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“Bases genéticas de la resistencia bacteriana. Estructura genómica y evolución hacia la extrema resistencia en infecciones
crónicas de P. aeruginosa. ”
IMPaMCONICET-UBA
Instituto de Investigaciones en
Microbiología y Parasitología MédicaCONICET
Curso Precongreso
Congreso de la Sociedad Chilena de Infectología 2015
Daniela CentrónLaboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos,
IMPAM UBA/CONICET,Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires.
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Describir las vías moleculares de la evolución hacia la
extrema resistencia antibiótica (XDR) en las
infecciones crónicas de P. aeruginosa.Particularmente:
• Conocer el/los hábitats de P. aeruginosa y las patologías
que puede causar al ser humano.
• Conocer la problemática de la resistencia a antibióticos.
• Describir los mecanismos de mutaciones, ADN móvil y
dinámica poblacional que llevan a la XDR en esta especie.
• Cómo opera el sistema Integrón/Cassettes.
• Cuáles son las características de la adaptación a la
cronicidad en P. aeruginosa.
• Identificar el rol de la Transferencia Horizontal de la
Resistencia Antibiótica en las infecciones crónicas de P.
aeruginosa.
Tópicos de la charla
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Descripta por primera vez como Bacillus pyocyaneus en
1882. Es ubicua en la biosfera, puede estar en suelos, H2O
dulce o salada, con predilección por ambientes húmedos.
Coloniza desinfectantes, jabones, colirios, sistemas de
ventilación, equipos de terapia respiratoria......
de vez en cuando migra de su entorno natural
P. aeruginosa y su adaptación a
diferentes nichos ecológicos.
Infección respiratoria crónica en pacientes con patologías de base
(Fibrosis Quística, Bronquiectasias, EPOC).
Produce infecciones en pacientes de la comunidad: enterocolitis necrotizante,
otitis media maligna e infecciones urinarias.
Es uno de los principales patógenos nosocomiales ya que produce neumonía,
sepsis, infección de heridas, infección urinaria…
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Resistencia natural de P. aeruginosa
Cloranfenicol
Tetraciclinas
Macrólidos
Glicopéptidos
Trimetoprima
Sulfametoxazol
Acido nalidixico
Aminopenicilinas
Aminop. + inhibidores
Cefalosporinas 1ra y
2da
Cefoxitina
Cefotaxima y Ticarcilina-clavulánico
presentan sensibilidad in vitro,
resistencia in vivo
(Hancock R et al., 1998; Girlich D et al., 2004; Lister et al., 2009)
Expresión basal de bombas
de expulsión (MexAB-OprM)
Impermeabilidad
β-lactamasas cromosómicas
blaAMPC
blaOXA-50
Resistencia multifactorial
actuando en
forma concertada
“resistoma intrínseco”“independiente de exposición previa
a antibióticos y no debido a eventos
de THG”
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(Livermore DM.Clin. Microb Rev.8,4:557-584, 1995, Boletín N 158 de la AAM, pág.5-7, 2003)
Pseudomonas aeruginosaEs uno de los 6 microorganismos más
agresivos y con mayor resistencia a
antibióticos. Pertenece al grupo
ESCAPE(Infectious Diseases Society of America).
Escherichia coli (20.5%),
Pseudomonas aeruginosa (11.8%),
Klebsiella pneumoniae (8%),
Acinetobacter spp. (7.5%),
entre otros (Según datos del SIR)
en Argentina, Chile, y en el mundo, altos porcentajes de
resistencia a antibióticos....
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Pseudomonas aeruginosa
(Magiorakos et al, 2012)
Fenotipo MDR
multirresistente
Adquisición de resistencia
en al
menos un ATB en 3 familias
de antibióticos
Fenotipo XDR
resistencia extrema
Adquisición de resistencia
en al
menos un ATB en todas las
familias menos dos
familias de antibióticos
Fenotipo PDR
pandroga resistencia
Adquisición de resistencia a todos los ATBs
en todas las familias de antibióticos
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Evolución genómica bacteriana
ancestro
Reducción
genómica
por eventos de
deleción
Mutaciones,
rearreglos
genómicos,
y duplicación de
genes
Transferencia
Horizontal
Genética
(THG)
Bacteria intracelular
obligada
Todo tipo de nicho
ecológico
Bacteria extracelular
en contacto con otras
bacterias
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Evolución hacia XDR en P. aeruginosa
Fenotipo Pandroga ResistenteIntegrones/Cassettes
ADN Móvil
Dinámica poblacional
Mutaciones/Reducción
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Sistema Integrón/Cassettes
Ingeniería genética in vivo
Pc
attI
(Stokes and Hall, 1989)
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2343 cassettes diferentes en 50 m2 de superficie de suelo
Los cassettes
(Michael y col., 2003, Partridge y col., 2009)
Resistencia a ß-lactámicosResistencia a aminoglicósidosResistencia a cloranfenicolResistencia a trimetoprimaResistencia a estreptotricinaResistencia a rifampicinaResistencia a eritromicinaResistencia a fluoroquinolonasResistencia a antisépticos
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MLST
http://pubmlst.org/paeruginosa
Estructura poblacional de P. aeruginosa
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Argentina ST621 con IMP-13
ChecoslovaquiaST235 con aacA7-aadA6-orfD,ST357 con blaIMP-7
ST175 con aadB-aadA13ST132 con aacA4
Rusia, Suecia, Hungria y GreciaST235 con blaVIM
Corea del Sur ST235 con blaIMP-6-qac-aacA4-blaOXA-1-aadA1
JapónST235 con In113 blaIMP-1- aacA28-aadA1aST357 con In994 blaIMP-1
AlemaniaST622 (CC235) con blaIMP-35- blaOXA-35- aacA6
(Empel y col., 2007; Nemec y col., 2010 ; Garcia-Castillo y col., 2011; Havrak y col., 2011; Maatallah y col., 2011; Yoo y col., 2011; Poumaras y col., 2013; Mano y col., 2015);
Rumania, Austria, Belgica y Francia
ST621 con IMP-13
Alta asociación entre integrones de clase 1 y secuenciotiposespecíficos evidencia la transmisión de un linaje preexistente.
Expansión de clones epidémicos exitosos
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Genoma “core”
Pangenoma
Genoma “flotante
o accesorio”
Resistencia adquirida por ADN Móvil en
P. aeruginosa
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Elementos móviles
Retrotransposones
Secuencias de Inserción
Transposones
Transposones conjugativos
Bacteriófagos
Sistema cassettes/integrones
El 80% de la resistencia
antibiótica
es debido al
“Moviloma”
Resistencia adquirida por ADN Móvil en
P. aeruginosa
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Mutators!
30-60% de los pacientes con Fibrosis Quística (FQ)
57% en pacientes con bronquiectasias o EPOC
P. aeruginosa es capaz de persistir en el pulmón del paciente con
FQ, adaptarse a la respuesta inmunitaria del propio paciente y
resistir a todos los tratamientos antibióticos que se le administran.
Frecuencias de mutación
espontánea incrementadas
100-1000 veces por deficiencias
en los sistemas de reparación del
ADN
Adaptación por mutaciones
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Enfermedad hereditaria autosómica recesiva más
frecuente en la población de origen caucásico.
La primera causa de afección pulmonar crónica en la
infancia
1/2500-1/5000 nacidos vivos
Mejor modelo de infección crónica de
P. aeruginosa:
FIBROSIS QUíSTICA
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Temprana mortalidad
Alteraciones digestivas
70% niños fallecían antes
del año de vida por
complicaciones digestivas
Tratamientos específicos
-Deficiencias digestivas-
1936
1970
(Goss, CH y Rosenfeld, 2004; www.cff.org/news/general_news)
FIBROSIS QUíSTICA
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Welsh, MJ and Smith, AE. Cystic Fibrosis. Scientific American. 273 (6): 52,
1995.
Colonización
patogénica
pulmonar
Alta morbilidad y
mortalidad
causante del 95 % de los fallecimientos
1970
2015
FIBROSIS QUíSTICA
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Adaptado de Gibson, RL, Burns, JL, and Ramsey, BW. Pathophysiology and Management of PulmonaryInfections in Cystic Fibrosis. AJRCCM 168 (918-951); 2003.
Evolución temporal de las
colonizaciones patogénicas
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% c
ep
as r
esi
ste
nte
s
Cepas FQ hipermutadoras
(Oliver et al, Science 2000)
Hipermutación y multirresistencia en pacientes con FQ
Cepas FQ NOhipermutadoras
Cepas NO FQ
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Número de antibióticos
2 3 4 5 6 7
% cepas resistentes
Adaptación por mutaciones
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• Las elementos móviles no se identificaron
en la adaptación genómica.
• Se calcula una reducción de 22.637 pares
de bases por año en las cepas
patogénicas de pacientes FQ versus 3723
en cepas de P. aeruginosa en otros
nichos.
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• Hipermutación
• Mutaciones adaptativas
• Reducción genómica
• y la Transferencia Horizontal
Genética???Florencia Rappisardi, Angélica Galán,
Verónica Alvarez,
Elisabet Vilacoba y Cecilia Quiroga
Mecanismos moleculares que
llevan a la extrema resistencia
en P. aeruginosa durante
infecciones crónicas
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Estudio Epidemiológico
De 102 pacientes con Fibrosis Quística, 25
infectados con P. aeruginosa durante más de
6 años con más de 10 muestras de esputo en
nuestro laboratorio (2005-2012).
Años Cepas Totales Cepas con intI1
Primeros 2 años 26 1
Desde el 2do al 4to año 44 14
Desde el 4to al 6to año 30 22
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
hasta 2 de 2 a 4 de 4 a 6
Cepas Totales
Cepas con intI1
A medida que aumenta la cronicidad de la infección de P. aeruginosa, aumenta la frecuencia de cepas con integrones de clase 1.
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Aislamientos Gen bla Fecha
PAE 906-PAE 907 11/2005
PAE 969-PAE 970 09/2006
PAE 974
PAE 975
10/2006
PAE 977 11/2006
PAE 980-PAE 981-PAE 982 blaVIM-205/2007
Paciente FQ 1
Paciente infectado con P. aeruginosa
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4 Genomas completos secuenciados
Paciente FQ 1
Pae 969
Pae 975
Pae 977Pae 981
Distribución de Islas Genómicas
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• Mutación en mucB que le otorgafenotipo mucoide a Pae 981.
• Reducción genómica de20.000 pares de bases.
• Adquisición de un integróninsertado en un transposónportador de la carbapenemasa blaVIM-2.
Las cepas Pae 975 y 981
son isogénicas, excepto por:
La Transferencia Horizontal Genética
Mediada por integrones de clase 1 MDR
está involucrada en la adaptación de
P. aeruginosa al pulmón del paciente FQ.
Paciente FQ 1
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Resistencia adquirida por ADN Móvil
en P. aeruginosa
Integrones de clase 1
localizados
en islas genómicas
en P. aeruginosa
de infecciones
intrahospitalarias
Tn6162
Tn6163
Integrón de clase 1 con blaGES-1 en la isla PAPI-1
Paciente FQ 2
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Evolución genómica bacteriana
hacia fenotipos MDR y XDR
ancestro
Reducción
genómica
por eventos de
deleción
Mutaciones,
rearreglos
genómicos,
y duplicación de
genes
Transferencia
Horizontal
Genética
(THG)
Bacteria intracelular
obligada
Todo tipo de nicho
ecológico
Bacteria extracelular
en contacto con otras
bacterias
La THG mediada por los integrones
de clase 1 es una pieza importante
hacia la MDR y XDR de P. aeruginosa,
no solo en cepas intrshospitalarias,
sino también en cepas de infecciones
crónicas.
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MUCHAS GRACIAS!!!!!!
GRACIASLab “Flotante”
Dr. Maurizio Labbate (Australia)
Dr. Paul H. Roy (Canadá)
Dr Gerardo Gonzalez Rocha (Chile)
Dr. Alejandro Petroni (Argentina)
Dra. Carolina Márquez (Uruguay)
Dra. Sara Kaufman (Argentina)
Dr. Pablo Power (Argentina)
Dr. Mariano Pistorio (Argentina)
Dra Ma. Fernanda Falcone Dias
(Brasil)
Lab “Core”
Dra. M. Paula Quiroga
Dra. Cecilia Quiroga
Dra M. Cecilia Rodríguez
Dra M. Soledad Ramírez
Lic. Angélica Galán
Lic. Luciana Chamosa
Lic. Florencia Rapisardi
Lic. Verónica Álvarez
CONICET, UBA, ISID, IUMS, ASM, FUNDACIÓN A. ROEMMERS y ANPCyT
LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN MECANISMOS DE RESISTENCIA
A ANTIBIÓTICOS,
2015
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Historia de las cepas “transmisibles”
y de los clones “epidémicos”
(Fothergill, JL y col., 2012; Romling U y col., 2005; )
Cepas epidémicas: cuando se registran
cepas similares en diferentes regiones.
Ej.: LESB58 y AES.
Cepas transmisibles: cuando se identifican
cepas que se transfirieron entre pacientes.
Ej.: LESB58, AES-1, MES y DK2.
En ambos tipos de cepas, la segregación
de pacientes
limitó la transmisión.
1986: Primera sugerencia
de cepaepidémica
1994: Clon C Identificado
en Europa
2001: cepa MESIdentificada en
UK (Manchester)
2004: Relevamiento nacional en UK revela
Cepas clonales LES, MES, Mid1, Stoke, Trent y Sheffield
2008: AES-3aislada enAustralia
1993: cepa transmisiblede B. cenocepacia
1996: Identificaciónde LES en UK
2001: Clondominante en
colonias deverano enHolanda
2002: AES-1 esidentificada en Australia
2004: AES-2 esidentificada en Australia
2008: LES esidentificada
en USA
2009: LES essecuenciada
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Cepa LESB58 (Liverpool Epidemic Strain).
• Primer cepa de P. aeruginosa
resistente a ceftazidima aislada
de pacientes con FQ.
• El clon LES es el más frecuente en
pacientes FQ de UK y Escocia.
• Fue descripto en menor frecuencia
también en USA, Canadá y Australia.
• Es altamente transmissible.
De paciente FQ a ambos padres no-FQ
De paciente FQ a mascota gato
• Siempre fue identificada en pacientes
con FQ.
(Scott and Pitt 2004; Edenborough et al. 2004; McCallum et al. 2001; Panagea et al. 2005, Al Aloul et al. 2004;
McCallum et al. 2002; Mohan et al. 2008; Salunkhe et al. 2005; Fothergill et al. 2007; Kukavica-Ibrulj et al. 2008)
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Cepas LESB58 (Liverpool Epidemic Strain).• Está asociado a mayor mortalidad
en los pacientes con FQ.
• Exhibe mayor sobrevivencia en
superficies secas que otras cepas.
• Es hiperpoductor de biofilm.
• Posee un inusual fenotipo, con
precoz expresión del Sistema
del regulón del “quorum sensing”.
• El clon LES es hallado en pacientes FQ
de UK, Escocia, USA, Canadá y Australia.
• Es altamente transmissible.
De paciente FQ a ambos padres no-FQ
De paciente FQ a mascota gato
(Scott and Pitt 2004; Edenborough et al. 2004; McCallum et al. 2001; Panagea et al. 2005, Al Aloul et al. 2004;
McCallum et al. 2002; Mohan et al. 2008; Salunkhe et al. 2005; Fothergill et al. 2007; Kukavica-Ibrulj et al. 2008)
El biofilm, la ciudad
de las bacterias……
Rasgos cooperativos y coordinados entre bacterias
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Genómica comparativa de
cepas LES.
(Jeukens J y col., PLosOne, 2014)
• Algunos de los aislamientos de ambos
continentes son indistinguibles tanto
a nivel genómico como fenotípico.
• Sintenia conservada entre 7 genomas
de UK y Canadá.
• Presencia de mini-isla (7.4 kb)
específica de cepas LES.
• Mientras que el genoma core se halla
conservado entre las cepas, se
identificó alta variabilidad en el genoma
accesorio.
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Mecanismos involucrados en la
evolución hacia la cronicidad
Mecanismos genéticos
• Hipermutación
• Mutaciones adaptativas
• Reducción genómica
Mecanismos poblacionales
• Coexistencia de linajes
• Crecimiento en Biofilms
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9 pacientes360 genomas
secuenciados de P. aeruginosa
La divergencia genética de los
linajes de P. aeruginosa dentro de los pacientes resultó
mayor que entre pacientes
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Tambien mutantes aflagelados,
modificaciones del LPS y colonias enanas
(SCV).
Se observan cambios
fenotípicos:
Se observa una gran biodiversidad fenotípica, tanto a nivel
de cultivo como por microscopía.
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Los estadíos hacia la cronicidad incluyen
tanto adaptación genómica de un linaje como coexistencia de
linajes.
Adaptación Genómica. Aparece el fenotipo
mucoide, generalmente en
mutaciones del gen mucA.
La conversión al morfotipo mucoide otorga resistencia tanto
a los tratamientos antibióticos como a la propia respuesta
inmunitaria del paciente.