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→ La frecuencia de las mutaciones en nuestra población fue del 24,7%, encontrándose dentro del rango descripto en la literatura.
→ El 62% las mutaciones se ubicaron en el sitio ATP binding/SH2 contact. Y la T315I fue la mas frecuentemente observada.
→ La presencia de más de dos mutaciones presentó una muy baja incidencia.
→ Se detectaron mutaciones aun no reportadas en la bibliografía como es el caso de la E316V, de la que se desconoce su respuesta al tratamiento.
→ La utilización de las técnicas HRM/PCR-ASO aumentó la sensibilidad de detección de los clones mutados.
→ Las mutaciones se distribuyen en forma homogénea entre los diferentes grupos etarios, sin exhibir mayor incidencia en los pacientes con edad avanzada.
→ El presente análisis refleja nuestra experiencia en los estudios de detección de mutaciones como causales de resistencia al tratamiento a los ITKs, a fin de
replantear la estrategia terapéutica a seguir.
Nº 12
RESISTENCIA AL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON LEUCEMIA
MIELOIDE CRÓNICA (LMC) TRATADOS CON INHIBIDORES DE TIROSINA
QUINASA. SU EVALUACIÓN MOLECULAR
Noriega M.F#; Ferri C*; Krzywinski A#; Martorell Caro M#; Hauser N#; Ferrulli M#; Bengió R**; Acevedo S#; Larripa I*
#División Genética. Departamento de Patología Diagnóstica. I.I.Hema “Mariano R. Castex”. ANM. *Laboratorio de Genética Hematológica. IMEX, CONICET-ANM**División Clínica Hematológica. Departamento de Hemato-Oncología. I.I.Hema “Mariano R. Castex”. ANM. Academia Nacional de Medicina. Pacheco de Melo 3081. CABA.(1425) Buenos Aires. Argentina. Tel: 4805-8803. Fax: 4803-9475. [email protected] / [email protected]
MATERIALES Y MÉTODOS
Población Estudiada: Se evaluaron 154 pacientes con LMC tratados con ITK que ingresaron al Instituto en el período de Oct 2010-Sept 2017. De los cuales 144 se encontraban en fase crónica, 5 en fase acelerada y 5 en crisis blástica. Se determinó el nivel de transcriptos BCR-ABL1 mediante la técnica de PCR cuantitativa QRT-PCR; el screening de búsqueda de mutaciones por High Resolution Melting (HRM) y la identificación de las mismas por secuenciación directa (SD). PCR en tiempo Real (QRT-PCR): La cuantificación de los niveles de transcripto BCR-ABL1 y del gen ABL1 (gen de referencia) se realizó mediante el uso del kit comercial “One-Step RT-PCR cuantitativa” (Molecular MD). Los niveles de BCR-ABL1 fueron medidos y normalizados usando el gen ABL1. Se utilizaron los primers específicos para la isoforma p210 y del gen control ABL1. Los resultados obtenidos se expresaron como % BCR-ABL1/ABL1 corregido por el factor de conversión. Detección de Mutaciones: Se utilizaron los primers descriptos por Gorre y col. (Science 2001, 293:876) para realizar la amplificación del gen mutado BCR-ABL1. Se purificaron los productos de PCR utilizando columnas comerciales (GE Healthcare) para luego secuenciarlos por el método de secuenciación directa (sensibilidad 10-20%) y los resultados obtenidos se evaluaron utilizando los programas Mutation Surveyor® y el ChromasLite®. High Resolution Melting (HRM): Análisis post PCR , permite diferenciar variaciones de temperatura producidas por el cambio de hasta un solo nucleótido. Se utilizan 3 juegos de Primers para amplificar los clusters : P-loop, ATP-Binding, Catalytic Domain; y como templado el producto de 1313 pb obtenido con los primers A (BCR13) y B (ABL7). El análisis se realiza con el software del equipo Rotor-Gene 6000 Qiagen. Los resultados compatibles con la presencia de mutaciones ¡son confirmados por Q-PCR ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Para lo cual se realiza una PCR con un primer forward para cada región, un primer reverse discriminante y no discriminante para cada mutación.
INTRODUCCIÓN
La LMC Phi positiva se origina por la translocación recíproca entre el gen ABL1 (9q34) y el gen BCR (22q11), dando origen al gen quimérico de fusión BCR-ABL1 (patognomónico de la enfermedad) y a la producción de una proteína oncogénica con actividad de tirosina kinasa (TK) aumentada. El descubrimiento del gen de fusión, su actividad TK y la demostración que intervenía en el origen de la LMC, impulsó el desarrollo de drogas selectivas como los inhibidores de la tirosina kinasa (ITK), dirigidas a un blanco específico. Hacia el año 2001, con la aparición de estos inhibidores como el Imatinib (cuyo mecanismo de acción es por unión al sitio del ATP en la molécula del BCR–ABL1 inhibiendo en forma competitiva la fosforilación de los residuos de tirosina de su sustrato), surge un tratamiento altamente eficaz, que prolonga la sobrevida con escasos efectos secundarios. Con el transcurso de los años, se observó que algunos pacientes presentaban resistencia al tratamiento de 1º línea por lo que requerían de inhibidores de 2º y 3º línea como el Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib y Ponatinib. Estudios publicados han demostrado que la administración prolongada con dichas drogas puede producir resistencia al tratamiento por diferentes mecanismos, dentro de los cuales se encuentran: * los Independientes del gen de fusión BCR-ABL1 y los* Dependientes del BCR-ABL1: donde lo más frecuente, es la adquisición de mutaciones en sitios críticos del dominio kinasa del gen ABL1, responsables del 40% de los casos de resistencia 2ria y de un 10-15% de las resistencias 1ria.
*Analizar pacientes con diagnóstico de LMC que presentan resistencia a los ITKs
mediante técnicas de biología molecular, a fin de determinar la presencia de
mutaciones en el dominio quinasa (DK) del gen ABL1, su frecuencia , tipo de ITK y
tiempo de tratamiento administrado. NEJM 1999
Cancer Institute
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Ferri C et al. Leuk.Lymphoma 2012
Amplificación por PCR del segmento del gen quimérico BCR-ABL1 para ser utilizado en HRM y Q-PCR ARMS
BCR ABL1
1313 pb A B
P-loop Imatinib
Binding
Catalytic
Domain
170 pb 131 pb 100 pb
Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3
P-loop ATP binding Drug
E255K/V M244V
L248V G250E F311I
F317L
T315I
V299L M351T F359V
C H G F E D
Ferri C et al. Leuk.Lymphoma 2012
1313 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ABL1 BCR b2 b3 a2
Pr.Fw A Pr Rv B
586 bp
Pr.P-loop Pr A7
Diseño de PCR para la detección de mutaciones
T315I: Codón 315 ACT>ATT
SD: Electroferograma de la mutación T315I
Región ATP-BINDING. Mutación T315I
Control positivo
Control negativo
Pac. con mutación
Análisis por HRM de la mutación T531I
∆ct 10
WT 100%
Pr. no discriminantes
Pr. Específicos
de la Mutación
∆ct 0,4
Mutado 100% ∆ct 2,83
Mutado 25%
Confirmación de la mutación por Q-PCR ARMS
OBJETIVOS
Presencia de Mutaciones 38/154 (24,7%)
¤ Edad media: 49 años
¤ 21/38 varones ¤ Mediana de aparición de mutaciones:
36 meses
1 mutación: 89,5% (34/38) Pacientes con 2 mut.: 7,9% (3/38) 3 mut.: 2,6% (1/38)
13 pac. con Imatinib Tratamiento 20 pac. con Dasatinib 5 pac. con Nilotinib
Respuestas moleculares por QRT-PCR * Nula: 21 casos
* Mínima: 9 casos
* Menor: 8 casos
Detección de las Mutaciones
* por SD: 94,7% (36/38)
* por HRM/PCR ARMS: V299L en un 10% y F359V en un 1,17%
D276G
E282G
L364I
P310Q
Y253H E316V