CACOSPONGIONOLIDE Y SCALARADIAL, DOS SESTERTERPENOS MARINAS COMO POTENTES FACTORES QUE INDUCEN APOPTOSIS EN LÍNEAS CELULARES DE CARCINOMA HUMANODANIELA DE STEFANO  , JOSEFINA TOMMONARO , SHOAIB AHMAD MALIK, , CARMINE IODICE , SALVATORE DE ROSA , MARIA CHIARA MAIURI  , ROSA CARNUCCIO. 2011

INTRODUCCIÓN• El cáncer es una causa

principal de muerte en países industrializados.

• Apoptosis: una forma de

muerte de célula programada.

• Productos marítimos naturales (sesterterpenoides), importantes en el descubrimiento y el desarrollo de nuevas medicinas.

• Organismos de cuerpos

suaves.

HIPÓTESIS

• El scalaradial y cacospongionoloide inhiben la proliferación de células cancerígenas e inducen apoptosis

OBJETIVOS

• Ver la capacidad del scalaradial y cacospongionoloide para inhibir la proliferación e inducir apoptosis en varias líneas de célula de carcinoma humanas.

• Determinar apoptosis a través de diferentes métodos empleando células cancerigenas diferentes .

• Determinar la vía por la cual producen apoptosis

MÉTODO EXPERIMENTAL

Scalaradial (SC) fue aislado de la

esponja scalaris Cacospongia

Cacospongionoloide (CSP) se aisló de la esponja  Fasciospon

gia cavernosa

CULTIVO CELULAR

Cultivo celular de

T74D, A431,HeLa

Cultivo celular de HCT116

se sembraron en placas

durante 24 hrs

Incubación

Ensayo de MTT para viabilidad celular

Las células se sembraron en 96 plocillos de

cultivo

Las células fueron

incubadas con SC ,CSP o solos

Ensayo MTT

Incubación durante 3 h

Espectrofotómetro de micro

placas

ENSAYO COMETA

25 min

25 minA un pH de

13

Células teñidas con bromuro de

etidio

Cuantificación de la fragmentación del ADN

Acido tricloroacéti

co

15 min

Cuantificación

(difenilamina)

CITOMETRÍA DE FLUJO

* Dihexyloxacarboc

yanine yoduro* Yoduro de

propidio

Clasificación de células

HeLa y células HCT116

APOPTÓSIS EN MATRIZ

Kit de apoptosis de

matriz humana

Células HeLa : tratadas y no

tratadas

Quimioluminiscencia

Escaneo de

membrana

Cuantificación :

• Con tratamiento vs. Células sin tratar.

Relación expresada:

ANÁLISIS POR WESTERN BLOT

Células T47D

Electroforesis

Anti-p50Anti-p65

GAPDH • Densitometria

ANÁLISIS ESTADÍSTICO • La significancia estadística fue calculada

por one-way analysis de varianza ANOVA .

• El nivel de significancia es definido como p<0.05

RESULTADOS• Efecto de SC y CSP en viabilidad celular

EFECTO DE SC Y CSP EN MORFOLOGÍA CELULAR

EFECTO DE SC Y CSP EN FRAGMENTACIÓN DE DNA

EFECTO DE SC Y CSP EN PROTEÍNAS SEÑALIZADORAS DE APOPTOSIS

EFECTO DE INHIBIDORES DE CASPSAS Y P53

EFECTO DE SC Y CSP EN TRANSLOCACIÓN NUCLEAR P50 Y P65

DISCUSIONES

T47D

HCT116

A431

HeLa

Reducen viabilidad celular en de una manera dependiente de concentración.

Apoptosis

Reducción m

Fragmentación

de DNA

Proteínas anti-

apoptoticas son

inhibidas

Survivin Bcl-2 IAPs

• Vía p53• Vía caspas

SC y

CPS

apoptosis

Reguladas a nivel transcripcional por NF-B

SC y CSP son capaces de inhibir translocación nuclear p50y p65.

CONCLUSIONES • CS y CSP inducen muerte celular por características

como: reducción m y fragmentación de DNA.

• SC y CSP no actúan vía p53; y la activación de las caspasas son las moléculas clave de su efecto.

• La significativa reducción de la expresión de varias proteínas antiapoptóticas sugieren propiedades anticancerígenas prometedoras de SC y CSP.

• SC y CSP son capaces de inhibir translocación nuclear p50y p65.

• Son necesarias posteriores investigaciones para entender detalladamente el mecanismo molecular por el cual CSP y CS inducen las apoptosis de células cancerígenas.

REFERENCIAS

• 1. World Health Organization (2005) Global action against cancer. Geneva, Switzerland.

• 2. Al-Ejeh F, Kumar R, Wiegmans A, Lakhani SR, Brown MP, et al. (2010) . Harnessing the complexity of DNA-damage response pathways to improve

cancer treatment outcomes. Oncogene 29(46): 6085–6098.• 3. Udagawa T, Wood M (2010) Tumor-stromal cell interactions and

opportunities for therapeutic intervention. Curr Opin Pharmacol 10(4): 369–374.

• 4. Lin X, Liu M, Hu C, Liao DJ (2010) Targeting cellular proapoptotic molecules for developing anticancer agents from marine sources. Curr Drug Targets 11(6): 708–715.

• 5. De Rosa S, Mitova M (2005) ‘‘Bioactive marine sesterterpenoids’’ in Studies in Natural Products Chemistry, Ed. Atta-ur-Rahman, Elsevier, Amsterdam, Netherlands Vol. 32, 109–168.

• 6. Napolitano JG, Daranas AH, Norte M, Ferna´ndez JJ (2009) Marine macrolides, a promising source of antitumor compounds. Anticancer Agents Med Chem 9(2): 122–137.

• 7. . Liu Y, Levy R (1997) Phospholipase A2 has a role in proliferation but not in differentiation of HL-60 cells. Biochim Biophys Acta 1355(3): 270–280.

• 8. Xie Y, Liu L, Huang X, Guo Y, Lou L (2005) Scalaradial inhibition of epidermal growth factor receptor-mediated Akt phosphorylation is independent of secretory phospholipase A2. J Pharmacol Exp Ther 314(3): 1210–1217.

• 9. Ruipe´rez V, Casas J, Balboa MA, Balsinde J (2007) Group V phospholipase A2- derived lysophosphatidylcholine mediates cyclooxygenase-2 induction in lipopolysaccharide- stimulated macrophages. J Immunol 179(1): 631–638.

• 10. Posadas I, De Rosa S, Terencio MC, Paya´ M, Alcaraz MJ (2003)Cacospongionolide B suppresses the expression of inflammatory enzymes and tumour necrosis factor-alpha by inhibiting nuclear factor-kappa B activation. Br J Pharmacol 138(8): 1571–1579.

• 11. Karin M (2009) NF-kappaB as a critical link between inflammation and cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 1(5): a000141.

• 12. De Rosa S, De Stefano S, Zavodnik N (1988) ‘‘Cacospongionolide: a new antitumoral sesterterpene, from the marine sponge Cacospongia mollior’’. J Org Chem 53: 5020–5023.

• 13. De Rosa S, Crispino A, De Giulio A, Iodice C, Pronzato R, et al. (1995) ‘‘Cacospongionolide B, a new sesterterpene, from the marine sponge Fasciospongia cavernosa’’ J Nat Prod 58: 1776–1780.

• 14. Zamzami N, Marchetti P, Castedo M, Decaudin D, Macho A, et al. (1995) Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. J Exp Med 182: 367–377.

• 15. Rook GA, Dalgleish A (2011) Infection, immunoregulation, and cancer. Immunol Rev 240(1): 141–159.

• 16. Chaturvedi MM, Sung B, Yadav VR, Kannappan R, Aggarwal BB (2011) NFkB addiction and its role in cancer: ‘one size does not fit all’. Oncogene 30(14): 1615–1630.

• 17. Beth L (2007) Autophagy and cancer. Nature 446: 745–747.

• 18. Fedorov SN, Radchenko OS, Shubina LK, Balaneva NN, Bode AM, et al. (2006) Evaluation of cancer-preventive activity and structure-activity relationships of 3-demethylubiquinone Q2, isolated from the ascidian Aplidium glabrum, and its synthetic analogs. Pharm Res 23: 70–81.

• 19. Fedorov SN, Shubina LK, Bode AM, Stonik VA, Dong Z (2007) Dactylone inhibits epidermal growth factor-induced transformation and phenotype expression of human cancer cells and induces G1-S arrest and apoptosis. Cancer Res 67: 5914–5920.

• 20. Liu JJ, Lin M, Yu JY, Liu B, Bao JK (2011) Targeting apoptotic and autophagic pathways for cancer therapeutics. Cancer Lett 300(2): 105–114.

• 21. Demaria S, Pikarsky E, Karin M, Coussens LM, Chen YC, et al. (2010) Cancer and inflammation: promise for biologic therapy. J Immunother 33: 335–351.

• 22. Richardson A, Kaye SB (2008) Pharmacological inhibition of the Bcl-2 family of apoptosis regulators as cancer therapy. Curr Mol Pharmacol 1(3): 244–254.

• 23. Deorukhkar A, Krishnan S (2010) Targeting inflammatory pathways for tumor radiosensitization. Biochem Pharmacol 80(12): 1904–1914.

• 24. De Rosa S, Crispino A, De Giulio A, Iodice C, Benrezzouk R, et al. (1998) A new cacospongionolide inhibitor of human secretory phospholipase A2 from the Tyrrhenian sponge Fasciospongia cavernosa and absolute configuration of

• cacospongionolides. J Nat Prod 61(7): 931–935.