que se utilizan en el diagnóstico inmunológico de enfermedades, el desarrollo de pruebas inmunodiagnósticas o en el diseño de estrategias inmunoquímicas para la caracterización y/o purificación de macromoléculas de interés inmunológico.

Esta guía contiene además tres apéndices. El primero, Bioseguridad, para que el alumno adquiera las buenas prácticas de seguridad en el laboratorio puesto que tendrá contacto con materiales potencialmente patógenos. El segundo, referido al manejo adecuado de pipetas ya que es importante tener ciertos recaudos al realizar mediciones de volúmenes para conseguir resultados confiables y reproducibles. El tercero es una introducción a la microscopía de fluorescencia, metodología de amplia aplicación, no solo en la clínica sino también en investigación. A continuación, presenta un Glosario que facilitará al alumno acceder a definiciones breves y rápidas de conceptos tratados durante el dictado de los trabajos prácticos. Finalmente, se acompaña de una Bibliografía para que puedan consultar y ampliar los contenidos desarrollados.

Esperamos que este trabajo docente sea de suma utilidad para nuestros alumnos y egresados de la carrera de Bioquímica.

Los autores.

ÍNDICE

UNIDAD 1: CONCEPTOS INTRODUCTORIOS

REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTÍGENOS

3

Trabajo Práctico N° 1 15

Primera parte: Investigación de antígeno por ELISA directo (“sándwich”). 15 Segunda parte: Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación. 17 Modelo de informe. 19

UNIDAD 2: EL SISTEMA INMUNE INNATO

EL SISTEMA COMPLEMENTO EN LA RESPUESTA INNATA 21 Trabajo Práctico N° 2: Valoración de la vía alterna del complemento en unidades hemolíticas 50 % (AH50).

26

Modelo de informe. 30

UNIDAD 3: EL SISTEMA INMUNE ADAPTATIVO

REACCIONES DE INTERACCIÓN SECUNDARIA Y PRIMARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS

31

Trabajo Práctico N° 3 41 Primera parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa (ARP).

41

Segunda parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo (ALT). 43 Tercera parte: Identificación y semicuantificación de anticuerpos por hemaglutinación indirecta (HAI).

44

Técnica de screening. 45 Técnica de titulación. 47 Cuarta parte: Investigación de anticuerpos por ELISA. 48 Modelo de informe. 51

IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES CELULARES POR INMUNOFLUORESCENCIA 53

Trabajo Práctico N° 4: Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia indirecta.

63


MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA ADAPTATIVA FRENTE A LOS DISTINTOS TIPOS DE ANTÍGENOS

67

Trabajo Práctico N° 5 70 Primera parte: Valoración de la vía clásica del complemento en unidades hemolíticas 50 % (CH50).

70

Segunda parte: Valoración de la fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC).

77


UNIDAD 4: INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA

INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA 79 Trabajo Práctico N° 6 93 Primera parte: Producción de anticuerpos en animales de laboratorio. 93 Segunda parte: Purificación de IgG a partir de plasma. 96 Modelo de informe. 98

UNIDAD 5: EL SISTEMA INMUNE EN PATOLOGÍAS Y RECHAZO DE TRASPLANTES

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD 99 Trabajo Práctico N° 7 107 Primera parte: Anafilaxia cutánea pasiva (ACP). 107 Segunda parte: Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs indirecta. 109 Modelo de informe. 111 AUTOINMUNIDAD 113 Trabajo Práctico N° 8: Investigación de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta.

118

Modelo de informe. 120 INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS 121 Trabajo Práctico N° 9 124 Primera parte: Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo. 124 Segunda parte: Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC).

125

Modelo de informe. 126 INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS 127 Trabajo Práctico N° 10: Investigación de anticuerpos por western blot. 131 Modelo de informe. 135

APÉNDICE I: BIOSEGURIDAD 139 APÉNDICE II: MANEJO EN EL LABORATORIO 145 APÉNDICE III: CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 153 GLOSARIO 157 BIBLIOGRAFÍA 175

TRABAJOS PRÁCTICOS

UNIDAD 1 Guía Teórico-Práctica de Inmunología Conceptos Introductorios UNS

3

REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTÍGENOS

ANTÍGENO Se define como antígeno a toda sustancia capaz de unirse a los anticuerpos, al

receptor de membrana del linfocito B (LB, ver Glosario) o BCR o, al receptor de membrana del linfocito T (LT, ver Glosario) o TCR.

Entre las características de los antígenos (ver Glosario) se pueden mencionar a la reactividad y a la inmunogenicidad. La reactividad hace referencia a la capacidad de unirse de manera complementaria a los productos de una respuesta inmune (ver Glosario). La inmunogenicidad, se refiere a la capacidad de generar una respuesta inmune en un ser vivo. Esta propiedad es variable para los diferentes antígenos y depende de factores inherentes al mismo (composición química, tamaño molecular, carácter de no propio, heterogeneidad en la composición química, degradabilidad, estado físico) y de otros que no dependen de él (dosis y vía de administración, genotipo del receptor, adyuvantes). Si bien la reactividad es una característica general en un antígeno, puede ocurrir que no esté acompañada de la inmunogenicidad. No siempre un antígeno es a la vez un inmunógeno. Entonces, el inmunógeno genera una respuesta inmune y además reacciona con los productos de dicha respuesta in vitro; en cambio un antígeno interacciona con los productos de la respuesta inmune aunque no necesariamente puede generarla.

En cuanto a la composición química, los antígenos pueden ser proteínas, polisacáridos, lípidos o ácidos nucleicos. Los más inmunogénicos son las proteínas debido a la complejidad química que presentan. Los polisacáridos de alto peso molecular suelen también ser buenos inmunógenos. Los lípidos y ácidos nucleicos son los menos inmunogénicos, pero asociados a proteínas o hidratos de carbono aumentan su poder de generar una respuesta inmune.

Los haptenos (ver Glosario) son pequeñas moléculas o grupos químicos que pueden ser reconocidos por el BCR (por lo que son antígenos), pero son incapaces de inducir una respuesta inmune (no son inmunógenos). Pueden adquirir inmunogenicidad al asociarse covalentemente a una molécula transportadora o carrier de mayor peso molecular,


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EPITOPE

EPITOPE EPITOPE

EPITOPE

ANTÍGENO

generalmente una proteína. Podemos mencionar entre ellos al DNP (dinitrofenol), TNP (trinitrofenol) y algunos fármacos.

Determinantes antigénicos y epitopes De toda la estructura de un antígeno sólo pequeñas zonas o regiones, llamadas

determinantes antigénicos o epitopes (Figura 1) (ver Glosario) son reconocidas por el sistema inmune y generan una respuesta adaptativa dirigida específicamente hacia ellas. Cuando se trata de una proteína, un epitope tiene una extensión de 5-6 aminoácidos relacionados; en el caso de un polisacárido son 5-6 unidades de hexosas.

Figura 1: Representación esquemática de un antígeno con cuatro epitopes diferentes. El epitope es la zona del antígeno que interactúa de manera complementaria con el

paratope (sitio de unión o área de reconocimiento específico, ver Glosario) de un anticuerpo. También se utiliza el término epitope para hacer referencia al área de una proteína que da lugar a los péptidos que reconocen los receptores de los LT.

El número de epitopes que presenta un antígeno se denomina valencia (ver Glosario). Pueden existir antígenos monovalentes (cuando hay un solo sitio de unión) o multivalentes (cuando tiene más de uno).

Según la disposición espacial, un epitope puede ser conformacional (discontinuo) o lineal (continuo). El primero está constituido por aminoácidos separados en la estructura primaria, pero próximos en la conformación tridimensional. Los segundos están formados por aminoácidos contiguos en la estructura primaria (Figura 2).


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Figura 2: Representación esquemática de un epitope conformacional y un epitope lineal.

CLASIFICACIÓN DE ANTÍGENOS Existen distintas formas de clasificar a los antígenos. Según el estado físico, se

pueden clasificar en particulados (formes) o solubles. Los primeros son suspensiones de células o partículas. Como ejemplos se pueden mencionar suspensiones de bacterias, glóbulos rojos, células, etc. Los segundos son soluciones de macromoléculas, tales como una solución de proteínas o hidratos de carbono.

Otra forma de clasificar a los antígenos es en timo-dependientes (ver Glosario, ej.: antígenos proteicos, haptenos fijados a proteínas, etc.) o timo-independientes (ver Glosario, ej.: poliósidos, lipopolisacáridos, flagelina polimerizada, etc.). En cada caso la clase de respuesta inmune que se genera frente a ellos es distinta según participen o no los LT.

INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO IN VITRO En la interacción in vitro de un antígeno con su correspondiente anticuerpo se

distinguen dos etapas, la reacción primaria (ver Glosario) no visualizable y la reacción secundaria (ver Glosario), que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la precipitación o aglutinación (ver Glosario).

Interacción primaria Cuando se pone en contacto un antígeno y su anticuerpo específico

(complementario), se forman rápidamente complejos no visualizables. La variación de la temperatura y de la concentración salina tiene muy poca influencia en la formación de estos complejos. Esta reacción se llama de interacción primaria.

EPITOPE CONFORMACIONAL

EPITOPE LINEAL


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Las técnicas de interacción primaria permiten la identificación de antígenos o anticuerpos que, por su baja concentración o por sus características fisicoquímicas (anticuerpos monovalentes, haptenos), no pueden detectarse a través de técnicas de interacción secundaria.

Las técnicas de interacción primaria se caracterizan porque la identificación del antígeno o del anticuerpo tiene lugar por interacción simple entre el antígeno y el anticuerpo, sin la participación de fenómenos asociados como se verá que ocurre en las técnicas de interacción secundaria.

Si bien la interacción primaria antígeno-anticuerpo no es visible, existen métodos que hacen posible la visualización. Esto se consigue al emplear el antígeno o el anticuerpo marcado, hecho que, además, incrementa la sensibilidad de la técnica. Para marcar un antígeno o un anticuerpo pueden utilizarse distintas sustancias. Según la naturaleza de éstas, la técnica recibe distintos nombres:

Enzimoinmunoensayo: cuando se emplea una enzima. Inmunofluorescencia: cuando se usa un fluorocromo. Radioinmunoensayo: cuando se utiliza un radioisótopo. La elección de la técnica dependerá de las características de la sustancia a investigar

o cuantificar y de las condiciones del laboratorio con las que se cuenten. En el caso de tratarse de biomoléculas solubles presentes en baja concentración en los líquidos biológicos, se pueden emplear tanto los enzimoinmunoensayos como los radioinmunoensayos.

En estos tipos de ensayos, la inmunomarcación empleando anticuerpos conjugados (anticuerpo unido a una marca, ver Glosario) permite detectar antígenos. La misma puede ser directa o indirecta.

Inmunomarcación directa: emplea un anticuerpo marcado que se une directamente al antígeno en estudio presente en la muestra analizada (Figura 3).


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Figura 3: Esquema de inmunomarcación directa.

Inmunomarcación indirecta: emplea un anticuerpo sin marca (primario) que reconoce al antígeno de interés y luego un anticuerpo marcado (secundario) capaz de reconocer al primario (una anti-inmunoglobulina marcada) (Figura 4).

Figura 4: Esquema de Inmunomarcación indirecta Las técnicas que utilizan la inmunomarcación son más sensibles que aquellas que se

basan en interacciones secundarias. Por otra parte, cabe tener en cuenta que la inmunomarcación directa necesita de un anticuerpo primario marcado para cada antígeno a detectar (lo que implica un costo económico relativo mayor). En cambio, en una inmunomarcación indirecta, si bien se necesitan dos anticuerpos (primario y secundario), el anticuerpo secundario marcado puede reconocer distintos anticuerpos primarios generados en la misma especie, y en consecuencia pueden utilizarse en varios ensayos.

ANTICUERPO MARCADO

ANTÍGENO

SOPORTE CÉLULA

ANTÍGENO

SOPORTE CÉLULA

ANTICUERPO PRIMARIO

ANTICUERPO SECUNDARIO

MARCADO


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Técnicas inmunoenzimáticas Las técnicas inmunoenzimáticas (EIA) se basan en la marcación de antígenos o de

anticuerpos con enzimas para la posterior detección de la interacción específica mediante el agregado de un sustrato cromogénico.

El uso de enzimas como marcadores capaces de proveer una señal potente mediante su actividad catalítica, resulta ventajoso respecto a otros métodos, como es el caso de los inmunoradiométricos. A diferencia de estos últimos, las técnicas inmunoenzimáticas no requieren de la manipulación de isótopos radioactivos, ni de un operador experto, así como tampoco una habilitación especial del laboratorio. Los conjugados enzimáticos mantienen su actividad biológica por períodos prolongados cuando son correctamente conservados. El instrumento de lectura no es tan costoso como en las técnicas inmunoradiométricas, con la ventaja adicional de que los métodos inmunoenzimáticos tienen límites de detección tan bajos como los métodos inmunoradiométricos.

Por todos estos motivos estas técnicas son ampliamente utilizadas en la cuantificación de distintos tipos de sustancias como fármacos, hormonas, citoquinas, mediadores de inflamación, metabolitos tóxicos, etc.

Clasificación de los enzimoinmunoensayos Se debe considerar que en la bibliografía aparecen diversas nomenclaturas para

referirse a los inmunoensayos. Una primera clasificación en técnicas homogéneas o heterogéneas se relaciona con la inmovilización o no de los inmunoreactantes. Las técnicas homogéneas se realizan en fase líquida en cambio las heterogéneas emplean un soporte sólido para inmovilizar a uno de los inmunoreactantes.

Este Trabajo Práctico sólo se referirá a las heterogéneas, puesto que son las de mayor uso, y particularmente al ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) que presenta gran simplicidad y versatilidad.

ELISA En esta técnica la actividad de la enzima empleada como marca no es afectada por

la reacción antígeno-anticuerpo. Es indispensable contar con una o más etapas de separación entre reactivos unidos y reactivos libres. Esta situación se resuelve de forma


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simple mediante una fase sólida en la que se inmoviliza uno de los inmunoreactantes lo que permite eliminar los reactivos no unidos (mediante lavados) luego de cada etapa de incubación. La prueba de ELISA puede emplearse para la detección de antígenos o anticuerpos.

ELISA para identificar y semicuantificar antígenos Las técnicas que permiten el estudio de antígenos se conocen con el nombre de

ELISA "sándwich" o ELISA de captura. El primer paso que se realiza es la sensibilización. En este caso, consiste en la

unión a una fase sólida de un anticuerpo específico para el antígeno de interés. La fase sólida puede ser de poliestireno, cloruro de polivinilo, nylon, etc. Este anticuerpo específico es el responsable de capturar al antígeno de la muestra. El origen de dicho anticuerpo es generalmente monoclonal para aumentar la especificidad del ensayo.

Para la detección del complejo anticuerpo-antígeno capturado se pueden utilizar anticuerpos monoclonales (ver Glosario) o antisueros policlonales (ver Glosario) marcados (Figura 5A). Cuando el anticuerpo de captura es monoclonal, se puede emplear otro anticuerpo monoclonal marcado que reconozca un epitope diferente al que reconoce el anticuerpo de captura, o el mismo epitope si se sabe que éste se encuentra alejado y repetido como mínimo dos veces en la molécula. El uso de un antisuero policlonal marcado asegura un reconocimiento amplio a través de múltiples epitopes del antígeno.

En caso de emplear un anticuerpo sin marca para la detección del complejo anticuerpo-antígeno capturado (Figura 5B), es necesario contar con un antisuero policlonal, ahora marcado, dirigido contra las inmunoglobulinas de la especie a la que pertenece el primer anticuerpo. Además, este primer anticuerpo sin marcar debe ser obtenido en una especie diferente de aquella en la que se obtuvo el anticuerpo de captura para evitar que el segundo anticuerpo marcado reconozca a dicho anticuerpo. Un ejemplo que aplica el diseño de la Figura 5B utilizaría: un anticuerpo de captura monoclonal anti-antígeno, un anticuerpo primario sin marca anti-antígeno (antisuero policlonal) obtenido en cabra, un anticuerpo secundario marcado anti-inmunoglobulinas de cabra (antisuero policlonal) obtenido en conejo.


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Figura 5: Distintos diseños de ELISA para la determinación de antígenos.

La etapa de bloqueo sigue a la de la sensibilización. Con este fin se emplean

soluciones de proteínas ajenas al sistema evaluado. Dichas proteínas ocupan los sitios libres a los que no se ha fijado el antígeno en la etapa previa. Esto evita las uniones inespecíficas en etapas posteriores de incubación con los anticuerpos. Las soluciones de bloqueo más comúnmente utilizadas son las de proteínas de la leche, albúmina o gelatina.

Luego de cada etapa de incubación y para eliminar los inmunoreactantes no unidos o unidos inespecíficamente se realizan lavados con una solución buffer que contenga un agente tensioactivo (un detergente no iónico como el Tween-20).

Como diluyente de los sueros y conjugados deben emplearse soluciones buffer que contengan Tween-20 y proteínas ajenas al sistema en estudio, las que competirán con dichos inmunoreactantes por los sitios de unión inespecíficos en los componentes inmovilizados en la fase sólida.

Para la detección de la actividad enzimática se puede optar por el uso de diferentes soluciones de revelado. Estas soluciones contienen una sustancia cromogénica o cromógeno (ver Glosario) responsable de la producción de un compuesto coloreado soluble en el medio de reacción. Existen disponibles diferentes enzimas (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.) y sus respectivos sustratos cromogénicos (ortofenilendiamina, fenilendiamina, trimetilbencidina, nitroazul de tetrazolio, entre otros). Una de las enzimas más utilizadas es la peroxidasa, en este caso, proveniente de la raíz del rábano picante (HRP). Esta enzima cataliza una reacción de óxido-reducción donde la sustancia

Anticuerpo Anti-Inmunoglobulina marcado con enzima

Antígeno en estudio

Anticuerpo de captura

A B

Anti-Antígeno marcado con enzima


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cromogénica (DH) funciona como donante de electrones y el peróxido de hidrógeno como aceptor de los mismos. La reacción general catalizada puede escribirse como:

2 DH + H2O2 2 H2O + 2 D (cromógeno oxidado coloreado)

En resumen, los pasos de la técnica son: Inmovilización del inmunoreactante (anticuerpo de captura) en la fase sólida

(sensibilización). Incubación con la muestra (antígeno) para permitir que ésta reaccione con el

inmunoreactante inmovilizado. Amplificación o modulación por medio del empleo de un conjugado enzimático

(esta etapa puede comprender, en realidad, más de un paso). La lectura de los resultados se puede efectuar de forma visual o instrumental. En la

primera se comparan los colores finales de la reacción de la muestra con los colores de los controles positivo y negativo (ver Glosario). Este tipo de lectura sólo es válido para determinaciones cualitativas. En la segunda se emplean lectores de absorbancia. Son fotómetros manuales, semiautomáticos o totalmente automatizados que trabajan a una cierta longitud de onda. Según el equipo disponible será posible medir la absorbancia, definir un resultado como positivo o negativo, o establecer un valor con determinadas unidades. Este tipo de lectura se emplea tanto en determinaciones cualitativas como cuantitativas.

La expresión de los resultados puede diferir para los distintos sistemas antígeno/anticuerpo y fabricantes de kits comerciales. En las determinaciones cualitativas de lectura instrumental es indispensable obtener previamente el valor de corte (cut off, ver Glosario), que permite definir a una muestra como positiva o negativa. Una de las formas de calcular este valor de corte es leer la absorbancia de 30 muestras negativas como mínimo, promediarlas y calcular el desvío estándar (DS).

Donde n es el número de muestra negativas analizadas, m es la media aritmética y xi

es la reactividad de cada muestra.

1

2

n

mxi

DS =


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El valor de corte (X) estará determinado por: Generalmente, en los equipos comerciales el fabricante indica cómo se calcula este

valor.

Interacción secundaria En las reacciones de interacción secundaria los complejos antígeno-anticuerpo

generados en la interacción primaria se agregan para dar diferentes fenómenos visibles. Estas reacciones se aceleran con la temperatura, la agitación y la concentración de electrolitos.

Para que una reacción primaria, progrese a secundaria deben cumplirse los siguientes requisitos: antígeno multivalente, anticuerpo bivalente como mínimo, concentraciones adecuadas de antígeno y anticuerpo.

Los fenómenos de interacción secundaria se visualizan de manera diferente según el estado físico del antígeno. Cuando un anticuerpo se pone en contacto con su antígeno particulado específico (hematíes, bacterias, parásitos, células) se observará el fenómeno de interacción secundaria llamado aglutinación (ver Glosario). Si el anticuerpo interactúa con su antígeno soluble específico (proteínas, polisacáridos) se observará el fenómeno de precipitación (ver Glosario).

Para que se formen los complejos las proporciones de ambos deben ser las adecuadas según lo propuesto en la Teoría del enrejado o de Marrack. Estos complejos forman una red que estará integrada por varias moléculas de anticuerpo interactuando simultáneamente con varios determinantes antigénicos presentes en la misma molécula de antígeno y a su vez cada sitio activo de la molécula de anticuerpo uniéndose con determinantes antigénicos presentes en moléculas diferentes de antígeno. Cuando la masa de la red de complejos antígeno-anticuerpo formados supera las fuerzas que los mantiene en solución, caen por su propio peso y se observan grumos en la aglutinación o precipitado en la precipitación.

Reacciones de precipitación Se utilizan para investigar antígeno o anticuerpo, dependiendo de cuál sea el

inmunoreactante conocido.

X = XAbs + (3 x DS)


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Las reacciones de precipitación, cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas pueden realizarse en medio líquido o gelosado. Estas reacciones se estudiarán con mayor profundidad en otros Trabajos Prácticos.

Reacciones de aglutinación También son útiles para investigar antígeno o anticuerpo. De acuerdo a las

características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación pueden clasificarse como reacciones de aglutinación directa o reacciones de aglutinación indirecta (pasiva). Las reacciones de aglutinación directa se basan en el empleo de una partícula aglutinante como antígeno. Un ejemplo de este tipo de reacciones es la determinación de grupo sanguíneo y factor Rh, donde los glóbulos rojos son los antígenos en estudio (investigación de antígenos eritrocitarios del sistema ABO y D). Las reacciones de aglutinación indirecta o pasiva se basan en el empleo de una partícula aglutinante inmunológicamente inerte a la cual se le ha unido un antígeno soluble.

La aglutinación puede realizarse en forma cualitativa o semicuantitativa. Los métodos cualitativos son utilizados para investigar la presencia de un antígeno o anticuerpo. Por ejemplo, se puede mencionar para el caso de antígeno la investigación de una bacteria en un líquido biológico o la determinación de grupos sanguíneos.

Antígenos hemáticos: Sistemas ABO y Rh Los antígenos del sistema ABO surgen de una familia de glucolípidos presentes en la

superficie del eritrocito. Su estructura básica consiste en el lípido ceramida unido a un oligosacárido formado por glucosa (Glu), galactosa (Gal), N-acetilgalactosamina (NAcG), galactosa y fucosa (Fuc). En las personas de grupo O, éste es el único glucolípido que se forma. La persona de grupo sanguíneo A tiene la enzima que puede agregar una N-acetilgalactosamina adicional para formar el antígeno A, mientras que las personas de grupo sanguíneo B tienen una enzima que puede agregar una galactosa adicional a la estructura básica y formar así el antígeno B (Figura 6).


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Figura 6: Composición de los isoantígenos del sistema ABO.

El sistema Rh contempla cinco antígenos de los cuales el antígeno D es el de mayor inmunogenicidad. Su presencia es la que establece que un individuo sea Rh positivo. Está constituido por numerosos epitopes. Contiene 12 dominios transmembrana de tipo hidrofóbicos, 6 loops extracelulares, un extremo N-terminal intracitoplasmático y un extremo C-terminal también intracitoplasmático (Figura 7).

Figura 7: Esquema de la ubicación del antígeno D en la membrana de los hematíes.

Para la determinación de los antígenos hemáticos del sistema ABO se emplean

anticuerpos monoclonales específicos de la clase IgM. Dado que la IgM tiene 5 sitios de unión al antígeno, se favorece la formación de la red de Marrack que conduce a la aglutinación de los glóbulos rojos. En el caso de la determinación del antígeno D se emplea una mezcla de anticuerpos monoclonales de clases IgM e IgG.

Glu

Gal

Gal Fuc

NAcG

CERAMIDA

Glu

Gal

Gal Fuc

NAcG

CERAMIDA

NAcG

Glu

Gal

Gal Fuc

NAcG

CERAMIDA

Gal

GLUCOLÍPIDO BASE ANTÍGENO A ANTÍGENO B


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TRABAJO PRÁCTICO N° 1

Primera parte Investigación de antígeno por ELISA directo (“sándwich”)

FUNDAMENTO:

La interacción del antígeno presente en la muestra a investigar con un anticuerpo específico para dicho antígeno, inmovilizado sobre un soporte sólido, puede ponerse en evidencia por medio de un segundo anticuerpo, específico para el antígeno, conjugado con una enzima cuya actividad produce una reacción de color visible cuando se agrega el sustrato correspondiente. OBJETIVO: Investigación del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) en un suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano.

REACTIVOS Y MATERIALES: Placas de poliestireno sensibilizadas con el anticuerpo anti-HBs. Buffer de lavado: buffer salino con tensioactivo. Conjugado concentrado: anticuerpo anti-HBs conjugado con peroxidasa (dilución de

trabajo: 1 parte de conjugado concentrado + 50 partes de diluyente de conjugado) Diluyente de conjugado: buffer Tris. Reactivo revelador: Tetrametilbencidina (TMB) en buffer citrato con el agregado de

peróxido de hidrógeno. H2SO4 2 N. Control positivo: suero inactivado reactivo para HBsAg. Control negativo: suero inactivado no reactivo. Pipetas automáticas y tips.


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PROTOCOLO: En los pocillos de la policubeta a utilizar colocar: Cubrir la policubeta con cinta adhesiva para evitar la evaporación. Incubar en estufa a 37 °C durante 60 min. *Aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo, desechándolos en un recipiente que

contenga hipoclorito de sodio al 5 %. **Lavar 4 veces durante 2 min con buffer de lavado (350 μl/pocillo cada vez). ***Al finalizar el último lavado secar cuidadosamente la policubeta, invirtiéndola sobre

papel absorbente. Agregar 100 μl del conjugado a todos los pocillos. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 min en estufa a 37 °C. Repetir los pasos *, ** y ***. Agregar 100 μl del reactivo revelador (preparado adecuadamente) a todos los pocillos. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. Incubar 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz. El color desarrollado será celeste. Agregar 100 μl de H2SO4 2 N para frenar la reacción, a todos los pocillos (el color

celeste virará a color amarillo). Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

La lectura de los resultados se realiza con espectrofotómetro a 450 nm dentro de los 5 a 30 min de finalizada la reacción.

Se debe calcular el valor de corte de la siguiente manera: Cut off = CN + 0,060; donde CN = Promedio de las absorbancias del control (-).

Blanco Control (-) Control (+) Muestra

- 100 μl 100 μl 100 μl


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Se considera: Resultado Absorbancia de la muestra Reactivo ≥ cut off

No reactivo < cut off NOTA: Todos los reactivos y muestras a investigar deben estar a temperatura ambiente antes

de iniciar la prueba. Es importante en las etapas de lavado no dejar que los pocillos se sequen durante el

procedimiento.

Segunda parte Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación

FUNDAMENTO:

La aglutinación se produce cuando un anticuerpo conocido es puesto en contacto con su antígeno particulado específico (hematíes, bacterias, parásitos, células) en un medio salino adecuado. En este caso particular, anticuerpos dirigidos contra antígenos expresados en la membrana de los glóbulos rojos interaccionan con ellos y forman complejos antígeno-anticuerpo que se visualizan en forma de grumos. OBJETIVO: Tipificación de antígenos hemáticos. MUESTRA A ANALIZAR: Sangre entera recolectada con citrato, oxalato o heparina como anticoagulante. REACTIVOS Y MATERIALES: Reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales: anti-A, anti-B y anti-D. Portaobjetos. Varillas mezcladoras.


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Lámparas. PROTOCOLO: Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-A y una gota de sangre entera.

Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Observar si hay o no aglutinación.

Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-B y una gota de sangre entera. Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Observar si hay o no aglutinación.

Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-D y una gota de sangre entera. Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Acercar cuidadosamente el portaobjeto a una fuente de calor. Observar si hay o no aglutinación.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

La aglutinación o no de los glóbulos rojos ensayados frente a cada uno de los reactivos indica la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos en la membrana de los mismos.

Aglutinación con

Grupo sanguíneo Suero anti-A Suero anti-B A Positivo Negativo B Negativo Positivo AB Positivo Positivo O Negativo Negativo

Factor Suero anti-D Rh negativo Negativo Rh positivo Positivo

NOTA: Los reactivos y las muestras deben hallarse a temperatura ambiente para evitar

aglutinaciones inespecíficas.


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No prolongar la lectura del ensayo luego de los 2 min para evitar que los inmunoreactantes se sequen por evaporación.

MODELO DE INFORME

TRABAJO PRÁCTICO N° 1 Primera parte: Investigación de antígeno por ELISA directo (sándwich) Objetivo: Sistema: Resultado: Interpretación: Segunda parte: Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación Objetivo: Sistema: Resultado: Grupo …. Factor …. Interpretación:

UNIDAD 2 Guía Teórico-Práctica de Inmunología El Sistema Inmune Innato UNS

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EL SISTEMA COMPLEMENTO EN LA RESPUESTA INNATA

EL SISTEMA INMUNE INNATO La inmunidad innata (ver Glosario) contribuye a la erradicación del foco infeccioso

por mecanismos humorales y celulares. Estos mecanismos, establecidos aún antes de contraerse la infección, están preparados para responder con rapidez una vez que ésta se produce.

Los principales componentes de la inmunidad innata son: Barreras físicas y químicas (piel, secreciones mucosas). Células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos) y células NK. Proteínas sanguíneas (sistema complemento y otros mediadores de la

inflamación). Citoquinas que regulan y coordinan muchas de las actividades celulares.

Dentro de los mecanismos innatos efectores humorales se encuentran el sistema complemento (C, ver Glosario), las colectinas, las ficolinas y las pentraxinas. Todas estas proteínas circulan en forma soluble en el plasma (ver Glosario) y los líquidos extracelulares y reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), actuando como opsoninas y marcando a patógenos para su posterior fagocitosis por los neutrófilos y macrófagos (ver Glosario).

EL SISTEMA COMPLEMENTO El sistema complemento es un complejo proteico polimolecular, compuesto por un

grupo de más de 30 proteínas. Están presentes en concentraciones que varían entre 1 g/ml, como en el caso el factor D, hasta 1 mg/ml, como en el caso de la fracción C3. Se encuentran en todos los vertebrados, con un alto nivel de conservación en los mamíferos. Son sintetizadas en su mayoría por los hepatocitos aunque los macrófagos tisulares y las células endoteliales representan una fuente alternativa. Las proteínas del complemento circulan en la sangre, normalmente en forma inactiva. La activación puede ocurrir a través de tres vías:


22

Vía Alterna. Vía de las Lectinas. Vía Clásica.

Este proceso de activación está bajo estricto control de mecanismos regulatorios mediados por factores solubles y/o asociados a membranas celulares. Cuando el complemento es activado se pone en marcha un potente mecanismo de amplificación similar a la cascada de la coagulación.

Las consecuencias de la activación del complemento por cualquiera de las tres vías son:

Generación de moléculas opsonizantes (C3b). Producción de moléculas quimiotácticas y anafilácticas (C3a y C5a) que

participan en el proceso inflamatorio. Formación del complejo de ataque a membrana (C5b-9) que genera poros en

la misma provocando la lisis celular. Potenciación de las respuestas de los linfocitos B.

Durante la inmunidad innata el sistema complemento realiza su función efectora, activándose mediante dos de sus tres vías, la vía alterna y la vía de las lectinas (Figura 8).

Para el estudio del sistema complemento, en el laboratorio, se han desarrollado dos tipos de ensayos: funcionales como la Valoración del Complemento e inmunoquímicos como la Inmunodifusión Radial Cuantitativa (IDRC, ver Glosario). Los ensayos funcionales evalúan la integridad del sistema y la IDRC utiliza anticuerpos específicos para cuantificar un componente particular del sistema.

El dosaje de la actividad del complemento en un suero (ver Glosario) utilizando un ensayo funcional puede determinarse en unidades hemolíticas 100 % o en unidades hemolíticas 50 %. Se define como unidad hemolítica a la menor cantidad de suero capaz de producir la lisis total o parcial de un sistema antígeno-anticuerpo, glóbulos rojos de carnero y su correspondiente anticuerpo (vía clásica), o de glóbulos rojos de determinadas especies animales en condiciones adecuadas (vía alterna).

Estudios realizados sobre la cinética de la inmunohemólisis han demostrado que se obtiene una mayor sensibilidad cuando la valoración de la actividad del complemento se efectúa utilizando unidades hemolíticas 50 %.


23

Figura 8: Activación del complemento en la respuesta inmune innata.

VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO Si se ponen en contacto distintas diluciones de una muestra biológica, cuyo

complemento se desea valorar, con un sistema formado por glóbulos rojos de carnero y su anticuerpo específico (vía clásica), o glóbulos rojos de ciertas especies animales (vía alterna) se produce la lisis de los hematíes. Es posible entonces graficar el porcentaje de

ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO

VÍA DE LAS LECTINAS

Se activa por la unión de una lectina ligadora de manosa a la

superficie del patógeno

VÍA ALTERNA

Se activa por la presencia de determinadas moléculas en la

superficie del patógeno

PRODUCCIÓN DE:

C3a, C5a C5b-C9 C3b C3bi

Atracción de células

inflamatorias

Perforación de la membrana de los

patógenos por formación del

complejo de ataque a membrana

Recubrimiento del patógeno

favoreciendo la fagocitosis

Potenciación de la respuesta B

MUERTE DEL PATÓGENO


24

hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado, observándose que se obtiene una curva sigmoidea, con una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75 % de hemólisis. De esto se deduce que existe una mayor sensibilidad si la determinación se hace según el 50 % de hemólisis, pues para pequeñas variaciones en la concentración de complemento se observan mayores variaciones en el porcentaje de hemólisis (Figura 9).

Figura 9: Porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos en función de la cantidad de complemento presente en un suero.

La expresión matemática de esta curva es la ecuación de Van Krough donde X = K

[Y/(1-Y)]1/n. En esta ecuación X es la cantidad de complemento expresada en ml de dilución e Y corresponde al grado de lisis como fracción de 1. K es una constante que equivale a la cantidad de complemento que produce el 50 % de hemólisis, 1/n es el valor de la pendiente, que varía según las condiciones del ensayo. La transformación logarítmica de la ecuación de Van Krough es útil para la valoración del complemento porque su representación matemática es una recta: log X= log K + 1/n log [Y/(1-Y)]. Cuando Y=0,5 (es decir cuando se produce el 50 % de lisis), [Y/(1-Y)] será 1, haciendo que el término sea igual a cero, y el log de X en ese punto sea igual al log K, determinando de este modo la cantidad de complemento (en ml de dilución del suero) que produce el 50 % de lisis del sistema hemolítico (vía clásica) o de glóbulos rojos de ciertas especies animales (vía alterna).

25

50

75

% de Hemólisis

Cantidad de complemento


25

APLICACIONES DEL ESTUDIO DEL COMPLEMENTO EN EL LABORATORIO

La evaluación de la actividad del complemento o la cuantificación de las proteínas individuales que lo componen permiten conocer si el sistema está involucrado en el origen o en el proceso de diferentes enfermedades. Los resultados de estas pruebas pueden ayudar al diagnóstico y comprobar la eficacia del tratamiento en algunas patologías. Por ejemplo, los pacientes con una enfermedad autoinmune (ver Glosario) como Lupus Eritematoso Sistémico pueden tener niveles bajos de C3 y C4, y estos niveles del Complemento pueden seguirse como un índice de la actividad de la enfermedad. Otra situación a tener en cuenta es que la actividad de complemento, medida como CH50 (vía clásica) y AH50 (vía alterna) puede variar en los diferentes fluidos biológicos, entonces, la actividad del complemento en la sangre de pacientes con Artritis Reumatoide puede estar normal o aumentada, pero en el líquido articular la actividad se encuentra francamente disminuida. En algunas enfermedades graves bacterianas, por hongos y/o por parásitos los niveles del complemento se encuentran muy disminuidos, al igual que en algunas inmunodeficiencias (ver Glosario).


26

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

Valoración de la vía alterna del complemento en unidades hemolíticas 50 % (AH50)

FUNDAMENTO:

Los glóbulos rojos de conejo presentan un bajo contenido de ácido siálico en sus membranas, lo que permite la activación de la vía alterna del sistema complemento. Si se ponen en contacto glóbulos rojos de conejo con un suero recién extraído (fuente de complemento) se produce la lisis de los mismos por la formación del complejo de ataque a membrana, como consecuencia de la activación del complemento por la vía alterna. La hemoglobina liberada es un índice de la actividad funcional de esta vía. Efectuando una batería de tubos con diluciones del suero se puede expresar la concentración del complemento activado por vía alterna en unidades hemolíticas.

OBJETIVO: Estudiar la actividad funcional del sistema complemento por vía alterna

semicuantificando su concentración en unidades hemolíticas 50 % (AH50). MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Suspensión de glóbulos rojos de conejo al 2,5 %. Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, gelatina 0,66 %, veronal 0,053 M, EGTA 0,008

M y MgCl2 0,01 M. Buffer complemento de trabajo 1X: diluir al quinto el buffer complemento 5X. Solución Fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Pipetas automáticas y de vidrio. Pipetas Pasteur.


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Propipeta. Baño termostatizado. Tubos de hemólisis y de Khan (semimicrotubos). Centrífuga. Espectrofotómetro. PROTOCOLO: Preparar 6 diluciones seriadas razón 2 del suero a valorar en buffer complemento de

trabajo en tubos de hemólisis como se indica en el cuadro. En el tubo 6, descartar 0,2 ml de la dilución.

Tubo Buffer de

trabajo Suero o dilución del suero

Dilución

1 0,2 ml 0,2ml de suero 1/2 2 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/2 1/4 3 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/4 1/8 4 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/8 1/16 5 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/16 1/32

6 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/32 1/64

Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando 0,2 ml

de buffer de trabajo y 0,2 ml de agua destilada respectivamente. Agregar los glóbulos rojos al 2,5 % como muestra el siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 0% lisis 100% lisis Diluciones del suero (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - - Buffer de trabajo (ml) - - - - - - 0,2 - H2O destilada (ml) - - - - - - - 0,2 GR 2,5 % (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Incubar 60 min a 37 °C agitando ocasionalmente para mantener los glóbulos rojos en suspensión.


28

Agregar 2,4 ml de SF en cada tubo para frenar la reacción, excepto en el tubo control de 100 % de lisis, al que se le agregan 2,4 ml de agua destilada.

Centrifugar 5 min a 2000 rpm. Trasvasar el sobrenadante a tubos de Khan o de hemólisis para realizar la lectura. Leer la absorbancia de cada sobrenadante a una longitud de onda de 540 nm, llevando

a cero con agua destilada. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Con los datos obtenidos de absorbancia confeccionar la siguiente tabla y graficar el Log X (en el eje de las ordenadas, eje y) en función del Log [Y/(1-Y)] (en el eje de las abscisas, eje x).

X (diluciones del suero)

Y (Fracción de lisis)

[Y/(1-Y)] Log [Y/(1-Y)] Log X

1/2 1/4 1/8

1/16 1/32 1/64

En todos los casos, para obtener Y (Fracción de lisis) se calcula:

Y= Absorbancia de la dilución / Absorbancia del tubo de 100 % de lisis

Una vez graficada la recta, obtener el punto que corta al eje de las ordenadas, y a

partir de ese punto determinar las unidades hemolíticas 50 % (ver ejemplo a continuación).


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Ejemplo de cálculo de la AH50: El punto donde la recta corta al eje de las y, corresponde al 50 % de lisis. En ese

punto el log [Y/(1-Y)] es 0. log X = log K + 1/n log [Y/(1-Y)]

log X = log K + 0 En la gráfica:

log X = 1,13 X = antilog 1,13 X = 13,48

Este valor se multiplica por la inversa de la dilución inicial del suero. Suponiendo una dilución inicial de ½:

AH50 = 13,48 x 2 AH50 = 27 UH

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5

Log

X

Log [Y/(1-Y)]

Valoración de la vía alterna del complemento en unidades hemolíticas 50 % (AH 50)


30

NOTAS: El plasma es el líquido sobrenadante que se obtiene luego de centrifugar la sangre

recolectada con anticoagulante. El plasma contiene todas las proteínas de la sangre incluyendo anticuerpos, factores de la coagulación, fibrinógeno, etc.

El suero es el líquido sobrenadante que se obtiene luego de centrifugar la sangre recolectada sin anticoagulante. Contiene todas las proteínas de la sangre, incluyendo los anticuerpos, menos las que participan en el fenómeno de la coagulación.

El suero debe ser recién extraído. Sino debe mantenerse en freezer a -70 °C hasta su uso.

El agregado del EGTA inhibe la activación del complemento por la vía clásica.

MODELO DE INFORME TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 Valoración de la vía alterna del complemento en unidades hemolíticas 50 % (AH50) Objetivo: Resultado: Presentar tabla con los valores obtenidos y la recta confeccionada con algún programa de computación (Excel, GraphPad Prism, etc).

UNIDAD 3 Guía Teórico-Práctica de Inmunología El Sistema Inmune Adaptativo UNS

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REACCIONES DE INTERACCIÓN SECUNDARIA Y PRIMARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS

REACCIONES DE INTERACCION SECUNDARIA Las técnicas basadas en reacciones de interacción secundaria son más económicas

y de mayor simpleza que las que permiten visualizar una interacción primaria. Se pueden estudiar los anticuerpos presentes en una muestra mediante reacciones de precipitación o aglutinación, dependiendo del estado físico del antígeno. Las reacciones de precipitación pueden realizarse en medio líquido o gelosado.

Precipitación en medio líquido Puede ser cualitativa (zonal) o cuantitativa. Precipitación zonal rápida También conocida como Ring Test (RT) o Método del anillo. Sirve para investigar

tanto antígeno como anticuerpo. Pueden hacerse determinaciones cualitativas (investigar su presencia) o semicuantitativas (hallar concentraciones relativas).

Por sus características es la prueba rápida que se elige para evaluar la respuesta de un animal inmunizado con un antígeno soluble en el marco de un plan de inoculación (ver Glosario), con el objetivo de obtener anticuerpos específicos en dicho animal. En un microtubo, la solución antigénica se enfrenta a un suero que contiene anticuerpos específicos formándose en la interfase un anillo blanquecino.

Precipitación cuantitativa: Curva de precipitación Si en una serie de tubos, se mezclan volúmenes crecientes de antígeno soluble (de

una determinada concentración) con un volumen constante de un suero conteniendo anticuerpos específicos podemos observar al cabo de un cierto tiempo la formación de un precipitado. En esta batería de tubos, la cantidad de precipitado aumentará hasta alcanzar un máximo luego del cual disminuirá (Figura 10). Después de la incubación se separan los precipitados de los sobrenadantes por centrifugación. En los sobrenadantes se realizan


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reacciones en anillo enfrentándolos al antígeno y al anticuerpo respectivamente. En los precipitados se determina por alguna metodología adecuada la cantidad de anticuerpo presente. Con estos últimos valores y conociendo la cantidad de antígeno añadida se puede construir la siguiente curva:

Figura 10: Curva de precipitación. La forma de esta curva se explica de la siguiente manera: inicialmente, los complejos

antígeno-anticuerpo específicos se forman y precipitan a medida que se van agregando cantidades crecientes del antígeno (zona de exceso de anticuerpo). En los últimos tubos considerados, la cantidad de precipitado disminuye por la formación de complejos inmunes solubles (zona de exceso de antígeno). En la zona intermedia se encuentra la zona de equivalencia (ver Glosario). Se la define como aquella zona o punto ubicado entre las zonas de exceso de anticuerpo y la de exceso de antígeno, y en la que la precipitación es máxima.

Del análisis de la Figura 10 se desprende que la reacción de precipitación es de tipo reversible y se observa un equilibrio entre los complejos inmunes (precipitados y solubles) con antígeno y anticuerpo libres.

Ag + Ac (AgAc)(sólido)

(AgAc)(sólido) + Ag (Ag2Ac)(acuoso) + (Ag3Ac2)(acuoso) + (Ag4Ac3)(acuoso)


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El comportamiento en la zona de exceso de antígeno se explica por el fenómeno de redisolución del precipitado. En esta zona predominan los complejos solubles Ag2Ac.

A partir de esta curva es posible determinar la concentración de anticuerpos específicos en un suero. Para ello se debe primero hallar cualitativamente la zona de equivalencia mediante reacciones del anillo. En aquel tubo (o aquellos), donde las reacciones del anillo den negativas tanto frente a antígeno como frente a anticuerpo, se hace la determinación cuantitativa de anticuerpos.

Precipitación en medio gelosado Estas reacciones aprovechan la capacidad de las macromoléculas de difundir

libremente a través de geles. Dentro de las reacciones de precipitación en medio gelosado se encuentran la doble difusión bidimensional de Outcherlony, que permite la identificación de varios sistemas antígeno-anticuerpo interaccionantes y la Inmunodifusión Radial Cuantitativa, que es de utilidad para cuantificar antígenos.

Micrométodo de Outcherlony El antígeno y el anticuerpo difunden uno hacia el otro a través de un gel (agar) y el

complejo inmune que se genera precipita en forma de línea o banda opaca en la región donde las proporciones son óptimas (zona de equivalencia). Si la solución antigénica contiene más de un antígeno es posible que se observe más de una banda. La sensibilidad del método puede ser insuficiente para detectar todos los antígenos por lo que en este caso se observan la mínima cantidad de sistemas interaccionantes.

La posición de la banda entre el pocillo que contiene al antígeno y el que contiene al anticuerpo depende de la velocidad de difusión, que está en relación con el peso molecular y la concentración inicial de los reactantes. Por ejemplo, la banda formada suele ser cóncava hacia el pocillo que contiene el reactante de mayor peso molecular.

Inmunodifusión radial cuantitativa Esta técnica se estudiará en el Trabajo Práctico N° 5.


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Aglutinación para la detección de anticuerpos De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de

aglutinación para la detección de anticuerpos pueden clasificarse como: Reacciones de aglutinación directa. Reacciones de aglutinación indirecta o pasiva.

Las reacciones de aglutinación directa se basan en el empleo de una partícula aglutinante como antígeno. Como ejemplos se pueden mencionar:

Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica Bacterias

(Brucella abortus) Huddleson Búsqueda de anticuerpos

anti-B. abortus en suero Parásitos

(Trypanosoma cruzi) Aglutinación directa-Chagas Búsqueda de anticuerpos

anti-T. cruzi en suero Parásitos

(Toxoplasma gondii) Aglutinación directa-

Toxoplasmosis Búsqueda de anticuerpos anti-T. gondii en suero

Las reacciones de aglutinación indirecta o pasiva se basan en el empleo de una

partícula aglutinante inmunológicamente inerte a la cual se le ha unido un antígeno soluble. Como ejemplos se pueden mencionar:

Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica Glóbulos rojos + lisado de T. cruzi

HAI-Chagas Búsqueda de anticuerpos anti-T. cruzi en suero

Glóbulos rojos + lisado de T. gondii

HAI-Toxoplasmosis Búsqueda de anticuerpos anti-T. gondii en suero

Látex + glicoproteína gp 120

Búsqueda de anticuerpos anti-HIV en suero

Látex + HBsAg

Búsqueda de anticuerpos anti-HBsAg en suero

Látex + estreptolisina

ASTO Búsqueda de anticuerpos anti estreptolisina O en suero


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Los soportes inertes empleados para estas reacciones pueden ser glóbulos rojos (hemaglutinación), partículas de látex o de gelatina. Para la preparación de este tipo de reactivos es necesaria una etapa de incubación, entre la partícula inmunológicamente inerte y el antígeno soluble sensibilizante, que permitirá la unión del mismo a las partículas. La fijación se obtiene por mezcla directa o previo acondicionamiento de la superficie de la partícula. En el caso de los glóbulos rojos el acondicionamiento se logra por incubación con ácido tánico o tricloruro de cromo.

El anticuerpo a investigar por aglutinación directa o indirecta debe ser por lo menos funcionalmente bivalente. Aquellos anticuerpos que poseen un solo paratope (ver Glosario) funcional de alta afinidad se denominan anticuerpos incompletos o bloqueantes (ver Glosario) y no generan reacciones de interacción secundaria cuando se enfrentan a su antígeno específico. Aparecen en mayor concentración relativa en enfermedades crónicas causadas por antígenos particulados como la brucelosis, la triquinosis y la gonococcia. Para poder evidenciarlos utilizando reacciones de interacción secundaria es necesario recurrir a otras pruebas como la de la antiglobulina, conocida como reacción de Coombs (ver Glosario), la que se estudiará en el Trabajo Práctico N° 7.

La aglutinación puede realizarse en forma cualitativa o semicuantitativa. La primera es utilizada para investigar la presencia de anticuerpos. Por ejemplo: búsqueda de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en un suero. La formación de grumos indica especificidad del sistema antígeno-anticuerpo reaccionante. Los métodos semicuantitativos determinan cuál es la máxima dilución del suero analizado capaz de aglutinar al antígeno específico. Es importante destacar que no es posible determinar la concentración absoluta de anticuerpos sino que se determina un título (ver Glosario). Para ello se incuban diluciones seriadas de un suero con cantidades constantes de antígeno. El título se expresa como la inversa de la máxima dilución del suero que produce aglutinación visible. Los métodos semicuantitativos efectuados en forma seriada permiten seguir la respuesta inmune experimental o la evolución de una infección.

La determinación de anticuerpos por aglutinación puede hacerse usando reacciones de lectura lenta o rápida. En el primer caso se mezclan diferentes diluciones del suero a valorar con suspensiones diluidas del antígeno. A continuación, una de las posibilidades es incubar los tubos de reacción a 37 °C durante 2 horas y luego dejarlos en heladera hasta el día siguiente para que la reacción se complete. Para determinar el título se busca el último


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tubo de la serie que presenta aglutinación. En el segundo caso, la reacción se efectúa en placa, mezclando volúmenes decrecientes del suero a investigar (sin diluir) con un volumen constante de antígeno. El antígeno empleado es más concentrado que el utilizado en la aglutinación lenta y la lectura del resultado se efectúa entre los 3 y 5 minutos. En el caso del sistema Brucella abortus/anti-Brucella abortus, el título se expresa por convención.

Al valorar un suero, la disminución de anticuerpos por dilución hace que disminuya la aglutinación hasta desaparecer lo que permite obtener el título. En algunos sueros se observa un comportamiento particular, caracterizado por la ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie, donde la concentración de anticuerpo es máxima, y con aglutinación a diluciones mayores (Figura 11). Este fenómeno se denomina prozona (ver Glosario), y es propio de la aglutinación. Al existir un exceso de anticuerpos con respecto a los determinantes antigénicos, es muy poco probable que los dos sitios activos del anticuerpo se unan a determinantes antigénicos de dos moléculas de antígeno diferentes y formen la red. Cuando ocurre el fenómeno de prozona se debe repetir el procedimiento pero empleando una dilución del suero a investigar. Para determinar el título se observa cuál es la máxima dilución que produce aglutinación visible. El título en este caso estará dado por la inversa de la máxima dilución aglutinante multiplicada por el factor de la dilución realizada.

Figura 11: El fenómeno de prozona.

Aglutinación con y sin 2-mercaptoetanol (2-ME) La reacción de aglutinación puede realizarse en ausencia o presencia de 2-ME lo que

permite determinar qué clase de anticuerpo está produciendo dicha reacción. Cuando se


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realiza la titulación de un suero por aglutinación en ausencia de 2-ME el título corresponde a la actividad aglutinante de la IgM e IgG. Si, siguiendo el mismo protocolo, se realiza la titulación en presencia de 2-ME, éste produce una reducción de la IgM pentamérica. Como la IgM monomérica resultante no es aglutinante, el título obtenido en este caso corresponderá exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. La caída del título de un suero obtenido por aglutinación con 2-ME respecto al obtenido sin 2-ME es indicativa de la presencia de IgM específica. El hallazgo de esta IgM es de importancia en muchos casos porque es indicio de infección aguda.

Reacciones cruzadas En ciertas ocasiones puede ocurrir que un anticuerpo generado frente a un antígeno

determinado reaccione con otro antígeno que comparte algunos determinantes antigénicos con el antígeno inductor de la respuesta inmune. Esto se conoce como reactividad cruzada (ver Glosario) y es importante tenerla en cuenta ya que puede conducir a resultados falsos positivos cuando se está analizando la presencia de anticuerpos específicos en una muestra.

REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA

ELISA para la detección de anticuerpos Los diseños de ELISA para la detección de anticuerpos pueden ser: competitivos o

no competitivos. En un ELISA competitivo para la determinación de anticuerpos, el antígeno se

encuentra fijado a un soporte. Luego se le agrega la muestra (en la que se desea investigar anticuerpos) junto con un anticuerpo anti-antígeno marcado con una enzima. Ambos anticuerpos, el de la muestra y el marcado, compiten por su unión al antígeno fijado. Cuanto mayor sea la concentración del anticuerpo sin marca, menor será la cantidad de anticuerpo marcado que se unirá al antígeno fijado y en consecuencia, menor la medida de absorbancia detectada.

El diseño más simple de un ELISA no competitivo (o de amplificación) consiste en unir a una fase sólida el antígeno de interés, el que será reconocido por los anticuerpos de


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la muestra. Una vez lavado el material no unido, los anticuerpos son detectados mediante un conjugado anti-inmunoglobulina marcada con enzima obtenido en una especie diferente (Figura 12A). Este diseño experimental es el que se utilizará en el Trabajo Práctico.

Un diseño alternativo, como el mostrado en la Figura 12B, es útil cuando el antígeno no se une eficientemente a la fase sólida debido a su naturaleza química u otros factores.

Figura 12: Distintos diseños de ELISA para la medición de anticuerpos.

Recordando los pasos de la técnica (ver Trabajo Práctico N° 1): Inmovilización del inmunoreactante (antígeno o, anticuerpo de captura y luego

antígeno) en la fase sólida (sensibilización). Incubación con la muestra (anticuerpo) para permitir que ésta reaccione con el

inmunoreactante inmovilizado. Amplificación o modulación por medio del empleo de un conjugado enzimático

(esta etapa puede comprender, en realidad, más de un paso). El imnunoreactivo usado para sensibilizar puede ser soluble (proteínas, hidratos de

carbono, ácidos nucleicos) o particulado (células). Para este último caso se debe tratar previamente la placa con polilisina.

Escogiendo el conjugado adecuado es posible detectar distintos isotipos de anticuerpos contra un antígeno en particular.

Los ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos, según el origen del antígeno utilizado para la sensibilización de la fase sólida se clasifican en ELISA de primera, segunda o tercera generación.

A B Anti-Inmunoglobulina marcada con enzima

Anticuerpo en estudio

Antígeno


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ELISA de primera generación Utilizan antígenos procedentes de lisados de parásitos, bacterias o virus cultivados

en células. Su desventaja son los problemas de especificidad por reacciones cruzadas con otras enfermedades parasitarias, bacterianas o contaminantes celulares.

ELISA de segunda generación Emplean antígenos recombinantes originados al insertar una región determinada del

genoma de un parásito, bacteria o virus en vectores biológicos. Así pueden obtenerse proteínas antigénicas en grandes cantidades. La especificidad no es totalmente óptima pues pueden existir reacciones inespecíficas contra determinantes antigénicos del vector.

ELISA de tercera generación Utilizan como antígenos péptidos sintéticos. Conociendo la estructura de la proteína

antigénica se construye, in vitro, una secuencia lineal que se emplea para la sensibilización de la placa.

Actualmente las mejores técnicas de ELISA utilizan para fijar a la placa mezclas de antígenos provenientes de diferentes fuentes lográndose así la máxima sensibilidad y especificidad.

Obtención de los resultados La lectura de resultados cualitativos (presencia/ausencia de anticuerpos) puede

realizarse de diversas formas, como se explicó en el Trabajo Práctico N° 1. Si el objetivo es la semicuantificación de anticuerpos específicos en un suero se

pueden emplear diversas metodologías: Titulación a punto final. Medida de la absorbancia a dilución simple. Título de un suero en unidades arbitrarias por comparación con un suero patrón.

El más utilizado es el método de titulación a punto final. Según esta metodología se debe graficar el logaritmo de la dilución del suero versus la absorbancia obtenida (Figura 13). El título del suero investigado se obtiene leyendo por curva cual es la dilución que produce el 50 % de la absorbancia máxima del sistema. Este método tiene la ventaja de


40

que al analizar la curva de titulación de cada suero, puede aplicarse para sueros con bajo o alto título.

-6 -5 -4 -3 -2 -1 00.00

0.25

0.50

0.75

log dilución

Ab

so

rban

cia

a 4

90 n

m

Figura 13: Gráfico del logaritmo de la dilución del suero versus la absorbancia obtenida

para el método de titulación a punto final. También se puede obtener la concentración de anticuerpos específicos mediante un

ELISA cuantitativo. Para ello es necesaria la construcción en paralelo de una curva de calibrado con testigos de concentración conocida.

50 %


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TRABAJO PRÁCTICO N° 3

Primera parte Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa

(ARP) FUNDAMENTO:

Si se pone en contacto una suspensión de bacterias Brucella abortus de una determinada concentración con diferentes alícuotas de un suero en el cual se quiere investigar la presencia de anticuerpos específicos anti-Brucella abortus es posible determinar el título de estos anticuerpos. Este título está dado por la menor alícuota del suero en la que se observa aglutinación, y en este caso se establece por convención. OBJETIVO: Semicuantificar anticuerpos anti-Brucella abortus en un suero.

MUESTRA A ANALIZAR: Suero de conejo. REACTIVOS Y MATERIALES: Antígeno: suspensión de microorganismos 100.000 millones/ml de Brucella abortus en

NaCl 12 % con colorante azul de metileno u otro. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Pipetas automáticas y tips. Varillas. Portaobjetos. PROTOCOLO: Colocar en portaobjetos 80, 40, 20, 10 y 5 µl de suero a investigar y 40 µl de SF como

control negativo. Agregar 30 µl de antígeno a dichas alícuotas.


42

Mezclar con varilla. Observar entre los 3 y 5 min si hay o no aglutinación y en qué alícuota. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Según las alícuotas usadas en este protocolo los títulos corresponden a valores de 20, 40, 80, 160 y 320. Son títulos establecidos por convención. Los resultados obtenidos en la titulación en placa se aproximan a los obtenidos en la prueba en tubo, considerando las siguientes diluciones:

Volumen de suero (ml) Dilución aproximada en la prueba en tubo 0,08 1/20 0,04 1/40 0,02 1/80 0,01 1/160

0,005 1/320 NOTAS: El colorante agregado a la suspensión bacteriana mejora la visualización e impide la

proliferación bacteriana. Tener en cuenta al realizar este procedimiento el posible fenómeno de prozona. Esta técnica permite evaluar la respuesta de un animal de experimentación durante la

inmunización con un antígeno particulado. Cuando el sistema evaluado es distinto al de Brucella abortus/anti-Brucella abortus, el

título se expresa como la inversa de la máxima dilución aglutinante.


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Segunda parte Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo

(ALT) FUNDAMENTO:

Si se efectúan diluciones seriadas de un suero en el cual se quiere investigar la presencia de anticuerpos específicos anti-Brucella abortus y se agrega una volumen constante de una suspensión de bacterias Brucella abortus de una determinada concentración es posible determinar el título de esos anticuerpos. Este título está dado por la inversa de la mayor dilución del suero en la que se observa aglutinación. OBJETIVO: Semicuantificar anticuerpos anti-Brucella abortus en un suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero de conejo. REACTIVOS Y MATERIALES: Antígeno: suspensión de microorganismos 5000 millones/ml de Brucella abortus en

solución salina tamponada. Solución salina tamponada: NaCl 0,15 M; fosfato monopotásico 0,01 M, pH 7,2. Tubos de hemólisis. Pipetas de 1 y 5 ml. Gradillas. Baño de agua. PROTOCOLO: Preparar una serie de 10 tubos de hemólisis. Colocar en cada uno de ellos 0,5 ml de solución salina tamponada. Al primero agregar 0,5 ml del suero a investigar. Mezclar. Transferir 0,5 ml de la mezcla al segundo tubo.


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Proceder de este modo con los siguientes tubos hasta el penúltimo del que se extraen 0,5 ml y se desechan.

El último tubo lleva sólo solución salina tamponada y se usa como control. Agregar a todos los tubos 0,5 ml de la suspensión antigénica. De este modo quedan realizadas diluciones “razón” 2 a partir del primero cuya dilución

es 1/4. Mezclar e incubar en baño de agua a 37 °C durante 15 min. Reposar 24 h en heladera. Resuspender suavemente. Observar y determinar la máxima dilución aglutinante. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Se expresa el título, que está dado por la inversa de la máxima dilución aglutinante.

NOTA: También puede realizarse la lectura el mismo día en que se efectúa la determinación.

Para ello, luego de la incubación en baño, se centrifugan los tubos a 1000 rpm durante 1 min y se determina el título.

Tercera parte Identificación y semicuantificación de anticuerpos por

hemaglutinación indirecta (HAI) FUNDAMENTO:

La hemaglutinación indirecta (HAI) se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (en este caso anti-Trypanosoma cruzi) de producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero también existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) que son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas especies. Su posible presencia se investiga enfrentando el suero con glóbulos rojos no sensibilizados.


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MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Reconstituyente HAI: solución fisiológica tamponada, pH 7,0. Antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensibilizados con antígenos

citoplasmáticos de T. cruzi rehidratado en reconstituyente HAI. Glóbulos rojos de carnero no sensibilizados: suspensión al 1 % para control de

heterofilia. Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH 7,5 con colorante inerte. Solución proteica: solución de albúmina bovina al 10 %. Diluyente de suero HAI: agregar 0,2 ml de solución proteica cada 10 ml de buffer HAI. Control positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos anti-T. cruzi. Control negativo: suero inactivado no reactivo. Policubetas. Ansas. Microgoteros. Microdilutores. Pipetas automáticas y tips.

TÉCNICA DE SCREENING OBJETIVO: Determinar la posible presencia de anticuerpos anti-T. cruzi en un suero. PROTOCOLO: Colocar una gota de diluyente de sueros HAI con microgotero de 25 l en todos los

pocillos a utilizar de la policubeta (un pocillo por cada muestra). Sumergir un ansa limpia en la muestra. Colocar el ansa cargada en el pocillo que contiene el diluyente de sueros HAI, rotando

la misma para obtener un buen mezclado y distribuir la gota sobre todo el fondo del pocillo.


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Retirar el ansa y secarla con papel absorbente, lavar en dos recipientes con agua destilada.

Secar nuevamente con papel absorbente. Proceder de la misma manera para cada nueva muestra. Agregar con microgotero de 25 l, una gota de antígeno HAI reconstituido y

homogeneizado a cada pocillo. Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales. Cubrir con cinta adhesiva transparente para evitar evaporaciones y dejar reposar, al

resguardo de vibraciones 90 min a temperatura ambiente. Procesar simultáneamente un control positivo y un control negativo utilizándolos de la

misma manera que la muestra. Efectuar la lectura. RESULTADOS:

No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón en el fondo del pocillo. Reactivo: presencia de una película o manto en el fondo del pocillo.

NOTA: Los antígenos particulados constituyen mezclas heterogéneas que sedimentan por lo

que es de importancia homogeneizarlas adecuadamente al momento de tomar una alícuota. Por esto tener en cuenta homogeneizar el Antígeno HAI por agitación evitando la formación de espuma.

Un suero reactivo siempre debe ser confirmado para discriminarlo de un falso positivo, debido a la presencia de anticuerpos heterófilos. Estos últimos reaccionan contra determinantes antigénicos presentes en la membrana de los glóbulos rojos soporte y pueden encontrarse en el suero de individuos normales. Por esta razón es necesario un control de heterofilia que se realiza en la técnica de titulación al enfrentar las diluciones ½ y ¼ del suero con glóbulos rojos no sensibilizados.


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TÉCNICA DE TITULACIÓN OBJETIVO: Determinar y semicuantificar anticuerpos anti-T. cruzi en un suero. PROTOCOLO: Colocar una gota con microgotero de 25 l de diluyente de sueros HAI en todos los

pocillos a usar de la policubeta. Tomar una alícuota del suero con microdilutor de 25 l. Colocar el microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para lograr

una correcta dilución. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilución 1/2), pasando el

microdilutor al pocillo siguiente y así sucesivamente hasta la dilución que se desee investigar, rotando en cada paso el microdilutor por lo menos 10 veces. Descartar los últimos 25 l.

Si se emplea micropipeta automática de 25 l para la toma y/o dilución de la muestra homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 l de pocillo a pocillo hasta la dilución que se desee investigar. Descartar los últimos 25 l.

Colocar 25 l de glóbulos rojos no sensibilizados en los pocillos que contienen las diluciones 1/2 y 1/4 del suero, para control de heterofilia.

En el resto de los pocillos agregar 25 l de antígeno HAI. Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales. Cubrir con cinta adhesiva transparente para evitar evaporaciones y dejar reposar, al

resguardo de vibraciones 90 min a temperatura ambiente. Efectuar la lectura. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón en el fondo del pocillo. Reactivo: presencia de una película o manto que cubre el 50 % o más del fondo del

pocillo. El título se expresa como la inversa de la mayor dilución del suero que da reactivo.


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NOTAS: Tener en cuenta homogeneizar el Antígeno HAI y los glóbulos rojos no sensibilizados

por agitación, evitando la formación de espuma, antes de usarlos. Si las diluciones 1/2 y 1/4 dieran reactivas, indicarían la presencia de anticuerpos

heterófilos (heterofilia). Por lo tanto la determinación debe repetirse, previo tratamiento del suero incógnita con glóbulos rojos no sensibilizados con la finalidad de adsorber los anticuerpos heterófilos.

La presencia de IgM específica característica del período agudo de la enfermedad se investiga empleando la técnica de titulación previo tratamiento del suero con 2-Mercaptoetanol (2-ME). En una infección aguda, los sueros tratados con 2-ME presentan una caída del título en por lo menos dos diluciones comparados con los mismos sueros sin tratar.

Cuarta parte Investigación de anticuerpos por ELISA

FUNDAMENTO:

La interacción del anticuerpo presente en la muestra a investigar con un antígeno específico inmovilizado sobre un soporte sólido, puede ponerse en evidencia por medio de un segundo anticuerpo, específico para el anticuerpo presente en la muestra, conjugado con una enzima cuya actividad produce una reacción de color visible luego del agregado del sustrato cromogénico correspondiente. OBJETIVO: Investigación cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en un suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Placas de poliestireno sensibilizadas con antígenos recombinantes de T. cruzi.


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Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas obtenidas en cabra conjugadas con peroxidasa.

Diluyente de muestras: albúmina bovina en solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos, pH 7,2.

Sustrato (revelador A): peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer citrato 50 mmol/l, pH 3,2.

Cromógeno (revelador B): Tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en HCl 0,1 N. Buffer de lavado concentrado: NaCl 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y

tensioactivo no iónico 0,1 g/l (dilución de trabajo: 1 parte de buffer de lavado concentrado más 4 partes de agua destilada).

H2SO4 2 N. Control positivo: suero inactivado reactivo conteniendo anticuerpos anti-T. cruzi. Control negativo: suero inactivado no reactivo. Pipetas automáticas y tips. PROTOCOLO: En los pocillos de la policubeta a utilizar colocar: Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. Cubrir la policubeta con cinta adhesiva para evitar la evaporación. Incubar en estufa a 37 °C durante 30 min. *Aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo, desechándolos en un recipiente que

contenga hipoclorito de sodio al 5 %. **Lavar 5 veces durante 2 min con buffer de lavado (300 μl/pocillo cada vez). ***Al finalizar el último lavado secar cuidadosamente la policubeta, invirtiéndola sobre

papel absorbente.

Pocillos 1 2 3

Diluyente de muestras 200 μl 200 μl 200 μl

Control (+) 10 μl

Control (-) 10 μl

Suero desconocido 10 μl


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Agregar una gota del conjugado (50 μl en caso de emplear micropipeta) a todos los pocillos.

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 min en estufa a 37 °C. Repetir los pasos *, ** y ***. Agregar una gota de revelador A (50 μl en caso de emplear micropipeta) a todos los

pocillos. Agregar una gota de revelador B (ídem al anterior) a todos los pocillos. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s. Incubar 30 min a temperatura ambiente. Agregar a todos los pocillos una gota (o bien 50 μl con micropipeta) de H2SO4 2 N

para frenar la reacción. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de policubeta durante 10 s. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

La lectura de los resultados puede realizarse empleando un espectrofotómetro a 450 nm o bien a simple vista por comparación con los controles positivos y negativos.

Interpretación visual (es la que se realizará en este caso): Color desarrollado por la

muestra Lectura Resultado

< al control negativo Visual No reactivo ≥ al control positivo Visual Reactivo

> al control negativo (ligeramente tenue)

Espectrofotométrica Reactivo o no reactivo según el valor de corte

Con instrumental óptico: En este caso realizar en paralelo un blanco de reactivos para llevar el

espectrofotómetro a cero. El mismo se procesa de la misma forma omitiendo el agregado de la muestra. La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T. cruzi se determina relacionando la absorbancia de la muestra con el valor del cut off.

Cut off = CN + 0,300 donde CN es el promedio de las lecturas de absorbancia del Control Negativo que se procesa por triplicado.


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NOTAS: Todos los reactivos y sueros a investigar deben estar a temperatura ambiente antes de

iniciar la prueba. La actividad de la enzima peroxidasa se pone de manifiesto por la aparición de un color

netamente amarillo. El color desarrollado es estable durante 30 min.

MODELO DE INFORME TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 Primera parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa (ARP). Objetivo: Sistema: Resultado: Título: ... Segunda parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo (ALT). Objetivo: Sistema: Resultado: Título: ... Tercera parte: Identificación y semicuantificación de anticuerpos por hemaglutinación indirecta (HAI).

Técnica de screening: Objetivo: Sistema: Resultado: Ej. Suero 1: no reactivo.

Técnica de titulación: Objetivo: Sistema: Resultado: Ej. Suero 2: Título: … Cuarta parte: Investigación de anticuerpos por ELISA. Objetivo: Sistema: Resultado: Interpretación:


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IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES CELULARES POR INMUNOFLUORESCENCIA

Entre las técnicas de inmunomarcación encontramos aquellas que utilizan anticuerpos

que tienen acoplado una sustancia fluorescente o fluorocromo (ver Glosario). Se usan para detectar antígenos en tejidos (Inmunohistoquímica), antígenos en células en suspensión o fijadas a portaobjetos (Inmunocitoquímica) y también para la detección de anticuerpos.

Cuando la marcación con una sustancia fluorescente se realiza sobre cortes de tejidos (impronta) se emplea para la visualización un microscopio de fluorescencia. Cuando la marcación se realiza sobre células en suspensión se emplea un citómetro de flujo, o bien un microscopio de fluorescencia si luego de la marcación se colocan esas células sobre un portaobjetos.

La detección de antígenos puede hacerse por Inmunofluorescencia Directa (IFD, ver Glosario) o Inmunofluorescencia Indirecta (IFI, ver Glosario), según sea el primer o segundo anticuerpo el que está conjugado con el fluorocromo (Figura 14). En cualquier caso son imprescindibles los controles positivos y negativos para cada prueba.

Figura 14: Inmunofluorescencia directa (A) e indirecta (B). Los anticuerpos marcados con

una molécula fluorescente pueden utilizarse para detectar la presencia de antígenos en células y tejidos.

Particularmente, en este Trabajo Práctico se hará referencia al estudio de los linfocitos de sangre periférica.


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AISLAMIENTO DE POBLACIONES CELULARES SANGUÍNEAS En muchas ocasiones, para poder estudiar las células del sistema inmune es

conveniente aislar las distintas poblaciones. En el caso de los linfocitos es adecuado obtener previamente una fracción enriquecida en células mononucleares sin la presencia de eritrocitos y granulocitos, ya que éstos últimos liberan sustancias tóxicas que pueden producir alteraciones celulares.

La densidad de flotación es un parámetro útil para lograr la separación de células mononucleares de sangre humana total. Una de las maneras de conseguir esta separación empleando esta propiedad es usando un gradiente de Ficoll-Hypaque (ver Glosario) de densidad 1,077 g/ml. El procedimiento para lograr este gradiente de densidad consiste en diluir un volumen de sangre entera con un volumen de solución fisiológica. Luego se coloca en un tubo de centrífuga el Ficoll-Hypaque y sobre éste la sangre diluida, previamente homogeneizada, formando dos fases (Figura 15). Se centrifuga y se separa la interfase entre el Hypaque y el plasma diluido, que contiene la fracción enriquecida en células mononucleares en la que se pueden estudiar los linfocitos.

Figura 15: Obtención de células mononucleares totales de sangre periférica según su

densidad. Antes de realizar la purificación o el enriquecimiento de poblaciones celulares

inmunocompetentes se deben considerar varios aspectos: el órgano donde existe el mayor porcentaje de las células de interés, la accesibilidad de dicho órgano (en general cuando se


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trabaja con seres humanos se prefiere sangre periférica), la menor contaminación con otras células, etc.

MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA PARA EL ESTUDIO DE POBLACIONES CELULARES

La incubación de células con un anticuerpo monoclonal específico marcado con un fluorocromo dirigido contra una molécula expresada en su membrana; o bien con un anticuerpo sin marcar y luego detectando la unión formada con un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón fluorescente permite el estudio de marcadores fenotípicos.

Los conceptos básicos sobre microscopía de fluorescencia se han desarrollado en el apéndice correspondiente (ver Apéndice III). Los pasos de las técnicas de inmunofluorescencia que utilizan un microscopio de fluorescencia se muestran en las Figuras 16 y 17.

Cabe mencionar que cuando se quiere aplicar la técnica de inmunofluorescencia a células en suspensión existen dos alternativas. En una de ellas se fijan las células a un portaobjeto y luego se realiza la inmunomarcación (Figuras 16 y 17). Otra forma consiste en la incubación de las células en suspensión con los anticuerpos específicos y luego para la observación microscópica se las coloca entre porta y cubreobjetos. Esta última opción se empleará en este Trabajo Práctico.

Figura 16: Inmunofluorescencia directa.


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Figura 17: Inmunofluorescencia indirecta.

CITOMETRÍA DE FLUJO En la actualidad, la técnica de inmunofluorescencia más utilizada para el análisis de

características morfológicas celulares, así como la expresión de proteínas, el ciclo celular, la activación celular, etc., es la citometría de flujo. El citómetro de flujo (Figura 18) es un instrumento capaz de detectar un mínimo de tres señales fluorescentes de diversos colores, procedentes de células en suspensión, por lo que permite analizar simultáneamente la expresión de muchas moléculas distintas por parte de una única célula.


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Figura 18: Esquema de un citómetro de flujo.

Además de detectar las señales fluorescentes, los citómetros de flujo también miden la dispersión hacia adelante y hacia los lados procedentes de las células, lo que da información de su tamaño y complejidad interna, respectivamente (Figura 19). Esta


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información suele utilizarse para distinguir los distintos tipos celulares. Por ejemplo, en comparación con los linfocitos, los neutrófilos dan lugar a una dispersión lateral mayor debido a sus gránulos citoplasmáticos, y los monocitos provocan una dispersión mayor hacia adelante debido a su tamaño.

Figura 19: Dispersión de la luz hacia adelante y angular.

Para su análisis, la suspensión celular en estudio se incuba con una sonda fluorescente. En el citómetro de flujo, la suspensión fluye por una cámara rodeada por un líquido acuoso donde las células pasan de una en una a través de un haz incidente generado por un láser. De la incidencia de esta luz sobre cada célula se obtienen los parámetros morfológicos de tamaño y complejidad celular. El detector frontal (FSC, Foward Scatter) se halla en línea con el láser y en él se obtiene, con el paso de las células, una penumbra que es proporcional al tamaño de éstas. Por otra parte, como las células no son opacas, la luz que entra al citoplasma se refracta por toda la superficie celular en forma proporcional a la granularidad citoplasmática. Esta refracción es recogida a 90° por el detector lateral (SSC, Side Scatter). La fluorescencia resultante de la excitación de los fluorocromos con la luz láser se recoge en tres detectores de fluorescencia (FL1, FL2 y FL3). La cantidad de fluorescencia unida o incorporada a cada célula se interpretará en función de lo que se haya marcado: proteínas, lípidos, azúcares, iones o ADN. Cabe aclarar que todas estas medidas son recogidas por detectores específicos y convertidas en impulsos eléctricos, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en un ordenador. A este proceso se lo conoce como adquisición (ver Glosario) de datos de la muestra.


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En particular, el estudio de proteínas expresadas en la membrana de linfocitos circulantes permite determinar distintos subtipos celulares. Para ello las células linfoides se incuban con anticuerpos monoclonales acoplados a diferentes sustancias fluorescentes, que quedarán adheridos a la superficie celular. Luego se recurre a un citómetro de flujo que tenga el láser adecuado para excitar los distintos fluorocromos utilizados.

Es posible también estudiar moléculas intracitoplasmáticas. Para ello se debe realizar la permeabilización transitoria de las células, de modo que los anticuerpos marcados puedan atravesar la membrana plasmática. Además de anticuerpos, pueden usarse otro tipo de sondas fluorescentes que censan estrés oxidativo o se unen al ADN y permiten el estudio del ciclo celular.

Adquisición de datos e interpretación de resultados La adquisición de los datos es la visualización en tiempo real y por medio de

citogramas de los parámetros de dispersión y fluorescencia que presentan las células de la muestra a analizar y que pueden ser almacenados para su posterior análisis. Durante la adquisición se puede seleccionar un conjunto de células a través de regiones de exclusión llamadas ‘gate’ o ‘ventanas’ (ver Glosario), de este modo se analiza o simplemente se visualiza el comportamiento físico y antigénico de la población elegida. Antes de la adquisición de los datos de las muestras debe corroborarse que estén colocadas las condiciones de calibración del equipo.

Los datos adquiridos por el programa del citómetro de flujo pueden ser volcados en una variedad de gráficos (citogramas) con distinta utilidad: gráfico de puntos (Dot Plot) (Figura 20A), histograma (Figura 20B), gráfico de contornos (Figura 20C), gráfico de densidad (Density Plot) (Figura 20D), y representaciones 3D (Figuras 20E y 20F).

De cada gráfico se pueden tener los valores estadísticos para el análisis y debe considerarse si se trata de la población total o de una región (gate). Estos valores estadísticos pueden ser el número de eventos (número de células), porcentaje de células, media de intensidad de fluorescencia, etc.


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Figura 20: Representaciones gráficas de datos citométricos. Los leucocitos pueden diferenciarse de acuerdo a su tamaño y su complejidad celular

(Figura 21A). Cuando se desea estudiar algunas de las células que forman parte del sistema inmune, como los linfocitos, se puede dibujar un gate (Figura 21B) para procesar y mostrar los datos registrados de la fluorescencia de los distintos fluorocromos exclusivamente de esta población celular.

SSC

FSC

ASS

C

FSC

CIntensidad de Fluorescencia (FL1)

N

de

Cé

lula

s

B

N

de

Cé

lula

s

E

SSC

FSC

D

F


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Figura 21: A. Gráfico de puntos de tamaño celular versus complejidad celular. B. Selección

de una región o gate. Es importante determinar la marcación inespecífica de cada anticuerpo. Para esto, la

muestra en estudio se incuba con un anticuerpo que no reconoce ningún epitope en las células a marcar, que es del mismo isotipo que el anticuerpo específico que tiene acoplado el fluorocromo, y que también está acoplado al mismo fluorocromo (control de isotipo). Esto nos indica la fluorescencia de una población que es negativa para el componente celular en estudio. Por ejemplo, si el anti-CD3 FITC que se usa para la marcación de una molécula de superficie es una IgG1, el control de la marcación inespecífica de ese anticuerpo se realiza con un anticuerpo que debe ser una IgG1 acoplada a FITC pero que no reconozca a la molécula CD3.

Cuando se estudian simultáneamente dos parámetros de fluorescencia pueden representarse por un gráfico de puntos o dot plot (Figura 22A). El patrón de fluorescencia obtenido con los controles de isotipo correspondientes, permite el trazado de cuadrantes para establecer el límite NEGATIVO-POSITIVO necesario en las lecturas de las muestras. Una vez establecidos los cuadrantes, se continúa con la adquisición de las marcaciones específicas de las muestras.

En el estudio de expresión de proteínas, la intensidad de fluorescencia de cada una de las células en la muestra puede ser representada mediante un histograma (Figura 22B). En este caso el control de isotipo permite discriminar entre una población negativa y una positiva para un cierto parámetro.


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Figura 22: A. Gráfica de puntos de dos parámetros de fluorescencia, FL1 y FL2. B.

Histograma de fluorescencia para FL3. La citometría de flujo posee algunas ventajas en relación a la microscopia de

fluorescencia. Entre esas ventajas encontramos que pueden emplearse múltiples marcajes, analizar un elevado número de partículas en corto tiempo, analizar poblaciones celulares o epitopes y también permite cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un determinado grupo celular. Es una metodología que aporta mayor objetividad y sensibilidad, pero como emplea una suspensión celular no brinda información sobre la arquitectura de los tejidos y la interacción entre células.

Cuadro 1: Algunos marcadores de superficie de células del sistema inmune.

Marcadores de superficie Células que expresan ese marcador CD19, CD20 Linfocitos B CD3, CD28 Linfocitos T, células NKT

CD4 Linfocitos T helper CD8 Linfocitos T citotóxicos CD56 Células NK, células NKT CD14 Monocitos CD16 Células NK, células NKT, linfocitos T citotóxicos, monocitos,

neutrófilos CD25 Linfocitos T y B activados, células NK y NKT activadas


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Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia indirecta

FUNDAMENTO:

La separación de una fracción enriquecida en células mononucleares a través de un gradiente de densidad, y posterior marcación indirecta empleando una técnica inmunofluorescente, permite la identificación de células inmunocompetentes que presentan el marcador CD4 en la membrana celular.

OBJETIVO: Identificar LT colaboradores mediante la presencia del marcador fenotípico CD4 en su

membrana. MUESTRA A ANALIZAR: Sangre humana recolectada con heparina o EDTA. REACTIVOS Y MATERIALES:

Ficoll-Hypaque, densidad 1, 077 g/ml. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Buffer PBS, pH 7,4. Anticuerpo monoclonal anti-CD4 humano obtenido en ratón. Conjugado: Fragmento F(ab´)2 anti-inmunoglobulina de ratón marcado con isotiocianato

de fluoresceína obtenido en conejo. Tubos de centrifuga plásticos. Pipetas de vidrio. Pipetas Pasteur. Pipetas automáticas y tips. Medio de montaje: glicerina tamponada con azida sódica. Esmalte de uñas incoloro. Portaobjetos.


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Cubreobjetos. Centrifuga. Heladera. Agitador Vortex. Microscopio de fluorescencia. PROTOCOLO: Diluir un volumen de sangre entera con un volumen de SF. Mezclar. Colocar en un tubo de centrífuga 1 ml de Ficoll-Hypaque y depositar sobre él 2 ml de

sangre diluida homogeneizada, por las paredes, lenta y cuidadosamente, formando dos fases.

Centrifugar a 1700 rpm a temperatura ambiente durante 20 min. Transferir con pipeta Pasteur, con mucho cuidado y de una sola vez, la interfase entre

el Hypaque y el plasma diluido a un tubo de centrífuga de plástico. Descartar el resto. Agregar 2 ml de solución de PBS y resuspender con la misma pipeta. Centrifugar a 2100 rpm durante 10 min. Pipetear el sobrenadante y descartar. Resuspender el sedimento con agitador Vortex, en la gota remanente. Repetir este lavado dos veces. Retirar el sobrenadante mediante una sacudida y secar cuidadosamente con papel

absorbente, de inmediato colocar el tubo en posición vertical. Agregar sobre el sedimento 15 l de anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 humano. Mezclar perfectamente con agitador Vortex. Incubar a 4 °C durante 30 min. *Resuspender el sedimento con el agitador, agregar 0,5 ml de buffer PBS. Centrifugar

a 2100 rpm durante 5 min. Repetir este lavado 2 veces. Secar con papel absorbente el sedimento y colocar el tubo en posición vertical. Resuspender con agitador y agregar 10 l de Fragmento F(ab´)2 anti-inmunoglobulina

de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína obtenido en conejo. Incubar a 4 °C durante 30 min. Lavar como en *. Diluir el sedimento con una gota del medio de montaje PBS-glicerina.


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Mezclar con agitador. Colocar una gota pequeña en un portaobjeto, cubrir con el cubreobjetos y sellar con

esmalte de uñas incoloro. Dejar reposar durante 5 min a 4 °C. Observar en el microscopio de fluorescencia. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Observar al microscopio de fluorescencia, con luz visible los linfocitos presentes en un campo determinado y a continuación observar los linfocitos marcados con luz fluorescente en ese mismo campo. NOTAS: Se aconseja procesar la sangre dentro de las 2 horas de realizada la extracción. Los reactivos deben estar a temperatura ambiente en el momento de utilizarlas para

mejorar la eficiencia en la recuperación de las células, la cual decae con bajas temperaturas de trabajo.

El mismo procedimiento puede realizarse con material proveniente de médula ósea, usando una dilución al tercio de la muestra obtenida.

Si bien los nódulos linfáticos, las amígdalas y el bazo poseen una baja proporción de granulocitos, la muestra de elección para obtener células mononucleares de seres humanos es, sin dudas, la sangre periférica por su accesibilidad.

Si se desea semicuantificar el número de linfocitos CD4 positivos se procede de la siguiente manera:

- con luz visible se cuentan los linfocitos presentes en un campo determinado. - se observa con luz fluorescente cuántos de ellos poseen el marcador. - se continúa con este procedimiento hasta completar un total de 200 linfocitos observados con luz visible. - se calcula el porcentaje de linfocitos marcados sobre el total de 200.

El uso de un conjugado como fracción Fab o F(ab´)2 , en los casos donde se emplean células, evita falsos positivos, ya que la mayoría de las células poseen el receptor para Fc.


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MODELO DE INFORME

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia indirecta Objetivo: Sistema: Resultado: Interpretación:


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MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA ADAPTATIVA FRENTE A LOS DISTINTOS TIPOS DE

ANTÍGENOS

La inmunidad adaptativa (ver Glosario) se caracteriza por tener una exquisita especificidad y una memoria que le permite recordar las exposiciones repetidas al mismo microorganismo, generando respuestas más rápidas y de mayor afinidad. Los anticuerpos (ver Glosario) son proteínas que ejercen una función clave en la respuesta adaptativa. Están presentes en la sangre y en las secreciones mucosas y son producidos por las células plasmáticas (ver Glosario). Son capaces de reconocer a los antígenos microbianos, neutralizarlos y/o marcarlos como una diana para su eliminación por diversos mecanismos efectores. Uno de estos mecanismos es la activación del Sistema Complemento por la vía clásica (ver Glosario) que puede conducir a la muerte del patógeno.

ACTIVACIÓN DEL SISTEMA COMPLEMENTO POR LA VÍA CLÁSICA La activación se inicia cuando los anticuerpos se unen al primer componente de la

cascada, el complejo proteico multimérico C1. Este complejo está formado por 3 subunidades C1q, C1r, C1s. El C1q es el que se une a los fragmentos Fc de las IgG o IgM. Cada Fc tiene un único sitio de unión a C1q y cada molécula de C1q debe unirse a dos cadenas pesadas de inmunoglobulina para iniciar la activación de la vía clásica del complemento. La IgM tiene una estructura pentamérica, por lo que por sí sola puede unirse a C1q para activarlo, aunque es necesario su unión al antígeno ya que esto induce un cambio conformacional que permite la exposición de sus Fc. Por otro lado se necesitan por lo menos dos moléculas de IgG para activar al C1q y la única manera de que se agrupen es cuando interaccionan con un antígeno multivalente. Por lo tanto los anticuerpos deben estar unidos a los antígenos para la activación del complemento y no circulando libremente.

La unión del C1q a los Fc de las inmunoglobulinas provoca una activación enzimática del fragmento C1r, que a su vez escinde y activa al C1s. Este C1s escinde C4 generando C4b, que es una molécula análoga al C3b y tiene funciones biológicas similares. Por otra parte, C1s también escinde la molécula del complemento C2 generando C2b que junto con


68

el C4b forman el complejo C4bC2b llamado C3-convertasa de la vía clásica. Esta enzima tiene la capacidad de escindir C3 y generar C3a y C3b. Una de las funciones del C3b es formar parte de la C5-convertasa de la vía clásica (junto con C4b y C2b), que escinde C5 para generar C5a y C5b. Este último inicia el ensamblaje de los componentes finales del sistema complemento para formar el complejo de ataque a membrana que culmina con la lisis celular (Figura 23).

Figura 23: Vía clásica de activación del complemento.

ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO

VÍA CLÁSICA Se activa por la unión de

anticuerpos específicos a la superficie del patógeno

PRODUCCIÓN DE:

C3a, C5a C5b-C9 C3b C3bi

Atracción de células

inflamatorias

Perforación de la membrana de los

patógenos por formación del

complejo de ataque a membrana

Recubrimiento del patógeno

favoreciendo la fagocitosis

Potenciación de la respuesta B

MUERTE DEL PATÓGENO


69

Como se vio en el Trabajo Práctico N° 2, el sistema complemento se puede estudiar desde el punto de vista funcional e inmunoquímico. En este Trabajo Práctico se realizará la reacción de valoración, un ensayo funcional, para evaluar la activación por la vía clásica del complemento empleando un sistema antígeno-anticuerpo compuesto por glóbulos rojos de carnero y su correspondiente anticuerpo (hemolisina). Además se cuantificará un componente particular del sistema mediante una reacción de precipitación en agar, un ensayo inmunoquímico, como la inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC).

INMUNODIFUSIÓN RADIAL CUANTITATIVA (IDRC) La IDRC permite cuantificar un antígeno. El antígeno difunde a través de un agar

que contiene un antisuero monoespecífico en concentración constante y en exceso con el que interacciona. Inicialmente, la concentración elevada del antígeno en la periferia del pocillo de siembra provoca la redisolución de los complejos inmunes precipitados. A medida que el antígeno difunde más, la concentración disminuye hasta alcanzar el punto en el cual las proporciones son óptimas y se forma un halo de precipitación. El diámetro de este halo es proporcional a la concentración del antígeno. Para cuantificar un determinado antígeno pueden emplearse las tablas provistas por los fabricantes de los equipos o pueden construirse curvas de calibrado con testigos de concentraciones conocidas de dicho antígeno. Para obtener el resultado se ingresa con el radio cuadrado (r2) de la muestra incógnita y se determina la concentración correspondiente (Figura 24).

Figura 24: Curva de calibrado para la determinación de la concentración de un antígeno.

r12

r22

r32

C 1 C 2 C 3

Concentración del antígeno (mg/ml)

(r)2


70


Primera parte Valoración de la vía clásica del complemento en unidades

hemolíticas 50 % (CH50) FUNDAMENTO:

El complemento tiene la capacidad de fijarse inespecíficamente a complejos antígeno-anticuerpo y producir lisis si el antígeno es una célula. Si se incuba un suero incógnita, cuyo complemento se quiere valorar, en presencia de un sistema antígeno-anticuerpo (sistema indicador) constituido por glóbulos rojos de carnero y su correspondiente anticuerpo (hemolisina), se producirá la lisis de los eritrocitos. La hemoglobina liberada es un índice de la actividad funcional de esta vía de activación. Efectuando una batería de tubos con diluciones del suero se puede expresar la concentración del complemento activado por la vía clásica en unidades hemolíticas.

TITULACIÓN DE HEMOLISINA OBJETIVO: Determinar la dosis mínima hemolítica (DMH). REACTIVOS Y MATERIALES: Hemolisina: anticuerpo anti-glóbulo rojo de carnero. Glóbulos rojos de carnero al 5 %. Suero humano: fuente de complemento. Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, Gelatina 0,66%, Veronal 0,053 M, CaCl2

0,0003 M y MgCl2 0,02 M. Buffer complemento de trabajo 1X: diluir al quinto el buffer complemento 5X. Pipetas de vidrio. Pipetas automáticas y tips.


71

Pipetas Pasteur. Tubos de hemólisis y de Khan (semimicrotubos). Baño termostatizado. Centrífuga. Espectrofotómetro. PROTOCOLO: Preparar 6 diluciones seriadas razón 2 de hemolisina en buffer complemento de trabajo

en tubos de hemólisis, a partir de una dilución de hemolisina 1/100. En el tubo 6, descartar 0,3 ml de la dilución.

Tubo Buffer de trabajo

Diluciones de hemolisina Dilución

1 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/100 1/200 2 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/200 1/400 3 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/400 1/800 4 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/800 1/1600 5 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/1600 1/3200 6 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/3200 1/6400

Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando en

ellos 0,3 ml de buffer de trabajo y 0,3 ml de agua destilada respectivamente. Agregar los glóbulos rojos al 5 % en todos los tubos, según el siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 0% lisis

100% lisis

Diluciones de hemolisina (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 - - Buffer de trabajo (ml) - - - - - - 0,3 - H2O destilada (ml) - - - - - - - 0,3 Glóbulos rojos al 5% (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3


72

Incubar 20 min a 37 °C agitando ocasionalmente para mantener los glóbulos rojos en suspensión.

Agregar 0,9 ml de buffer de trabajo en cada tubo de reacción. Agregar 0,3 ml de suero humano (fuente de complemento) a cada tubo, mezclar e

incubar 60 min a 37 °C. Centrifugar 5 min a 2000 rpm. Trasvasar el sobrenadante de cada tubo de reacción a tubos de Khan o de hemólisis

para realizar la lectura. Leer la absorbancia de cada sobrenadante a una longitud de onda de 540 nm, llevando

a cero con agua destilada.

RESULTADO E INTERPRETACIÓN: Calcular la fracción de células lisadas dividiendo la absorbancia a 540 nm de cada

tubo por la absorbancia a 540 nm del tubo de 100 % de lisis. Luego construir la curva de la fracción de células lisadas en función de la dilución de la hemolisina y determinar la dilución que produce el 50 % de lisis interpolando en la curva. NOTAS: La DMH (dosis mínima hemolítica) es la dilución de hemolisina capaz de sensibilizar

(unirse) al 50% los glóbulos rojos. La sangre de carnero se obtiene por punción de la vena yugular del animal. Se mezcla

en partes iguales con la solución de Alsever, suavemente. Se conserva en heladera por una semana para lograr su estabilización (permitir que todos los glóbulos rojos adquieran un comportamiento similar).

La solución de Alsever contiene glucosa (monosacárido) como fuente de energía para mantener la vitalidad del glóbulo rojo; citrato como anticoagulante; cloruro de sodio para mantener la isotonicidad y ácido cítrico como buffer.

La hemolisina es el anticuerpo anti-glóbulo rojo de carnero. Se puede obtener inoculando conejos adultos con glóbulos rojos enteros o con estroma. Las hemolisinas así obtenidas difieren en calidad y presentan distinto comportamiento in vitro. La hemolisina de elección es la obtenida por inmunización de conejos con estroma ya que tiene un comportamiento más estable en el tiempo y en un mayor rango de diluciones,


73

lo que permite estandarizar la técnica y trabajar con mayor confianza. Antes de su uso, este suero hemolítico es tratado con calor a 56 °C durante 30 min con la finalidad de inactivar el complemento presente, que podría interferir en la reacción.

Si como fuente de complemento se utiliza suero humano se debe realizar la pre-adsorción del suero para eliminar los anticuerpos heterófilos. Para ello se incuba partes iguales de suero humano y paquete de glóbulos rojos de carnero. Se incuba en baño de hielo durante 30 min agitando esporádicamente para mantener las células en suspensión, se centrifuga a 2000 rpm y se recupera el sobrenadante con el cual se trabajará.

También se puede utilizar complemento comercial de cobayo. Tiene una concentración de 25-40 mg%, buena actividad y buen comportamiento en función del tiempo. Se adquiere en el comercio liofilizado, se reconstituye en el momento de usar con agua destilada, según las instrucciones del fabricante y se diluye convenientemente con buffer complemento de trabajo 1X.

SISTEMA HEMOLÍTICO (SH)

OBJETIVO: Preparar el sistema indicador. REACTIVOS Y MATERIALES: Glóbulos rojos de carnero al 5 %. Hemolisina en una dilución adecuada. Baño termostatizado. Pipetas automáticas y tips. PROTOCOLO: Se mezclan partes iguales de glóbulos rojos de carnero al 5 % y hemolisina diluida

convenientemente. Agregar siempre la hemolisina sobre los glóbulos rojos de a gotas, lentamente, agitando

constantemente en baño de agua a 37 °C. Una vez finalizado el agregado, incubar en baño de agua 20 min a 37 °C para una correcta sensibilización.


74

VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO EN UNIDADES HEMOLÍTICAS 50 % (CH50) OBJETIVO: Estudiar la funcionalidad del sistema complemento semicuantificando su concentración

en unidades hemolíticas 50 % (CH50). MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Sistema hemolítico. Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, Gelatina 0,66%, Veronal 0,053 M, CaCl2

0,0003 M y MgCl2 0,02 M. Buffer complemento de trabajo 1X: diluir al quinto el buffer complemento 5X. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Pipetas de vidrio. Pipetas automáticas y tips. Pipetas Pasteur. Tubos de hemólisis y de Khan (semimicrotubos). Baño termostatizado. Centrífuga. Espectrofotómetro. PROTOCOLO: Preparar 5 diluciones seriadas razón 2 del suero a valorar en buffer complemento de

trabajo en tubos de hemólisis, a partir del primer tubo cuya dilución es 1/5. En el tubo 5, descartar 0,25 ml de la dilución.


75

Tubo Buffer de trabajo

Suero o diluciones del suero Dilución

1 0,4ml 0,1 ml de suero 1/5 2 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/5 1/10 3 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/10 1/20 4 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/20 1/40 5 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/40 1/80

Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando 0,25

ml de buffer de trabajo y 0,25 ml de agua destilada respectivamente. Agregar el sistema hemolítico como muestra el siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 0% de lisis

100% de lisis

Diluciones del suero (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - - Buffer de trabajo (ml) - - - - - 0,25 -

H2O destilada (ml) - - - - - - 0,25 Sistema Hemolítico (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Incubar 60 min a 37 °C agitando ocasionalmente para mantener los glóbulos rojos en

suspensión. Agregar 2,6 ml de SF en cada tubo para frenar la reacción, excepto en el tubo control

de 100 % de lisis, al que se le agregan 2,6 ml de agua destilada. Centrifugar 5 min a 2000 rpm. Trasvasar el sobrenadante de cada tubo de reacción a otros tubos de Kahn o de

hemolisis para realizar la lectura. Leer la absorbancia de cada sobrenadante a una longitud de onda de 540 nm, llevando

a cero con agua destilada. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Con los datos obtenidos de absorbancia confeccionar la siguiente tabla:


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X (diluciones del suero)

Y (Fracción de lisis)

[Y/(1-Y)] Log [Y/(1-Y)] Log X

1/5 1/10 1/20 1/40 1/80

Graficar Log X (en el eje de las ordenadas, eje y) en función de Log [Y/(1-Y)] (en

el eje de las abscisas, eje x), como se muestra en el siguiente ejemplo:

Para calcular el valor de CH50 se procede como en el Trabajo Práctico Nº 2: obtener el punto en el que la recta corta al eje de las ordenadas (y). A partir de este valor determinar las unidades hemolíticas 50 %. NOTAS: Se debe proceder con ciertas precauciones para evitar que se destruyan las fracciones

termolábiles del sistema complemento en el suero a valorar. Una vez extraída la sangre dejar coagular espontáneamente a temperatura ambiente durante 30 min y separar el

0

0,5

1

1,5

2

2,5

-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6

Log

de

X

Log de [Y/(1-Y)]

Valoración de la vía clásica del complemento en unidades hemolíticas 50 % (CH 50)


77

suero rápidamente por centrifugación. Refrigerar inmediatamente entre 2 y 4 °C, siendo útil sólo ese día. Conservado a -70 °C mantiene su actividad durante un año.

Durante las incubaciones con sistema hemolítico conviene resuspender el paquete globular periódicamente sin retirar los tubos del baño de agua.

Segunda parte Valoración de fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa

(IDRC)

FUNDAMENTO: Cuando un antígeno difunde a través de un agar que contiene un antisuero

monoespecífico para dicho antígeno, se producirá un halo de precipitación. El diámetro del halo será directamente proporcional a la concentración del antígeno, si se mantiene la concentración del anticuerpo constante y en exceso en el agar. OBJETIVO: Determinar cuantitativamente las fracciones C3 o C4 del sistema complemento en un

suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Placas comerciales de IDRC para valorar C3 o C4. Jeringas Hamilton. Cámara húmeda. Dispositivo para medir halo. PROTOCOLO: Sembrar 5 μl del suero en el que se desea cuantificar la fracción C3 o C4 por

duplicado.


78

Dejar difundir en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 a 72 h o hasta constancia del diámetro del halo de precipitación.

Medir el diámetro de los halos de precipitación. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Determinar la concentración de C3 o C4 haciendo uso de la tabla que provee el fabricante. NOTAS: Se debe tener presente la posible alteración del antígeno y por lo tanto la probable no

correspondencia del anticuerpo utilizado. Hay que trabajar con una concentración de anticuerpo constante (homogéneamente

distribuido) y en exceso en el gel utilizado.

MODELO DE INFORME TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 Primera parte: Valoración de la vía clásica del complemento en unidades hemolíticas 50% (CH50) Objetivo: Resultado: Presentar tabla con los valores obtenidos y la recta confeccionada con algún programa de computación (Excel, GraphPad Prism, etc). Segunda parte: Valoración de fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC) Objetivo: Sistema: Resultado:

UNIDAD 4 Guía Teórico-Práctica de Inmunología Inmunización Activa y Pasiva UNS

79

INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA

La inmunidad se define como la capacidad de resistencia a la infección y puede

adquirirse en forma activa o pasiva, natural o artificial.

INMUNIZACIÓN ACTIVA La vacunación es una forma de inmunización activa y artificial en la que se manipula

al Sistema Inmune (SI) con fines profilácticos o terapéuticos. En este caso se enfrenta al SI

con un agente extraño que mimetiza la infección natural primaria, o antígenos derivados de

él, tras lo cual se adquiere inmunidad. Cuando el agente tipo salvaje ingresa, se despliega

rápidamente una inmunidad protectora dada por los anticuerpos circulantes existentes y por

la respuesta secundaria que se genera, con todos sus beneficios. Así mismo, la obtención

de anticuerpos en animales de laboratorio, que luego son extraídos y purificados con

múltiples fines, también se consigue a través de la inmunización activa y artificial.

INMUNIZACIÓN PASIVA Se conoce como inmunización pasiva al procedimiento por el cual se transfieren

células sensibilizadas o anticuerpos preformados, homólogos o heterólogos, de un individuo

a otro. En consecuencia se confiere inmunidad, aunque temporal ya que no activa la

respuesta inmune propia. Las vías más usadas de inmunización pasiva con preparados de

inmunoglobulinas son la intramuscular y la endovenosa.

En este Trabajo Práctico se abordarán algunos aspectos relacionados con estos

temas. En primer lugar, se discutirá sobre la producción de anticuerpos en animales de

laboratorio (AL). Se considerarán aspectos prácticos a tener en cuenta en el diseño de un

plan de inoculación y aspectos teóricos relacionados con los eventos que se dan en el SI

del animal y condicionarán la producción de anticuerpos. Finalmente, se estudiarán los


80

métodos utilizados para la purificación de inmunoglobulinas, en nuestro caso humanas, que

dan origen a los preparados comerciales utilizados en la seroterapia.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN ANIMALES DE LABORATORIO

Generalidades sobre el uso de animales de laboratorio El uso de animales de laboratorio (AL) tiene que estar justificado, asegurándose su

protección, respeto y cuidado (evitar la incomodidad, estrés, dolor). En este sentido se debe considerar, previamente y cuando sea posible, el reemplazo por un modelo alternativo no consciente o no sensible. De no ser posible debe procurarse la reducción al mínimo del número de animales a emplear así como el refinamiento en el trato de los mismos y la responsabilidad en su uso. El Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia cuenta con un Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAE) el cual tiene como principal función velar por el cumplimiento de la reglamentación vigente respecto al uso de animales de laboratorio.

Las ratas y los ratones son los animales más empleados en la docencia universitaria

y la investigación. En el campo de la Inmunología es frecuente recurrir a conejos, ratones,

cobayos, ratas, hámster, caballo, cerdo, oveja, cabra, entre otros. La elección de unos u

otros para la producción de anticuerpos dependerá de múltiples variables.

Para generar experimentalmente la respuesta inmune contra un determinado antígeno se recurre un animal vertebrado, inmunológicamente maduro y que no haya estado en

contacto con dicha sustancia previamente. Esto último hace que dicho animal sea

considerado virgen para esa sustancia. Algunos factores que también determinan la

especie animal a elegir son el volumen de antisuero que se pretende obtener y el acceso a

un lugar cómodo para alojarlos (bioterio) entre otros. La producción de anticuerpos en un AL permite obtener antisueros del tipo policlonal.

Para esto se lo debe estimular con el antígeno de interés siguiendo un plan de inoculación.

Este plan puede variar de acuerdo a las necesidades y a la respuesta generada. En un plan


81

básico de inmunización la frecuencia de administración es cada quince días por al menos

dos meses.

En la obtención de antisueros, el conejo es uno de los animales más utilizados. Entre

las ventajas de su uso se encuentra el tamaño mediano, la docilidad, la facilidad de manejo,

los hábitos alimenticios, el costo no excesivo de su manutención, la accesibilidad a grandes

vasos sanguíneos en las orejas y, la cantidad y calidad de anticuerpos que se obtienen.

Entre sus desventajas se haya la predisposición a sufrir una gran variedad de

enfermedades.

Adyuvantes Por lo general, cuando se desea generar una respuesta inmune adecuada contra una

molécula, ésta debe inocularse acompañada de un adyuvante. Sobre todo si la molécula

posee escaso poder inmunogénico o puede ser rápidamente catabolizada por el organismo.

Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que se inyectan junto con el

inmunógeno para hacer más efectiva la respuesta inmune. En consecuencia se puede

producir una mayor concentración de anticuerpos específicos. Además, con su empleo es

posible disminuir la cantidad de antígeno usado por inyección y el número total de

inoculaciones necesarias para alcanzar una respuesta adecuada. El adyuvante de Freund completo (FCA) es uno de los más utilizados en AL. El

FCA es una emulsión constituida por una parte de un oleato y nueve partes de vaselina

líquida, junto a un macerado de bacilos tuberculosos muertos. La inmunogenicidad

intrínseca de los bacilos promueve el efecto adyuvante ya que incrementa el número de

células del sistema inmune que acuden al sitio de inoculación. La porción oleosa hace que

el antígeno se libere lentamente, en forma gradual, permitiendo un estímulo persistente. Cuando el adyuvante se prepara sin las micobacterias se denomina adyuvante de Freund

incompleto (FIA). Por su reactogenicidad este tipo de adyuvante no es aplicable en el

hombre. Los más utilizados en seres humanos y que forman parte de algunas vacunas son


82

aquellos basados en sales de aluminio (hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio) y otros

de reciente aparición denominados MF59, AS04 y AS03.

Vías de administración Cuando se administra una sustancia a un AL por cualquier vía se deberán seguir las

buenas prácticas de cuidado y uso de los mismos, puesto que los errores durante este

procedimiento pueden causar un sufrimiento que es evitable.

Cuando las sustancias son administradas en forma de soluciones, los vehículos más

utilizados son el agua para inyectables y la solución fisiológica estéril. Para compuestos

insolubles en agua se puede emplear algún vehículo orgánico adecuado. Éste debe carecer

de efectos farmacológicos, ser estable en las condiciones de uso y no ser tóxico ni irritante.

Además, debe permanecer fluido a la temperatura a la que será usado y su viscosidad

debe ser la adecuada para facilitar la inyección.

La elección de la vía estará determinada por el inmunógeno empleado, el propósito

del experimento, la especie animal, los posibles efectos de la técnica de administración, la

frecuencia de las inoculaciones y el tipo de adyuvante disponible. Las tres vías más frecuentes son parenterales: intravenosa (o endovenosa), subcutánea e intradérmica

(Figura 25). No es común la elección de la vía intraperitoneal. Las vías enterales (oral

sobretodo) así como la vía inhalatoria resultan útiles en la inmunización activa en el hombre

(vacunas). Se debe tener en cuenta que un antígeno soluble no debería inocularse por vía

intravenosa ya que se degradaría rápidamente. En cambio, un antígeno particulado puede

ser inoculado por vía intravenosa, intradérmica o subcutánea sin dificultades. Cuando se utiliza un adyuvante con componentes oleosos nunca debe ser introducido por vía

intravenosa con el fin de evitar la formación de trombos.


83

Figura 25: Vías más utilizadas en la inmunización.

En el conejo, los lugares de inoculación de elección son el lomo o la parte interna de las patas traseras, ya que son zonas muy cercanas a las cadenas ganglionares linfáticas,

lo que favorece la generación de una buena respuesta inmune. La vía más común es la intradérmica. En el punto de inoculación del inmunógeno puede aparecer un granuloma,

que es una reacción de tipo inflamatoria.

Generación de la respuesta inmune que conduce a la producción de

anticuerpos específicos

Localización de la respuesta inmune humoral y celular

El timo es la principal localización donde maduran los LT procedentes de la médula

ósea y el hígado fetal. Luego, los LT maduros vírgenes se dirigen a la zona de LT en los

órganos linfáticos secundarios donde eventualmente se encontrarán con los antígenos extraños. Los LB se desarrollan, en el hombre, en la médula ósea a partir de precursores

pluripotentes y terminan su proceso de maduración en el bazo. Estos LB maduros vírgenes

se ubican en los folículos de los tejidos linfoides secundarios.


84

La llegada del antígeno a los tejidos linfáticos y la activación de los LT

Cuando un antígeno extraño, como una proteína, traspasa la barrera epitelial, las células dendríticas (CD) inmaduras lo captan en periferia y lo transportan al ganglio

linfático más cercano. En los casos en que el antígeno sea transportado vía sanguínea, su

encuentro con las CD inmaduras se da en el bazo. Estas CD que han incorporado el

antígeno maduran y migran a zonas de LT de los tejidos linfáticos donde podrán entrar en contacto con los LT vírgenes. Las CD procesan al antígeno y presentan pequeñas

porciones del mismo sobre moléculas del CMH-II expresadas en su membrana celular. El

contacto de estas CD con LT colaboradores específicos vírgenes genera su activación, la expansión del clon celular y, la diferenciación a LT efectores y células de memoria. Los LT

activados presentan un aumento en la expresión de CD40L en membrana, un incremento

de la secreción de citoquinas y un cambio en la expresión de receptores de quemoquinas.

Por ello, algunos LT colaboradores efectores pueden migrar al foco de inflamación en

periferia donde, mediante la expresión en membranas de algunas moléculas y la secreción

de citoquinas, aumentan la eficiencia en la actividad de los macrófagos encargados de la

eliminación del agente agresor. Otros LT colaboradores permanecen en los tejidos linfáticos

aunque se dirigen hacia el folículo donde podrán cooperar con los LB en su activación.

La activación de los LB

La unión de un antígeno proteico, que ingresa vía linfática al ganglio, con el receptor del LB folicular (BCR) inicia el proceso de activación de la célula. En él se ponen en

marcha cascadas de señalización intracelulares que concluyen con la activación de factores

de transcripción que llevarán a la expresión de los genes necesarios para las respuestas

funcionales de los LB activados. Se induce su proliferación, diferenciación y se observa un

aumento en la expresión de moléculas del CMH-II, moléculas coestimuladoras (CD86 y

CD80) y receptores para citoquinas (para aquellas que producen los LT) y quemoquinas.


85

Antígenos T-independientes y T-dependientes

Algunas clases de antígenos, como los polisacáridos o los glucolípidos, poseen

múltiples epitopes idénticos en cada molécula por lo que pueden entrecruzar de forma

eficaz BCR cercanos e iniciar la activación del LB sin colaboración de los LT. Estos antígenos se conocen como independientes del timo o T-independientes. En cambio, los

antígenos proteicos presentan generalmente una sola copia de cada epitope por molécula,

razón por la cual su capacidad de entrecruzar BCR vecinos sería nula. Es por ello que la

activación adecuada de los LB por este tipo de antígenos requiere de eventos adicionales

relacionados con la cooperación de los LT. Los LB que se activan en esta situación son los LB2, ubicados en los folículos primarios de los órganos linfoides secundarios. Para que

esto sea posible el complejo proteína-BCR, en este ejemplo, se endocita y se procesa en el

LB que de este modo lo presentará asociado a una molécula de CMH-II en la superficie

celular. Esto permite que los LT colaboradores, específicos y previamente activados,

interactúen físicamente y a través de la liberación de citoquinas con los LB. De esta manera

estos últimos serán capaces de generar una respuesta humoral más eficiente. Estos antígenos se conocen como dependientes de timo o T-dependientes.

Respuesta inmune a antígenos T-dependientes

En los órganos linfoides secundarios, los LB activados migran hacia la zona de LT.

Los LB situados en la interfase T-B interactúan con los LT colaboradores, de quienes

reciben ayuda a través de CD40L y las citoquinas (IL-2, 4 y 21 principalmente) que éstos

producen. Algunos de estos LB activados dejan este primer foco de proliferación y se dirigen a los cordones medulares del ganglio linfático donde se diferencian en plasmocitos

de vida corta productores de IgM. La mayoría de los LB migran de nuevo hacia zonas

profundas del folículo donde forman un centro germinal o zona de alta proliferación

(folículo secundario) en la cual se producen el cambio de isotipo, la hipermutación

somática y los fenómenos de selección que dan lugar a la maduración de la afinidad y la


86

generación de los LB de memoria. El área central de esta zona alberga a los centroblastos

en rápida proliferación que se observan rodeados de su progenie, linfocitos de menor tamaño o centrocitos.

En el centro germinal, los LB activados experimentan el cambio de clase de la

cadena pesada dando lugar a la síntesis de anticuerpos de los isotipos IgA, IgE o IgG que

mantiene la misma especificidad antigénica de la IgM producida inicialmente. En este

fenómeno es crucial la señal que genera CD40 hacia el interior del LB así como la

presencia de determinadas citoquinas producidas por los LT activados que también

migraron desde la zona de interfase T-B junto con los LB.

La maduración de la afinidad da lugar a LB productores de anticuerpos con alta

afinidad por el antígeno que los activó en primer lugar. Este proceso es dependiente de la

colaboración de los LT y ocurre tras la hipermutación somática de los genes que codifican

para la inmunoglobulina. En el centro germinal, el ADN que corresponde al segmento VDJ

de un LB se vuelve propenso a fenómenos de mutación (hipermutación) generando

centrocitos que producen una inmunoglobulina ligeramente diferente en su secuencia de

aminoácidos. Algunas de las mutaciones serán útiles y conseguirán aumentar la afinidad de

unión por el antígeno pero muchas otras generarán una disminución o incluso pérdida de esa capacidad de unión. Es aquí donde las CD foliculares (CDF) cumplen un rol

importante en el proceso de selección de aquellos LB que expresan el anticuerpo con

mayor afinidad. Estas células son diferentes de las CD que incorporaron y presentaron el

antígeno a los LT. Las CDF poseen largas prolongaciones que forman una red alrededor de

la cual se forman los centros germinales. Estas prolongaciones se hallan en estrecho

contacto con los centrocitos y presentan el antígeno que inicialmente activó a los LB (Figura 26). Aquellos centrocitos que reconozcan con mayor afinidad al antígeno serán

seleccionados para sobrevivir. Es decir que los centrocitos están predestinados a morir por

apoptosis rápidamente sino son rescatados por el reconocimiento del antígeno sobre las

CDF.


87

Figura 26: La CDF expresa receptores para complemento (CR) y para Fc de Ig (FcR) que

le permiten unirse a antígenos opsonizados.

Finalmente, la progenie generada en los centros germinales se diferencia a células

plasmáticas de larga vida y a LB de memoria. Las células plasmáticas de larga vida

migran a la médula ósea donde son las responsables de la producción de anticuerpos. Los

LB de memoria son los responsable de la rápida respuesta humoral frente a la

reintroducción del antígeno. Estos linfocitos típicamente tienen receptores del antígeno con

afinidad elevada y de isotipos cambiados.

Respuesta inmune a antígenos T-independientes

En general, los polisacáridos y los lípidos logran activar a los LB sin la cooperación

de los LT. Sin embargo, a diferencia de las respuestas T-dependientes, se producen

anticuerpos generalmente de baja afinidad y principalmente IgM con un escaso cambio a

algunos isotipos de IgG. Esto se debe a que dichos antígenos no pueden ser procesados y

presentados adecuadamente por las CPA y en consecuencia no se activan LT específicos

que colaboren con los LB. Las respuestas T-independientes se pueden generar en el bazo,


88

la médula ósea, la cavidad peritoneal y las mucosas. Los linfocitos BZM (LB de la zona

marginal) son un subconjunto de LB que responden principalmente a polisacáridos y

sintetizan IgM luego de ser activados. Por esta razón cumplen un papel muy importante en

la defensa contra las bacterias capsuladas. Otro linaje que responde principalmente a antígenos T-independiente son los LB1 ubicados en las cavidades peritoneal y pleural.

Respuesta inmune primaria y secundaria

La respuesta inmune que se genera cuando un antígeno T-dependiente es inoculado por primera vez se conoce como respuesta primaria. Es iniciada por unos pocos linfocitos

que poseen receptores específicos para ese antígeno. La principal clase de anticuerpos que se generan corresponden al isotipo IgM (a cargo de plasmocitos que no llegaron a cambiar

el isotipo de inmunoglobulina sintetizada) y en menor medida a IgG.

Ante la segunda entrada del mismo antígeno se produce una respuesta inmune, denominada secundaria, en la que participan principalmente linfocitos de memoria de larga

vida originados en la respuesta primaria. Ahora, los anticuerpos producidos son principalmente de la clase IgG de alta afinidad (Figura 27A).

La respuesta inmune provocada por un antígeno T-independiente (polisacáridos, LPS,

etc.) no se caracteriza por la generación de linfocitos B de memoria y, en consecuencia,

tanto la respuesta primaria como la secundaria es idéntica. Se encuentran principalmente anticuerpos de la clase IgM (Figura 27B).


89

Figura 27: Respuestas primarias y secundarias para antígenos T-dependientes (A) y T-

independientes (B).

Sangría exploratriz Para conocer si el animal estimulado antigénicamente ha respondido o no con la

producción de anticuerpos se deberá realizar una sangría exploratriz. En este procedimiento

se extrae sangre durante el transcurso de un plan de inoculación para la posterior búsqueda

de anticuerpos específicos en el suero.

La especie animal y el volumen necesario determinarán la vía de acceso más

adecuada para la obtención de la muestra de sangre. Cabe tener en cuenta que existe un

máximo volumen extraíble para cada especie y según el peso del animal. Por ejemplo, en

un conejo de 3 kg de peso se pueden extraer hasta 15 ml de sangre aproximadamente sin

producirle alteraciones en su fisiología.


90

PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS Diferentes estrategias se pueden emplear para separar, purificar y caracterizar

antígenos o anticuerpos. Estas metodologías son diseñadas y estudiadas por una rama de la Inmunología llamada Inmunoquímica.

Los anticuerpos, por sus características, no pueden ser sintetizados por métodos

químicos convencionales y por ello se debe recurrir a una fuente natural para obtenerlos:

suero, plasma u otro material biológico, sobrenadante de cultivo, etc.

Para lograr una fracción enriquecida en inmunoglobulinas se puede recurrir a diferentes métodos clasificados en inespecíficos y específicos. Los primeros utilizan las

propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos (solubilidad, carga eléctrica, tamaño, peso

molecular) o las propiedades biológicas de algunas proteínas (proteína A de

Staphylococcus aureus y/o proteína G de Streptococcus) para separar las

inmunoglobulinas de las restantes proteínas. En cambio, los segundos se valen de las

propiedades inmunológicas de los anticuerpos (la reacción antígeno-anticuerpo) para

purificar aquellos específicos presentes en la mezcla. Algunos métodos inespecíficos son la precipitación salina, la precipitación con

etanol, y la cromatografía de intercambio iónico. La electroforesis de proteínas es un

método inespecífico muy utilizado aunque con fines analíticos en el control de la

purificación.

Precipitación Uno de los métodos más empleados para la obtención de inmunoglobulinas a partir

de sueros/plasmas humanos es la precipitación con etanol frío en condiciones controladas,

descrito por Cohn-Oncley. La precipitación de las diferentes fracciones/proteínas del

plasma se produce en función de cinco variables: concentración de etanol, pH, fuerza

iónica, temperatura y concentración proteica. La variación en la concentración de etanol modifica la constante dieléctrica de las distintas proteínas provocando la precipitación de


91

las menos solubles hasta las más solubles en forma secuencial. Los productos obtenidos se identifican con números romanos: la fracción II+III da lugar al concentrado de

inmunoglobulinas.

La precipitación salina con sulfato de amonio sobresaturado es otro método muy

utilizado en el laboratorio. La técnica consiste en agregar una solución saturada de iones

pequeños muy cargados, como el sulfato de amonio, a la muestra bajo condiciones

adecuadas de temperatura y pH. Se produce una competencia por las moléculas de agua de solvatación entre las inmunoglobulinas y la sal (salting out). En consecuencia, las

interacciones proteína-proteína aumentan haciendo que las mismas precipiten.

Una de las principales ventajas de estos métodos es que preservan la estructura de

las proteínas, por las condiciones en que se llevan a cabo, y en consecuencia los

anticuerpos conservan su actividad biológica. Sin embargo, el producto contiene además de

inmunoglobulinas, otras proteínas de alto peso molecular o proteínas que quedan atrapadas

en el precipitado. Por ello, estas técnicas suelen combinarse con otras que permiten alcanzar un producto de mayor pureza. Entre éstas se encuentran los métodos

cromatográficos.

Cromatografía de Intercambio Iónico (CII) La CII tiene en cuenta la carga eléctrica de las proteínas en solución. Las proteínas

con una determinada carga se unen a una matriz estacionaria o resina de carga opuesta.

Esta unión es del tipo electrostático y reversible. Luego, la fuerza de esta unión se puede

modificar variando la concentración salina (fuerza iónica) y/o el pH del buffer utilizado

como eluyente.

La resina intercambiadora está constituida por una matriz insoluble inerte, que puede

ser silicato de aluminio, resinas sintéticas o polisacáridos como la celulosa y el dextrano, a la que se ligan grupos funcionales cargados. La naturaleza de estos grupos es la que

determina el tipo y la fuerza de unión de la resina. Entre las resinas empleadas en el


92

laboratorio de inmunoquímica se hallan la Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y la Carboximetil

(CM)-celulosa, resinas de intercambio aniónico y catiónico débiles respectivamente, las que

deben ser activadas previamente a su uso.

Para la purificación de IgG se puede utilizar la resina DEAE-celulosa y el

procedimiento consta de tres etapas. En una primera etapa se ajustan adecuadamente la

fuerza iónica y el pH de la resina activada y la muestra. En una segunda etapa, se agrega

la muestra que en parte será adsorbida sobre la resina por fuerzas electrostáticas. Por

último, se procede a la elución de la IgG con una solución buffer de mayor fuerza iónica. El

eluido se recoge en fracciones que son controladas por mediciones de absorbancia a 280

nm de longitud de onda en espectrofotómetro. El pico proteico se corresponde con la

presencia de IgG con un alto grado de pureza.

Otras resinas y métodos son también utilizados para la purificación de

inmunoglobulinas totales o clases de inmunoglobulinas. Los descriptos anteriormente son

algunos de los más comunes tanto en los laboratorios de investigación como en la industria

farmacéutica. A nivel industrial, la obtención de hemoderivados (factores de la coagulación,

inmunoglobulinas, albúmina, etc.) se realiza a partir de grandes mezclas de plasma

provenientes de donantes. Los métodos de precipitación (crioprecipitación, precipitación con

etanol) y los cromatográficos (filtración por geles, intercambio iónico y afinidad) constituyen,

en general, las técnicas más utilizadas en la preparación de concentrados de

inmunoglobulinas de aplicación intramuscular (IgIM) y endovenosa (IgIV). Los métodos

cromatográficos generan un producto carente de sustancias vasoactivas, agregados de IgG

y/o pequeñas cantidades de otras proteínas, lo que permite disminuir los efectos adversos

observados con la aplicación de otros preparados de inmunoglobulinas. En la elaboración

de este tipo de productos la seguridad constituye un aspecto de gran relevancia. Por esto

es indispensable un estricto control serológico inicial de las mezclas de plasmas y la

introducción de etapas de inactivación o eliminación viral durante el proceso de producción

y al finalizar el mismo.


93

TRABAJO PRÁCTICO N° 6 Primera parte

Producción de anticuerpos en animales de laboratorio FUNDAMENTO:

La introducción de un inmunógeno mezclado o no con adyuvantes, por una vía

determinada, y siguiendo un plan de inoculación, en un animal de experimentación

vertebrado e inmunológicamente maduro, induce en éste una respuesta inmune mediada

por células y/o anticuerpos.

PLAN DE INOCULACIÓN

OBJETIVO:

Estimular antigénicamente a un animal de experimentación.

FRECUENCIA DE INMUNIZACIÓN:

Una inoculación cada quince días por al menos dos meses.

ANIMALES:

Conejos (Oryctolagus cuniculus).

REACTIVOS Y MATERIALES:

Inmunógeno soluble: ovoalbúmina (1mg/ml) mezclada en partes iguales con adyuvante

de Freund completo o incompleto, según el caso.

Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M.

Alcohol, algodón.

Jeringas (2,5 ml) y agujas (20G1).


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PROTOCOLO

Elegir la zona del animal donde se realizará la inoculación.

Depilar y desinfectar con alcohol.

Colocar el inmunógeno en una jeringa con aguja estéril e inocular 1 ml vía intradérmica.

EXTRACCIÓN DE SANGRE

OBJETIVO:

Obtener suero inmune específico.

ANIMALES:

Conejos inmunizados.


Jeringas (10 ml) y agujas (21G1).

Alcohol y algodón.

Tubos de centrífuga.

PROTOCOLO:

Depilar la oreja del animal.

Exaltar la arteria mediante masajes.

Desinfectar con alcohol y extraer sangre con jeringa y aguja.

Recolectar la sangre en un tubo de centrífuga.

Dejar coagular a 37°C en baño de agua una hora, o dos horas a temperatura ambiente.

La conservación en heladera toda la noche favorece la retracción del coágulo y permite

la exudación de mayor cantidad de suero.


95

Luego de coagulada la sangre centrifugar 10 min a 3000-4000 rpm y separar el suero

que puede usarse inmediatamente o conservarse en freezer a -20 °C hasta su

utilización.

SANGRÍA EXPLORATRIZ

OBJETIVO:

Valorar semicuantitativamente los anticuerpos producidos por un animal de

experimentación durante el desarrollo de un plan de inmunización.

MUESTRA A ANALIZAR:

Suero inmune de conejo (suero del conejo inmunizado).


Antígeno soluble: ovoalbúmina (1 mg/ml).

PROTOCOLO

Distintas técnicas inmunológicas se pueden aplicar para la investigación de

anticuerpos en un material biológico como el suero. Muchas de ellas fueron desarrolladas

en el cursado de la materia.

NOTA

Actualmente, respecto al uso de AL, la normativa vigente a nivel internacional

comprende: a) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, NIH, National Academy Press, USA; b) Directiva 2010/63/UE relativa a la Aproximación de las

Disposiciones Legales, Reglamentarias y Administrativas de los Estados Miembros de la

Comunidad Económica Europea respecto a la Protección de los Animales Utilizados

para Experimentación y otros fines científicos.


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Segunda parte

Purificación de IgG a partir de plasma

FUNDAMENTO:

Una muestra de plasma que es fraccionada en primer lugar por precipitación con

sulfato de amonio es luego utilizada para obtener mediante Cromatografía de Intercambio

Iónico (CII) un producto de mayor pureza en IgG. En este caso, la IgG se adsorbe sobre la

fase estacionaria (DEAE-celulosa) mediante fuerzas electrostáticas y luego es eluida con

una solución buffer de mayor fuerza iónica.

OBJETIVO:

Purificar IgG por CII a partir de un plasma. MUESTRA A PURIFICAR:

Plasma humano previamente fraccionado por precipitación con sulfato de amonio.


DEAE-celulosa DE23 Whatman, capacidad 0,5 g/g resina seca. HCl 0,5 M. NaOH 0,5 M. BufferTris-HCl 0,2 M, pH 8,5. Buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5. Buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5; NaCl 0,05 M. Jeringas plásticas. Cánulas de plástico. Pinzas. Soporte universal. Papel de filtro. Pipetas Pasteur.


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Pipetas de vidrio de 10 ml. Vaso de precipitado de 50 ml. Semimicrotubos o tubos de Khan. Espectrofotómetro UV/visible. PROTOCOLO:

Preparación de la muestra

Dializar la muestra obtenida por precipitación contra buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5

durante 24 h a 4 °C o bien diluirla 1/12 con dicho buffer.

Preparación de la columna

Pretratamiento (Activación de la resina) Pesar la cantidad necesaria de resina y, en un vaso de precipitado de 50 ml,

resuspenderla en 15 volúmenes de HCl 0,5 M. Lavar la resina hasta que el filtrado

tenga pH 4. Agregar luego 15 volúmenes de NaOH 0,5 M y lavar nuevamente hasta

que el filtrado tenga pH neutro.

Agregar 15 volúmenes de buffer Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5. Ajustar el pH de la mezcla de

ser necesario. Filtrar y repetir la operación. Dejar decantar. Remover el sobrenadante.

Empaquetamiento y equilibrado Armar con una jeringa invertida una columna sostenida con pinzas a un soporte.

Conectar las cánulas de plástico a la entrada y salida de la columna. Acoplar a estos

tubos pinzas que permitan regular los flujos. Agregar la resina húmeda a la columna.

Dejar correr el eluyente.

Pasar a través de la columna buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5 hasta que el eluyente

tenga el mismo pH y conductividad que el buffer. Detener el flujo.


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Cromatografía

Agregar cuidadosamente la muestra diluida en buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5, en la

parte superior de la columna, de manera de no distorsionar el lecho de la resina.

Esperar que se incorpore. Abrir el flujo y pasar a través de la columna 6 ml de buffer

Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5. A continuación, pasar a través de la columna 6 ml del buffer

de elución (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5; NaCl 0,05 M).

Colectar el eluyente en volúmenes de 1,5 ml por semimicrotubo y controlar la aparición

de proteínas por lecturas de absorbancia a 280 nm en espectrofotómetro. El pico

proteico se corresponde con la presencia de IgG.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Se grafica el cromatograma correspondiente: Absorbancia vs. Fracción eluida.

Interpretar, de observarse, el pico de absorbancia.

Si se realiza el control de purificación por electroforesis en gel de poliacrilamida con

SDS (PAGE-SDS), comparar el plasma del cual se partió para la purificación, la fracción

resultante de la precipitación con sulfato de amonio y la muestra purificada por CII.

MODELO DE INFORME


Segunda parte: Purificación de IgG a partir de plasma.

Objetivo:

Resultados: Cromatograma (gráfico).

PAGE-SDS (figura).

Interpretación:

UNIDAD 5 Guía Teórico-Práctica de Inmunología El Sistema Inmune en Patologías y Rechazo de Trasplantes UNS

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REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD

La inmunidad adaptativa es la responsable de proteger al hospedador de las infecciones ocasionadas por los agentes patógenos. Sin embargo existen ocasiones en las cuales la respuesta inmune es capaz de producir lesiones hísticas y enfermedades. Estas reacciones no deseadas que ocasiona la respuesta inmune se conocen como reacciones de hipersensibilidad.

Gell y Coombs clasificaron a las reacciones de hipersensibilidad en cuatro grupos (Cuadro 2), en cada uno de ellos participan de manera secuencial diferentes tipos de células y mediadores solubles. Cuadro 2: Reacciones de hipersensibilidad de acuerdo a la clasificación de Gell y Coombs.

TIPO I TIPO II TIPO III TIPO IV

Células y/o anticuerpos

IgE Mastocitos Basófilos

Eosinófilos LTh2

IgG/ IgM Complemento

Neutrófilos Macrófagos

IgG/ IgM Complemento

Neutrófilos Macrófagos

LTh1 LTh17

Macrófagos

LTCD8+

Mecanismo

efector

Activación de mastocitos.

Fagocitosis, activación de neutrófilos y

macrófagos por complejos inmunes fijados a células.

Activación de neutrófilos y macrófagos

por complejos inmunes

circulantes.

Activación de macrófagos por IFN-γ

Activación de

LTCD8+

Patología

Asma alérgica,

rinitis alérgica, alergias

alimentarias, anafilaxia

Fiebre reumática, anemia perniciosa,

diabetes resistente a insulina, miastenia gravis, citopenias, nefritis, vasculitis,

sinovitis.

Enfermedad del suero, nefritis,

vasculitis, sinovitis,

fenómeno de Arthus.

Diabetes mellitus T1, artritis reumatoidea,

miocarditis autoinmune, TBC:

lesión granulomatosa, lesiones asociadas a

autoinmunidad e infecciones.

Dermatitis de

contacto


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Un mismo antígeno puede desencadenar diferentes mecanismos de hipersensibilidad. Por su relevancia médica, podemos mencionar el caso de los antibióticos betalactámicos, y en particular la penicilina, que es capaz de producir reacciones de hipersensibilidad mediadas por cualquiera de los cuatro mecanismos anteriormente citados.

Este Trabajo Práctico se relaciona con las reacciones de hipersensibilidad mediadas por anticuerpos, y en particular, con las reacciones de hipersensibilidad de tipo I y II.

HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO I Dentro de este grupo de afecciones encontramos a las reacciones alérgicas (rinitis

alérgica, conjuntivitis alérgica, asma, dermatitis atópica, alergias alimentarias) y a las manifestaciones sistémicas agudas y graves como el shock anafiláctico. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo I afectan al 25 % de la población mundial y son mediadas por IgE.

El concepto de atopia (del griego atopos: fuera de lugar) se relaciona muy estrechamente con las reacciones de hipersensibilidad de tipo I. Los individuos atópicos presentan una predisposición a producir IgE en respuesta a antígenos inocuos denominados alérgenos. Los alérgenos más frecuentes son los pólenes, ácaros, cucarachas, hongos, alimentos, pelos de gatos y perros, algunas drogas, látex, y metales. En general, los alérgenos presentan las siguientes propiedades:

Son proteínas de bajo peso molecular, lo que favorece sus propiedades aerodinámicas.

Tienen actividad enzimática, casi siempre proteolítica lo que facilita su ingreso a las mucosas.

Alta estabilidad por la que pueden mantener sus propiedades físicoquímicas inalteradas por largo tiempo.

Alta solubilidad lo que permite su rápida difusión hacia las superficies mucosas con las que contacta.

Algunos pueden actuar como haptenos asociándose con proteínas del individuo atópico a fin de adquirir inmunogenicidad (metales, antibióticos, medicamentos).


101

Etapas de una reacción de hipersensibilidad de tipo I El antígeno que ingresa por piel, mucosa del árbol respiratorio o tracto gastrointestinal

es captado por células dendríticas para ser presentado a los LTh. El LTh se activará y se diferenciará a LTh2 secretor de citoquinas como IL4 e IL 13 que colaboran con el LB en el cambio de clase de inmunoglobulina a fin de producir IgE específica. Esta IgE se fijará al receptor de alta afinidad (RFcεI) de mastocitos y basófilos. Esta etapa recibe el nombre de sensibilización.

Cuando el individuo se expone nuevamente al mismo antígeno, éste se une a las IgE fijadas a mastocitos y basófilos, lo que favorece el entrecruzamiento de los mencionados receptores. Esto activa una serie de cascadas intracelulares que conducen a la liberación del contenido de los gránulos que poseen estas células. Los gránulos contienen mediadores biológicos como histamina, serotonina, proteasas, heparina, peroxidasas, entre otros, que median los efectos que promueven el desarrollo de los procesos alérgicos. Por ejemplo, la histamina contrae la musculatura lisa bronquial, relaja la musculatura lisa vascular, incrementa la permeabilidad vascular (edema), actúa sobre las células dendríticas inhibiendo su capacidad de estimular la diferenciación de las células TCD4+ hacia un perfil Th1, promoviendo así la diferenciación hacia un perfil Th2.

Existen dos receptores diferentes que median la unión de la IgE a las células a través del fragmento Fc: RFcεI y RFcεII (CD23).

El RFcεI pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La unión de la IgE al RFcεI no induce por sí sola la desgranulación del mastocito. Para que esto ocurra será necesario el entrecruzamiento del receptor inducido por el alérgeno.

El RFcεII pertenece a la superfamilia de las lectinas de tipo C. Es expresado por los monocitos, macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, LB y plaquetas, como también por las células epiteliales. Reconoce y une dos ligandos: el fragmento Fc de la IgE y la molécula CD21 (receptor de complemento de tipo 2 que integra el correceptor del LB). Puede mediar el transporte bidireccional de la IgE a través del epitelio promoviendo la liberación de anticuerpos IgE en la luz y también el transporte de alérgenos (que se hayan unido a la IgE) desde la luz hasta los sitios inductivos de las mucosas. Estas acciones favorecen tanto la desgranulación de los mastocitos como el ingreso de los alérgenos para poder ser captados por las células dendríticas y los LB. El RFcεII puede ser escindido por


102

proteasas y liberarse como receptor soluble. De esta forma puede interactuar con CD21 brindando una señal estimuladora al LB, promoviendo el cambio hacia IgE y perpetuando de esta manera el fenómeno alérgico.

ANAFILAXIA Es una reacción de hipersensibilidad que afecta a más de dos órganos o sistemas.

Está determinada por las características del antígeno, la dosis, la vía de penetración, el tipo de anticuerpo formado contra ese antígeno, la genética del individuo, entre otros.

Clásicamente está mediada por un mecanismo de hipersensibilidad de tipo I aunque también puede ocurrir en la hipersensibilidad de tipo II y III.

Los desencadenantes más frecuentes de las reacciones anafilácticas son: Alimentos: maní, huevo, mariscos, pescados, leche. Medicamentos: antibióticos betalactámicos, aspirina, ibuprofeno. Venenos de insectos, látex, polen.

La anafilaxia es un fenómeno inmediato, ya que los inmunocomplejos se forman rápidamente (segundos o minutos), y está mediada por anticuerpos llamados citotrópicos, es decir que tienen capacidad de fijarse a células.

Los anticuerpos citotrópicos se clasifican en: Homocitotrópicos, si tienen capacidad para fijarse a células homólogas (de la misma

especie). Ej. IgE en el hombre. Heterocitotrópicos, si tienen la capacidad de fijarse a células heterólogas (de

especie diferente). Ej. IgG.

Anafilaxia experimental La anafilaxia es útil para demostrar la participación de los anticuerpos como

mediadores del fenómeno, así como también para estudiar la dinámica propia de la reacción ya que se puede tener el control, entre otros factores, de la clase de anticuerpos inoculados.

La anafilaxia puede ser activa (mediada por anticuerpos homocitotrópicos) o pasiva (mediada por anticuerpos homocitotrópicos o heterocitotrópicos). Tanto la activa como la pasiva pueden tener manifestaciones locales o generales. Los pasos que se deben seguir


103

para desencadenar una reacción anafiláctica experimental en un animal de laboratorio (AL) son:

1. Sensibilización del animal: Se refiere a la existencia en el AL de anticuerpos específicos citotrópicos que pueden

originarse en el mismo animal, en forma activa, o pueden provenir de otro animal. En este último caso la sensibilización es pasiva y los anticuerpos pueden ser homo o heterocitotrópicos.

Tanto en la anafilaxia activa como en la pasiva debe esperarse un período de latencia entre la inoculación del antígeno o de los anticuerpos preformados y, la dosis del antígeno desencadenante del fenómeno. Durante este período, los anticuerpos citotrópicos se unen a mastocitos y a basófilos circulantes

2. Administración de la dosis de antígeno desencadenante: El fenómeno anafiláctico es mediado por la interacción del antígeno con anticuerpos

citotrópicos. El acontecimiento crítico es el entrecruzamiento de los receptores por un antígeno multivalente que a modo de puente une dos moléculas de anticuerpo vecinas (Figura 28).

Figura 28: Entrecruzamiento de receptores para Fc de inmunoglobulinas. Finalmente, ocurre la desgranulación de los mastocitos y basófilos involucrados con

la consecuente liberación de mediadores químicos preformados así como la síntesis de otros. Entre los mediadores preformados se encuentran la histamina, serotonina, heparina, proteasa neutra, factor activador de plaquetas, etc. y entre los sintetizados de novo se encuentran los leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos. Las consecuencias que produce la liberación de estos mediadores pueden circunscribirse a un tejido en particular

Receptor para Fc de Ig

Anticuerpo citotrópico

Antígeno multivalente

Mastocito/Basófilo


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(fenómeno local) o bien pueden afectar a todos los tejidos (fenómeno sistémico). En el laboratorio se observará un video donde se podrá visualizar la experiencia práctica de una Anafilaxia Cutánea Pasiva, descripta inicialmente por Ovary.

Choque o shock anafiláctico Cuando un alergeno reingresa en el torrente sanguíneo aún en dosis muy pequeñas,

en un individuo sensibilizado, puede causar la activación de los mastocitos asociados a los vasos sanguíneos del tejido conectivo. Esto causa una reacción de hipersensibilidad peligrosa que se conoce como Anafilaxia Sistémica o shock anafiláctico.

Las características de este choque anafiláctico difieren según la especie animal y es consecuencia, principalmente de los mediadores químicos liberados y de la ubicación de las células fijadoras de los anticuerpos. En general, se produce contracción de la musculatura lisa, sobre todo intestinal y bronquial, y aumento de la permeabilidad vascular. El choque anafiláctico en el hombre es un hecho poco común. Puede ocurrir por la inyección de sueros antitoxinas (proteínas séricas de caballo), antibióticos, drogas, vacunas, etc. El tracto respiratorio es el más afectado, pero también se observa picazón en las palmas de las manos, enrojecimiento de la piel, edema de glotis, disnea y colapso. Por regla general, ocurre edema obstructivo del árbol respiratorio superior, seguido de hipotensión y muerte.

HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO II Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II son mediadas por anticuerpos IgG o

IgM que reconocen antígenos presentes en la superficie celular o en la matriz extracelular. Estos anticuerpos participan de diferentes maneras en el desencadenamiento de este tipo de reacción:

Opsonizan células circulantes promoviendo su fagocitosis por macrófagos. Este mecanismo puede dar lugar a diferentes citopenias.

Activan el sistema complemento, a través de la vía clásica promoviendo el reclutamiento y la activación de neutrófilos, monocitos y macrófagos. Esto conduce a la aparición de cuadros inflamatorios que afectan preferentemente el glomérulo renal (glomerulonefritis), pequeños vasos (vasculitis) y las articulaciones (sinovitis).


105

Algunas de las patologías producidas por acción de anticuerpos dirigidos contra antígenos expresados en la superficie celular o en la matriz extracelular son: Eritroblastosis fetal, Anemia hemolítica autoinmune, Vasculitis, Púrpura trombocitopénica idiopática, Sindrome de Goodpasture, Enfermedad de Graves, Fiebre reumática, Anemia perniciosa, etc.

Como ejemplo de reacción de hipersensibilidad de tipo II se hará referencia a la Eritroblastosis Fetal y en particular a la reacción de Coombs como metodología de laboratorio que permite detectar los anticuerpos específicos responsables de la patología.

Eritroblastosis fetal La Eritroblastosis fetal es una enfermedad grave que puede llevar a la muerte del

feto. Se caracteriza por anemia hemolítica en grado variable. La hiperbilirrubinemia, secundaria al proceso hemolítico, puede ocasionar daño neurológico. En la mayoría de los casos es ocasionada por incompatibilidad Rh, aunque también puede ser secundaria a incompatibilidad de otros grupos sanguíneos (sistema ABO).

Durante el trabajo de parto es frecuente que cierto volumen de sangre escape desde la circulación fetal hacia la circulación materna. Además puede ocurrir que existan microfisuras placentarias que también favorezcan este pasaje. Estas razones hacen que si los glóbulos rojos del feto son Rh (+) y los de la madre son Rh (-), ella se sensibilice y desarrolle anticuerpos contra el antígeno D. En un embarazo posterior, si los glóbulos rojos del feto fueran Rh (+), los anticuerpos IgG maternos podrán atravesar la placenta (que posee receptores para el fragmento Fc de la IgG), y opsonizar a los eritrocitos fetales que serán eliminados y destruidos por el sistema mononuclear fagocítico, fundamentalmente por células de Kupffer del hígado y los macrófagos esplénicos.

Cabe destacar que la IgG unida a la superficie del eritrocito no puede activar la vía clásica del complemento, ya que la densidad de antígenos D expresada en la membrana del eritrocito es baja.

La enfermedad hemolítica del recién nacido puede prevenirse mediante la inmunización pasiva de la madre con un concentrado de anticuerpos del isotipo IgG que reaccionan con el antígeno D (inmunoglobulina anti-D). Las mujeres Rh (-) deben recibir


106

esta inmunoglobulina en dos momentos: en la semana 28 de gestación y dentro de las 72 horas posteriores al parto.

Desde el punto de vista diagnóstico, es importante señalar que los anticuerpos anti-Rh de la clase IgG no son capaces de aglutinar in vitro los eritrocitos Rh (+) debido a la baja densidad de antígenos D expresada en superficie. La aglutinación de los eritrocitos recubiertos por IgG anti-D puede ponerse de manifiesto mediante la reacción de Coombs, que también es de utilidad para detectar anticuerpos incompletos o bloqueantes. Esta reacción emplea un suero, llamado suero de Coombs, constituido por una mezcla de anticuerpos anti-IgG y anti-C3 (fracción de complemento). La Prueba de Coombs puede ser directa o indirecta.

Coombs directa: Detecta los anticuerpos IgG maternos unidos a la superficie de los

eritrocitos del feto o del recién nacido. El agregado del suero de Coombs a los eritrocitos inducirá aglutinación sólo en el caso de que éstos estén opsonizados por IgG maternas. Otra utilidad de esta prueba es la identificación de anticuerpos sobre eritrocitos de pacientes que padecen Anemia Hemolítica Autoinmune.

Coombs indirecta: Permite detectar anticuerpos IgG anti-Rh en el suero materno a fin de determinar si la madre se ha sensibilizado frente al antígeno D. Esta reacción también se utiliza para investigar la presencia de anticuerpos incompletos en el suero de pacientes con enfermedades crónicas bacterianas, como es el caso de la brucelosis.


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Primera parte Anafilaxia cutánea pasiva (ACP)

FUNDAMENTO:

Se inocula a un ratón, vía intradérmica, el suero de un animal inmunizado, se espera un período de latencia para permitir la fijación de los anticuerpos a las células granuladas basófilas y mastocitos y luego se inyecta el antígeno mezclado con Azul de Evans por vía intravenosa. La interacción antígeno-anticuerpo a nivel de los capilares provoca la liberación de mediadores químicos que alteran la permeabilidad capilar y producen la extravasación del colorante inyectado. Se observa una mancha azul en el punto de inoculación inicial lo que demuestra la correspondencia entre antígeno y anticuerpo. OBJETIVO: Demostrar la participación de anticuerpos específicos citotrópicos (IgG) en el fenómeno

de anafilaxia experimental. MUESTRA A ANALIZAR: Suero de conejo inmunizado activamente con ovoalbúmina. REACTIVOS Y MATERIALES: Ratones no inmunizados. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Antígeno: ovoalbúmina (OVA) 0,2 % en SF. Colorante: Azul de Evans 1 % en SF. Jeringas tipo tuberculina y agujas 25G5/8’’. Algodón. Alcohol. Tijeras. PROCEDIMIENTO: Rasurar la región dorsal del animal.


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Inocular en esa zona 0,1 ml de suero anti-ovoalbúmina vía intradérmica. Inocular a no menos de dos centímetros de la inoculación anterior 0,1 ml de SF como

control. Esperar 3 h como mínimo (período de latencia). Inocular vía intravenosa 1 ml de una mezcla de partes iguales de solución antigénica y

colorante. Cumplido el período de desencadenamiento de 30 min como mínimo, sacrificar el

animal, quitar la zona de piel rasurada y observar por transiluminación. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Para realizar la lectura debe comprobarse que en la zona de inoculación del control no se observe mancha.

Al observar la zona de inoculación del anticuerpo pueden darse dos situaciones: Situaciones Observación Resultado Interpretación

1 Mancha azul Positivo Especificidad antígeno-anticuerpo

2 No mancha azul Negativo No especificidad antígeno-anticuerpo

La intensidad y el tamaño de la mancha dependen del grado de sensibilización del

animal. Se puede medir el diámetro de las manchas y obtener el grado de positividad de la reacción. Se expresa en cruces:

Diámetro del halo (cm) Grado de positividad 0,5 +/- 1 +

1,5 ++ 2 o más +++/++++


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NOTAS: La aparición de una mancha azul en la zona de inoculación del antisuero es debida a la

extravasación del colorante de alto peso molecular producida por la alteración de la permeabilidad capilar.

El anticuerpo citotrópico puede ser bivalente, monovalente o incompleto. La dosis desencadenante de antígeno debe ser la adecuada para permitir la formación

del complejo antígeno-anticuerpo. El período de latencia varía según la concentración del anticuerpo y según la especie

animal. No se deben producir lesiones en la piel del animal pues esto conduciría a

extravasaciones no específicas del colorante. Utilizando este modelo experimental también se pueden determinar dosis mínimas

sensibilizantes de anticuerpos así como las condiciones óptimas de sensibilización. Es una reacción muy sensible: 1 μg/ml de antígeno desencadena la reacción

anafiláctica. Como animal de experimentación también se puede utilizar el cobayo.

Segunda parte Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs

indirecta FUNDAMENTO:

Los anticuerpos anti-Rh presentes en un suero al ponerse en contacto con glóbulos rojos O Rh positivo no producen aglutinación visible debido a la baja densidad del antígeno D sobre la membrana. Su presencia se detecta agregando en una segunda etapa un suero antiglobulina o suero de Coombs que producirá una aglutinación visible. OBJETIVO: Identificar anticuerpos anti-Rh en un suero.


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MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Antígeno: suspensión de glóbulos rojos O Rh positivo al 3 % en SF. Suero de conejo antiglobulina humana: Suero anti-inmunoglobulina G y anti-fracción C3

humanos obtenidos en conejo. Tubos de hemólisis. Pipetas automáticas y tips. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Baño de agua a 37 °C. Gradillas. Centrífuga. PROTOCOLO:

Reactivo Tubo1 (de reacción)

Tubo 2 (control)

GR O Rh+ al 3 % 0,1 ml 0,1 ml Suero a investigar 0,2 ml ------

SF ------ 0,2 ml Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 1 h. Lavar tres veces con SF en una relación de 20 volúmenes por cada volumen de

glóbulos rojos. Luego de cada centrifugación desechar el sobrenadante y antes de agregar nuevamente la solución de lavado, resuspender el sedimento.

Agregar a cada tubo 0,1 ml de suero de conejo antiglobulina humana. Incubar 15 min en baño de agua a 37 °C. Centrifugar. Resuspender y observar si hay aglutinación.


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RESULTADOS E INTERPRETACIÓN: Una vez que se ha verificado que el tubo control da correctamente, se procede a

hacer la lectura en el tubo de reacción, pudiéndose dar dos situaciones:

Tubo de reacción Observación Resultado Interpretación Situación 1 Presencia de grumos Positivo Presencia de anticuerpos anti-Rh Situación 2 Ausencia de grumos Negativo Ausencia de anticuerpos anti-Rh

NOTAS: Esta determinación puede realizarse en forma semicuantitativa efectuando diluciones

seriadas del suero a valorar. En este caso se determina el título. La prueba de Coombs indirecta también es de utilidad para investigar la presencia de

anticuerpos incompletos o bloqueantes que se producen en mayor concentración relativa por la multiestimulación con antígenos particulados tanto en el hombre como en los animales (ej: brucelosis crónica). Estos tienen la capacidad de unirse a su antígeno específico pero son incapaces de generar reacciones visibles por sus características fisicoquímicas. Recordar que se debe contar con un suero antiglobulina que reconozca los anticuerpos incompletos o bloqueantes de la especie en estudio.

MODELO DE INFORME

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs indirecta. Objetivo: Sistema: Resultado: Positivo/Negativo Interpretación:


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AUTOINMUNIDAD La Autoinmunidad se define como la presencia de LT con reactividad contra lo

propio o de anticuerpos autorreactivos y la Enfermedad Autoinmune como la secuela patológica de una respuesta inmune. La detección de LT autorreactivos o de los autoanticuerpos permite estudiar desde el laboratorio a las enfermedades autoinmunes. El análisis de los LT autorreactivos no es fácil de implementar en un laboratorio clínico, sin embargo es más sencillo demostrar la presencia de autoanticuerpos, lo que constituye la principal herramienta en el diagnóstico de las patologías autoinmunes.

En relación a la identificación de los autoanticuerpos se debe tener en cuenta que pueden encontrarse en individuos sin enfermedad aparente en bajos títulos y que su detección requiere de un umbral. Solamente los títulos que están sobre ese umbral tienen significado clínico. La ausencia de los autoanticuerpos no descarta un desorden autoinmune.

Las enfermedades autoinmunes son multifactoriales en cuanto a sus causas. Entre los principales factores se encuentran los genéticos, los hormonales y/o los ambientales. Según la distribución de los tejidos afectados las podemos clasificar en: Enfermedades órgano-específicas: la respuesta inmune está dirigida a antígenos de

determinados órganos o glándulas. Se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos específicos de órgano.

Enfermedades no órgano-específicas o sistémicas: la respuesta inmune está dirigida frente a antígenos no específicos de órgano. Se asocian con anticuerpos antinucleares. Los mecanismos de daño predominantes están dados por complejos inmunes circulantes y pueden afectar múltiples órganos.

ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA) La presencia de ANA es el denominador común de muchas enfermedades

autoinmunes sistémicas. La frecuencia es alta en Lupus Eritematoso Sistémico (LES), Síndrome de Sjögren, Esclerodermia, Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo y Hepatopatías Autoinmunes, entre otras. Su presencia en las distintas patologías tiene valor


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diagnóstico, pronóstico y de monitoreo, sin embargo también pueden estar presentes en enfermedades infecciosas, pacientes sanos y en personas de edad avanzada.

La primera referencia a la presencia de ANA surge en el año 1948, cuando se describen las células LE. Estas células son leucocitos polimorfonucleares que han incorporado material nuclear opsonizado por autoanticuerpos. Estos autoanticuerpos estaban dirigidos contra diferentes componentes nucleares. Hacia fines del año 1950 se desarrolló la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) empleando como sustratos cortes de tejidos de hígado o riñón de rata o ratón. En los últimos años se han incorporado líneas celulares como sustrato para la detección de ANA por IFI, siendo las HEp-2 las más usadas.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANA

El método recomendado actualmente para detección de autoanticuerpos es la IFI empleándose como sustrato tejidos animales o células de cultivo, según las características del autoanticuerpo que se quiera detectar (Figura 29).

Figura 29: Inmunofluorescencia indirecta.


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El fundamento de la IFI consiste en incubar cortes de tejido o monocapas de células fijadas y permeabilizadas, con el suero diluido del paciente. Después de lavados, que eliminan los anticuerpos no unidos al sustrato, se incuba con anti-inmunoglobulina humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Posteriormente se lava, se realiza el montaje y se observa en el microscopio la fluorescencia de las estructuras celulares que se han unido a sus anticuerpos específicos.

Por ser una técnica manual y subjetiva requiere de un observador muy experimentado para la lectura de los resultados. Esto hace necesario la estandarización de las distintas variables propias de esta técnica lo que permite asegurar la calidad en la determinación de los ANA. Entre estas variables se pueden mencionar: Microscopio de fluorescencia: dada la variedad de fuentes de luz y filtros disponibles,

la elección del microscopio es muy importante. Las lámparas pueden ser halógena, de mercurio o sistema de LED. La magnificación recomendada para la observación de los preparados es de 400X.

Recolección y almacenamiento de las muestras: se emplea suero. Este debe conservarse entre 2 y 8 °C si se procesa dentro de las 72 h, de lo contrario se debe conservar a -20°C. Evitar congelamientos y descongelamientos sucesivos que podrían alterar los resultados. No usar muestras muy hemolizadas o lipémicas.

Elección del sustrato: Durante muchos años se utilizaron cortes de hígado o de riñón de rata o ratón para la detección de anticuerpos antinucleares y/o anticitoplasmáticos. En la actualidad han sido reemplazados por monocapas de células tumorales, siendo las más utilizadas las células epiteliales humanas procedentes de un carcinoma laríngeo mantenidas en cultivo conocidas como HEp-2 (Figura 30). Las ventajas de utilizar células HEp-2 en lugar de tejidos de roedores son:

- Es un sustrato más sensible porque presenta mayor concentración de antígenos. - Tiene mayor especificidad por ser de origen humano. - Al provenir de un cultivo celular asincrónico permite la detección de anticuerpos

contra múltiples estructuras nucleares, citoplasmáticas y relacionadas con la división celular.

- Los núcleos presentan mayor tamaño por lo que los patrones de fluorescencia son más fáciles de visualizar.

- La distribución antigénica es uniforme.


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Figura 30: Distribución celular de los antígenos en las HEp-2.

Conjugado fluorescente: Los anticuerpos conjugados con isotiocianato de fluoresceína

son los más usados. El conjugado puede ser anti-IgG o anti-GAM. La mayoría de los autoanticuerpos

asociados a enfermedades autoinmunes sistémicas son de isotipo IgG. La relación Fluoresceína (F)/Proteína (P) debe estar entre 2,5-4,0. Si la relación F/P es mayor, aumentará la tinción fluorescente no específica y si es menor disminuirá la fluorescencia específica obteniéndose resultados falsos negativos. La relación Anticuerpo específico/Proteína debe ser aproximadamente 0,1 o mayor, si es menor disminuye la especificidad.

La concentración final (dilución de trabajo) del anticuerpo marcado específico debe estar entre 30 y 60 µg/ml. La dilución de trabajo es determinada por titulación. Para ello se debe contar con un suero de referencia de título conocido (control positivo, C (+)) y con un suero negativo (control negativo, C (-)). Se realiza la determinación frente a diluciones seriadas del conjugado, por ejemplo 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800, enfrentándolas con diluciones seriadas del C (+) y C (-). Estas diluciones deben cubrir el rango por encima y por debajo del título asignado al C (+). Por ejemplo, si el control positivo tiene un título de 1/640, se pueden obtener los resultados que figuran en el siguiente cuadro:


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Cuadro 3: Titulación del anticuerpo conjugado.

Se define como título plateau a la mayor dilución del C (+) que es positivo en al menos tres diluciones diferentes y consecutivas del conjugado, luego el título cae abruptamente. En el ejemplo: 1/640.

La mayor dilución del conjugado que permite obtener el plateau se denomina punto final del plateau. En el ejemplo: 1/400.

La dilución óptima de trabajo del conjugado es un cuarto de la dilución del punto final del plateau. En el ejemplo: 1/100.

Además se debe realizar un control de PBS (control de coloración inespecífica). La titulación del conjugado debe realizarse cada vez que se use un lote nuevo de

conjugado, si se cambia el sustrato o la lámpara del microscopio o ante la falta de resultados adecuados en los controles.

La IFI también resulta adecuada para la detección de otros autoanticuerpos como

anti-músculo liso, anti-citoplasma de neutrófilo, anti-endomisio, anti-mitocondria, etc. Se deben utilizar cortes de tejidos o células según la especificidad del anticuerpo que se quiere detectar.

-


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Investigación de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta.

FUNDAMENTO:

Empleando como sustrato células HEp2 obtenidas en cultivo y dispuestas en monocapa en una impronta y un anticuerpo anti-gammaglobulina humana marcado con isotiocianato de fluoresceína, es posible identificar en el suero de un individuo la presencia de autoanticuerpos mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta. OBJETIVO: Investigación de anticuerpos antinucleares en un suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Sueros control positivo y negativo. Anti-gammaglobulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína obtenida en

cabra. Improntas HEp2. Jarras de Coplin. Buffer PBS, pH 7,2. Cubreobjetos. Cámara húmeda. Medio de montaje: glicerina tamponada. Pipetas automáticas y tips. Microscopio de fluorescencia.


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PROTOCOLO: Diluir el suero desconocido 1/80 en PBS. Cubrir bien los pocillos de la impronta con el suero control positivo, suero control

negativo y dilución del suero incógnita, sin tocar el pocillo con el tip. Incubar durante 30 min en cámara húmeda a temperatura ambiente. Lavar en jarra de Coplin con buffer PBS 2 veces durante 5 min cada vez. Retirar y secar los bordes con papel absorbente sin tocar los sustratos. Evitar que estos

se sequen completamente. Cubrir con anti-gammaglobulina marcada diluida convenientemente (dilución de trabajo

obtenida mediante la titulación del conjugado). Incubar 30 min en cámara húmeda a temperatura ambiente y al resguardo de la luz. Lavar en jarra de Coplin con buffer PBS 2 veces durante 5 min cada vez. Retirar, quitar el exceso con papel absorbente. Colocar unas gotas de medio de montaje entre áreas reactivas y cubrir con un

cubreobjetos limpio y desengrasado. Realizar la observación microscópica en cuarto oscuro. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Observación Resultado Interpretación

Patrón fluorescente nuclear y/o citoplasmático definido

Positivo Presencia de anticuerpos específicos

No se discrimina un patrón fluorescente definido

Negativo Ausencia de anticuerpos específicos

Un resultado positivo debe estar acompañado por el título y el patrón correspondiente.

NOTAS: Las improntas deben sacarse del envase inmediatamente antes de su uso.


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Los lavados permiten eliminar el exceso de proteínas no fijadas. Al realizarlos, evitar agregar el buffer directamente sobre la impronta.

El pH del líquido de montaje debe ser 8,0 o mayor. La titulación del conjugado es indispensable, ya que permite la correcta diferenciación

entre un resultado positivo y uno negativo. Toda muestra positiva debe ser titulada para lo cual se realizan diluciones razón 2 del

suero a partir de la dilución inicial de trabajo. Se repite la técnica y se determina el título que estará dado por la inversa de la mayor dilución del suero que da positivo.

Los sueros control positivo y negativo provistos en el equipo comercial se usan sin diluir. Sin embargo, también pueden usarse sueros humanos positivos y negativos comprobados, diluidos 1/80 en PBS.

Comprobar que el resultado de los controles sea el esperado, caso contrario se invalida la determinación.

En esta técnica es muy importante el entrenamiento del observador, que condiciona la positividad o negatividad de un resultado.

Los patrones de fluorescencia son orientativos del autoanticuerpo involucrado siendo necesario el empleo de técnicas como LIA, ELISA o western blot para poder definir la correcta especificidad.

Según el Primer Consenso Argentino para la Estandarización de la Determinación de Anticuerpos Anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta-HEp-2 se debe informar el patrón de fluorescencia nuclear y el patrón de fluorescencia citoplasmática, indicando el título en cada caso.

MODELO DE INFORME

Trabajo Práctico Nº 8 Investigación de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta Objetivo: Resultado:

Positivo/negativo. Patrón.

Interpretación:


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INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS

Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogéneo de enfermedades genéticas de muy baja incidencia, caracterizadas por alteraciones cualitativas o cuantitativas que comprometen, en forma individual o combinada, los distintos componentes del sistema inmune: los LB responsables de la inmunidad humoral, los LT responsables de la inmunidad celular, el sistema fagocítico (polimorfonucleares y mononucleares) y/o el sistema complemento. El conocimiento de las IDP ha contribuido a la comprensión de muchas funciones normales del sistema inmune.

La incidencia de estas enfermedades es de 1 cada 10000 recién nacidos vivos, siendo el 65 % debido a deficiencias humorales, 5 % a celulares, 15 % son IDP combinadas (celular/humoral), 10 % afectan a células fagocíticas y el 5% restante son deficiencias del complemento. Los defectos inmunitarios pueden ser cuantitativos o funcionales.

La principal manifestación de las IDP es la aparición de infecciones causadas por bacterias, virus, parásitos u hongos, que resultan ser no patógenos para la población inmunocompetente. Estas infecciones son generalmente graves y complicadas, y además recidivantes y prolongadas en el tiempo. El tipo de microorganismo (bacterias, virus, hongos, parásitos) prevalente en cada paciente guarda relación con el tipo de inmunodeficiencia que éste padece. Estos procesos infecciosos no se limitan a un solo órgano, sistema o localización, y se repiten en distintas localizaciones y sistemas a lo largo del tiempo.

Dado que se trata de enfermedades bastante infrecuentes, siempre deben tenerse en cuenta otras causas predisponentes de infecciones recidivantes, como las enfermedades metabólicas, las malformaciones estructurales (en el aparato respiratorio o urinario por ejemplo) y el tratamiento con inmunosupresores. A su vez, hay infecciones, como es el caso de la infección por HIV, que pueden causar inmunodeficiencia (inmunodeficiencia secundaria).


122

EL DIAGNÓSTICO DE LAS IDP Existen varias clasificaciones de las inmunodeficiencias primarias. La LAGID (Latin

American Group of Immunodeficiencies) según el fenotipo, describe las siguientes categorías diagnósticas:

Deficiencias combinadas (celulares y humorales). Deficiencias predominantes de anticuerpos. Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas a otros defectos mayores (como los

síndromes de ataxia telangiectasia y de Wiskott Aldrich, entre otros). Inmunodeficiencias asociadas con defectos del fagocito. Defectos del complemento.

El estudio de laboratorio básico para el diagnóstico correcto de una inmunodeficiencia primaria consiste en:

Hemograma con recuento y fórmula leucocitaria. Estudio de las principales subpoblaciones de linfocitos circulantes (T, B, NK y dentro

de las T: CD4+ y CD8+). Búsqueda de anticuerpos preexistentes (isoaglutininas). Cuantificación de inmunoglobulinas séricas (IgA, IgG e IgM).

Si alguno de estos parámetros no se encuadra dentro de los valores considerados normales, el diagnóstico se enfocará hacia una inmunodeficiencia primaria. Si dieran normales, se siguen con otras pruebas elegidas en base a la sintomatología del paciente. Entre los estudios que se realizan hay ensayos cuantitativos y funcionales.

En este Trabajo Práctico se hará referencia a dos de estas determinaciones, la semicuantificación de isoaglutininas y la cuantificación de inmunoglobulinas.

ISOAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B Los eritrocitos humanos presentan en la superficie los aloantígenos del sistema ABO.

Su presencia o ausencia permite clasificar a los glóbulos rojos en grupos sanguíneos A, B, AB u O. El polimorfismo genético ABO genera finalmente diferencias en los carbohidratos de los glucolípidos presentes en la superficie de los glóbulos rojos (ver Trabajo Práctico N° 1).


123

En el suero de los seres humanos están presentes de manera natural anticuerpos que reaccionan con los antígenos A y/o B del sistema ABO. Los determinantes antigénicos de los glóbulos rojos humanos se comportan como antígenos timo-independientes y estimulan solo la producción de anticuerpos del isotipo IgM (Cuadro 4). Cada individuo genera anticuerpos que reconocen el determinante antigénico que no posee en sus propios glóbulos rojos.

Cuadro 4: Antígenos de membrana de los eritrocitos e isoaglutininas séricas de acuerdo al

grupo sanguíneo.

Estos anticuerpos que se conocen con el nombre de isoaglutininas se forman como

consecuencia del estímulo continuo que generan los determinantes antigénicos A y B presentes en bacterias del tracto gastrointestinal, como por ejemplo Escherichia coli.

La investigación de isoaglutininas se realiza para determinar incompatibilidades en la transfusión sanguínea (son responsables de la hemólisis masiva de los eritrocitos transfundidos porque activan el sistema complemento por vía clásica). También se realiza previo a un trasplante de órganos para detectar el grado de sensibilización del receptor. Otra utilidad es para evaluar la respuesta inmune humoral ante la sospecha de una IDP ya que estos anticuerpos se generan en forma natural desde muy temprana edad como consecuencia de la colonización bacteriana del intestino poco después del nacimiento.

CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS El método de elección para cuantificar las inmunoglobulinas de mayor concentración

sérica, como son la IgG, IgA e IgM es la IDRC. El fundamento de este método ha sido explicado en el Trabajo Práctico N° 5.

Grupo sanguíneo Antígeno presente en la membrana del glóbulo rojo

Isoaglutininas (anticuerpos séricos)

A A Anti-B B B Anti-A

AB A y B No posee anticuerpos O No posee antígenos A ni B Anti-A y Anti-B


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Primera parte Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo

FUNDAMENTO:

Si se efectúan diluciones seriadas de un suero en el cual se quiere investigar la presencia de isoaglutininas (anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos del sistema ABO) y se agrega un volumen constante de una suspensión de glóbulos rojos que presenten el isoantígeno correspondiente, es posible determinar el título de dichos anticuerpos. OBJETIVO: Semicuantificar isoaglutininas en un suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano inactivado 30 min a 56 °C. REACTIVOS Y MATERIALES: Antígeno: suspensión de hematíes del grupo A o B al 2,5 % en SF. Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M. Semimicrotubos o tubos de Khan y gradillas. Pipetas automáticas y tips. PROTOCOLO: Preparar una serie de ocho semimicrotubos. En el primero colocar 0,4 ml de SF y en los siguientes 0,25 ml de la misma solución. Al primer tubo agregar 0,1 ml de suero anti-A o anti-B inactivado a investigar. Mezclar.

Transferir 0,25 ml del primer tubo al segundo y así sucesivamente hasta el tubo Nº 7 del que se extraen 0,25 ml y se desechan. El último tubo se usa como control negativo.


125

Agregar a todos los tubos 0,1 ml de glóbulos rojos A o B al 2,5 %. De este modo quedan realizadas diluciones razón 2 a partir del primer tubo cuya dilución es 1/7.

Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min. Resuspender suavemente. Observar y

determinar la máxima dilución aglutinante. RESULTADO:

Se expresa el título de isoaglutininas. NOTA: Para evitar la activación del sistema complemento y que esto interfiera en la reacción, el

suero debe ser calentado a 56 °C durante 30 min previo a su uso.

Segunda parte Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial

cuantitativa (IDRC) FUNDAMENTO:

Cuando un antígeno difunde a través de un agar que contiene anticuerpos monoespecíficos para dicho antígeno, se producirá un halo de precipitación. El diámetro del halo será directamente proporcional a la concentración del antígeno, si se mantiene la concentración del anticuerpo constante y en exceso en el agar. OBJETIVO: Determinar la concentración de IgG, IgA o IgM en suero. MUESTRA A ANALIZAR: Suero humano. REACTIVOS Y MATERIALES: Placas comerciales para IDRC conteniendo anticuerpos monoespecíficos.


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Sueros testigos de concentración conocida. Jeringas Hamilton. Cámara húmeda. Dispositivos para medir halos. PROTOCOLO: Sembrar 5 μl del suero a investigar por duplicado. En la misma placa sembrar 5 μl de los testigos de alta, media y baja concentración. Dejar difundir en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 a 72 h o hasta

constancia del diámetro del halo de precipitación. Medir el diámetro de los halos de precipitación. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Graficar la curva de calibrado: concentración del antígeno (mg/ml) presente en el suero testigo versus su correspondiente radio al cuadrado (r2). Hallar la concentración de la inmunoglobulina en estudio por interpolación, mediante el r2 correspondiente. NOTA: Si no se cuenta con los sueros testigos el resultado se obtiene utilizando la tabla que

provee el fabricante.

MODELO DE INFORME TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 Primera parte: Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo. Objetivo: Sistema: Resultado: Segunda parte: Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC). Objetivo: Sistema: Resultado:


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INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS

Las ID secundarias o adquiridas se producen como consecuencia de neoplasias, infecciones virales, tratamiento de enfermedades específicas con algunos fármacos y malnutrición entre otras causas. El principal ejemplo de inmunodeficiencia secundaria a una infección viral es el SIDA, causada por la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Este virus infecta y elimina los LT CD4+, destruyendo la función de los LT colaboradores.

EL VIH Y SU DIAGNÓSTICO El VIH es un retrovirus que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. Estos virus se

caracterizan por tener una organización genómica compleja, afectan el sistema nervioso, producen viremia persistente, inmunodeficiencia y largos períodos de infección asintomática. La partícula viral contiene dos cadenas simples de ARN idénticas.

Existen dos tipos de virus denominados VIH-1 y VIH-2 y, de cada uno de ellos varios grupos y subgrupos. Las proteínas codificadas en el genoma del virus son inmunogénicas en el organismo infectado y se distinguen tres grupos principales de antígenos. Las proteínas gag o de la cápside (p55, p24 y p17), las glicoproteínas de la envoltura (gp160, gp120 y gp41) y las proteínas pol (p66, p51 y p31) entre las que se encuentra la polimerasa inversa.

El diagnóstico de laboratorio de la infección con VIH presenta cuidados especiales desde la consulta del paciente hasta la entrega del resultado. Aquí se hará referencia resumidamente a la metodología.

El laboratorio clínico se centra en la detección de los antígenos del virus o ácidos nucleicos circulantes y en la identificación de anticuerpos específicos. Para ello se utilizan métodos directos e indirectos. En los primeros se estudia la presencia del virus o sus partes (antigenemia). El principal antígeno buscado mediante inmunoensayos es la proteína p24. También pueden detectarse las secuencias genéticas del virus por PCR. En los métodos indirectos se investiga la presencia de anticuerpos contra el virus utilizando inmunoensayos.


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Inicialmente se recurre a ensayos de screening o cribado, altamente sensibles que permiten asegurar un resultado negativo. Luego, se procede a confirmar los resultados positivos (reactivos) mediante pruebas más específicas. Esto permite descartar los resultados falsos positivos encontrados en el screening y que pudieran deberse a reacciones cruzadas. Los inmunoensayos de screening disponibles son del tipo aglutinación pasiva, ELISA, dot blot y ensayos quimioluminiscentes. Algunas de estas pruebas combinan la búsqueda de p24 y anticuerpos contra el VIH-1 y el VIH-2 de manera simultánea. Entre los ensayos confirmatorios el más utilizado es el western blot. Éste es una prueba altamente específica e incluso, algunos kits comerciales permiten distinguir la presencia de anticuerpos contra VIH-1 y VIH-2.

WESTERN BLOT El western blot o inmunotransferencia ofrece una herramienta reproducible y muy

sensible para el estudio de una o más proteínas incluidas en una mezcla o bien, la búsqueda de anticuerpos específicos. El método consiste en separar, en una primera etapa, una mezcla de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida y luego transferirlas a una membrana sintética donde quedan inmovilizadas y se pueden analizar. Habitualmente, la transferencia se logra bajo un campo eléctrico (electrotransferencia), aplicado en sentido transversal a la corrida electroforética inicial, obteniéndose una réplica en espejo del patrón del gel (Figura 31). Existen distintos tipos de membranas sintéticas, capaces de unir proteínas, que se utilizan en estos ensayos. Las más comunes son las de nitrocelulosa y las de difluoruro de polivinilideno (PVDF).

A continuación, se realiza sobre la membrana el revelado de la o las bandas de interés. En los casos en que se investigue la presencia de un antígeno en particular, el procedimiento continúa con la incubación de la membrana con los anticuerpos específicos adecuados y luego, con la anti-gammaglobulina conjugada. Cuando lo que se estudia es la presencia de un anticuerpo en un suero, la membrana se incuba con dicho suero y luego, con una anti-gammaglobulina unida a una marca. Esta última suele ser una enzima.

El estudio de un complejo antígeno-anticuerpo inmovilizado en un soporte provee de ventajas adicionales. La más importante es que la visualización de la banda no depende de la formación de un complejo inicialmente visible, sino de la amplificación que proporciona el


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uso de anticuerpos en la inmunodetección. El análisis de los resultados se basa en la visualización de una o varias bandas que se corresponden con la presencia del antígeno o anticuerpo investigado.

Figura 31: Western blot (revelado inmunoenzimático).

Cabe recordar algunos aspectos de la separación electroforética que se realiza como

primer paso. La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es uno de los métodos más comunes y utilizados en el estudio de proteínas. La misma se puede realizar sin dodecilsulfato de sodio (SDS), conocida como electroforesis nativa; o con SDS, llamada electroforesis desnaturalizante. En este último caso puede o no tratarse la muestra con un agente reductor de los enlaces disulfuro de las proteínas (Ej. 2-mercaptoetanol, ditiotreitol).

Al realizar un PAGE-SDS, la movilidad electroforética diferencial de los polipéptidos en presencia de un campo eléctrico estará determinada fundamentalmente por sus pesos moleculares (PM) más que por su relación carga/masa. En consecuencia, el efecto de tamiz molecular del entramado del gel es el responsable de la separación. Por esta razón, el PAGE-SDS permite determinar el PM aparente de las proteínas separadas. Para ello se deben correr simultáneamente con las muestras marcadores de PM conocidos. El logaritmo de los PM de estos marcadores (expresado en daltons) será proporcional a las respectivas


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movilidades relativas (Rf). Luego, con las movilidades relativas de las proteínas pueden interpolarse en la gráfica sus respectivos PM aparentes (Figura 32).

Figura 32: Curva Rf vs. log PM.

WESTERN BLOT Y VIH

El western blot permite confirmar los casos en que resulta reactivo, mediante alguna técnica de screening, un suero donde se quiere determinar la posible infección por VIH. En este caso se separa por electroforesis una mezcla de proteínas antigénicas del VIH-1 inactivado y parcialmente purificado. Estas bandas son electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa donde luego se realiza la incubación con el suero del paciente y posterior revelado. Algunas pruebas agregan en un extremo de la membrana una banda de un péptido sintético propio del VIH-2. Como en todo inmunoensayo se requiere del procesamiento en paralelo de sueros controles positivos y negativos. Un resultado positivo, negativo o dudoso estará determinado por el criterio que dicte la organización o institución de referencia en salud (OMS, Centro de Control de Enfermedades Estadounidense, etc.) que se siga. Por ejemplo, el CCE de EEUU determina como resultado positivo la presencia de dos bandas cualesquiera: p24, gp41, gp120/gp160.

Si bien el Trabajo Práctico que se realizará no involucra la búsqueda de anticuerpos anti-VIH, se trabajará de forma análoga en la búsqueda de un anticuerpo de interés en un suero de conejo por western blot.

Rf

log PM

Rf

log PM


131


Investigación de anticuerpos por western blot FUNDAMENTO:

Una mezcla antigénica es inicialmente separada por PAGE-SDS tras la cual se transfiere, bajo un campo eléctrico, a una membrana de nitrocelulosa donde se fija. Luego, se incuba con el suero donde se investiga la presencia de anticuerpos específicos. Finalmente, se realiza la inmunodetección mediante el agregado de un anticuerpo anti-gammaglobulina, conjugado con peroxidasa. La presencia de anticuerpos específicos en la muestra se evidencia por la aparición de una banda de color luego del revelado cromogénico.

OBJETIVO: Determinar la presencia de anticuerpos anti-lisozima de clara de huevo. MUESTRA A ANALIZAR: Suero de conejo. REACTIVOS Y MATERIALES: Tratamiento de la muestra: Clara de huevo diluida ¼ con agua destilada. Buffer muestra 2X (dos veces concentrado): Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 4 %, 2-

mercaptoetanol 5 %, glicerol 20 %, azul de bromofenol 0,02 %. PAGE-SDS: Solución de Acrilamida-Bisacrilamida 30:0,8. Buffer gel de resolución: Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8. Buffer gel de apilamiento: Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8. Solución de SDS 10 %. Buffer de corrida: Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M, pH 8,3, SDS 0,1 %.


132

Vasos de precipitados. Pipetas de vidrio, pipetas Pasteur y pipetas autmomáticas y tips. Dispositivo de armado de geles, placas de vdrio, separadores, peine, broches. Cuba de electroforesis y fuente de poder.

Electrotransferencia e inmunorevelado: Buffer de Transferencia: Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, metanol 20 %, pH 8,3. Colorante de membrana reversible: Rojo Ponceau S 0,5 % en ácido tricloroacético 5%. Decolorante Rojo Ponceau: agua destilada. Buffers:

TBS: Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M. TBS-Tween 20 0,1 % (solución de lavado). TBS-Leche descremada 5 % (solución de bloqueo). TBS-Tween 20 0,1 %-Leche descremada 1 % (solución para la dilución de antisueros).

Segundo anticuerpo: conjugado anti-IgG de conejo obtenido en cabra marcado con peroxidasa en dilución adecuada.

Sustrato: disolver 30 mg de 4-cloronaftol en 10 ml de metanol en un tubo protegido de la luz con papel aluminio. Por otro lado agregar 300 l de agua oxigenada (30 vol) en 50 ml de TBS. Mezclar ambas preparaciones y usar inmediatamente.

Recipientes de fondo plano. Grillas y esponjas para armar el sándwich, papel de filtro, membrana de nitrocelulosa. Cuba de transferencia y fuente de poder. PROTOCOLO: Tratamiento de la muestra con SDS Mezclar partes iguales de la clara de huevo diluida y buffer muestra 2X. Llevar a baño

de agua a 100 °C durante 3 min. Retirar y dejar enfriar. PAGE-SDS Armar y ajustar el dispositivo donde se formará la placa de gel vertical.


133

Preparar la mezcla del gel de resolución y agregar lentamente en el dispositivo de armado. Sobre la mezcla del gel de resolución agregar agua destilada que nivela y elimina burbujas de la superficie y minimiza el contacto con el aire. Esperar hasta gelificación total.

Retirar el agua por sobre el gel de resolución. Situar el peine que formará las calles de siembra. Cargar la mezcla del gel de apilamiento. Esperar hasta gelificación total.

PAGE-SDS Gel de Resolución 15 % Gel de Apilamiento 4 % Buffer gel 3,8 ml 1,7 ml Acrilamida-Bisacrilamida 7,5 ml 0,9 ml SDS 10 % 150 μl 66 μl Agua destilada 3,6 ml 4,1 ml

Mezclar Persulfato de amonio * 75 μl 33,4 μl TEMED 5 μl 3,3 μl

Armar la cuba electroforética con la placa de gel. Cargar el buffer de corrida en los compartimentos catódico y anódico. Retirar el peine con cuidado. Sembrar las muestras en cada calle (el volumen será

determinado en el momento). Conectar los electrodos a la fuente de poder. Programar las condiciones de corrida:

voltaje, amperaje y tiempo. V 200

mA 30 Tiempo (h) 2

Finalizado el tiempo de corrida desconectar la fuente de poder, descartar los buffers y

conservar la placa de gel. Hacer un corte de referencia en el extremo inferior derecho o última calle.

Es posible colorear irreversiblemente el gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 0,05 % para detectar las bandas de proteínas separadas o continuar con la electrotransferencia como será nuestro caso.


134

Electrotransferencia Diez minutos antes de finalizar la corrida electroforética embeber la membrana de

nitrocelulosa, los papeles de filtro y la grilla con esponjas en buffer de transferencia. Terminada la corrida electroforética, retirar el gel y sumergirlo en buffer de transferencia

durante 10 min aproximadamente para equilibrar, eliminar sales y SDS. Proceder al armado del “sándwich” con los elementos mencionados, sobre la grilla y

bajo buffer de transferencia: 1. Colocar una de las esponjas sobre una de las grillas. 2. Colocar sobre ella 3 papeles de filtro. 3. Colocar la placa de gel. 4. Colocar la membrana de nitrocelulosa sobre el gel desde un extremo hacia el otro

para evitar que queden atrapadas burbujas. 5. Sobre la membrana colocar otros 3 papeles de filtro. 6. Eliminar con cuidado posibles burbujas deslizando suavemente un tubo de ensayo

sobre el conjunto formado. 7. Colocar la esponja restante y cerrar el conjunto con la otra grilla.

Llevar el conjunto armado a la cuba de transferencia, sumergir el “sándwich”, tapar y conectar los cables a la fuente de poder.

Programar las condiciones de corrida: voltaje, amperaje y tiempo. V 75

mA 350 Tiempo (h) 1

Para constatar la transferencia eficiente de las proteínas realizar una coloración

reversible con Rojo Ponceau S durante 3 min y decolorar con agua destilada hasta visualizar las bandas. Luego proseguir con el lavado hasta decoloración total.

Inmunorevelado Realizar el bloqueo de la membrana de nitrocelulosa con TBS-L durante toda la noche. Lavar con TBS-T por 5 min 2 veces.


135

Incubar la membrana con la dilución adecuada del suero de conejo durante una hora a temperatura ambiente.

Lavar con TBS-T por 5 min 6 veces. Incubar la membrana con la dilución adecuada del segundo anticuerpo durante una hora

a temperatura ambiente. Lavar con TBS-T por 5 min 6 veces. Agregar la solución que contiene al sustrato. Tapar y dejar revelar. Frenar la reacción

enzimática por lavados con agua destilada. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:

Observar la aparición de una banda de color en la membrana de nitrocelulosa. De ser así, calcular gráficamente el PM aparente.

La presencia de una banda de 14 kDa (lisozima) indica la presencia de anticuerpos específicos. NOTAS: Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente. El oxígeno retarda la gelificación por lo que se debe minimizar la formación de burbujas

durante la preparación de las mezclas. La placa gelificada puede conservarse en la heladera para ser usada más tarde.

MODELO DE INFORME TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 Investigación de anticuerpos por western blot Objetivo: Sistema: Resultado:

Positivo, indicar PM aparente/Negativo Adjuntar la curva Rf vs. log PM.

Interpretación:

APÉNDICES

APÉNDICE I Guía Teórico-Práctica de Inmunolgía UNS

139

BIOSEGURIDAD

El término bioseguridad está compuesto por el vocablo “seguro” que significa libre de peligro, daño o riesgo, y el prefijo “bio” que significa vida. Bioseguridad se puede entender, entonces, como protección a la vida, o bien seguridad biológica o también ausencia o control de riesgos para los seres vivos, en particular el ser humano. Como se ve, el término es un neologismo que posee una acepción amplia en su significado.

Pero, en cualquier caso, el control de riesgos o el logro de una condición segura para el hombre están íntimamente relacionados con el modo de evitar accidentes, y esto se consigue definiendo todos los factores y todas las situaciones potenciales de riesgo en las maniobras que se realicen dentro del Laboratorio de Inmunología. Este análisis permitirá elaborar rutinas de prevención de accidentes, en particular en la manipulación de material potencialmente patógeno.

Con respecto a los factores de riesgo que se ponen en juego en una tarea específica, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) define como riesgo a una probabilidad para que se produzca un daño en un individuo o un grupo poblacional en un ámbito determinado. Los riesgos potenciales de los laboratorios en general, se pueden clasificar en: químicos (ácidos, bases, sustancias cancerígenas, mutagénicas, teratogénicas, isótopos radiactivos); ambientales (térmicos, eléctricos, etc.); y biológicos (bacterias, virus, hongos, parásitos y animales o vegetales de laboratorio).

Sin embargo, también debe considerarse otro aspecto importantísimo como son las situaciones potenciales de riesgo asociadas con las conductas al ejecutar el trabajo. De esta manera, a modo de ejemplo, se pueden señalar situaciones o conductas que ponen en riesgo: impericia (ignorancia o falta de conocimientos), imprudencia (obrar descuidadamente sin poner toda la atención requerida), negligencia (obrar deliberadamente mal o de una manera desaprensiva), y muchas situaciones que se podrían encuadrar en algunas de las tres descriptas, por ejemplo, excesiva confianza, falso coraje, falta de atención, acostumbramiento a una determinada situación, y muchas otras variantes.

Los objetivos de la bioseguridad son abarcativos no solamente de la protección del individuo, sino también de la comunidad y del medio ambiente. Esta es la razón por la que


140

todo residuo contaminado con líquidos potencialmente patógenos debe eliminarse de manera segura.

CONTAMINACIÓN E INFECCIÓN Cuando un microorganismo toma contacto con un individuo se dice que hay

contaminación. El concepto también es válido cuando el contacto se produce con objetos inanimados, por ejemplo una mesada, pipetas, tips, varillas, etc.

Las vías y modos principales de contaminación se resumen en la tabla siguiente:

VÍA MODO Aérea Inhalar aerosoles microbianos.

Digestiva Pipetear con la boca.

Cutánea Inoculación con elementos cortopunzantes. Contacto con fluidos y elementos contaminados. Piel con soluciones de continuidad.

Conjuntiva Salpicaduras y aerosolizaciones. Contacto con lentes contaminadas de microscopios o lupas.

La palabra infección deriva del vocablo latino inficere, que significa meter, introducir.

Infección, entonces, supone la existencia de microorganismos en el organismo del hospedador y puede definirse como el proceso por el cual esos microorganismos que han entrado en el hospedador logran establecerse y desarrollar.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD El Centro para el Control de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés: Center

for Disease Control), organismo público norteamericano que se dedica al monitoreo y seguimiento epidemiológico de las enfermedades; y al diseño, regulación de normas y procedimientos para el control de las mismas, publica un folleto titulado: “Clasificación de los agentes etiológicos según su peligrosidad”, que desde 1969 ha servido como referencia para establecer los riesgos relativos al trabajo con agentes biológicos.


141

Esta clasificación establece cuatro niveles de peligrosidad de acuerdo a la patogenicidad del microorganismo y al riesgo que implica para el operador, para la comunidad y para el ambiente.

En el Nivel 1 de bioseguridad se incluyen aquellos agentes que no poseen potencial patogénico conocido para las personas inmunocompetentes. Presentan escaso riesgo individual y comunitario. En general, son los que utilizan los alumnos en trabajos prácticos. Ejemplos de estos microorganismos son: Bacillus subtilis, Escherichia coli y otros.

Los agentes incluidos en el Nivel 2 de bioseguridad son los que se encuentran con mayor frecuencia en las muestras clínicas. Poseen un riesgo individual moderado y limitado riesgo comunitario. Incluyen todos los agentes comunes de enfermedades infecciosas, así como algunos patógenos menos usuales. Por ejemplo: virus de la hepatitis B, Mycobacterium tuberculosis, especies de Salmonella y Shigella, y otros.

Al Nivel 3 pertenecen ciertos agentes como Brucella spp., algunos arbovirus y arenavirus, lentivirus (HIV) y el virus de la estomatitis vesicular, que se encuentran presuntamente en el material biológico a procesar. Implican un riesgo individual elevado y riesgo comunitario escaso.

Finalmente, en el Nivel 4 de bioseguridad se incluyen ciertos arbovirus, arenavirus o filovirus, que se encuentran en general en determinadas regiones y presentan elevado riesgo individual y comunitario.

De lo dicho brevemente en los párrafos anteriores, es fácil concluir que deben aceptarse e instrumentarse ciertos aspectos referidos a la organización, diseño y funcionamiento de los laboratorios donde se procesa material potencialmente patógeno, los que, reunidos, constituyen buenas prácticas de seguridad en todas las áreas especializadas.

PRINCIPALES NORMAS DE BIOSEGURIDAD La prevención de accidentes se apoya en el conocimiento de las situaciones

potencialmente peligrosas y en las conductas apropiadas para afrontarlas. Esto ayuda a disminuir al máximo la posibilidad de que el operador adquiera alguna infección o bien que se produzca dispersión de patógenos a la comunidad o al medio ambiente por prácticas incorrectas.


142

Se mencionan las siguientes: Todo material biológico (sangre, suero, plasma, etc.) debe considerarse como

potencialmente infeccioso y manipularse tomando los recaudos apropiados pues expone a riesgo individual y comunitario.

Utilizar en el laboratorio ropa protectora (guardapolvo, chaqueta, etc.) que debe usarse solo dentro del laboratorio.

El tratamiento posterior al uso de la indumentaria no requiere otro procedimiento que el lavado en lavarropas en agua a más de 70 °C durante al menos 30 minutos. Como alternativa, y también en el caso que la indumentaria presente contaminación con fluidos biológicos o aerosoles, se pueden introducir las mismas en una solución de hipoclorito de sodio al 1 % (1 ml de lavandina de uso doméstico de 55 g cloro/L en un volumen final de 100 ml de agua) durante 10 minutos antes del lavado normal.

Utilizar guantes de látex, vinilo o nitrilo para la manipulación de tubos o materiales de laboratorio conteniendo líquidos biológicos humanos.

Los materiales potencialmente patogénicos (restos de sangre y sus derivados, guantes, manoplas, algodones, jeringas, material descartable y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patogénicos) deben descartarse en cajas especiales. Estas cajas son de paredes de cartón grueso, identificadas convenientemente con el símbolo de residuos patogénicos, contienen bolsas de polietileno de alta densidad de color rojo, y luego serán recolectadas por empresas dedicadas al tratamiento de este tipo de residuos.

Al terminar de trabajar descartar los guantes en la bolsa roja. Las bolsas rojas se destinan exclusivamente para la eliminación de material

descartable contaminado o biológico. Nunca se deben utilizar para residuos domésticos ordinarios (papel, botellas, yerba, restos de alimentos, etc.).

Utilizar manoplas para tocar elementos de uso común como centrifugas, carpetas, picaportes, tapas de recipientes, teléfonos, etc.

Lavarse las manos después de quitarse los guantes, y cada vez que se retire del laboratorio.


143

Utilizar protectores oculares (antiparras) y barbijo en aquellas situaciones que exista riesgo de salpicaduras o formación de aerosoles.

No pipetear con la boca ni líquidos biológicos ni reactivos. Utilizar pipetas automáticas y propipetas.

Dentro del laboratorio no se debe comer, beber ni fumar. No guardar comestibles ni bebidas en las heladeras del laboratorio. Evitar la formación de aerosoles, los que se producen por el agitado de tubos sin

tapa, incorrecta centrifugación (tubos con excesivo volumen, sin tapa o levantar la tapa de la centrifuga antes de tiempo), etc.

Si durante la centrifugación se rompe algún tubo se debe decontaminar la centrifuga.

Extremar los cuidados para evitar pinchazos accidentales, derrames, salpicaduras y formación de aerosoles.

Utilizar descartadores de paredes rígidas para eliminar las agujas y elementos cortopunzantes para que al ser manipulados por cualquier persona no produzcan heridas. Luego desecharlos en las mismas bolsas rojas que se usan para residuos patogénicos.

Las agujas no deben reintegrarse a su capuchón, pues es la principal fuente de accidentes.

Para decontaminar pipetas, tubos, portaobjetos, sumergirlos en recipientes plásticos especiales con hipoclorito de sodio al 10 % durante 30 minutos previo a su lavado.

Al finalizar la tarea decontaminar con hipoclorito de sodio al 10 % las superficies de trabajo o inmediatamente cada vez que se derrame material.

No debe apoyarse en las mesadas de trabajo indumentaria personal, carpetas cartucheras, que posteriormente serán llevadas a los domicilios particulares.

Todo personal que manipule material potencialmente patógeno debe vacunarse contra la hepatitis B como medida profiláctica obligatoria.

APÉNDICE II Guía Teórico-Práctica de Inmunología UNS

145

MANEJO EN EL LABORATORIO

El objetivo de esta sección es ofrecer al alumno un repaso de algunas prácticas que serán habituales durante el desarrollo de los Trabajos Prácticos de Inmunología. Es por esto que recomendamos su lectura cuidadosa para poder utilizar eficientemente el tiempo de cada Trabajo Práctico y lograr resultados confiables. Luego de esta lectura, el alumno podrá familiarizarse con las técnicas descriptas y practicarlas en la mesada de trabajo antes de la realización de las actividades correspondientes a ese día. Finalmente encomendamos el cuidado del equipamiento provisto teniendo en cuenta los consejos para el buen uso de los mismos. Al finalizar el día de trabajo, deberá dejar los elementos utilizados en iguales condiciones que cuando los recibió.

MEDICIÓN DE VOLÚMENES: PIPETAS MANUALES Y AUTOMÁTICAS Durante el transcurso de las prácticas será común recurrir a la medición y

transferencia de volúmenes exactos y precisos. Para ello en un laboratorio existen elementos como pipetas manuales, pipetas automáticas, buretas, probetas o matraces aforados. El grado de precisión de cada uno de ellos es diferente y su elección dependerá de la situación. Aquí sólo se introducirá el uso apropiado de las pipetas manuales y automáticas.

Uso correcto de pipetas manuales Existen dos clases de pipetas: una de éstas, están calibradas hasta la punta y deben

llenarse con el líquido a medir, dispensarse y, el líquido remanente en la punta debe también desalojarse. Este tipo de pipetas se distinguen fácilmente ya que la graduación se extiende hasta la punta de la pipeta. Por otro lado, existen pipetas que están calibradas entre dos marcas que no incluye la punta. En este caso, el volumen que se dispensa debe ser regulado manualmente.


146

Técnica de pipeteo En primer lugar se debe seleccionar la pipeta adecuada para el volumen que se

desea medir. Se aconseja elegir en función del volumen a pipetear, de manera que este volumen esté lo más cercano posible a la capacidad máxima de la pipeta. Por otra parte debe considerarse la precisión de la medida y para ello se debe observar la graduación de la pipeta.

Luego de escoger la pipeta adecuada se ajusta en la boquilla de la pipeta el

dispositivo que se utilizará para crear vacío y succión: la propipeta o pera de hule (Figura 33) cuyo funcionamiento se detalla a continuación.

Figura 33: Propipeta.

La propipeta cuenta con tres puntos marcados como A, B, C en la Figura 33 y donde

se ejercerá presión. Al presionar uno de estos puntos, un balín interno permitirá la entrada o salida de aire para que la pipeta pueda succionar (A) o dispensar (B) el líquido que contiene. El punto C es útil para dispensar la última gota en aquellas pipetas graduadas hasta la punta. El uso correcto de este dispositivo requiere de práctica.

Ej.: Se dispone de dos pipetas cuyas capacidades máximas son: 0,1 ml y 1 ml. ¿Cuál utilizaría para pipetear 100 μl y 550 μl? En el primer caso se utilizaría la pipeta de 0,1 ml para pipetear 0,1 ml (equivalente a 100 μl) con mayor precisión que si se utilizara una de 1 ml graduada. En el segundo caso, la pipeta de 1 ml serviría para pipetear 550 μl (0,55 ml) y se debe tomar una pipeta graduada 1/100, es decir que permita medir las centésimas de ml con precisión.


147

La pipeta se debe llenar hasta un poco más arriba del inicio de la graduación de la escala y luego se ajusta, frente a los ojos y en posición vertical, al punto exacto de graduación de la escala (generalmente 0). Recordar que para líquidos transparentes, el fondo del menisco del líquido se ajusta a la graduación mientras que para líquidos no transparentes, los extremos del menisco se ajustan a la graduación de la escala.

A continuación, la pipeta conteniendo el líquido a dispensar se coloca en el recipiente donde se depositará el líquido, luego se presiona suavemente la propipeta en el punto que permite la salida del líquido y, una vez descargado el volumen deseado, se retira la pipeta siempre en posición vertical. Luego se retira la propipeta y la pipeta se descarta en un recipiente acondicionado para ellas y donde deben estar totalmente sumergidas. Es posible volver a utilizar la pipeta si se trata del mismo líquido y para ello se deben extremar los cuidados para no ensuciar o contaminar la punta de la pipeta.

Uso correcto de pipetas automáticas Las pipetas automáticas permiten medir volúmenes pequeños de soluciones. Existen

pipetas automáticas de volumen fijo y de volúmenes variables. Las primeras sólo pueden medir un volumen predeterminado por el fabricante (Ej. 10 μl o 25 μl). En cambio, en las segundas se puede seleccionar el volumen a medir dentro de un rango de valores. Un esquema general de este tipo de pipetas que poseemos en el laboratorio se muestra en la Figura 34.

Las pipetas automáticas se caracterizan por utilizar puntas o tips plásticos descartables que se ajustan al extremo o cono y en ellas se deposita el volumen a medir.

Técnica de pipeteo Nuevamente, el primer paso en esta tarea es elegir la pipeta adecuada para los

volúmenes que se quieren medir. En general, estas pipetas poseen en el botón pulsador el rango de volúmenes que se pueden medir con precisión. Los rangos más comunes en las pipetas de volumen variable son 0,5-10 μl (utilizan tips transparentes); 2-20 μl y 20-200 μl (utilizan tips amarillos) y 100(200)-1000 μl (utilizan tips azules).


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Figura 34: 1: botón, 2: rueda dentada de graduación del volumen, 3: cono de la pipeta, 4: expulsor de tip, 5: tip descartable.

Para fijar el volumen a medir se debe identificar la rueda de selección de volúmenes

en la parte superior de la pipeta automática y el indicador de volúmenes compuesto por tres dígitos que se leen de arriba hacia abajo. Dependiendo del rango de la pipeta el último número será el último dígito o el primer decimal del volumen a fijar (los decimales se muestran en rojo) excepto en el caso de la pipeta de rango 100 o 200-1000 μl. En esta última pipeta automática la escala que muestra el indicador es en mililitros, por lo que volúmenes menores a 1 ml se indican con decimales. Ej. 0,20 ml; 0,90 ml; etc.

Rango de volúmenes 2-20 μl 20-200 μl 200-1000 μl

Indicador

0 1 0 (rojo) 5 5 5

5 (rojo) 0 5 Ej. volumen a medir 5,5 μl 150 μl 550 μl


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Fijado el volumen, colocar el tip correspondiente en el extremo de la pipeta con una suave presión y un leve movimiento giratorio para asegurar el correcto ajuste.

Para tomar y dispensar un volumen de líquido se procede de la siguiente manera: Apretar el botón de la pipeta hasta el primer tope fuera de la solución que se quiere

tomar. Mantener. Con la pipeta en posición vertical sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en el líquido. Permitir la aspiración de la solución al quitar lentamente la presión sobre el botón de la pipeta. Esperar un segundo. Cuidar en este paso de no permitir la entrada de aire al tip. Si este fuera el caso el volumen de líquido no será el deseado y se deberá repetir la operación. Retirar la pipeta de la solución y llevarla al recipiente donde se colocará el volumen medido. Descargar el líquido del tip apretando nuevamente el botón de la pipeta hasta el primer tope, esperar un segundo, mantener. En caso de quedar líquido continuar con la presión hasta el segundo tope, mantener y retirar con el botón todavía presionado para evitar la reaspiración del líquido. Retirar el tip presionando el botón de expulsión de la pipeta.

Figura 35: A: fijado el volumen se presiona el botón hasta el primer tope. B: la pipeta se sumerge 1-3 mm en el líquido a tomar. C: aspiración del líquido soltando el botón lentamente. D: forma correcta de dispensar el líquido medido. E: se puede presionar hasta el segundo tope para expulsar totalmente el líquido. F: dispensado el líquido se vuelve a la posición inicial y se descarta el tip presionando el botón de expulsión.


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Sugerencias para un buen uso de las pipetas automáticas: 1) Nunca tomar líquido sin el tip puesto en el extremo. 2) Cuidar que el líquido medido nunca entre en contacto con el cono de la pipeta. 3) Nunca colocar la pipeta en posición horizontal si el tip tiene líquido. 4) Nunca ajustar el volumen fuera del rango permitido por la pipeta.

PREPARACIÓN DE DILUCIONES: SIMPLES Y SERIADAS

Diluciones simples Hacer una dilución significa preparar una solución menos concentrada, y que

generalmente se llama de trabajo, a partir de una solución más concentrada, llamada solución madre. La dilución se expresa como fracción decimal de la solución más concentrada (Ej. 1/5; 1/10) donde se expresa el volumen o peso de una sustancia (numerador) en un volumen o peso total o final (denominador). En el caso de una dilución 1/10 de una solución significa que un volumen de la solución más concentrada se diluye hasta obtener 10 volúmenes finales de la solución menos concentrada deseada. Para ello deberá contarse con 9 volúmenes de diluyente que junto al volumen a diluir totalizan los 10 volúmenes. Para calcular la concentración final de una dilución se debe multiplicar la concentración de la solución concentrada por la dilución expresada como fracción.

En el caso de realizar más de una dilución, la concentración final se obtiene al

multiplicar la concentración original de la solución por el producto de las diluciones expresadas como fracciones.

Ej. Si se cuenta con una solución 90 g/l de NaCl y se diluye 1/10, la concentración final de la solución es de 90 g/l x 1/10 = 9 g/l.

Ej. Si se diluye una solución de 90 g/l de NaCl primero 1/2 y luego 1/5, la concentración final de la solución será de 90 g/l x 1/2 x 1/5 = 9 g/l.


151

El factor de dilución representa el número de veces que está diluida una solución respecto de la original y en los ejemplos anteriores es de 10. Este factor de dilución es muchas veces utilizado para rotular soluciones que se preparan concentradas.

Diluciones seriadas Se trata de una serie de diluciones consecutivas a partir de una primera y que se

caracterizan por tener el mismo factor de dilución respecto de la más concentrada anterior. A continuación se explicará con un ejemplo la preparación de una serie o batería de tubos de diluciones razón 2, es decir con un factor de dilución 2.

Ej. Se desea preparar para un ensayo una serie de 10 tubos de diluciones de suero humano razón 2 a partir del primer tubo que tiene una dilución 1/2 del suero. El volumen final de la dilución debe ser de 250 μl aunque el volumen final de reacción será de 500 μl cuando se agregue otro reactante. Estas diluciones de suero suelen prepararse en solución fisiológica.

Para preparar el primer tubo se procederá de la siguiente manera: Tubo 1: 250 μl de SF + 250 μl de suero, se homogeneizará y se obtendrá una

dilución 1/2 del suero. En los restantes 9 tubos se puede tener agregado 250 μl de SF y a continuación se

les agregará 250 μl de la dilución previa: Tubo 2: 250 μl de SF + 250 μl de la dilución del tubo 1. Homogeneizar. Tubo 3: 250 μl de SF + 250 μl de la dilución del tubo 2. Homogeneizar. … Tubo 10: 250 μl de SF + 250 μl de la dilución del tubo 9. Homogeneizar. Para mantener los mismos volúmenes de diluciones en todos los tubos se tomarán

los 250 μl de la dilución del tubo 10 y se descartarán. De este modo se tendrán 10 tubos con suero sucesivamente diluido con un factor de

dilución 2. Por otra parte, para la expresión correcta del resultado deberá tenerse en cuenta el volumen final de reacción. Si se recuerda este volumen es del doble del volumen de

Ej. Si se prepara una solución 9 g/l de NaCl pero 10 veces concentrada se dice que es una solución 10X de 9 g/l de NaCl que es lo mismo que decir 90 g/l de NaCl.


152

dilución en cada tubo y por tanto no puede despreciarse. Es decir que la dilución del suero en el primer tubo no será 1/2 sino que luego del agregado del otro reactante será de 1/4.

¿Cómo se llega a este número? Tubo 1 (T1): 250 μl de SF + 250 μl de suero = 500 μl de dilución T1. Se extraen 250 μl de dilución para el tubo 2. Restan 250 μl de dilución en el T1 que contiene 125 μl del suero original. Se agregan 250 μl de reactivo = 500 μl de volumen de reacción. Para obtener la dilución final hecha del suero: 125 μl del suero original en 500 μl de

volumen final es una dilución 1/4. Tubo 2 (T2): 250 μl de SF + 250 μl de dilución T1 = 500 μl de dilución T2. Se extraen 250 μl de dilución para el tubo 3. Restan 250 μl de dilución en el T2 que contiene 62,5 μl del suero original. Se agregan 250 μl de reactivo = 500 μl de volumen de reacción. Para obtener la dilución final hecha del suero: 62,5 μl del suero original en 500 μl de

volumen final es una dilución 1/8. Notar que el factor de dilución es 2 respecto del T1. Los cálculos son similares en los siguientes tubos y las diluciones del suero en cada

uno de ellos serán:

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048

Algunas veces los volúmenes de reactivo agregado a los volúmenes de diluciones

son despreciables y en consecuencia la dilución del suero es, en definitiva, la que se debe tener en cuenta para la expresión de los resultados.

APÉNDICE III Guía Teórico-Práctica de Inmunología UNS

153

CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCIÓN Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación

de mayores detalles de los que pueden verse a simple vista. Hay dos tipos principales de microscopio: el microscopio electrónico y el microscopio de luz. El microscopio electrónico utiliza la propiedad que poseen los haces de electrones de ser desviados por un campo electromagnético. El microscopio de luz usa un haz de luz para iluminar los objetos a estudiar. Este haz de luz puede atravesar el objeto o simplemente incidir en cierto ángulo sobre el mismo. En el primer caso se habla de trans-iluminación y en el segundo caso de epi-iluminación (Figura 36). En el caso de la trans-iluminación, la imagen se obtiene por transmisión de la luz a través de la muestra. El microscopio clásico que emplea este tipo de iluminación es el microscopio de campo claro. En el caso de epi-iluminación, la luz incide en forma oblicua sobre la muestra y los rayos reflejados son los que se capturan para formar la imagen.

Figura 36: Mecanismos de iluminación empleados en microscopía.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA La fluorescencia es una propiedad que tienen ciertas moléculas llamadas

fluorocromos. Estas moléculas absorben la radiación, al ser excitadas por una luz incidente de una longitud de onda determinada, y emiten luz de una mayor longitud de onda (menor energía). El fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.


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Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente (Figura 37 y Tabla 1).

Los fluorocromos pueden ligarse a un componente celular y también pueden ser acoplados químicamente a otras moléculas como es el caso de los anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente celular.

Figura 37: Espectro de excitación y emisión del isotiocianato de fluoresceína (FITC).

Tabla 1: Principales fluorocromos utilizados.

El microscopio de fluorescencia irradia a la muestra con la luz de excitación y es capaz de separar la luz fluorescente emitida de la luz de excitación por medio de filtros. Así, solo la luz emitida por la muestra es detectada por el ojo. Como resultado, las partes fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo oscuro con suficiente contraste como para permitir la detección.


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El concepto de microscopía múltiple se refiere a que es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más fluorocromos siempre que emitan en diferentes longitudes de onda y el sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.

El microscopio de fluorescencia consta de los mismos componentes de un microscopio óptico normal al que se le añade una fuente luminosa, filtros y espejos dicroicos. Fuente luminosa: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en

el espectro específico de cada fluorocromo. Estas fuentes generan radiaciones UV, violeta, azul, verde. Las más empleadas son las lámparas de mercurio a alta presión.

Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. Por ello, están diseñados y construidos para que también funcionen como lentes condensadores proyectando la energía radiante uniformemente sobre la muestra. Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación UV.

Filtros: Retienen la radiación UV, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos.

Filtros de excitación: Ubicado entre la fuente de luz y el preparado. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente.

Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación de la de fluorescencia. Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda de excitación (más corta) es reflejada y la longitud de onda de emisión (más larga) lo atraviesa. Por lo tanto, permite reflejar hacia el espécimen, la longitud de onda filtrada y seleccionada y deja pasar las longitudes de onda emitidas.

Filtros de barrera o de emisión: Ubicado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan del espejo dicroico. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. Por lo tanto, suprime completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. Los fabricantes suelen proporcionar bloques o cubos de filtros que son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con los apropiados espejos dicroicos (Figura 38).


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Figura 38: Cubo de filtros para el microscopio de fluorescencia.

En la Figura 39 se muestra un esquema del funcionamiento de un microscopio de

epifluorescencia.

Figura 39: Esquema de funcionamiento del microscopio de epifluorescencia.

La luz procedente de la fuente, atraviesa el filtro de excitación que selecciona la

longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. En el caso de la figura, en la que la muestra ha sido marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), el filtro permite el paso de ondas de luz con longitud de onda que caen en el rango azul para que el preparado sea alcanzado exclusivamente por ella. Esta luz se refleja en un espejo dicroico e incide sobre la muestra. El objetivo actúa como condensador porque enfoca la luz sobre ella. El fluorocromo se excita y emite fotones de una longitud de onda mayor que la luz incidente. La luz emitida por la muestra no se refleja sino que atraviesa el espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. En este caso el filtro de emisión, selecciona la luz de longitud de onda en el rango del verde, por lo que deja pasar solo la luz verde.

GLOSARIO

GLOSARIO Guía Teórico-Práctica de Inmunología UNS

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ctivación del complemento: desencadenada por agentes patógenos, serie de reacciones en las que intervienen los componentes plasmáticos del complemento. Se conocen tres vías de

activación: Vía alterna: se activa cuando la proteína C3b se une a las superficies celulares de los

microorganismos, es independiente de los anticuerpos.

Vía clásica: se pone en marcha tras la unión de los complejos antígeno-anticuerpo a la

molécula C1 y origina una cascada proteolítica en la que intervienen otras proteínas del

complemento.

Vía de las lectinas: es activada por la unión de una lectina de unión de manosa presente en

el plasma a peptidoglicanos con manosa presentes en la superficie bacteriana. Adquisición: se refiere al proceso del pasaje de una muestra en la citometría de flujo. Los datos

tales como tamaño, complejidad, intensidades de fluorescencia son guardados en la memoria de una

computadora. Adyuvante: sustancia que se utiliza para aumentar la respuesta inmune adaptativa contra cualquier antígeno. Se mezcla con éste último antes de la inoculación.

de Freund incompleto: emulsión que resulta de la mezcla de un aceite mineral y vaselina líquida.

de Freund completo: Freund incompleto al que se le agrega un macerado de bacilos tuberculosos muertos.

Afinidad: medida de la fuerza con la que un epitope se une a un solo sitio de unión en el anticuerpo (paratope). Agente patógeno: organismo, frecuentemente un microorganismo, que es capaz de producir enfermedad. Aglutinación: fenómeno visible por formación de grumos que resulta de la interacción secundaria entre un antígeno particulado y su correspondiente anticuerpo específico. Alérgeno: antígeno, normalmente inocuo, que produce reacciones alérgicas. Ejemplos: polen, polvo, caspa animal, etc. Ver Alergia. Alergia: estado de hipersensibilidad a un alérgeno que se produce como resultado de la interacción entre éste y anticuerpos o linfocitos T (LT) producidos por la exposición previa al mismo. Ver Reacciones de hipersensibilidad. Anafilaxia: forma de reacción alérgica (generalmente hipersensibilidad de tipo I de Gell y Coombs) de comienzo rápido y mediada por IgE que lleva a la liberación de mediadores químicos por

A


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mastocitos y basófilos causantes de los efectos locales o sistémicos. Ver Anafilaxia cutánea pasiva, Shock anafiláctico.

cutánea pasiva (ACP): cuando anticuerpos específicos generados en un animal se inoculan intradérmicamente en otro, de la misma o distinta especie, generando un fenómeno de anafilaxia localizado ante un encuentro con el antígeno correspondiente.

Anticuerpos: forma secretada de las inmunoglobulinas producidas por las células plasmáticas. Las inmunoglobulinas son glucoproteínas que elaboran los vertebrados al ser estimulados por un inmunógeno y que tienen la capacidad de reaccionar específicamente con el inductor. Se hallan principalmente en el plasma circulante. Existen varios isotipos o clases posibles según la especie que los produce. En el hombre existen cinco clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y cuatro subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y dos de IgA (IgA1 e IgA2). Conforman por esto una familia de proteínas. Son elaboradas por las células plasmáticas o plasmocitos, que derivan de la diferenciación inmunológica de los linfocitos B (LB). Las inmunoglobulinas poseen una estructura tetrapeptídica de dos cadenas livianas (L) y dos cadenas pesadas (H), con dominios compartidos y diferenciales entre los distintos isotipos.

citotrópicos: con capacidad para fijarse a células. conjugado: unido a una marca. Esta puede ser una enzima, un fluorocromo o un

radioisótopo. heterocitotrópicos: con capacidad para fijarse a células heterólogas. heterófilos: que interaccionan con un mismo antígeno o antígenos similares presentes en la

naturaleza y que pueden estar compartidos por bacterias, hongos, vegetales superiores, vertebrados, etc. Uno de los más conocidos son los anticuerpos que reaccionan con los antígenos de Forssman presentes en la membrana del glóbulo rojo, en el hombre.

homocitotrópicos: con capacidad para fijarse a células homólogas. incompletos o bloqueantes: funcionalmente univalentes, es decir, con un solo paratope

disponible para la unión al antígeno. monoclonales: producidos por un solo clon de LB y, en consecuencia, son idénticos entre sí

en estructura y especificidad. Antígeno: sustancia capaz de interaccionar específicamente con los productos de una respuesta inmune (anticuerpos o receptores de linfocitos T) que no necesariamente generaron. Ver Inmunógeno.

particulado: forme. Ej. bacterias, glóbulos rojos, células. soluble: que forma soluciones. Ej. solución de proteínas, hidratos de carbono.


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Timo-dependiente: dependen de la participación de los linfocitos T colaboradores o helper (LTh) para inducir una respuesta de anticuerpos adecuada. Ej. antígenos proteicos, haptenos fijados a proteínas, etc.

Timo-independiente: pueden inducir una respuesta de anticuerpos sin la participación de los LTh. Ej. poliósidos, lipopolisacáridos, flagelina polimerizada.

Antisuero: suero enriquecido en una población heterogénea de anticuerpos específicos producidos contra un antígeno determinado. Esta heterogeneidad hace que cada antisuero sea único. También se lo llama suero inmune o hiperinmune.

monoespecífico: suero que contiene en alto título/concentración una población heterogénea anticuerpos que interaccionan específicamente con un antígeno en particular.

policlonal: suero producido por más de un clon de LB y, en consecuencia, presenta una población heterogénea de anticuerpos en estructura y especificidad.

poliespecífico: suero que contiene en alto título/concentración una población heterogénea de anticuerpos que interaccionan específicamente con más de un antígeno.

Autofluorescencia: es la luz emitida naturalmente por una partícula que no ha sido coloreada ni marcada con fluorocromos. Autoinmunidad: estado de reactividad del sistema inmune adaptativo frente a antígenos propios que aparece cuando los mecanismos de autotolerancia fallan. Avidez: fuerza de unión entre un anticuerpo y un antígeno. Depende de la afinidad y de la valencia del anticuerpo.

asófilos: una de las poblaciones de granulocitos, componentes celulares de la sangre. Se caracterizan por su contenido de gránulos que se tiñen con colorantes básicos.

Bazo: órgano adyacente al estómago. Es un tejido linfoide primario donde terminan de madurar los LB en el hombre. También es un tejido linfoide secundario que compone el sistema inmune y donde los LB interaccionan con los patógenos o antígenos transportados por la sangre.

adena liviana: el menor de los polipéptidos que constituyen a las inmunoglobulinas. Posee una región variable y otra constante respecto a su composición aminoacídica. Existen dos clases:

cadenas λ y κ. Se unen a una cadena pesada por un puente disulfuro. Cadena pesada: el mayor de los polipéptidos que constituyen a las inmunoglobulinas. Posee una región variable y otra constante respecto a su composición aminoacídica. Existen cinco tipos de cadenas: α, δ, ε, γ y μ que determinan las diferentes clases o isotipos de inmunoglobulinas y en consecuencia, las distintivas funciones efectoras de los anticuerpos.

B

C


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Cambio de clase de las Inmunoglobulinas (switch): proceso por el cual un LB cambia la clase de inmunoglobulina que produce sin perder su especificidad antigénica. El cambio de isotipo implica una recombinación somática donde el gen que codifica para la región variable se une a un gen que codifica para la región constante de una cadena pesada diferente a la expresada hasta ese momento. CD (Cluster of Differentiation): moléculas presentes en la superficie celular que en muchos casos sirven para diferenciarlas unas de otras in vitro. La nomenclatura utiliza las iniciales CD seguidas por un número de orden. CDR (Complementarity Determining Regions): regiones determinantes de la complementariedad. Regiones de las cadenas de inmunoglobulina y del receptor de LT que se unen al antígeno y que determinan la especificidad antigénica. Son las partes más variables de las regiones variables y por esto se conocen como regiones hipervariables. Células de Langerhans: células dendríticas fagocíticas que se encuentran en la epidermis y que, tras endocitar y procesar antígenos, migran hacia los ganglios linfáticos locales para convertirse en células dendríticas. Células dendríticas: células presentadoras de antígeno profesionales con una morfología ramificada dendrítica. También se conocen como células dendríticas interdigitantes. Son las estimuladoras más potentes de la respuesta de los LT. Son diferentes de las células dendríticas foliculares. Células dendríticas foliculares: células características del folículo linfático. Poseen prolongaciones citoplasmáticas que forman un entramado esencial para la arquitectura del mismo. Expresan sobre su membrana receptores del complemento y para el Fc de Ig que le permiten exhibir antígenos sobre su superficie destinados al reconocimiento por los centrocitos. Estas células tienen un papel muy importante en la selección de LB con Ig de alta afinidad durante el proceso de maduración de la afinidad. Células plasmáticas o plasmocitos: LB que ha llegado al final de su vía de diferenciación y secreta anticuerpos. Célula Presentadora de Antígenos (CPA): células capaces de presentar antígenos a LT vírgenes y activarlos. Se las distinguen entre profesionales (células dendríticas, macrófagos y LB) y no profesionales. Expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) sobre las que se presenta el péptido antigénico. Células NK (Natural Killer): linfocitos citotóxicos grandes y granulosos que pueden reconocer y destruir células tumorales o infectadas por virus y otros patógenos intracelulares. También median la citotoxicidad mediada por anticuerpos.


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Célula NKT: linfocitos que expresan en su membrana moléculas características de los LT (TCR) y NK (CD 16 y CD56). Tienen una morfología y un contenido granular intermedios entre las células T y células NK. Además, reconocen antígenos lipídicos presentados por moléculas CD1. Centroblasto: LB de gran tamaño en división presente en los centros germinales donde ocurren los fenómenos de hipermutación somática entre otros. Centrocito: LB que no se divide en los centros germinales. Esta célula ha sufrido cambios de clase de inmunoglobulinas e hipermutación somática. Centro germinal: zona del tejido linfoide secundario de intensa proliferación, selección, maduración y muerte de LB. Los centros germinales se forman alrededor de redes de células dendríticas foliculares. Citoquinas: proteínas producidas por células que afectan el comportamiento de células diana. Las producidas por los linfocitos se conocen generalmente como linfoquinas o interleuquinas. Citotóxico: con capacidad de destruir células. Clon: células de constitución genética idéntica derivadas de una única célula. Complejo mayor de histocompatibilidad o CMH: conjunto de genes codominantes que codifican para un grupo de glucoproteínas polimorfas llamadas moléculas del CMH que participan en la presentación de péptidos a los LT. Complemento: conjunto de proteínas plasmáticas que se activan en cascada. Como resultado se generan moléculas que pueden recubrir al agente extraño y destruirlo directamente por lisis o bien mediar la fagocitosis por células fagocíticas (ver Opsonización). Algunos componentes del complemento son mediadores de la inflamación. Control negativo: suero no reactivo inactivado (tratado para eliminar componentes patogénicos), es decir que no contiene el antígeno o el anticuerpo que se investiga. Control positivo: suero reactivo inactivado, es decir que contiene el antígeno o el anticuerpo que se investiga. Cromatografía de intercambio iónico (CII): la cromatografía, en general, es un método de separación química ampliamente utilizado, basado en la interacción entre solutos, una fase móvil y una fase estacionaria. En el caso de la CII adquiere relevancia la carga eléctrica de la molécula que se va a separar. Estas moléculas se unen a una matriz estacionaria o resina de carga opuesta. La unión entre ellas es del tipo reversible y se puede modificar variando la fuerza iónica y/o el pH de la fase móvil utilizada para eluir la fracción de interés. Cromógeno: capaz de generar un compuesto coloreado soluble o insoluble a través de una reacción química. Cuadrantes: se refiere a cada una de las cuatro áreas delimitadas al dibujar dos líneas perpendiculares en un gráfico de citometría de flujo.


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egranulación: exocitosis de gránulos a partir de células tales como mastocitos y basófilos.

Desnaturalización: pérdida de la estructura tridimensional de una macromolécula, generalmente por calor o tratamiento químico. Determinante antigénico: zona o región definida del antígeno que genera una respuesta inmune adaptativa. Es generalmente utilizado como sinónimo de epitope aunque algunos autores distinguen entre uno y otro (ver Epitope). Doble difusión bidimensional o método de Ouchterlony: técnica inmunoquímica que aprovecha la capacidad de las moléculas, en este caso, antígeno y anticuerpo, de difundir a través de un gel (agar) bajo condiciones adecuadas. Si existe especificidad entre ambas moléculas se formará una línea o banda opaca en la región donde las proporciones son óptimas (ver Zona de equivalencia). Dominio de unión: ver Región variable, Paratope. Dominio efector: ver Región constante, Fc.

dema: hinchazón del tejido debida a la acumulación anormal de líquidos en el compartimiento extravascular.

Electroforesis: técnica que permite separar, mediante la acción de un campo eléctrico, componentes de una mezcla sembrada en un punto definido en un medio soporte. Los medios soportes pueden ser el papel, el acetato de celulosa o gel (agar, agarosa, poliacrilamida).

en geles de poliacrilamida: una de las formas más utilizadas de la electroforesis en gel. La matriz está formada por acrilamida polimerizada que se entrecruza con unidades de N-N´-metilen-bisacrilamida. Se utiliza tanto en el estudio de proteínas como ácidos nucleicos.

Electrotransferencia: proceso en el que se transfieren, bajo la influencia de un campo eléctrico, moléculas previamente separadas por electroforesis en gel a una membrana donde quedan fijadas para su posterior estudio. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): prueba empleada para la detección o la cuantificación de un anticuerpo o un antígeno mediante un conjugado enzimático que cambia el color de un sustrato cromogénico. Enfermedad autoinmune: ver autoinmunidad. Enzimoinmunoensayos o ensayos inmunoenzimáticos: técnicas inmunoquímicas donde la interacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo específico se detecta a través de una marca, en este caso, una enzima de cuya actividad se obtiene un compuesto coloreado o luz. Eosinófilos: una de las poblaciones de granulocitos. Participan principalmente en la defensa contra las infecciones parasitarias y en las reacciones alérgicas.

D

E


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Epitope: área que agrupa a unos pocos aminoácidos (5-6) relacionados, en el caso de una proteína, o unas pocas unidades de hexosas (5-6), en el caso de un polisacárido, que interactúa con el paratope de un anticuerpo. También se lo utiliza para referirse al área de una proteína que da lugar a los péptidos que reconocen los receptores de los LT.

conformacional o discontinuo: formado por aminoácidos separados en la estructura primaria y que forman un grupo al aproximarse por acción de las estructuras secundaria y terciaria.

lineal o continuo: formado por aminoácidos contiguos en la estructura primaria. Especificidad: propiedad de los anticuerpos y de otras moléculas de unión a antígenos que se refiere a la interacción selectiva con sólo uno o algunos tipos de molécula o célula. Extravasación: desplazamiento de células o líquido desde el interior de los vasos sanguíneos hacia los tejidos circundantes.

(ab): fragmento producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por una cadena liviana y la mitad aminoterminal de una cadena pesada unidas por un puente disulfuro intercatenario. Se

comporta frente al antígeno como ligando univalente. F(ab’)2: fragmento producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por ambas cadenas livianas y las mitades aminoterminales de las cadenas pesadas incluyendo parte de la zona de la bisagra. Se comporta frente al antígeno como ligando bivalente. Fc: fragmento sin actividad anticuerpo producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por las mitades carboxiterminales de ambas cadenas pesadas unidas por puentes disulfuro en la región residual de la bisagra. Es responsable de otras propiedades biológicas inherentes a la molécula entera. FcR: receptor que se halla en la superficie de algunas células y que une fragmentos Fc de inmunoglobulinas. Ficoll-Hypaque: sustancia que permite la separación de células mononucleares de la sangre humana total a través de un gradiente de densidad. Está compuesto por un polisacárido (Ficoll) que aglutina y sedimenta los glóbulos rojos y una sustancia densa (Hypaque) que diluida adecuadamente otorga una densidad característica a la mezcla, en nuestro caso 1,077 g/ml. Fluorocromo: sustancia fluorescente, es decir capaz de emitir luz en una determinada longitud de onda luego de ser excitada por un haz de luz de longitud de onda menor. Se utiliza como marcador en las técnicas de inmunofluorescencia. Folículo linfoide primario: zona de un tejido linfoide secundario donde abundan los LB en ausencia de una respuesta inmunitaria.

F


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Folículo linfoide secundario: zona de un tejido linfoide secundario donde abundan los LB en proliferación y diferenciación inducida por antígenos. En las respuestas inmunes a antígenos timo- dependientes aloja en su interior al centro germinal.

ammaglobulinas: conjunto de proteínas séricas que migran conjuntamente cercanas al cátodo en una electroforesis. Incluye a la mayoría de las inmunoglobulinas. Ver Anticuerpos.

Ganglio linfático: tejido linfoide secundario ubicado en muchos sitios del cuerpo donde convergen los vasos linfáticos. Es el punto de encuentro entre los antígenos y los linfocitos vírgenes a partir de los que se desencadena la respuesta inmune adaptativa. Gate o región: ventana que delimita un sector en un gráfico en citometría de flujo. Granulocitos: una de las poblaciones de leucocitos, poseen el núcleo generalmente multilobulado y gránulos citoplasmáticos característicos. Se conocen tres clases: neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Granuloma: sitio de inflamación que se genera alrededor de un agente infeccioso persistente o cuerpo extraño no degradable en el que predominan, en la zona central, macrófagos activados (generalmente fusionados formando células gigantes multinucleadas) rodeados por LT.

apteno: grupo químico definido y de bajo peso molecular que carece de poder inmunogénico pero es capaz de interaccionar con anticuerpos preformados.

Hemaglutinación: aglutinación donde participa el glóbulo rojo como soporte de un antígeno que se adsorbe en su superficie celular. Heterólogo: término que refiere a la procedencia de una molécula, célula, tejido u órgano de un organismo de una especie diferente. Hipermutación somática: mutación que ocurre con alta frecuencia en la región variable reordenada de los genes de inmunoglobulinas en los LB activados lo que da como resultado la producción de anticuerpos variantes, algunos de los cuales presentan una afinidad más alta por el antígeno. Histamina: amina vasoactiva almacenada en los gránulos de los mastocitos y basófilos. Homólogo: término que refiere a la procedencia de una molécula, célula, tejido u órgano de un organismo de la misma especie. Humoral: relativo a los líquidos extracelulares, incluyendo el suero y la linfa. En Inmunología refiere a la respuesta inmune adaptativa mediada por anticuerpos (ver Inmunidad humoral).

nflamación: término general que designa a la acumulación de líquido en el compartimiento extravascular, proteínas plasmáticas como la albúmina y leucocitos (edema que produce tumor,

dolor) como resultado del aumento de la permeabilidad vascular (eritema que produce rubor y calor), que se inicia por un daño tisular, una infección o una respuesta inmunitaria local.

G

H

I


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Inmunidad: capacidad de resistencia a la infección. adaptativa o adquirida: ver Respuesta inmune adaptativa o adquirida. humoral: mediada por anticuerpos y que por consiguiente puede ser transferida a un

receptor no inmune por el suero. innata: ver Respuesta inmune innata. mediada por células o celular: mediada principalmente por los LT efectores específicos de

antígeno. No es transferible mediante el suero a un receptor virgen. Inmunización o inoculación: inducción natural o artificial de una respuesta inmune.

activa: inducción deliberada y artificial de una respuesta inmune mediante la introducción de una proteína, polisacárido, toxoide, microorganismo vivo atenuado, muerto o inactivado. La inmunización activa que tiene como objeto inducir una inmunidad protectora contra una enfermedad se conoce como vacunación.

pasiva: transferencia de células sensibilizadas y/o anticuerpos preformados (homólogos o heterólogos) específicos generados por inmunización activa.

Inmunocompetente: en un individuo se refiere al estado de madurez inmunológica. Inmunocomplejo: complejo formado por la unión de un antígeno con un anticuerpo específico. Puede contener también componentes del sistema complemento. Inmunodeficiencia: Grupo heterogéneo de enfermedades debidas a alteraciones del sistema inmune. Estas alteraciones pueden ser causadas por un defecto genético en algún componente del sistema, denominándose inmunodeficiencias congénitas (primaria), o bien por alteraciones adquiridas tras una infección viral, malnutrición, depresión, denominándose inmunodeficiencias adquiridas (secundaria). Inmunodifusión: refiere a la difusión de un inmunoreactante a través de una matriz semisólida en condiciones experimentales adecuadas.

Radial Cuantitativa (IDRC): técnica inmunoquímica que permite cuantificar un antígeno de interés. El antígeno difunde a través de un agar que contiene un antisuero monoespecífico, (donde los anticuerpos están en concentración constante y en exceso), con el que interacciona. El tamaño del halo de precipitación es proporcional a la concentración del antígeno.

Inmunofluorescencia: técnica inmunoquímica donde la interacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo específico se detecta a través de una marca fluorescente (fluorocromo). La visualización de la fluorescencia requiere de un microscopio de fluorescencia o un citómetro de flujo según el caso.

directa: cuando el anticuerpo conjugado con el fluorocromo es el primario. indirecta: cuando el anticuerpo conjugado con el fluorocromo es el secundario.


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Inmunógeno: sustancia capaz de generar una respuesta inmune humoral y/o celular cuando es introducida en un organismo vertebrado adulto produciendo anticuerpos y/o células sensibilizadas con los que reacciona específicamente (ver Antígeno). Inmunoglobulina: ver Anticuerpo. Inmunoquímica: rama de la Inmunología que estudia y diseña métodos que permiten obtener, analizar y cuantificar fracciones de antígenos o anticuerpos en mezclas complejas. Inoculación: ver Inmunización. Interacción primaria: la primera de las etapas en la que ocurre la interacción entre antígenos y anticuerpos in vitro o in vivo. Refiere a la unión específica entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo. Es una etapa no visualizable. Interacción secundaria: etapa que sigue a la interacción primaria in vitro. Los inmunocomplejos formados se agregan para dar diferentes fenómenos visibles que dependen del estado físico del antígeno. Estas reacciones se aceleran con la temperatura, la agitación y la concentración de electrolitos. Interacción terciaria: fenómenos colaterales que ocurren a continuación de la interacción primaria in vivo. Estas reacciones dependen del tipo de anticuerpo o células intervinientes, características y dosis del antígeno, vía de inoculación, etc. Se pueden mencionar: la necrosis en la reacción de Arthus, los fenómenos vasógenos y de contractura de la musculatura lisa en la anafilaxia, etc. Isoaglutininas: nomenclatura original con la que se denominaban a los anticuerpos dirigidos contra los antígenos (isoantígenos) del sistema ABO presentes en la membrana de los glóbulos rojos sanguíneos. Isotipos o clases: sinónimo de isoformas. Se refiere a las diferentes formas en una familia de proteínas que se encuentran en todos los individuos de una especie. En nuestro caso refiere a las diferentes formas o clases de inmunoglobulinas (ver Anticuerpos).

infocitos: una de las poblaciones de leucocitos, son células mononucleadas responsables de la respuesta inmune adaptativa. B (LB): clase de linfocitos que median la inmunidad humoral. Son los encargados de

producir y secretar anticuerpos específicos cuando son activados. Los LB maduros vírgenes se caracterizan por expresar en su membrana IgM que forma parte del receptor del LB (BCR).

B1 (LB1): subconjunto de LB que expresan un repertorio limitado de genes V con escasa diversidad de unión, responden a antígenos timo-independientes y segregan IgM.

BZM: subconjunto de LB ubicados en la zona marginal del bazo que responden a antígenos microbianos con producción de IgM.

L


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de memoria: LB o LT específicos de antígeno, de larga vida. Son producidos a partir de linfocitos activados en la respuesta primaria a un antígeno y son reactivados en la respuesta secundaria y subsiguientes.

proB: estadio temprano del desarrollo de los LB. proT: estadio temprano del desarrollo de los LT. T (LT): clase de linfocitos que participan del desarrollo de la inmunidad celular y humoral.

Los LT maduros se caracterizan por expresar en su membrana el receptor de LT (TCR). T CD8+ citotóxico (LTc): subclase de LT que se caracteriza por expresar en su membrana

el correceptor CD8 y reconocer antígenos peptídicos presentados por moléculas del CMH clase I. Son los linfocitos efectores de la inmunidad celular.

T CD4+ helper (LTh): subclase de LT que se caracteriza por expresar en su membrana el correceptor CD4 y reconocer antígenos peptídicos presentados por moléculas del CMH clase II.

T CD4+ helper 1 (LTh1): LTh que producen un conjunto de citoquinas características. Participan principalmente en la activación de macrófagos.

T CD4+ helper 2 (LTh2): LTh que producen un conjunto de citoquinas que inducen en los LB el cambio isotípico a IgE.

T CD4+ helper folicular (LThF): LTh que se caracterizan por producir un conjunto particular de citoquinas. Participan principalmente en la activación de los LB.

T regulador: LT cuya acción puede suprimir las respuestas inmunes. virgen o naive: LB o LT maduro que ha dejado la médula ósea o el timo, respectivamente,

pero aún no ha encontrado su antígeno específico que lo active.

acrófago: células mononucleadas fagocíticas que residen en la mayor parte de los tejidos y que deriva de los monocitos sanguíneos. Participan de la respuesta inmune innata y

adaptativa. En esta última funciona como células presentadoras de antígeno profesionales y como células efectoras de la inmunidad humoral y celular. Mastocitos (células cebadas): grandes células derivadas de la médula ósea que se encuentran presentes en los tejidos conectivos de todo el cuerpo. Sus gránulos contienen una variedad de mediadores químicos (histamina, etc.) y en su membrana se expresan receptores de alta afinidad para IgE. Estas células participan de las reacciones de hipersensibilidad tipo I. Médula ósea: tejido que se encuentra en la cavidad central de ciertos huesos y que constituye el sitio principal de generación de los elementos celulares sanguíneos, incluidos los linfocitos inmmaduros y el lugar de maduración de los LB. Mieloma: tumor de células plasmáticas residentes en la médula ósea.

M


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Moléculas del CMH: productos de los genes que conforman el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH). Se los agrupan en tres clases y participan principalmente en la presentación antigénica a los LT. Monocitos: una de las poblaciones de leucocitos, son células mononucleadas precursoras de los macrófagos tisulares. Multivalente: refiere a la presencia de más de un sitio de unión para un mismo ligando o ligandos diferentes. En el caso de un antígeno, refiere a la existencia de más de un epitope capaz de interaccionar con anticuerpos. También pueden dar lugar a numerosos péptidos que luego serán reconocidos por los LT.

eutrófilos: una de las poblaciones de granulocitos, la más abundante. Son células fagocíticas que ingresan en grandes cantidades a tejidos que han sido infectados.

ntogenia: proceso de diferenciación y proliferación de un tipo celular en un tejido u órgano.

Opsonización: formación de una capa en la superficie de un patógeno u otra partícula con cualquier molécula (opsonina) que facilite la fagocitosis. Los anticuerpos y el complemento son las principales opsoninas que facilitan la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos. Órganos linfoides: tejidos organizados que contienen grandes cantidades de linfocitos en un estroma no linfoide.

primarios: tejidos donde se generan y maduran los linfocitos. En el hombre son la médula ósea y el bazo para los LB y la médula ósea y el timo para los LT.

secundarios: tejidos donde se inicia y desarrolla la respuesta inmune adaptativa. Son los ganglios linfáticos, bazo y tejido linfoide asociado a las mucosas (amígdalas, placas de Peyer, apéndice).

arámetro: es el término aplicado a señales medidas por un citómetro de flujo.

Paratope o sitio de combinación del anticuerpo: región de la molécula de inmunoglobulina que establece una unión de tipo no covalente con el epitope. Período de desencadenamiento: en la reacción anafiláctica experimental (en el caso de Anafilaxia Cutánea Pasiva) es el período que transcurre entre la introducción de la dosis desencadenante de antígeno vía intravenosa y el sacrificio del animal.

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Período de latencia: en la reacción anafiláctica experimental (en el caso de Anafilaxia Cutánea Pasiva) es el período en el que los anticuerpos heterocitotrópicos inoculados intradérmicamente se fijan a mastocitos y basófilos a través de su Fc. Peroxidasa: hemoproteína que cataliza una reacción de oxidoreducción donde se transfieren electrones desde un donante (forma reducida de un compuesto cromogénico en las reacciones de EIA) al peróxido de hidrógeno. Plan de inoculación: período de inmunización con un antígeno dado en un animal vertebrado e inmunológicamente maduro que establece frecuencias y vías de administración, uso de adyuvantes, y otros cuidados a tener en cuenta con el objetivo de generar una respuesta inmune. Plasma: líquido biológico de color amarillento y aspecto límpido en condiciones basales. Se obtiene luego de centrifugar la sangre recolectada con anticoagulante. Precipitación: fenómeno visible por formación de un precipitado blanquecino que resulta de la interacción secundaria entre un antígeno soluble y su correspondiente anticuerpo específico. Precipitación salina: fenómeno químico visible generado a partir de la mezcla de dos soluciones y que da como resultado un precipitado insoluble. Preparado específico de Ig: Producto derivado de un antisuero que contiene en alta concentración anticuerpos que interaccionan específicamente con un antígeno en particular. Preparado inespecífico de Ig: Producto derivado de un suero normal que contiene anticuerpos que interaccionan específicamente con más de un antígeno. Prozona: fenómeno propio de la aglutinación. Se caracteriza por la ausencia de aglutinado en las primeras diluciones de una batería de titulación, donde la concentración de anticuerpo es máxima, y con aglutinación a diluciones mayores. Este comportamiento se explica por la poca probabilidad que existe de que los dos sitios activos de un anticuerpo se unan a epitopes de dos moléculas de antígeno diferentes y en consecuencia se forme la red.

uemoquinas: proteínas pequeñas que intervienen en la conducción de los leucocitos a los sitios en los que se necesitan sus funciones.

eacción cruzada: se observa cuando un antisuero elaborado contra un antígeno dado reacciona con antígenos parcialmente relacionados que poseen uno o más determinantes antigénicos

idénticos o similares. Reacción de Coombs: prueba diagnóstica en la que se utiliza un suero anti-inmunoglobulina para aglutinar antígenos particulados (eritrocitos, bacterias) recubiertos por anticuerpos. Reacción primaria: ver Interacción primaria. Reacción secundaria: ver Interacción secundaria.

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Reacción serológica: reacción antígeno-anticuerpo donde los anticuerpos se encuentran en un suero en estudio. Reacción terciaria: ver Interacción terciaria. Reacciones de hipersensibilidad: estados de hiperreactividad a un antígeno. Son respuestas inmunes excesivas o inadecuadas a un antígeno inocuo que dan origen a reacciones sintomáticas después de una nueva exposición. Región constante: dominios carboxiterminales, relativamente invariables, de las cadenas de inmunoglobulinas pesadas y livianas, y de las cadenas peptídicas del TCR. Conforman el sitio o dominio efector de las inmunoglobulinas. Región variable: dominios amino-terminales de las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas y de las cadenas del TCR. Conforman el sitio o dominio de unión al antígeno. Regiones hipervariables: ver CDR. Respuesta inmune: proceso puesto en marcha por el sistema inmune que se desencadena ante la exposición a un agente patógeno o cualquier molécula extraña.

adaptativa: respuesta a un antígeno donde participan LB y LT específicos (ver Inmunidad humoral e Inmunidad celular) y que incluye el desarrollo de memoria inmunológica.

innata: conjunto de mecanismos de protección que existen antes de la infección, responden rápidamente a los patógenos y reaccionan de la misma forma antes infecciones repetidas.

Respuesta primaria: respuesta inmune adaptativa que se produce después de la primera exposición a un antígeno determinado. Respuesta secundaria: respuesta inmune adaptativa que sigue a una segunda o subsiguiente exposición a un antígeno determinado. Difiere de la respuesta primaria en la velocidad con que se inicia y llega a su máximo nivel.

alting out: fenómeno que se produce en una solución de proteínas cuando se incrementa la fuerza iónica del medio por agregado de una sal. Aunque inicialmente el agregado de una sal

aumenta la solubilidad de las proteínas en solución, a medida que se eleva la fuerza iónica, por aumento en la cantidad de sal, la solubilidad alcanza un máximo que es seguido por una disminución de la misma. Probablemente se produce una competencia por las moléculas de agua de solvatación entre las proteínas y la sal. En consecuencia, aumentan las interacciones proteína-proteína causando su precipitación. Screening: ensayo o prueba clínica sistemática, en general de bajo costo y gran simplicidad que permite la investigación de una sustancia o atributo, lo que contribuye a detectar tempranamente la presencia de una condición o enfermedad.

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Shock o choque anafiláctico: reacción anafiláctica sistémica desencadenada en los minutos siguientes al contacto con un antígeno (alérgeno) para el cual se estaba previamente sensibilizado. El tracto respiratorio es el tejido más afectado (edema traqueal) y puede sobrevenir la muerte por asfixia. Sistema: en las reacciones inmunológicas experimentales, el par antígeno-anticuerpo de interés. Suero: líquido biológico de color amarillento y aspecto límpido en condiciones basales. Para obtenerlo se deja coagular la sangre, recolectada sin anticoagulante, 1 a 2 horas en baño a 37 °C, se centrifuga y luego se separa. Suero hiperinmune: ver Antisuero. Suero inmune: ver Antisuero. Suero pre-inmune: suero que se obtiene de un animal de experimentación previo al primer estímulo con un antígeno. Se lo estudia para descartar la presencia de anticuerpos preexistentes que produzcan reacciones cruzadas con el antígeno inoculado.

ejido linfoide: ver Órganos linfoides.

Tejido linfoide asociado a mucosas (MALT): acumulaciones de células linfoides en los epitelios mucosos y lámina propia subyacente. Los principales MALT son el tejido linfoide asociado con el intestino (GALT) que incluye las amígdalas palatinas, las placas de Peyer del intestino delgado y las capas de linfocitos intraepiteliales y el tejido linfoide asociado a bronquios (BALT) que se encuentra en las vías respiratorias. Timo: órgano linfoide primario situado en el mediastino anterior, donde maduran y se seleccionan los LT. Título: en aglutinación, inversa de la máxima dilución que produce la observación del fenómeno de interacción secundaria. Es una medida semicuantitativa de la presencia de anticuerpos específicos.

nidad hemolítica 50%: es la menor cantidad de suero capaz de producir la lisis del 50 % de un sistema antígeno-anticuerpo, formado por glóbulos rojos de carnero y su correspondiente

anticuerpo (vía clásica) o de glóbulos rojos de determinadas especies animales en condiciones adecuadas (vía alterna).

acunación: ver Inmunización activa.

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Valencia: En el caso de un antígeno, refiere al número de epitopes capaces de interactuar con el anticuerpo. En el caso de un anticuerpo se refiere al número de sitios de combinación funcionales para el antígeno. Valor de corte (cut off): valor obtenido estadísticamente a partir del estudio de un determinado número de sueros negativos, con el que se discrimina si una muestra es positiva o negativa para la presencia de anticuerpos específicos. En el caso del trabajo práctico de ELISA será el valor de absorbancia a partir del cual un suero se considera positivo.

estern blot: técnica inmunoquímica muy utilizada para el estudio de mezclas antigénicas. Consiste en una primera separación por electroforesis (PAGE-SDS) tras la cual los

componentes se transfieren, bajo un campo eléctrico, a una membrana donde se fijan. Luego, se realiza la inmunodetección de uno o más de los componentes antigénicos utilizando anticuerpos.

ona de equivalencia: frente a una curva de precipitación refiere a aquella zona ubicada entre las zonas de exceso de anticuerpo y la de exceso de antígeno y en la que la precipitación es

máxima.

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175

BIBLIOGRAFÍA LIBROS Margni R. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. 5ª Edición. Editorial Médica

Panamericana (1996). Fainboim L, Geffner J. Introducción a la Inmunología Humana. 6ª Edición. Editorial Médica

Panamericana (2011). Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Inmunología celular y molecular. 6º Edición. Editorial Elsevier

Saunders (2008). Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM. Roitt. Inmunología. Fundamentos. 12ª Edición.

Editorial Médica Panamericana (2014). Parham, P. Inmunología. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana (2006). Regueiro González JR, López Larrea C, González, Rodríguez S, Martínez Naves E. Inmunología.

Biología y patología del sistema inmunitario. 4ª Edición. Editorial Médica Panamericana (2011). Salinas Carmona MC. La Inmunología en la Salud y la Enfermedad. 1ª Edición. Editorial Médica

Panamericana (2010). Rabinovich, G. Inmunopatología Molecular. 1ª Edición. Editorial Médica Panamericana (2004). Prat MI, Aztiria ME, Martínez A, Bianchimano A, Galvez M, Lencinas I. Guía Teórico-Práctica de

Inmunología. 2ª Edición. EdiUNS (2008). Guía de Técnicas Inmunológicas. Facultad de Medicina. UBA (2009). Inmunología. Guía de Trabajos Prácticos. Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA (2008). Guía de Trabajos Prácticos de Microbiología Especial. Departamento de Biología Bioquímica y

Farmacia. UNS (2004). Riera NE, Galassi NV, Felippo ME. Guía Teórica-Práctica del Curso: Introducción a la Citometría

de Flujo. Instituto de Investigaciones Hematológicas “Mariano R. Castex”, Academia Nacional de Medicina, Argentina (2009).

Vademécum WIENER LABORATORIOS. 2008-2009. TRABAJOS EN REVISTAS CIENTÍFICAS Carballo OG, Ingénito FB, Ginaca A, Carvajal P, Costa MA, Balbaryski J. Primer Consenso

Argentino para la Estandarización de la Determinación de Anticuerpos Anti-nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta Hep-2. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 46 (1): 3-13 (2012).

176

Kemp SF, Lockey RF. Anaphylaxis: A review of causes and mechanisms. Journal of Allergy and Clinical Immunology 110: 341-348 (2002).

Romero Valdez JG, Pereira Q, Zini RA, Canteros GE. Reacciones de Hipersensibilidad. Revista de Posgrado de la VIa Cátedra de Medicina 167: 11-16 (2007).

Simons, FER. Anaphylaxis. Journal of Allergy and Clinical Immunology 121: S402-407 (2008). FIGURAS Figura 10: Margni R. Imunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica

Panamericana. Pág. 180 (1996). Figura 11: Guía de Técnicas Inmunológicas. Facultad de Medicina. UBA. Pág 8 (2009). Figura 14: Regueiro González JR et al. Inmunología. Biología y patología del sistema inmunitario.

4ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Pág. 237 (2011). Figura 15: Regueiro González JR et al. Inmunología. Biología y patología del sistema inmunitario.

4ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Pág. 242 (2011). Figura 16-17: Guía de Trabajos Prácticos y Talleres. Curso de Inmunología Básica. Facultad de

Ciencias Veterinarias. UNCPBA (2008). Figura 18: Abbas AK et al. Inmunología celular y molecular. 6ª Edición. Editorial Elsevier

Saunders. Pág. 208 (2008). Figura 19-22: Guía Teórica-Práctica del Curso: Introducción a la Citometría de Flujo. Instituto de

Investigaciones Hematológicas “Mariano R. Castex”, Academia Nacional de Medicina (2009). Figura 26: modificada de Kosco-Vilbois, MH. Are follicular dendritic cells really good for nothing?

Nature Review Immunology 3: 364-769 (2003). Figura 27: modificada de http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmuno2/ca032.htm Figura 29: Regueiro González JR et al. Inmunología. Biología y patología del sistema

inmunitario. 4ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Pág. 237 (2011). Figura 30: VII Curso de Laboratorio en las enfermedades autoinmunes. Laboratorio del Hospital

Alemán. CABA (2003). Figura 31: modificada de Lodish et al. Biología Celular y Molecular. Editorial Médica

Panamericana (2002).

prÓlogo - ri.conicet.gov.ar

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