PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULARObjectiu: unificar conceptes.

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

BIBLIOGRAFIA

Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, WilliamM. New York: WH Freeman and Co; c1999.

Molecular Cell Biology. 4th ed.Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: WH Freeman and Co; c1999.

Genomes. 2nd ed.Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd 2002.

Human Molecular Genetics 2. 2nd ed.Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.

Ingeniería Genética y transferencia Génica.Marta Izquierdo Rojo; Editorial PirámideMadrid, 2001

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmidsi YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

CRE-RECOMBINASE

ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat

loxP

Cre recombinase

loxP loxP

loxP

A

B

Excision of a loxP flanked region

0.2 - 2.0 MbYAC (yeast artificial chromosome)

up to 300 kbBAC (bacterial artificial chromosome)

130 - 150 kbPAC (P1 artificial chromosome)

30 - 44 kbCosmid

9 - 23 kbBacteriophage λ replacement

0 - 10 kbBacteriophage λ insertion

0 - 10 kbStandard high copy number plasmid

Size of insertCloning vector

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiquesi de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

Tejido

mRNA

H2O mRNA

OvocitosXenopus

Ensayo

Selecciónpor tamaño

ABCD H2O A B C D

SintesiscDNA

1

2

3

45

6

H2O 1 2 3 4 5 6

Aislamiento de clones únicos

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciacióautomàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

RECOMBINACIÓN IN VIVO

gene of interest

selection marker

targeting construct

X X

homology homology

double homologousrecombination

selection marker

inactivated gene

HOMOLOGOUS RECOMBINATION

egg

sperm

fertilized egg

ZYGOTE

32-64-cellstage

BLASTOCYST

inner cell mass (ICM)

Embryonic Stem cells:culture

genetic manipulation

reintroduce in host-embryo

CRE-LOXP:

TISSUE-SPECIFIC GENE INACTIVATION

(only one floxed allele indicated, should be homozygous or other allele otherwise inactivated)

PROGRAMA:

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lulesde mamífer. Teràpia gènica.

cDNAAffinity tagT7 promoter

Insert in an expression plasmid

TAAATG

NH4

Purify fusion protein via affinity tag

• Common affinty tags are be 6X-His & GST –both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin

Needs to be in frame

Liposome

Electroporation

Transfection

Vectors amb promotors induïbles

Tet-inducible, two component system.

+ Tet Ras

-CMV Promoter Tet r VP16 activation domain