Procura de novos drogas antifúngicas que contêm compostos naturais: perspectivas,

sinergismo e mecanismo de ação

Prof. Susana A. ZacchinoFarmacognosia

Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas

Os fungos

são oportunistas

Causan doença em pacientesimunossuprimidos

transplantados que recebem quimioterapia

prematurosqueimados

idosos

produzindo infecções muito graves

Brown et al., Hidden killers: Human fungalinfections. Med Mycol. 4, 165rv13, 2012

pulmões

cérebro

pele

rins

Frequentemente os fungos

causam a morte aos pacientes

imunossuprimidos

Pfaller, Michael A., et al. PloS one 9.7 (2014): e101510.

principalmente

Candida sppCryptococcus sp

Dispomos de

antifúngicos em uso clínico

Pared celular

Membrana

Inhibición de distintas etapas de

la biosíntesis del ergosterol

se liga a ergosterolANFOTERICINA B

de 1955

Pared celular

Membrana

Unión al ergosterol

AZOLES

Inibem diversos estádios da

biossíntese de ergosterol

ALILAMINAS

a inibição parede celular

fúngica

Membrana

Inhibición de distintas etapas de

la biosíntesis del ergosterol

Unión al ergosterol

Metabolismo

intermediário

Equinocandinas: CASPOFUNGINA

5-FC

No entanto infecções fúngicas são muito difíceis de erradicar

Muitos fungos tornaram-se resistentes

C C

Uma causa é a formação de biofilmes

Fungal comunidade aderida a uma superfície,

suportado por uma matriz extracelular polimérica

que aderir a qualquer superfície ou qualquer órgão

ARTICULAÇÕES Alvéolos pulmonares

N

N

N

OH

NN

N

F

F

NH

NH2N

NH

O

HO

HO

OH

NH

NH

HN

O

N

O

O

H3C

H3C CH3

OHNH

H2N

OHO

HOCH3

OH

OH

O

O

HN

NH

NH2

F

O

5’-fluorocitosina

fluconazolcaspofungina

CH3

O

OOHOHOHO OH

COOH

CH3

HO

H3COH

O

O

OH

NH2

H3C

OH

OH

OH

N CH3

H3CCH3

CH3

terbinafina

resistem ao entrada de antifúngicos

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0.03

0.06

0.12

0.25 0.

5 1 2 4 8 16 32 64 128

256

512

Resistente

Sensível

Concentração inibitória mínima (CIM) de FCZ

biofilm

Candida albicans

A fim de combater a infecções fúngicas,os médicos usam a terapia de combinação

Johnson, M., et al., AAC 48, 693-715, 2004

+

+

+

Terapia antifúngica de

combinación

5-fluorocitosina + fluconazol

itraconazol + anfotericina B

caspofungina + fluconazol

Célula fúngica

Os modos de acção da combinação

Efeitos sobre a

múltiplos alvos

Efeitos

farmacocinéticos e

físicoquímicos

Os modos de acção da combinação

Efeitos sobre a

múltiplos alvos

Efeitos

farmacocinéticos e

físicoquímicos

Efeitos sobre a

múltiplos alvos

Os modos de acção da combinação

Efeitos sobre a

múltiplos alvos

Efeitos

farmacocinéticos e

físicoquímicos

Os modos de acção da combinação

Efeitos sobre a

múltiplos alvos

Efeitos

farmacocinéticos e

físicoquímicos

Aumentar a solubilidadee / ou absorção

Melhorar a

biodisponibilidade dos compostos activos

Piper spp.piperina

aumenta a biodisponibilidade

Patente US 7119075 B2

O uso de agentes à base de plantas para a potenciação da bioeficácia de anti infecciosos

As plantas têm provado ser uma importante fonte de compostos antifúngicos

+

Atualmente estão sendo estudados, combinações

contendo antifungicos y extratos vegetais ou seus

componentes

Combinação de fármacos antifúngicos, com extracto de

Melaeuca alternifolia

WO 2011140309 A3

Abril 5, 2012

Como o efeito das combinações

é analisada?

Pode-se falar de

- Enhancement

de la actividad de un compuesto

DRI = Dose Reduction Index(Índice de redução da dose)>

CIM do composto sozinhoCIM del composto en combinaçao

DRI=

Use of herbal agents for potentiation of bioefficacyof anti infectives Patente US 7119075 B2

DRI = 16Dose Reduction Index(Indice de Reducción de dosis)

- Sinergismo

- Antagonismo

- Indiferencia o aditivismo

Pode-se falar de

SINERGISMO

El efecto producido es MAYOR que el que se podría

haber esperado de las contribuciones individuales.

Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and

Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161

ANTAGONISMO

El efecto producido sea MENOR que el que se podría

haber esperado de las contribuciones individuales.

Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and

Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161

Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and

Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161

INDIFERENCIA

El efecto producido es el que se podría haber esperado

de la suma de las contribuciones individuales.

Estudio de sinergismo in vitro

Metodología

HONGOS PRUEBASINERGISMO?Proporção de

cada um

dos

compostos

HONGOS PRUEBAProporção de

cada um

dos

compostos

a una concentración << CIM

MIC = 12 µg/mL

a una concentración<< CIM

MIC= 30 µg/mL

Concentraciones sub-

inhibitorias

15,0 µg/mL

7,5 µg/mL

3,7 µg/mL

1,9 µg/mL

………..

Concentraciones sub-

inhibitorias

6,0 µg/mL

3,0 µg/mL

1,5 µg/mL

0,7 µg/mL

………..

• Relación fija• Relación variable

Fungos alvo

Candida albicans

ATCC 90029

Candida albicans

ATCC 900955

3.12

Anfotericina B+ epigalocatequingalato (EGC)

Hirasawa et al., J. Antimicrob. Chemother. 2004 , 53, 225

Metodología

HONGOS PRUEBA

Existem diferentes metodologías

Interactions in vitro by fungal species

Combination antifungal agents

Candida spp. C. neoformans Aspergillus spp.

AMB + FC no interactionsynergy

synergyno interaction

no interactionsynergyantagonism

AMB + azoles no interactionantagonismsynergy

no interactionantagonismsynergy

no interactionantagonismsynergy

Azoles no interactionantagonismsynergy

synergy no interaction

no interaction

Estudos de combinaçãos de agentes antifúngicos

Cuenca-Estrella, M., J. Antimicrob. Chemother. 54, 854, 2004

Há muitos modelos para detectar sinergismo

Métodos in vitro mais utilizados

Tempo para matar

DifusiónCheckerboard

Métodos in vitro mais utilizados

Difusión

16 mg

8 mg

+

10 mg fluconazole

N

N

N

OH

NN

N

F

F

32 mg

64 mg

Métodos in vitro mais utilizados

Tempo para matar

Tempo para matar

Métodos in vitro mais utilizados

CheckerboardTabuleiro de

xadrez

ICIF ISOBOLOGRAMA

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

A

sozinho

B

sozinho

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

A

sozinho

B

sozinho

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

CIM da

A sozinho

CIM

deB sozinho

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

CIM da

A sozinho

CIM

deB sozinho

combinações inibitórios

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

COMBINAÇÕES

CIMA en combinación = 0,98 µg/mL

CIMA en solitario = 1,95 µg/mL= CIF A

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN

0 15,75 31,25 62,5 125 250

0

0,24

0,49

0,98

1,95

3,91

7,81

15,75

COMBINAÇÕES

CIMB en combinación = 15,75 µg/mL

CIMB en solitario = 1,95 µg/mL= CIFB

ICIF = CIFA + CIFB

ICIF < 0,5

ICIF 0,5 ≤ 4

ICIF > 4

Sinergismo

Antagonismo

Indice de Concentración Inhibitoria

Fraccionaria (ICIF)

Aditividade ou indiferença

Chequerboard technique.

Cuenca-Estrella M J. Antimicrob. Chemother. 2004;54:854-869

ISOBOLOGRAMA

ISOBOLOGRAMA

CIF A

CIF

B

Combinaciones

Un antifúngico + un extratode planta

Dos extratos de plantas

Estudos de combinações contendo produtos naturais

Um antifúngico + um composto natural pura

Combinaciones

Un antifúngico + un extratode planta

Dos extratos de plantas

Procura de novas combinações contendo produtos naturais

Um antifúngico + um composto natural pura

Estudos de combinações contendo produtos naturais

terpenos + fenoles

otros compuestos

Os compostos que mostraram uma maior capacidade de aumentar a actividade do antifúngico

70 %

Terpenos

Monoterpenes diterpenes

triterpenos

Fenóis

cumarina

Métodos in vitro

Estudios de mecanismo de acción

5 %

Estudios in vivo5 %

CheckerboardIsobologramaTempo para matarDRI

No hay prácticamente estudios en

humanos

Combinaciones

Un antifúngico + un extratode planta

Dos extratos de plantas

Procura de novas combinações contendo produtos naturais

Um antifúngico + um composto natural pura

Pelargoniumgraveolens (aceite esencial)

Origanum vulgare (aceite esencial)

Melaleuca alternifolia(aceite esencial)

As plantas que têm demonstrado sinergismo com Anfotericina B contra Candida albicans

Sinergismo de extratos vegetales e antifungico

A. Rosato et al. / Phytomedicine 15 (2008) 635–638

A. Rosato et al. / Phytomedicine 15 (2008) 635–638

Estudos em nosso laboratório

44 EXTRATOS

do géneroBaccharis

em combinação comTERBINAFINA

contraTrichophyton rubrum

Estudo tridimensional de

sinergismo

Extracto sozinho

Terbinafinasozinha

Efeito sobre o

crescimento

do fungo

Curva de dose-

resposta de

extracto

Curva de dose-

resposta da

terbinafina

A superfície é obtido para um comportamento de aditividade de efeitos

sinergismo

Baccharis articulata

Baccharis crispa

Baccharis trimera

Rodríguez et al. Phytomedicine 2013

Combinaciones

Un antifúngico + un extratode planta

Dos extratos de plantas

Procura de novas combinações contendo produtos naturais

Um antifúngico + um composto natural pura

Análise de curvas de dose-

resposta e o uso de Método

Efeito médio

Chou, T-Ch., Pharmacol, Rev 58, 621–681, 2006

Combinação de

Zuccagnia punctata Cav. (Fabaceae)

Larrea nitida Cav. (Zigophyllaceae)

utilizados em conjunto ou alternadamente na medicinatradicional

Objetivos

- Determinar se existe sinergismo

- Qual é la composição mais sinérgica

Zuccagnia punctata Larrea nitida

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

Dipping en DCM

60 s, ta

Dipping en DCM

60 s, ta

ZpE

Febrero

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

ZpE

MayoZpE

Septiembre

ZpE

NoviembreLnE

Febrero

LnE

MayoLnE

Septiembre

LnE

Noviembre

Collection em 4 meses diferentes

Zuccagnia punctata Larrea nitida

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

Dipping en DCM

60 s, ta

Dipping en DCM

60 s, ta

ZpE

Febrero

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

ZpE

MayoZpE

Septiembre

ZpE

NoviembreLnE

Febrero

LnE

MayoLnE

Septiembre

LnE

Noviembre

Collection em 4 meses diferentes

Zuccagnia punctata Larrea nitida

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

Dipping en DCM

60 s, ta

Dipping en DCM

60 s, ta

ZpE

Febrero

Febrero Mayo Septiembre Noviembre

ZpE

MayoZpE

Septiembre

ZpE

NoviembreLnE

Febrero

LnE

MayoLnE

Septiembre

LnE

Noviembre

Extrato 1 Extrato 2

Collection em 4 meses diferentes

1

Extrato 1

CompuSynComputer SoftwareChou, J and Chou, T.-C. Dose-effect analysis with microcomputers

Package ‘Mixlow’Author John Boik Software for assessing drug synergism/ antagonism

1

extracto 1

CIM50

1

2

Extrato 2

1

2

Extrato 2

CIM50

1

2C

Combinação 1+ 2

CIM50 + CIM50

CIM50 de la

combinaçao

CIM50 de la

combinaçao

[1] em combinação[1] sozinho

CIF1 =

CIM50 de la

mistura

[2] em combinação[2] sozinho

CIF2 =

Índice de combinação (Cl) para cada CIM

CI = CIF1 CIF2+

CI < 1 sinergismoCI = 1 indiferenciaCI > 1 antagonismo

CICIM50

CI

CIM80

CIM50

CI

CIM80

CIM50

CI < 1 sinergismo

1.0

Fevereiro

Maio

Setembro

Novembro

Contra C. albicans

Maio

C. glabrata

Fevereiro

Conteúdo de vários marcadores nas misturas sinérgicas

Mezcla ZpE-LnE May Mezcla ZpE-LnE Feb

L. nitida Z. punctata

Apesar da complexidade do estudo de compostos e extractos em combinação

Toxicidade

Resistencia

Recurrencia

Combinações N

N

N

OH

NN

N

F

F

Nuevas drogas antifúngicas

O re-exame da plantas en

combinaçao

Maximiliano SortinoMarcos DeritaLaura SvetazEstefanía ButassiAgustina PostigoMarcela RaimondiMaría Victoria Rodríguez