CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGICA DE PLANTAS MEDICINALES Y PRODUCTOS

FITOFARMACEUTICOS

Armando CáceresFacultad de CCQQ y Farmacia, Univ. de San Carlos y

Laboratorio de Productos Naturales Farmaya, Comisión Asesora de Productos Naturales (CAPRONAT)

Guatemala. E-mail: acaceres46@hotmail.com

VIII Curso Iberoamericano sobre Tecnología Fitofarmacéutica“Prof. Nikolai Sharapin” – Universidad Nacional de Rosario

Rosario, 26 de julio – 06 de agosto de 2010

FITOTERAPIA:Cadena de servicios

multidisciplinarios

PRODUCCIONAgrotecnología

VALIDACIONBiomedicina

TRANSFORMACIONFifofarmacia

UTILIZACIONFitoterapia

IDENTIDADEtnobotánica

BPRegulación

Articulación

FACTORES DETERMINANTES DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES

VARIABLE EJEMPLOS DE AGENTESg Genotipo Especies, cultivarg Desarrollo Crecimiento, floracióng Morfogénesis Órgano, tejidog Ambiente natural Fertilidad del suelo, luz,

temperatura, competenciaépoca de corte (fase lunar)

g Ambiente humano Manejo de desechos, hábitosg Proceso Secado, destilado, extraccióng Contaminación Física, biológica, química

A apartir de Máthé A & Franz C (1999) J Herbs, Species & Med Plan 6:101-113.

PLANTAS SILVESTRE Y CULTIVADASVentajas y Desventajas

FACTOR SILVESTREDisponibilidad DisminuyendoManipulación agro NoAdulteración FrecuenteIdentificación Poco confiableAprovicionamiento InestableMejoramiento genético NoControl de calidad PobreManejo postcosecha Pobre

Ref.: Capasso et al. (2000) Fitoterapia 71:S58-S65

CULTIVADAAumentando

SiRara

InquestionableConstante

SiAlto

Bueno

Problema: 80% de plantas compradas en Europa son silvestres.

BUENAS PRACTICAS AGRICOLASpara las Plantas Medicinales

Identificación precisa de la materia vegetal.Cultivo en condiciones ajustada a requerimientos. Destrucción de plantas enfermas o muertas.Cosecha en el máximo contenido del ingrediente.Control de la contaminación en todo momento.Procesamiento, lavado y oreado en condición aséptica.Proceso de secado a la brevedad, rápido y homogéneo.Envase y almacenamiento adecuados.Personal con capacitación en las operaciones.Documentación rigurosa de los procesos y actividades.

Ref.: Harnischfeger, G. Training Course on Phytomedicines, Panama, CYTED, 1997.

DESHIDRATADO VEGETALParámetros a controlar

Temperatura del aire de secado.Velocidad del aire de secado.Altura de la capa del producto.Tamaño del producto.Humedad dentro y fuera del sistema.Temperatura del producto.Intensidad de luz que entra al sistema.Contaminación microbiana.

PROCESO HISTORICO DEL SECADO PROCESO HISTORICO DEL SECADO DE PLANTAS MEDICINALESDE PLANTAS MEDICINALES

SECADO AL SOL O SOMBRA

Límite de temperatura y evaluación de composición química

SECADO EN ESTUFA Y CIRCULACION

SECADO EN SECADORES ESPECIALES

Preocupaba únicamente la apariencia

Evaluación de temperatura, velocidad del aire, altura de camada y consumo energético (evaluación química e ingeniería de proceso)

70s

80s

PROCESAMIENTO POSTCOSECHA Y PÉRDIDA DE PRINCIPIOS ACTIVOS

Los procesamientos poscosecha tienen por objeto la conservación de las características físicas, químicas, organolépticas y farmacológicas de la droga vegetal. Los factores que inciden en la pérdida son:

Degradación por procesos metabólicosHidrólisis de principios activosDescomposición por la luz y por enzimasDegradación de substancias termolábiles por calorVolatilización de los aceites esencialesContaminación por hongos y bacterias

ECOLOGIA MICROBIANAEfecto en la industria farmacéutica

AtmósferaRecuentos microbianosReducción del recuentoDesinfección químicaIrradiación UVAire comprimidoAguaFuentes de aguaCalidad del agua usadaDesagües y aguas negrasAblandamiento de aguaSistema de distribuciónAlmacenaje de agua

Flora respiratoria/dérmicaTransferencia de operariosDiseño de áreasMaterias primasEmpacadoEdificiosParedes y cielosEquiposMaterial de colectaLavado y desinfecciónChequeo microbianoEquipos de limpieza

Hugo & Russell - Pharmaceutical Microbiology, pp. 253-265.1981.

MATERIA MEDICA/DROGA VEGETAL

Características de la materia primag Completamente seca (<10% humedad)g Con su color naturalg Con su olor característicog Libre de material indeseable

n Otros órganos de la plantan Otros materiales y contaminantes

g Tamaño lo más entero posible (2-6 cm)g Libre de contaminación fecal

n Coliformes totales 104 NMP/gn Coliformes fecales 101 (sin Salmonella)n Bacterias aeróbicas 105

n Mohos y levaduras 105

CALIDAD MICROBIOLOGICARiesgos de contaminación durante el proceso

ETAPA NIVEL DE RIESGOPrecultivo Ninguno a bajo Cultivo en el campo Alto Cosecha AltoAlmacenaje intermedio Bajo a medianoTransporte Ninguno a bajoTratamientos Bajo a medianoProducto final Generalmente ninguno

Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.

CALIDAD MICROBIOLOGICAFactores determinantes

INTRINSECOS

Naturaleza de la planta y barreras naturales.

Estructura de la planta

Composición de la planta (compuestos antimicrobianos)

Contaminación intracelular microbiana

EXTRINSECOSClimaHumedadUbicación/PosiciónMétodo de cosechaPoscosechaEstado físico Tratamiento tecnológicoEmpaque/almacenajeContaminación bacteriana exógena

Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.

VALIDACION DE METODOLOGIACepas y medios selectivos recomendados

Para validar el método, cultive las cepas de referencia en los medios de cultivo sugeridos a 30-35°C durante 18-24 horas (Candida spp. 20-25°C por 48 horas), diluya en solución salina amortiguada a una suspensión de 103 microorganismos/ml.

WHO, 2005. Quality Control Methods Rev., pp. 31.

MICROORGANISMO CEPA MEDIOBacillus subtilis ATCC 6633 Soya-CaseinaCandida albicans ATCC 2091 Caldo SabouraudEscherichia coli ATCC 8739 Caldo lactosadoPseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Soya-CaseinaSalmonella abony NCTC 6017 Caldo lactosadoStaphylococcus aureus ATCC 6538 Soya-Caseina

CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

TECNICA CARACTERISTICASRecuento en cámara esporas, protozoosCitometría de flujo equipo sofisticadoNúmero más probable determinación en tuboSiembra cuantitativa en tubo o en placaFiltración por membrana proceso en serieFluorometría equipo sofisticadoFluorocult/cromocult rapidez, alto costo

PRUEBA DE PUREZARecuento total de aeróbicos viables en placa

g Pretratar el material con amortiguador y diluir adecuadamente.

g Filtración: Esterilizar el equipo con filtro <0.45 µm, transferir 10 ml de la dilución y filtrar; lavar cada membrana y colocar una en placa de agar caseina-soya (ACS) y otra en agar Sabouraud (AS). Incubar 5 días a 30-35°C y a 20-25°C.

g Recuento en placa (bacterias): En placas de Petri agregar 1 ml de material pretratado a 15 ml de ACS líquido o repartirlo en su superficie. Incubar a 30-35°C por 5 días.

g Recuento en placa (hongos): En placas de Petri agregar 1 ml de material pretratado a 15 ml de AS o repartirlo en su superficie. Incubar a 20-25°C por 5 días

g Contar y calcular el número de colonias.

TUBOS MULTIPLESEquipo y materiales

EQUIPOS Y MATERIALESIncubadora a 35oCIncubadora a 44oCCampana bacteriológicaMechero AutoclaveGradillasAsas bacteriológicas Campanas de Durham

FUNGIBLESPipetas estériles de 1 ml en 0.1 mlAgua peptonada 0.1% en frascos de 9 a 90 mlTubos con 9 ml de caldos: Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y EC Agar MacConkey

TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓNFundamentos y Prueba Presuntiva

Fundamento: Se basa en la observación de la producción de gas a partir de la fermentación de lactosa por bacterias viables y la estimación de la densidad de coliformes empleando tablas del NMP.

Procedimiento: Homogenizar y diluir el material (1:10) Prueba presuntiva:

Inocular una serie de tubos con caldo lactosado, con cantidades decimales (1, 0.1, 0.01 ml).Incubar a 35oC durante 24 hrs. Examinar la presencia o ausencia de gas. Reincubar si no hay gas y examinar a las 48 hrs.Presencia de gas = Prueba Presuntiva PositivaAusencia de gas = Prueba Presuntiva Negativa

TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN Pruebas Confirmativa y Complementaria

PRUEBA CONFIRMATIVASembrar una asada de los tubos positivos en la prueba presuntiva en tubos con caldo Bilis Verde Brillante e incubar a 35oC por 24 hrs para coliformes totales. Sembrar otra asada a tubos con caldo Bilis Verde Brillante o EC e incubar a 44oC por 24 hrs para colifromes fecales.

Interpretación: La presencia de gas se interpreta como prueba confirmativa positiva.

PRUEBA COMPLEMENTARIASembrar en estrías una asada del 10% de tubos positivos en agar MacConkey e identificar.

Interpretación: La combinación de tubos positivos se busca en las tablas de Número Más Probable (NMP) para obtener el NMP por 100 ml de muestras analizada.

0.1 ml/ tubo

0.01 ml/ tubo

0.001 ml/tubo

NMP/g o ml

3* 3 3 >1,1003 3 2 1,1003 3 1 5003 3 0 2003 2 3 2903 2 2 2103 2 1 1503 2 0 90

0.1 ml/ tubo

0.01 ml/ tubo

0.001 ml/tubo

NMP/g o ml

3 1 3 1603 1 2 1203 1 1 703 1 0 403 0 3 953 0 2 603 0 1 403 0 0 23

RECUENTO MICROBIANOCálculo del número más probable (NMP)

WHO. Quality Control Methods Rev, pp. 31. Geneva, 2005.

* Número de tubos con crecimiento microbiano; los caldos pueden variar de acuerdo con el microorganismo cuyo crecimiento queremos cuantificar.

FILTRACIÓN POR MEMBRANA Materiales necesarios

EQUIPO Y MATERIALESIncubadora a 35oCContador de coloniasCampana bacteriológicaFiltro para membrana (acero o vidrio) Bomba de vacíoMecheroPinzas planas

FUNGIBLES Y REACTIVOSMembrana de <0.45 mm de nitrato o acetato de celulosaCajas de petri estérilesAgar Plate Count o Agar Caseína-SoyaAgar Endo C

FILTRACIÓN POR MEMBRANAPrincipio y procedimiento

PRINCIPIO. Es la estimación del número de bacterias viables en muestras líquidas de baja turbidez. Se basa en la suposición que las células microbianas presentes forman colonias separadas en membranas colocadas sobre medios de cultivo que pueden ser:

PCA: Para recuentos totales de bacterias.Endo: Para recuento de coliformes totales y fecales.Saboraud: Para recuento de hongos.

PROCEDIMIENTOEsterilizar el aparato de filtración flameando el interior.Dejar que se enfríe el aparato y colocar la membrana (0.45 µ).Agregar el material de la muestra y filtrar.Colocar la membrana con la parte inferior hacia abajo sobre la superficie del Agar PCA, Endo o Sabouraud en cajas de Petri.Incubar a 35oC por 24 hrs.

FILTRACIÓN POR MEMBRANACálculo del recuento de enterobacterias

1.0g o ml

0.1g o ml

0.01g o ml

Número más probable por gramo (NMP/g)

+ + + > 102

+ + - < 102 pero más de 10

+ - - < 10 pero más de 1

- - - Menos de 1

WHO. Quality Control Methods Rev., pp. 33. Geneva, 2005.

PRUEBA DE PUREZAConfirmación del Control Sanitario

g Cuantificación. Inocular en caldo Mossel el material homogenizado, diluir (1, 0.1 y 0.01 g/ml), sembrar en Agar bilis violeta con glucosa/lactosa. Incubar a 35°C por 18-24 h. Estimar recuento de colonias bien desarrolladas color rojizo (Gramnegativo).

g E. coli. Transferir material homogenizado en caldo lactosado a 100 ml de caldo MacConkey (MC), incubar a 44°C por 24 h, inocular subcultivos a placas de Agar MC y reincubar. Estimar la colonias rojas, no mucoides, rodeada de zona rojiza. Confirmar por formación de indol a 44°C.

PRUEBA DE PUREZADemostración de Salmonella

g Incubar material pretratado a 36°C por 5-24 h.g Prueba primaria. Transferir 10 ml a 100 ml de caldo

tetrationato-bilis verde brillante, incubar a 42°C por 18-24 h. Subcultivar en dos de cualquier Agar: desoxicolato citrato, xilosa, lisina o verde brillante. Incubar a 36°C por 24 h.

g Prueba secundaria. Subcultivar colonias en TSI en siembra profunda. La prueba es positiva si se presenta cambio de color en profundidad con formación de gas y ácido sulfhídrico. Confirmar por bioquímica o serología.

PRUEBA DE PUREZAPseudomonas y Staphylococcus

g Pretratar material en amortiguador peptonado.g Pseudomonas aeruginosan Inocular 100 ml de Medio Soya-Caseina.n Incubar a 35°C por 24-48 h.n Subcultivar en Agar Cetrimida e incubar.n Si no hay crecimiento la prueba es negativa.g Staphylococcus aureusn Inocular Agar Blair-Parkern Incubar a 35°C, por 24-48 h.n Si no hay crecimiento la prueba es negativa.

PRUEBA DE PUREZAShigella y Clostridia

g Shigellan Pretratar material en amortiguador peptonado.n Inocular Medio MacConkey+1 µg de telurito de potasio.n Incubar a 35°C, 18-24 h. Confirmar XLD o desoxicolato,

seguido de inoculación en TSI o KIAn Si no hay crecimiento la prueba es negativa.g Clostridian Inocular 2x100 ml de Medio de Carne Cocida con 10 gn Sellar uno con una capa de parafina estériln Calentar el otro a 65°C por 30 min y sellar.n Incubar a 37°C, examinar cada 24 h/4 díasn Sin crecimiento en ninguno, la prueba es negativa.n Identificar los esporoformadores

FLUOROCULT/CROMOCULTEquipo y materiales

Mechero Gas propanoCampana bacteriológica LUVPipetas estériles de 1 ml en 0.1 ml AutoclaveAgua peptonada 0.1% en recipientes de 9 a 90 ml

CALDO FLUOROCULTTubos con 9 ml de Caldo Fluorocult

Incubadora a 35°CReactivo de Kovacs

AGAR CROMOCULTCajas de petri estérilesAgar para Coliformes

MONOTUBO PARA COLIFORMESCaldo Fluorocult LMX

Combina dos técnicas, una cromogénica y otra fluorogénica, en la que se requiere un solo medio de cultivo.Permite la detección rápida de E. coli y coliformes usando el compuesto cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido (XGal) y el compuesto fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-D-glucoronido (MUG). Este medio contiene una enzima que detecta la β-D-galactosidasa (BGal) y la β-D-glucoronidasa (BGud).Cuando XGal es roto por BGal, el caldo se torna verde azulado por la conversión de las agliconas liberadas a indigo. En presencia de BGud el compuesto fluorescente 4 metil-umberilferona se rompe del MUG. La luz azul fluorece en el caldo bajo luz UV (365 nm), la cual indica la presencia de E. coli.Para confirmar la presencia de E. coli, se demuestra la producción de indol usando el reactivo de Kovack. La formación de un anillo rojo en la superficie indica la prueba positiva.

MONOTUBO PARA COLIFORMESProcedimiento e interpretación

PROCEDIMIENTOHomogenizar y diluir la muestra Inocular 9 tubos con caldo Fluorocult: los primeros 3 con 1 ml de la dilución, los siguientes 3 con 0.1 ml y los últimos 3 con 0.01 ml.Incubar a 35-37oC por 24 hrs.

INTERPRETACIÓNNegativo: No existe cambio de color en el tubo de ensayoPositivo: Viraje de coloración de amarillo a verde-azulado confirma la presencia de CT, según tabla de NMP.CF y E. coli: Exponer los tubos positivos a LUV de longitud de onda larga para fluorescencia. Una fluorescencia azul indica la presencia de E. coli y por lo tanto de CF.Confirmar la presencia de E. coli en los tubos con fluorescencia positiva, agregar dos gotas de reactivo de Kovac, un cambio de coloración a rojo confirma la presencia de E. coli.

LMX FLUOROCULT

AGAR CROMOCULTFundamento y Procedimiento

Agar selectivo para la detección simultanea de CT y E. coli en muestras de agua y comida.La interacción de peptonas seleccionadas, piruvato, sorbitol y amortiguador de fosfato garantizan el rápido crecimiento de colonias, incluso de coliformes subletalmente dañadas.Las bacterias G+ y algunas G– son inhibidas por el contenido de Tergitol-7 que no tiene efecto negativo sobre el crecimiento de coliformes.Una combinación de dos sustratos cromogénicos permite la detección simultanea de CT y E. coli.

PROCEDIMIENTOInocular el medio por el método de vertido en placa o por esparcido de la muestra en la superficie de la placa. La técnica de filtración por membrana también puede usarse.Incubar a 35-37oC por 24 hrs.

AGAR CROMOCULTIdentificación e interpretación

IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMESLa enzima característica de coliformes, BGal se adhiere al sustrato GAL-Salmón y causa una coloración de salmón a roja de las colonias de coliformes. IDENTIFICACIÓN DE E. coliEl sustrato X-glucurónido es usado para la identificación de β-D-glucoronidasa, que es una enzima característica de E. coli. E. coli se adhiere a GAL-Salmón y X-glucorónido tomando las colonias positivas una coloración de azul oscuro a violeta. Para la confirmación de E. coli, demostrar la producción de indol con reactivo de Kovac. INTERPRETACIÓNE. coli: colonias azul oscuro a violetas Coliformes totales: Colonias salmón a rojas y colonias de color azul oscuro a violetas.

AGAR CHROMOCULT

LIMITES MICROBIANOSContaminación máxima aceptada

g Material vegetal “crudo” colectado en condiciones higiénicas que tendrá un procesamiento posterior (físico o químico):

Escherichia coli, 104/g Propágulos de mohos, 105/gg Materiales que han sido pretratados o para uso tópico:

Bacterias aeróbicas, 107/g Levaduras y mohos, 104/gEscherichia coli, 10/g Otras enterobacterias, 103/gSalmonella, Shigella y Clostridia, ausente/1g

g Otros materiales para uso interno (tisanas):Bacterias aeróbicas, 105(107)/g Levaduras y mohos, 103(104)/gEscherichia coli, 100(101)/g Otras enterobacterias, 103/gSalmonella y Shigella, ausente

WHO. Quality Control Methods Rev., p. 37. Geneva, 2005.

CALIDAD MICROBIOLOGICAde las preparaciones farmacéuticas

g Categoria 1. Preparaciones que requieren esterilidadPrueba de esterilidad

g Categoría 2. Preparaciones para uso tópico y transdérmicoBacterias aeróbicas, 102/g Enterobacterias, 101/gPseudomonas, ausente Staphylococcus, ausente

g Categoría 3A. Preparaciones para uso oral/rectal Bacterias aeróbicas, 102/g Enterobacterias, 101/g

g Categoría 3B. Preparaciones para administración oral sin tratamiento.Bacterias aeróbicas, 104/g Enterobacterias, 102/gEscherichia coli, Salmonella y Staphylococcus, ausentes

g Categoría 4A. Preparaciones a las que se les agregará agua hirviendo.Bacterias aeróbicas, 107/g Escherichia coli, 102/g

g Categoría 4B. Preparaciones a las que no se les agregará agua hirviendo.Bacterias aeróbicas, 105/g Enterobacterias, 103/gEscherichia coli, Salmonella y Staphylococcus, ausentes

Gaedcke & Steinhoff. Herbal Medicinal Products, p. 105, 2003.

Estudio: Control de calidad y sanitario en muestras de plantas medicinales distribuidas en la ciudad de Guatemala.Muestra: 13 muestras de las plantas de mayor frecuencia de uso compradas en 8 centros naturistas y 6 de infusiones comerciales.Métodos: Observación macroscópica y físico-organoléptica y recuento de CT y CF por la técnica del NMP.Resultados: Organoléptico: Solamente 3 según norma (<10% materia extraña).CT y CF: 5 (38.5%) de las hierbas de centros naturistas y 2 (40%) de las infusiones comerciales con recuentos >102 NMP/g. Discusión: Los resultados evidencian deficiencias en la calidad físico-organoléptica y microbiológica de las infusiones de hierbas medicinales.

CALIDAD MICROBIOLOGICAEvaluación de 10 especies de uso medicinal

Girón LM et al. (1986) Simposio sobre Biología de Salud Tropical. Guatemala, 7 p.

CALIDAD MICROBIOLOGICAAnálisis de 10 especies medicinales en Guatemala

Especie/órgano Prove. %MV Q/g útil Calidad NMP/gAlbahaca/hoja A 65 0.038 7 93Hierbabuena/hoja A 100 0.022 12 460Hierba del gato/hoja A 53 0.069 9 <3Hierba del gato/hoja H 100 0.012 18 <3Ajenjo/hoja B 29 0.032 11 <3Anís/fruto B 0 0 1 1,100Verbena/hoja B 11 0.149 6 4Verbena/hoja C 1 1.000 7 15Té de limón/hoja D 55 0.026 11 2,400Llantén/hoja E 41 0.041 6 240Manzanilla/flor F 5 0.400 6 1,100Manzanilla/flor H 100 0.016 15 23Pericón/hoja G 73 0.039 15 <3

CALIDAD MICROBIOLOGICAEvaluación de dos especies de uso medicinal

Estudio: Análisis microbiológico de dos infusiones de hierbas medicinales en Costa Rica.Muestra: 24 muestras de materia vegetal de menta y de anís estrella.Métodos: Recuento total aeróbico, CT, CF y P. aeruginosa, por la técnica de recuento en placa.Resultados: Recuento Total: El 85.7% de las muestras de menta y 8.3% de las de anís presentaron recuentos totales que sobrepasan la norma internacional. CT y CF: El 100% de las muestras de menta incumplieron la norma para CT y el 41.7% para CF; en el anís estrella, el 100% cumple con la norma internacional. Discusión: Los resultados evidencian serias deficiencias en la calidad microbiológica de las infusiones de hierbas medicinales, aunque es de considerar que la menta es cultivada en Costa Rica y el anís importado.

Arias ML et al. (2003) Análisis microbiológico de algunas infusiones de hierbas medicinales. Rev. Biomed. 10:1-10.

Contaminación fúngica en PortugalSe colectaron 62 muestras de 7 plantas medicinales (manzanilla,Se colectaron 62 muestras de 7 plantas medicinales (manzanilla,naranja, tilo, estigmas de manaranja, tilo, estigmas de maííz, algas marinas, menta y salvia z, algas marinas, menta y salvia PrPráácticamente todas las muestras (96.8%) estaban contaminadas cticamente todas las muestras (96.8%) estaban contaminadas con con Bacillus cereusBacillus cereus; 19.2% con l; 19.2% con líímites mayores de 10mites mayores de 1033 esporas/g. esporas/g. Los niveles mas altos se encontraron en estigmas de maLos niveles mas altos se encontraron en estigmas de maííz (>10z (>1077

esporas/g). Se detectaron esporas de esporas/g). Se detectaron esporas de Clostridium perfringensClostridium perfringens(83.9%), pero solo19.2% con niveles >10(83.9%), pero solo19.2% con niveles >1033/g. /g. La media de poblaciones fLa media de poblaciones fúúngicas fue de 10ngicas fue de 105.5 5.5 ufc/g. Los estigmas ufc/g. Los estigmas de made maííz fueron los mas contaminados (>10z fueron los mas contaminados (>106 6 ufc/g). ufc/g). Fusarium Fusarium spp.spp., , Penicillium Penicillium spp.spp., Aspergillus flavus , Aspergillus flavus yy A. niger A. niger fueron predominantes fueron predominantes en todas las muestras con excepcien todas las muestras con excepcióón de salvia.n de salvia.Varias levaduras se encontraron en manzanilla, tilo, estigmas deVarias levaduras se encontraron en manzanilla, tilo, estigmas demamaííz, menta y salvia, predominando especies de z, menta y salvia, predominando especies de Cryptococcus Cryptococcus laurentii laurentii (28.1%) (28.1%) y Rhodotorula mucilaginosa y Rhodotorula mucilaginosa (22.8% (22.8% ). ). Los niveles Los niveles medio de medio de C. laurentii C. laurentii en estigmas de maen estigmas de maííz fue >10z fue >1044ufc/g.ufc/g.

Martins HM et al. (2001) Internat J Food Microbiol 68:149-153.

CALIDAD MICROBIOLOGICATamizaje en drogas vegetales

Universo y muestra:138 muestras escogidas al azar de 31 drogas vegetales, provenientes de 9 proveedores de Austria y Alemania.Metodología:Parámetros estándar: Recuento aeróbico mesofílico, enterobacterias, coliformes, esporoformadores aeróbicos, levaduras y mohos, enterococos, lactobacilus y pseudomonadales y aeromonades.Selectivos: E.coli EH, Salmonella, Campylobacter jejuni, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Estafilococo coagulasa +, Candida albicans, mohos potencialmente aflatoxigénicos.

Czech E et al. Planta Med. 2001; 67:263-269.

CALIDAD MICROBIOLOGICAResultados en drogas vegetales

Recuento aeróbico mesofílico: El grado de contaminación varia considerablemente, de 100 UFC/g (semilla de Linum) hasta >108

UFC/g (hierba Passiflora).Coliforme y enterobacterias: No se detectaron en varios casos, se detectó en algunos (mo > de 6.5 log UFC/g).Levaduras y mohos: valores menores de <102-106 UFC/g. En 12 (8.7%) hubo sobrecrecimiento de mohos.Bacterias esporoformadoras: Detectadas en todas las muestras con rangos muy variables (102-107 log UFC/g).Estafilocos y enterococos: Recuentos de fueron <102

Pseudomonas-Aeromonas: 30% de recuentos entre 104-106.Patógenos: E. coli 4 (2.3%), C. jejuni 2 (1.4%), estafilococo coagulasa + 1 (0.7%), ninguno otro patógeno fue demostrado.

Czech E et al. Planta Med. 2001; 67:263-269.

CONTROL MICROBIOLOGICOValor indicativo de grupos de MOs

GRUPO SIGNIFICADORecuento total mesofRecuento total mesofíílicolico ParParáámetro general de higienemetro general de higieneEnterobacteriasEnterobacterias Indica contaminaciIndica contaminacióón fecaln fecalColiformesColiformes Indica contaminaciIndica contaminacióón fecaln fecalEnterococosEnterococos Indica contaminaciIndica contaminacióón fecaln fecalPseudoPseudo-- y aeromonadasy aeromonadas Presagia descomposiciPresagia descomposicióónnEstafilococos coagulasa +Estafilococos coagulasa + PatPatóógeno de origen humanogeno de origen humanoBacterias esporoformadorasBacterias esporoformadoras Microflora del sueloMicroflora del sueloLactobacilosLactobacilos Indica plantas descompuestasIndica plantas descompuestasLevaduras y mohosLevaduras y mohos Micotoxigenicidad potencialMicotoxigenicidad potencialMicroorganismos patMicroorganismos patóógenosgenos Alto riesgoAlto riesgo

Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.

CONTROL MATERIA VEGETALFisicoquímico-Sanitario

g FISICOQUÍMICASn Color n Saborn Olorn Aspecto n Forman Humedad (%)n Aceite esencial (%)

CONTROL SANITARIORecuento aeróbico en placaMohos y levadurasColiformes (totales y fecales), ausencia de Salmonella, Shigella y Clostridia

CONTROL PRODUCTO: LIQUIDOFisicoquímico-Sanitario

g FISICOQUIMICOn Color n Sabor, olorn Aspecto y forman Densidadn pHn Viscosidadn Alcohol (%)

g CONTROL SANITARIOn Recuento en placan Mohos y levadurasn Coliformes (totales y fecales),

ausencia de Salmonella, Shigella y Clostridia

g CONTROL QUIMICOn Capilografían TLC/HPLC

CONTROL PRODUCTO: SEMISOLIDOFisicoquímico-Sanitario

g FISICOQUIMICOn Color, n Sabor, olorn Densidadn pH y viscosidadn Humedad (%)

g SENSIBILIDAD

g FUNDICION

g CONTROL SANITARIOn Recuento en placan Mohos y levadurasn Coliformes (totales,

fecales), ausencia de E. coli, Salmonella y Shigella

n Ausencia de Pseudomonas ni Staphylococcus

g FITOQUIMICA

CONTROL DE ACTIVIDADBioensayos farmacológicos

g Problemas de los ensayos químicosn Desconocimiento de los constituyentes activosn Correlación con la actividad biológican Equipamiento necesario (excesivo uso de HPLC)g Bioensayos como estándaresg Problemas de los bioensayos como estándaresn Falta de reproducibilidad en sistemas automatizadosn Falta de modelos para ciertas enfermedadesn Actividad consecuencia de una mezcla de efectosn Correlación in vitro – in vivog Algunos ejemplos de bioensayos como estándaresn Actividad antimicrobiana Actividad antiinflamatorian Citototoxicidad Inmunomoduladores Antioxidantes

CONTROL DE CALIDADTextos de apoyo

1991 WHO. Guidelines for the assessment of herbal medicines.1998 WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Geneva.2000 Martínez et al. Fundamentos de Agrotecnología de Cultivo de Plantas

Medicinales Iberoamericanas. Bogotá, SECAB-CYTED.Sharapin. Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos. Bogotá, SECAB-CYTED.Mazza & Oomah. Herbs, Botanical & Teas. Lancaster

2002 Mukherjee. Quality Control of Herbal Drugs. New Dehli.Rajpal. Standardization of Botanicals. Neh Dehli, Eastern Pub.

2003 Gaedcke & Steinhoff. Herbal Medicinal Products. Stuttgart. Verpoorte & Mukherjee. GMP for Botanicals. New Dehli.

2004 WHO. Directrices de la OMS sobre buenas prácticas agrícolas y de recolección (BPAR) de plantas medicinales, Ginebra

2005 WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Revised Update, QAS/05.131.Rev. 1