presentación de powerpoint - javeriana.edu.co20qu%cdmico%20y%20evaluaci%d3n... · lizó de acuerdo...
TRANSCRIPT
DEFENSAS ANTIMICROBIANASDEFENSAS ANTIMICROBIANASDE PLANTAS SUPERIORES:DE PLANTAS SUPERIORES:
““Un caso de aplicaciUn caso de aplicacióónn””
Julio Armando Pedrozo PérezProfesor Asociado
Departamento de QuímicaPontificia Universidad Javeriana
Bogotá – Colombia2003
GIFUJ
CULTIVO DE PAPACULTIVO DE PAPA
(Guasca – Cundi.)
El cultivo de plantas ornamentales se ha convertido en Colombia,en una de las industrias de mayor crecimiento, debido a la gran demanda internacional de flores de excelente calidad y sanidad.
Constituye uno de los rubros de mayor importancia de la econo-mía nacional, generando divisas comparables a las producidasen años precedentes por el petróleo o el café.
FLORICULTURAFLORICULTURA
FLORICULTURA EN COLOMBIAFLORICULTURA EN COLOMBIA
Colombia posee una combinación única de condiciones topográficasy de temperatura, que permiten la producción intensiva de más de 30tipos de flores cultivadas en invernadero, desde rosas, pompones,crisantemos, astromelias, girasoles y claveles, hasta las másexóticas, como heliconias y el “ave del paraíso”.
Hongos FitopatHongos FitopatóógenosgenosAlternariaAspergillusRhizoctonia
ColletotrichumSphaerotheca
FusariumBotrytis
Bacterias FitopatBacterias FitopatóógenasgenasPseudomonas
FITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS
CONTROL QUCONTROL QUÍÍMICOMICO
AGRICULTURA ORGAGRICULTURA ORGÁÁNICANICA
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANASSUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS
☼ INHIBIDORES☼ POSINHIBIDORES
2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PARECOSISTEMA PARÁÁMOMO
Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)
VEGETACIVEGETACIÓÓN DEL SUBPN DEL SUBPÁÁRAMORAMO
PROYECTOPROYECTO
ESTUDIO QUESTUDIO QUÍÍMICO Y EVALUACIMICO Y EVALUACIÓÓN DE LAN DE LAACTIVIDAD ANTIFACTIVIDAD ANTIFÚÚNGICA Y ANTIBACTERIANANGICA Y ANTIBACTERIANA
DE PLANTAS AUTDE PLANTAS AUTÓÓCTONAS DE PCTONAS DE PÁÁRAMOSRAMOSCOLOMBIANOS COLOMBIANOS
Investigadores:Rubén Darío Torrenegra GuerreroJulio Armando Pedrozo Pérez
COLCIENCIAS/U. JAVERIANA, código 1203-05-394-95, CT-128-97
Cromatogramas
Medio de cultivo +Microorganismo
Medio de cultico +Cromatograma invertido
Refrigeración / 18 horas
Retirar CCDIncubación
Comparación de resultadoscon duplicado de CCD
Medición de Rf y zonas de inhibición
Zonas de inhibición
TEST BIOAUTOGRÁFICO
Dipolostephium phylicoides - -Diplostephyum revolutum - -Senecio formosus b,c b,cSenecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,cPentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,cBejaria aestuans - -Gaultheria anastomosans b -Pernettya prostrata - -Vaccinium floribundum - -Cavendishia cordifolia - -Lupinus paniculatus - -Calamagrostis effusa - -Baccharis tricuneata - -Espeletia grandiflora a,b -Espeletia argentea a,b -Espeletiopsis corymbosa a,b -Ageratina vacciniaefolia a,b bAgeratina fastigiata a,b bAgeratina tinifolia a,b b
Especies vegetales A.AB A.AF
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)
Pentacalia ledifolia (H.B.K)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN DEL VEGETALN DEL VEGETALExtracto:Extracto:
Sustancias de la superficie foliarSustancias de la superficie foliar
200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y
concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató conMe2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue
removido por filtración y, el filtrado resultante, fueconcentrado y secado al ambiente.
El extracto se guardó en nevera a 4ºC paraevaluarle luego su acción antifúngica
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON PETRN CON PETRÓÓLEOLEO
• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,fue secado al ambiente y luego pulverizado.
• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío.
• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secóal ambiente.
El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluarluego su acción antifúngica.
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON ETANOLN CON ETANOL
• El material desengrasado se extrajo porpercolación en frío con EtOH 96% v-v.
• El extracto resultante se trató con agua, sefiltró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/Lcon CHCl3 y luego con AcOEt.
Las fracciones se concentraron, se secaron alambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,posteriormente, su acción antifúngica.
MMÉÉTODO DE CRECIMIENTOTODO DE CRECIMIENTORADIAL EN PDARADIAL EN PDA
Extracto vegetal Medio de cultivo
InóculoIncubación / 6 días
Medición de los diámetrosde las colonias
CIM ENCIM EN mgmg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,42h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,62f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,63h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,53r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,51h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,32h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,62f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,62r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,53r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
EXTRACTO DE MAYOREXTRACTO DE MAYORACCION ANTIFACCION ANTIFÚÚNGICANGICA
Procedimiento:
Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío conCHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vezdurante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentrarony se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CHCl3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en neveraa 4 ºC.
Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride
FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
CIM ENCIM EN mgmg/ml DE LA FCA DE ESPECIES/ml DE LA FCA DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTEDE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOSHONGOS FITOPATOGENOS
RECONOCIMIENTO DE PROBLEMASRECONOCIMIENTO DE PROBLEMASFITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS
Sphaerotheca pannosa var. rosae (Ascomicetes)
Parásito obligado
Causante del mildeo polvoso en el fruto del du-rasno, fresa y mora; es la enfermedad de mayorseveridad y diseminación en cultivos de rosa eninvernadero y en campo abierto.
La forma más corriente es la asexual, designadacomo Oidium leucoconium.
La forma sexual presenta cleiostecios globosos con unos peque-ños apéndices miceloides de color café; contienen 8 ascosporas.
Las esporas asexuales (conidias) son producidas en gran número yson prácticamente responsables de la propagación y diseminaciónde la especie.
Mildeo polvoso del rosalMildeo polvoso del rosalLos síntomas tempranos son un leve levan-tamiento, como una ampolla, a menudo, enáreas rojas en la superficie de la hoja.El micelio (con conidióforos) aparece comomanchas discretas en la superficie de lashojas jóvenes, las cuales se vuelven curva-das, deformes y, comúnmente, se recubrende un polvo blanco llamado.
Ataca las espinas en su base; a los tallos en las partes más tiernas;a las hojas jóvenes en toda su superficie; a las flores en los pedún-culos, en sépalos y receptáculos, especialmente cuando la flor aúnno está abierta.
El daño reduce el crecimiento de la hoja, el valor estético de laplanta, la eficiencia en la fotosíntesis y, por consiguiente, el desa-rrollo.
BIENSAYO BIENSAYO in vivoin vivo PARA HONGOSPARA HONGOSPARPARÁÁSITOS OBLIGADOSSITOS OBLIGADOS
Invernadero: dividido en naves de aproximadamente 1.000 m2 y, confor-mada cada una por 15 a 20 camas. Sólo se utilizaron 6 de estas camas,cada una conteniendo 280 plantas en periodo de floración. Éstas camasfueron distribuidas según un diseño de bloques al azar con aleatoriza-ción restringidaEvaluación: la evaluación del daño del hongo sobre las plantas se rea-lizó de acuerdo a una escala de calificación, correspondiente a porcen-tajes de ataque entre 0 y 50%.Aspersión: se utilizó una bomba de presión constante, previamente de-sinfectada y calibrada. Se utilizó el método de aplicación en escuadra.Muestras experimentales: se utilizaron soluciones acuosas de extrac-tos de especies de Pentacalia, adicionando un adherente especial(Pegal 0,5%). Análisis: se realizó la prueba de “t” y el análisis de varianza (ANOVA)que permite comparar más de dos medias poblacionales.
APLICACIAPLICACIÓÓN DE LAN DE LAFRACCIFRACCIÓÓN ACTIVAN ACTIVA
MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓN E N E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN
MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓNN•|Cromatografía en capa delgada preparativa• Fraccionamiento sobre lecho de sílica• Cromatografía en columna flash• Cromatografía en columna de sílica• Cromatografía en columna de sephadex
MMÉÉTODOS DE IDENTIFICACITODOS DE IDENTIFICACIÓÓNN• Espectrofotometría ultravioleta• Espectrometría de masas• Resonancia Magnética Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
Hongos FitopatHongos FitopatóógenosgenosAlternariaAspergillusRhizoctonia
ColletotrichumSphaerotheca
FusariumBotrytis
Bacterias FitopatBacterias FitopatóógenasgenasPseudomonas
FITOPATFITOPATÓÓGENOSGENOS
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANASSUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS
☼ INHIBIDORES☼ POSINHIBIDORES
2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PARECOSISTEMA PARÁÁMOMO
Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)
VEGETACIVEGETACIÓÓN DEL SUBPN DEL SUBPÁÁRAMORAMO
Dipolostephium phylicoides - -Diplostephyum revolutum - -Senecio formosus b,c b,cSenecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,cPentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,cBejaria aestuans - -Gaultheria anastomosans b -Pernettya prostrata - -Vaccinium floribundum - -Cavendishia cordifolia - -Lupinus paniculatus - -Calamagrostis effusa - -Baccharis tricuneata - -Espeletia grandiflora a,b -Espeletia argentea a,b -Espeletiopsis corymbosa a,b -Ageratina vacciniaefolia a,b bAgeratina fastigiata a,b bAgeratina tinifolia a,b b
Especies vegetales A.AB A.AF
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.(Guasg(Guasgüíüínn-- HuasgHuasgüíüín)n)
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN DEL VEGETALN DEL VEGETALExtracto:Extracto:
Sustancias de la superficie foliarSustancias de la superficie foliar
200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y
concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató conMe2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue
removido por filtración y, el filtrado resultante, fueconcentrado y secado al ambiente.
El extracto se guardó en nevera a 4ºC paraevaluarle luego su acción antifúngica
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON PETRN CON PETRÓÓLEOLEO
• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,fue secado al ambiente y luego pulverizado.
• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío.
• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secóal ambiente.
El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluarluego su acción antifúngica.
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN CON ETANOLN CON ETANOL
• El material desengrasado se extrajo porpercolación en frío con EtOH 96% v-v.
• El extracto resultante se trató con agua, sefiltró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/Lcon CHCl3 y luego con AcOEt.
Las fracciones se concentraron, se secaron alambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,posteriormente, su acción antifúngica.
CIM ENCIM EN mgmg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,42h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,62f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,63h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,53r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,51h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,32h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,62f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,62r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,53f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,53r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
EXTRACTO DE MAYOREXTRACTO DE MAYORACCION ANTIFACCION ANTIFÚÚNGICANGICA
Procedimiento:
Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío conCHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vezdurante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentrarony se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CHCl3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en neveraa 4 ºC.
Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride
FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
CIM ENCIM EN mgmg/ml DE LA FCA DE ESPECIES/ml DE LA FCA DE ESPECIESDE PENTACALIA, ANTEDE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOSHONGOS FITOPATOGENOS
MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓN E N E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN
MMÉÉTODOS DE SEPARACITODOS DE SEPARACIÓÓNN•|Cromatografía en capa delgada preparativa• Fraccionamiento sobre lecho de sílica• Cromatografía en columna flash• Cromatografía en columna de sílica• Cromatografía en columna de sephadex
MMÉÉTODOS DE IDENTIFICACITODOS DE IDENTIFICACIÓÓNN• Espectrofotometría ultravioleta• Espectrometría de masas• Resonancia Magnética Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
O
CH3O
HO O O
CH3O
O O
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIARCUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
Escopoletina 7-O-geranilescopoletina
FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIARFITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR
QUINOLES DE PENTACALIAQUINOLES DE PENTACALIA
(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato ...
Jacaranona
12
34
5
6
78
O
HO OCH3
O1
2
34
5
6
78
O
HO OCH2.CH3
O
Etiljacaranona
JACARANONAJACARANONA
MMÉÉTODO DE CRECIMIENTO RADIALTODO DE CRECIMIENTO RADIALBotrytis cinerea, Fusarium oxysporum
SUSTANCIAS ANTIFUNGICASSUSTANCIAS ANTIFUNGICAS
Escopoletina 120 1207-geraniloxilescopoletina 90 90Jacaranona 660 650Metiljacaranona 650 650
Sustancias CIM en μg/mlF.oxysporum B.cinerea
INDUCCIINDUCCIÓÓN DE ESCOPOLETINAN DE ESCOPOLETINAPATÓGENO
Virus del mosaico
Virus
VirusCeratostomella
fimbriata
Helicobasidiummompa
Phytophthorainfectans
Pseudomonassolanacearum
PLANTA
Tabaco
Tabaco
Papa
Papa
Papa
Papa
Tomate
BIBLIOGRAFÍA
Best, 1944
Andreae, 1948
Uritani, 1953
Hoshiya, 1958
Fang, 1988
Hofer, 1984
Paxton, 1944
También se ha encontrado ser inducidas por nemátodos e insectos
JACARANONAJACARANONAMarcada acción citotóxica y antitumoral
* Activo a 2 mg/kg sobre el sistema leucemia linfocítica P338* Solamente acción citotóxica marginal (ED50) a niveles de
2,1 μg/ml)
Acción inhibidora del crecimiento deSpodoptera litura (Lepidoptera)
Concentraciones inferiores a 1000 ppm
Mecanismos: como reactivos electrofílicos están implicadoscon intermediarios de la fosforilación oxidativa y en reac-ciones de eliminación. Pueden sufrir ataques nucleofílicosposiblemente por constituyentes celulares con grupo-S de
una enzima clave.
1 2
345
6
1'2'3'
4' 5'
6'
1''2''
3''4''
5''
6''
78
9
10111'''
2'''
O O
CH3O
OO
HOH
H
H HHO
HO
O HHH
CO
O
HH
OH
PENTACALIOSIDOSPENTACALIOSIDOS
O O
CH3OHH
H
H δ 6,37
δ 7,68δ 7,05
δ 7,59
δ 3,73
δ 5,73
δ 4,40
δ 5,14
δ 4,74δ 4,14
δ 4,38 δ 4,34
OO
HOH
H
H HHO
HO
O HHH
CO
O
HH
OH
HH
H
Hδ 6,32
δ 7,52
δ 3,10δ 3,23
ASIGNACIONES DE LAS SEASIGNACIONES DE LAS SEÑÑALES DELALES DELESPECTRO ESPECTRO 11HNMR DE PENTACALIHNMR DE PENTACALIÓÓSIDO ASIDO A
(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato de 6’-escopolinilo
O O
CH3OHH
H
H δ 6,37
δ 7,68δ 7,05
δ 7,59
δ 3,73
δ 5,73
δ 4,40
δ 5,14
δ 4,74δ 4,14
δ 4,38 δ 4,34
OO
HOH
H
H HHO
HO
O HHH
δ 2,35; 2,95
δ 2,14; 2,31
δ 3,10δ 3,23
CO
O
HH
OH
HH
HH
HHH
H
ASIGNACIONES DE LAS SEASIGNACIONES DE LAS SEÑÑALES DELALES DELESPECTRO ESPECTRO 11HNMR DE PENTACALIHNMR DE PENTACALIÓÓSIDO BSIDO B
(1-hidroxi-4-oxo-ciclohexanil) acetato de 6’-escopolinilo
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1. Sobre la superficie foliar de Pentacalia corymbosaexisten sustancias “protectoras” contra hongos einsectos.
2. Estas sustancias mostraron estructuras de tipocumarínico y quinólico.
3. Las cumarinas aisladas fueron la escopoletina y la 7-O-geranilescopoletina.
4. Los quinoles aislados fueron la jacaranona y laetiljacaranona.
• PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
• COLCIENCIAS
• UNIVERSIDAD DE STRATHCLYDE(Glasgow – Escocia)
• INSTITUTO DE INMUNOLOGIA(Bogotá – Colombia)
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS