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Antonia Picón y Juan L. Arqués
Colección de microorganismos INIA
INIA - Departamento de Tecnología de Alimentos
[email protected]; [email protected]; [email protected]
La colección de microorganismos españoles accesible “on-line”28 de Febrero de 2020
Título de la diapositivaTítulo de la diapositiva
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
INIA
• Uno de los siete Organismos Públicos de Investigación
• Único OPI dedicado exclusivamente a la investigación agroalimentaria y forestal
• 1.100 personas, 800 en tareas de investigación
Secretaría General de Investigación
CSIC
ISCIII
CIEMAT
INIA
IEO
IGME
IAC
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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
INIA
Centro para la Calidad de los Alimentos - Soria
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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Líneas de investigación
• Seguridad microbiológica de alimentos
• Tecnología de productos lácteos y cárnicos
• Calidad y seguridad de alimentos vegetales
Planta de Tecnología de Alimentos
• Altas presiones
• Salas de lácteos y cárnicos
• Sala y laboratorios de higiene de alimentos
Patógenos
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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS INIA
Bacterias de origen lácteoFunción: Mejorar el sabor y aroma del queso
• Tecnología y calidad
Bacterias lácticas productoras de bacteriocinas o reuterinaFunción: Mejorar la seguridad de alimentos
• Seguridad microbiológica
• Bacterias probióticasBacterias lácticas y bifidobacterias de origen humano
Función: Desarrollar nuevos alimentos probióticos
GRAS / QPS
Asociadas a fermentaciones
Cultivos iniciadores
Cultivos protectores
Probióticos
• Bacterias patógenas y alterantesListeria monocytogenesClostridium spp.
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COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS INIA
BACTERIAS LÁCTICAS PARA MEJORAR LA CALIDAD Y SEGURIDAD DE ALIMENTOS
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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
CALIDAD
• Mejora de las características sensoriales del queso
Potenciación del aroma y sabor
Reducción del periodo de maduración
Cultivos adjuntos de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas
75
5450
9
0
20
40
60
80 FMFM + INIA 415 (Nis + L481)FM + FTFM + FT + INIA 415 (Nis + L481)
(Días para alcanzar intensidad de sabor = 6)
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Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
CALIDAD
• Eliminación de la formación de aminas biógenas en queso
Cultivos adjuntos de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Histidina (mg/kg queso) Histamina (mg/Kg queso)
FM
FM + INIA 4-07
FM + EFS 2
INIA ESI 561
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Log UFC/g queso
FM
FM + INIA 4-07
FM + EFS 2
INIA ESI 561
Lb. buchneri St2A (productor de histamina) inoculado en leche
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CALIDAD
• Eliminación de la hinchazón tardía en queso
Cultivos adjuntos de bacterias lácticas productoras de bacteriocinasA: Clostridium beijerinckii INIA 63 + Lactococcus lactis INIA 415-2B: Clostridium beijerinckii INIA 63 + Lactococcus lactis INIA 415 (Nis + L481)
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CALIDAD
• Nuevos cultivos iniciadores para queso
Producción de compuestos volátiles por cepas autóctonas de bacterias lácticasDiferencias en el número y la abundancia de compuestos volátiles generados
0
1000
2000
3000
4000
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SEGURIDAD
• Seguridad microbiológica de alimentos: Bioconservación
L. lactis subsp. cremoris INIA 624 Lacticina 481
L. lactis subsp. lactis INIA 626 Nisina Z + Lacticina 481
L. lactis subsp. lactis INIA ESI 515 Nisina A
E. faecium INIA 607 Enterocinas A y B
E. faecalis INIA 652 Enterocina I
E. faecalis INIA 4 Enterocina AS-48
L. lactis INIA CL2 Nisina A + Pediocina PA-1
Lb. reuteri P572 Reuterina
Lb. reuteri P576 Reuterina
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SEGURIDAD
• Inactivación de Listeria monocytogenes en queso
0
1
2
3
4
5
6
7
0 h 8 h 7 d 15 d 30 d 60 d
Sin fermento
L. lactis TAB 50 Nis
L. lactis TAB 24 L481
E. faecalis TAB 28 AS48
Fermento comercial
L. lactis INIA 650 (Nis)
L. lactis INIA 624 (L481)
E. faecalis INIA 628 (AS-48)
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SEGURIDAD
• Inactivación de Listeria monocytogenes en queso
5,25 mmol/g
0
1
2
3
4
5
6
7
1 d 7 d 15 d 30 dLb. reuteriLb. reuteri + Glicerol
ControlGlicerol
+ Lb. reuteri INIA P572 (106/ml)+ glicerol (50 mM)
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SEGURIDAD
• Inactivación de Listeria monocytogenes en jamón curado
1
2
3
4
5
6
7
0 1 7 15 30
log
UFC
/g
Tiempo (d)
12 °C
No tratado
Enterocina AB
450/10
450/10 +Enterocina AB
+ APH 450 MPa/10 min / + Enterocina AB (E. faecium INIA 607) / + tratamiento combinado
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COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS INIA
BACTERIAS PROBIÓTICAS PARA EL DESARROLLO DE ALIMENTOS FUNCIONALES
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PROBIÓTICOS
Origen Especie
MADRE-HIJO 1 Leche materna B. longum
Heces bebé B. longum
Heces bebé 2008 B. bifidum
Heces madre 2009 B. bifidum
Heces niño B. pseudocatenulatum
Heces madre B. pseudocatenulatum
MADRE-HIJO 2 Leche materna B. infantis
Heces bebé B. infantis
MADRE-HIJO 3 Leche materna B. breve
Heces bebé B. breve
• Bacterias lácticas y bifidobacteriasaisladas de leche materna y hecesde bebés lactantes
Transmitidas de madre a hijo
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PROBIÓTICOS
Cepas bioprotectoras Cepas probióticas
EFECTO DOBLEALIMENTO-INTESTINO
• Bacterias lácticas de origenlácteo y productoras decompuestos antimicrobianos
Lactococcus lactis INIA 650 Nisina
Lactobacillus reuteri INIA P572 Reuterina
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POTENCIAL PROBIÓTICO Y TECNOLÓGICO
Identificación Producción antimicrobianos / Antagonismo Producción de metabolitos bioactivos Resistencia a condiciones GI Seguridad Adhesión / Formación de biofilms Inmunomodulación Crecimiento en leche / Congelación / Liofilización Desarrollo de quesos y yogures probióticos Valoración química y sensorial Escalado Modelos in vitro Estudios in vivo
CARACTERIZACIÓN
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PROBIÓTICOS
Características y efecto probiótico
Metabolismo de fitoestrógenos
Propiedades tecnológicas para desarrollar alimentos funcionales
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PROBIÓTICOS
Propiedades tecnológicas para desarrollar alimentos funcionales
Título de la diapositivaTítulo de la diapositiva
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PROPIEDADES TECNOLÓGICAS
0
5
508
459 55 74 160
272
393
461
478
495
534
587
708
733
243
313
334
340
344
374
426
486
520
603
622
220
355
448
572
579
LGG
SD2…
Crecimiento en leche4
Actividad acidificante
• Crecimiento en leche y actividad acidificante
• Tolerancia al oxígeno de las bifidobacterias
Resistencia al estrés oxidativo (3% de H2O2)Grupos bacterianos según la tolerancia a microaerofilia
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PROPIEDADES TECNOLÓGICAS
• Estabilidad de los cultivos en leche a 4°C
-5
-4
-3
-2
-1
0
784
517
43 466
598
600
670
671
685
711
826
840
18 49 366
608
663
691
703
710
712
714
730
734
763
728
731
737
BB-1
2BB
536
Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp.
• Estabilidad de los cultivos a -80°C
-5-4-3-2-10
784
517
43 466
598
600
670
671
685
711
826
840
18 49 366
608
663
691
703
710
712
714
730
734
763
728
731
737
Bb-1
2BB
536
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PROPIEDADES TECNOLÓGICAS
Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp.
• Estabilidad a la liofilización y almacenamiento
• Elaboración de quesos con cepas probióticas como adjuntos
0
2
4
6
8
10
0 h 1 d 7 d 15 d 28 d Digestión
bifidobacterias
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PROBIÓTICOS
Propiedades tecnológicas para desarrollar alimentos funcionales
Características y efecto probiótico
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RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
• Método ISO 10932 - Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) recomendada por la EFSA (2012)
Strains Species Ampicillin Vancomycin Gentamycin Kanamycin Streptomycin Etythromycin Clindamycin Tetracycline Chloramphenicol
INIA P272 Lb. paracasei S n.r. S R S S S S RINIA P344 Lb. rhamnosus S n.r. S R S S S S RINIA P572 Lb. reuteri R n.r. S S S S S R RINIA P540 Lb. rhamnosus S n.r. S S S S S S RINIA P508 Lb. mucosae S n.r. S S R S S R SINIA P183 Lb. salivarius S n.r. S R S S S S RINIA P448 Lb. salivarius S n.r. S R S S S S RINIA P461 Lb. paracasei S n.r. S R S S S S RINIA P734 B. breve S S S n.r. S S S S SINIA P784 B. adolescentis S S S n.r. S S S R SINIA P737 B. infantis S S S n.r. S S S R SINIA P712 B. breve S S S n.r. S S S S SINIA P678 B. longum S S S n.r. S S S S SINIA P671 B. bifidum S S S n.r. R S S S SINIA P753 B. pseudocatenulatum S S S n.r. S S S S SINIA P826 B. bifidum S S S n.r. R S S S SINIA P843 B. longum S S S n.r. S S S S SINIA P2 B. pseudolongum S S S n.r. S S R S SINIA P132 B. longum S S S n.r. R S S S SINIA P731 B. infantis S S S n.r. S S S R SINIA P900 B. animalis S S S n.r. S S S R SINIA 415 L. lactis S S S S S S S S STAB 50 L. lactis S S S R R S S S SINIA P553 E. faecium S S n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. n.t.TAB 7 E. faecium S S n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. n.t.
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PROCUCCIÓN DE AC. GRASOS CONJUGADOS
• Producción ac. linoleico conjugado (CLA) o ac. linolénico conjugado (CLNA)
Bifidobacterium Producción de CLA Lactobacillus Producción de CLAINIA P2 - INIA P55 ++
INIA P120 - INIA P74 -INIA P132 - INIA P143 +INIA P678 - INIA P160 -INIA P685 - INIA P183 -INIA P712 ++ INIA P235 -INIA P718 - INIA P243 -INIA P730 - INIA P272 -INIA P731 - INIA P344 -INIA P734 +++ INIA P374 +INIA P737 + INIA P448 +INIA P797 - INIA P461 +INIA P819 - INIA P508 ++INIA P836 - INIA P535 +INIA P879 - INIA P540 ++INIA P882 +++ INIA P572 -INIA P885 - INIA P574 +INIA P916 - INIA P582 ++INIA P965 - INIA P603 -INIA P996 ++ INIA P651 +
INIA P655 +INIA P733 +
Detección de linoleato isomerasa
Cepa Producción de CLA(µg /mL en sobrenadante)
Bifidobacterium breve LMG13194 (Control +) 34,20
Bifidobacterium breve INIA P734 25,32
Lactobacillus sakei LMG 13558 (Control +) 2,59
Lactobacillus mucosae INIA P508 8,82
Análisis cuantitativo
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EFECTO INMUNOMODULADOR-PROTECTOR
Línea celular (2 x 10⁵ ufc/ml): macrófagos RAW 264.7Estimulación con LPS: 1 µg/ml, 100 y 10 ng/ml
Producción de óxido nítrico (NO): reacción de Griess
Producción de citoquinas: ELISA (TNF-α, IL- 1β, IL – 6)
• Ensayos in vitro con cultivos celulares
Viabilidad celular: ensayo MTT
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EFECTO INMUNOMODULADOR-PROTECTOR
• Ensayos in vivo
DAI: índice de la enfermedad
HistologíaMarcadores proinflamatorios:
- Inmunomodulación- Permeabilidad intestinal
Modelo de colitis inducida por DSS (Dextran Sulfate Sodium) → C57BL/6: Valoración del proceso inflamatorio
Supervivencia al paso por el TGI → CD-1
Proteínas fluorecentes
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EFECTO INMUNOMODULADOR-PROTECTOR
DAI IL-1β IL-6 TNFα MMP-9 iNOS ICAM-1 MCP-1 MUC-2 ZO-1 occl
E. faecium TAB 7 +
L. lactis T AB24 +
L. lactis TAB26 + +
L. lactis TAB50 + + + +
L. paracasei P272 ++ + + + + +
L. rhamnosus P344 +/- + + +
L. reuteri P572 + + + + +
B. breve P734 + + + + + + +
Inmunomodulación Permeabilidad intestinal
Ec. faecium 607
Lc. lactis 624
Lc. lactis 626
Lc. lactis 650
Lb. paracasei P272
Lb. rhamnosus P344
Lb. reuteri P572
B. breve P734
PRODUCTOS MULTICEPA
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SECUENCIACIÓN
• Illumina MiSeq Sequencing System
Predicción de determinantes de resistencia a antibióticos, factores de virulencia o determinantes genéticos asociados con la interacción con el hospedador.
EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD ALIMENTARIA Y
ANÁLISIS FUNCIONAL
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PROBIÓTICOS
Metabolismo de fitoestrógenos
Propiedades tecnológicas para desarrollar alimentos funcionales
Características y efecto probiótico
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METABOLISMO DE FITOESTRÓGENOS
Estilbenos
Coumestanos
Isoflavonoides
Elagitaninos
Lignanos
NO
Metabolizable por la microbiota intestinal
SI
+ Estrógenicos+ Antiestrógenicos+ Antioxidantes
Equol
Urolitinas
Enterodiol+ Biodisponibles
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METABOLISMO DE FITOESTRÓGENOS
Cepas con buenas propiedades tecnológicas capacesde metabolizar fitoestrógenos en alimentos
Cepas probióticas capaces de metabolizarfitoestrógenos en intestino
Equol
Urolitinas
Enterodiol
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METABOLISMO DE FITOESTRÓGENOS
• Metabolismo de isoflavonas en bebidas de soja.
Cepas Isoflavonas bioactivas
Lb. salivarius INA P183 Daidzein, genistein, glicitein
Lb. rhamnosus INIA P226 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
Lb. rhamnosus INIA P508 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
Lb. paracasei INIA P461 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
Lb. mucosae INIA P508 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
Lb. rhamnosus INIA P535 Daidzein, genistein, glicitein , O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA
Lb. rhamnosus INIA P540 Daidzein, genistein, glicitein , O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA
Lb. reuteri INIA P572 Daidzein, genistein, glicitein , 6-hidroxi-O-DMA
Lb. plantarum ESI144 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
B. breve INIA P367 Daidzein, genistein, glicitein , 6-hidroxi-O-DMA
B. bifidum INIA P466 Daidzein, genistein, glicitein , O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA
B. longum INIA P678 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
B. catenulatum INIA P732 Daidzein, genistein, glicitein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA
B. adolescentis INIA P784 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
B. pseudocatenulatum INIA P815 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
B. animalis INIA P900 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
B. pseudocatenulatum INIA P946 Daidzein, genistein, glicitein , Dihidrodaidzein, O-DMA, 6-hidroxi-O-DMA, 4-hidroxi-equol
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METABOLISMO DE FITOESTRÓGENOS
• Metabolismo de lignanos y flavonoides desde semillas de lino en medio de cultivo o extractos de lignanos en leche.
Cepas Lignanos-Flavonoides de interésB. bifidum INIA P466 SECO, enterodiol, Kampferol y naringeninB. catenulatum INIA P732 SECO, enterodiol, enterolactona, Quercectin, Quercetagetin, Kampferol y naringeninB. pseudolongum INIA P2 SECO, enterodiol Kampferol y naringeninB. pseudocatenulatum INIA P946 SECO, enterodiol, enterolactona, Herbactetin, Quercectin, Quercetagetin, Kampferol y naringeninB. adolescentis INIA P784 SECO, enterodiol Kampferol y naringeninLb. salivarius INIA P183 SECO, enterodiol, enterolactona Kampferol y naringeninLb. salivarius INIA P448 SECO, enterodiol, enterolactona Kampferol y naringeninLb. mucosae INIA P58 SECO, enterodiol, enterolactona Herbactetin, Quercectin, Quercetagetin, Kampferol y naringeninLb. rhmanosus INIA P540 SECO, enterodiol, enterolactona Kampferol y naringeninLb. plantarum ESI144 SECO, enterodiol, enterolactona Herbactetin, Quercectin, Quercetagetin, Kampferol y naringenin
• Metabolismo de ac. elágico en medio de cultivo
CepasB. pseudocatenulatum INIA P815 Urolitinas A y B
Título de la diapositivaTítulo de la diapositiva
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