II

PRüTECCION DEL CULTIVO

PRESENCIA de FITOPLASMAS en ALIGONEROS , (CELTIS AUSTRAL/S) con SINTOMAS de DE:BILlTAMIENTO E. TORIU:S; F. GARCÍA¡ J. M. DEL LlANO; B. CA5nuo¡ M. PINART SJrv<;i !.:lh r:Hori ¡IniWl A r;lria. DARP. BAR ELONA. M.P. MARTÍN R~~d ,Jardín B t:ini'O ( ,sI,). MADRID

INTRODUCCiÓN

'1 ali 'onero ( '/Iis mwmli L.) e, un úr 01 orn mental e n ¡;f'illl pOI n~¡al como :'¡rbol

qu

alternativatil'n

<:n ciu­ncuenlra de

na.

intrbol saliS .

urban:ls

urhallCl, qu representa una pO!iibl al platanero. ActLllilmemc un;¡ presc'ncia importnn[ dades y también S"

maneru m(1 csp r:lrli a en ruraks, com úrhol de mar 'en.

De 'de ha e \lna déC<1da obscrvand un e njUl1h) cle mas que afcctan tanto a jóvenes como a ad\llt el neros, tanto de zonas como rurales.

Los lirbole a cClil,1 IS mUe lran un debilitamiento progresivo pucd· volu 'ionar hasta In muer­te. Tamhién se ob c:rvan entrcnu­dos m¡\s cortos, rotes con hojas pequeña In ramificaei6n, cian­do el a pecto de e coba dc bruja. [Jn las hoja~, I 18 ,lr1l . !Has pu den ser dc do. tipos: hoja COn m sai­COS lunarill S fUllY definido y/o hojas con amarilleamient mils difu~(). Por Clli'a pa! te C. tos sint • mas de m lsaia. se hahial! asocia­do la presencia de "chl!rry lea! ro/l vil'll.l''' (ANS MI, I \ISO) P ro en las rt11.1 Stras nalíza a en el

laborntl rio d' :l!lidnd egt'tal nune se pud det tria pr n­eia de virus de forma eanclll nte.

La apli aci611 L1' lécOICM molecu­lares, debrdo a su elevada especifi­cidad ensibilidac\, ha po ibilit ­do la d 1 ción d fitoplasl'n:ls en muchas plantas. A~i, por 'jempIo. én Italia se h podido id ntifi :Ir Ull

, r¡loplasma aso ia lo al debilit ­miento del aligonel'o (BERTA ClNL, 1 9). n Calaitllia So: est, n d lec­tand fíl pla8m en difé'rentes cultivos (RAIIÜLA, IlJ97: ABAn, 1998; B T' ,1C)l)).

Se ha estudiado la presencia de fitopl ll1a: en aligonero. con sín­tomas claros de mo~aico y dcbili­tntllient don, rurale del Del­ta de:! Ebro.

MATERIAL Y MÉTODOS

L s muestras so han recogido en d , fechas diferuntes, la primera el me. de, epticmbre y la segunda el mes de noviembre. S han pro­ccsado frutos, n 'rvio de hoja, (con mosaico o clorosis pedún­culos y hojas de tamailo pequeño

12 mue. tras). amo "ontrol's (lo:itivos . e han utili:z.ado extrac· tos de DN de fitopla. ma del grupo ue Stolbur y del grupo d lo;; 1m Ycllow;;.

Para la t;xtracción de Al) ,se

d I

ha

realizado una concentración pre­via de fitoplasmas a partir extracto ele UD "ramo de muestra e n tampón P .B (Phylop/asma

grindillf{ bllf(cl') y se ha pro sao lIo con e.1 kit 'ZNA'" plant ( me· ga biot\Jk) MARTIN&TORRES. 1998

La amplificación e ha realizado con Ready-T ~o P "R B ads (Ame,!". h,lm Pharma i.. l, hacieD­do ncsled-P R (do amplifica­ciolH:s) e ,n ini .iador cspecifi­e . de fito(llasma~ que hihridan en la snbunidad l6S rDNA. Para la primef'a amplificnei n, se ha utilizado la pareja de iniciadort:s externos I'I/P7 (PI:D lN 1 & HI­RUKI, l ( 1: P7: SMARí rt 111., J(05) y, para la segunda, los internos U'/ 3 (L >R ,NZ el al.. I ,. La vi-lializ, ción d<: los amplimcros ,e ha hecho por elce· lrofore is en geles de agarosa (SERVA 2%)

Los amplimeros se han di"crido on las nzilll&, de restricciÓn Alu

[ y Kpll l , iguiendo las instruccio­nes del fabricante. Se visualizan los patrones d¡:; bandas por clec­1 oforc: i en sel de agarosa (. R· VA 2%).

RESULTADOS

'on el nested-PCR, se han ampli­ficada bundas de un s 900 pb a partir de pr!tcticamente todas las muestras.

Los resultndo' s~)n siempre positi­vos en mue. ros de:

- hOJas de tamálio reducido de los brotes con ramificación más abun· dantl:: - frulCJS - pcdúl1<.:ulos de frutos

En cambio, Ñi se lrabaja con ner­vios de h jas on. int.orna, dc mosaico o cloro~ís los resullados varían y no siempre e pl sible la detección.

Los resultados son coincidentes en amhos mUe:. tr",os (scpti~mbrl:: y noviembre).

S gún las bandus resultantes de la di<>cstión cOn Alu [ y l\pll 1, la clasificación del fitoplasma seria compatibl on fitoplasma d I grupo de los "Aster Yellows" ( 16Srl).

DISCUSiÓN

Se ha podido confirmar la pr . en­cia de fitoplusmas en todos .Ios aligoneros que pre entuban los sintomas de~critos.

n principio. toda la temporada de ,t ño e~ adecuada para realizar el diagnóstico de la enfe.rmedad. En fuluros trabajos se estudiarán otras ~(lOC¡¡S de muestreo.

Es importante coger la muestra de 7.onn etativamente . cLivas y j6venes, y que lo, r sultndo negativ s en hojas clor6ticas :Idul· tas indican quc., ll1UY probabl '­mente, el fitoplasrna se encuentra en una 'onccnlraci n insuficiente para s r dete lado.

El estudio del polimorfismo de la longitud de los fra 'mentas de re ­trieción (RFLP), aunque incom­pleto, da un resultado compatihle c:on un fitopI, m I del 'rupo de los "Aster Yellows" (1 k rl .

En futun s trabajos, 'c estudinr;í la "ltl if'l'ación L1efinitiva sccue.n· ciand cd fra 'mcnto al'¡'lplifi aclo y tambi6n mediante un anúlisis dc RI=LP más completo. ambi6n s' e. tl.lr!iarú la distribuci n de e"tu patologia en :Italuiia...f.

BIBLlOGRAFfA

ABAD. P. et ;¡I., 1998: Nuevos casos de litoplasmas dl;¡nnuSlic;Jdos un ~s~la,ja. IX r.onqrer.n de 101 Sociedad Esn;l~ola de Htopatolot¡ia.

ANSELMI, N.; SARIC, A.: r.ru rRIN/. G P.. 1980: Su alcune altcralioni QI" rami e dr,/le foqlie di Ce/lis ,1IJSlr,1/is L. Intormarme Fitopatolo­Ilico 30: 11-· t7

8ATLLE. A: LAVINA. A.; MARTA, F.: MEDINA, V.; 1998 IncidcnGld y (letección del fitoplasma aSOGiBdo al d8caimi/:nló riel peral en Cataluna. IX Congreso d~ la S(J(;lcdad Esp;¡iiola de Fltop;¡lolouia.

8ERTACCINI, A: MITTEMPERGllrR, L.. VIHIO, M.; 1996: Idcnlifit;alion al phytoplasmas associaled witll a dedine 01 Europuan hack!Jwy (Cellis ,lIIstralis)

DENG, S: HIHUKI, C; 1991:Ampllfica­lion 01 16s rHNA¡lf:ne Irom culturable and noncullu !JI" mo/licu\es. J. Microbiol Meth. 14, 53-61

LORFNZ.K.H.: SCHNEIDER, 8.: AHRENS, U.; S~EMÜLLER, E.: 1995: Ol~tection 01 tho apple proilferation and pear Ih'clíne ptlytoplólsmas hy PCH amplíllcalion IIf ribosomal and nOIl..ribof,omat ONA. Phylopathol(I!ly 85, 771-77ü.

MARTIN. M.r.; TORfl~S. E.; 1998: 'Evaluación de los métodos de extraeciilll y amplilicaciéHI del DNA pnr Pr.R para la detección de litoplaslllas en villa. IX Congreso de la Sociedad hnarlola ile Fitopatoloqía.

SMART. C.D.; Sr.HNEIDErl, S.; 8LOMOUIST. C.I.; GUERRA, L.J: HARHISON. N.A.. AHRENS, U; LORENZ. K.H.: SE~MÜLLEA. L: KIHCHPAI HICK, R.C.; 1996: Phytoplasma'~pcdfie Pr.R prinlllrs basCd OH sequences ot the 165-235 rANA spaccr region. Appl. Environ. Microbiol. 62 (8), 2988-1993.

PRESENCIA DE FITOPLASMES EN LLEDONERS (CEL T/S AUSTRAL/S) AMB SíMPTOMES D'AFEBLJMENT.

Torres,E.", Garcia,F.", del L1ano,J.M"', Castillo,S:, Pinart,M"', Martín,M.P.....

• Servei Laboratori Sanitat Agraria. OARP. Vía Circulació Nord, Tram VI, 08004 Barcelona ssausv@lander.es

>w Real Jardín Botánico (CSIC). Pza. de Murillo, 2. 28014 Madrid. maripaz@ma-qb,csic.es

Introducció

El IIedoner (Ceftis austrafis L.) és un arbre ornamental amb gran potencial com a arbre urba, que representa una possible alternativa al plátan. Actualment té una presencia important en ciutats i també es traba de manera més esporádica en zones rurals com a arbre de marge,

Des de fa una década s'estan observant un conJunt de simptomes que afecten tant a arbres joves eom a adults de Iledoners, tant de zones urbanes com rurals. Els arbres afectats mostren un afebliment progressiu que pot evolucionar fins la mort També s'observen entrenusos mes curts, brots amb fulles petites ¡mes ramificació donant I'aspeete d'eseombra de bruixa. En les fulles els símptomes poden ser de dos tipus: tulles amb mosalCS grocs molt definits ¡lo fulles amb esgroguelment més difús, D'altra banda aquests símptomes de mosaie s'havien associat a la presencia de "cherry leaf roll virus" (Anselmi, 1980) peró en les mostres analitzades al laboratori de Sanitat Vegetal mai es va poder detectar la presencia de virus de forma concloent.

L'aplieació de técníques moleculars, degut a la seva elevada especificitat i sensibilitat, ha possibilitat la detecció de fitoplasmes en moltes plantes. Aixi, per exemple, a Italia s'ha pogut identificar un fitoplasma assoclat a I'afebliment del lledoner (Bertacclni, 1996). A Catalunya s'estan detectant titoplasmes en diferents cultius (Rahoia, 1997; Abad, 1998: Batlle,1998),

S'ha estudiat la presencia de fitoplasmes en lIedoners amb símptomes c1ars de mosaic í afebliment de zones rurals del Delta de l'Ebre,

Material i metodes

Les mostres s'han recollit en dues dates diferents, la primera el mes de setembre í la segona el mes de novembre. S'han processat frUlts, nervis de tulles (amb mosaie o clorosis), peduncles i fulles de mida petita (12 mostres). Com controls positius s'han utilitzat extractes de DNA de fitoplasmes del grup de ¡'Stolbur y del grup deis Elm Yellows.

Per I'extracció de DNA s'ha reafitzat una concentraeió prévia de fitoplasmes a partir de I'extracte d'un gram de mostra amb tampó PGB (Phytoplasma grrnding buffer) i s'ha processat 8mb el kit EZNA® plant (Omega biotek) (Martín & Torres, 1998), L'amplificació s'ha realitzat amb Ready-To-Go PCR Beads (Am8rsham Pharmacia), fent "nested­PCR" (dues amplificacions) amb iniciadors especifics de fitoplasmes que hibriden en la subunitat 168 rDNA Per la primera amplificacío, s'ha utilitzat la parella d'iniciadors externs P1/P7 (P1: Deng & Hiruki, 1991; P7: Smart et al., 1995) j, per la segona, els interns U5/U3 (Lorenz et al" 1996). La visualització deis amplimers s'ha fet per eleetroforesi en gels d'agarosa (SERVA 2%)

Els amplimers s'han digerit amb els enzims de restricció Alu I i Kpn I seguint les instruccions del fabricant. Es visualitzen els patrons de bandes per electroforesis en gel d'agarosa (SERVA 2%)

IV JORNADA DE PROTEceló VEGETAL. ICEA 11/02/2000

Resultats

Amb el nested-PCR, s'han amplificat bandes d'uns 900 pb a partir de practicament totes les mostres. Els resultats són sempre positius en mostres de:

- fulles de tamany reduit deis brots amb ramificaeló més abundant - fruits ~ peduncles de fruits

En canvi, si es treballa amb nervis de fulles amb simptomes de mosaie o clorosi els resultats varien i no sempre es possible la deteeció. Els resultats són coincidents en ambdós mostrejos (setembre i novembre). Segons les bandes resultants de la digestió amb Alu I i Kpn 1, la c1assificació del fitoplasma seria compatible amb fitoplasma del grup deis "Aster Yellows" (16Srf).

Discussió

S'ha pogut confirmar la presencia de fitoplasmes en tots els Iledoners que presentaven els simptomes descrits. En princlpi, tota la temporada de tardar es adient per realitzar el diagnóstic de la malaltia. En futurs treballs s'estudiaran altres epoques de mostreig. És important triar la mostra de wnes vegetativament actives i Joves, ja que els resultats negatius en fulles c10rátiques adultes indiquen que, molt probablement. el fitoplasma es traba en un concentració insuficient per a ser detectat. L'estudi del polimorfisme de la longitud deis fragments de restriccló (RFLP), encara que incomplet, dona un resultat compatible amb un fitoplasma del grup deis "Aster Yellows" (16Srl). En futurs treballs s'estudiara la classificació definitiva sequenciant el fragment amplificat i també mitjan9ant un analisis de RFLP més complet. També s'estudiara la distribució d'aquesta patología a Catalunya.

Bibliografia

1. ABAD, P. el al.; 1998: Nuevos casos de fitoplasmas diagnosticados en España, IX Congreso de la Sociedad Española de Fitopatologia.

2. ANSELMI, N.; SARIC, A.; CELLERINI, G P.; 1980: Su alcune alterazioni dei rami e delle foglie di Celtis austra/is L. Informatore Fitopatotogico 30: 11-17.

3. BATLLE. A.; LAVIÑA, A.; MARTA, F.; MEDINA, V.: 1998: Incidencia y detección del fitaplasma asociado al decaimiénto del peral en Cataluña. IX Congreso de la Sociedad Española de Fitopatologia.

4. SERTACCINI, A.; MITTEMPERGHER, L.; VIBIO, M.; 1996: Identification of phytoplasmas associated with a decline of European hackberry (Ce/tis australis)

5. DENG, s; HIRUKI, C; 1991 Amplificalíon of 16s rRNAgenes from culturable and nonculturable mollicutes. J. Microbio!. Meth. 14, 53-61.

6. LORENZ,K.H.; SCHNEIDER. s: AHRENS, u; SEEMÜLLER, E.: 1995: Detection of the apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of ribosomal and non-ribosomal DNA. Phytopathology 85, 771-776.

7. SMART. C.D; SCHNEiDER, s.; SLOMQUIST, C.L.; GUERRA, L.J.: HARRISON. N.A., AHRENS, U.; .LORENZ, K.H.: SEEMÜLLER, E.; KIRCHPATRICK. B.C: 1996: Phytoplasma-specific PCR primers based on sequences of the 168-23S rRNA spacer regian. App!. Environ. Microbiol. 62 (8), 2988-1993.

8. MARTiN, M.P.; TORRES. E.; 1998: Evaluación de los metodos de extracCión y amplificación del DNA por PCR para la detección de fitoplasmas en viña. IX Congreso de la Sociedad Española de Fitopatologia.

9. RAHOLA. J.; REYES, J.; GIRAlT, L1.; TORRES, E.; BARRIOS, G.; 1997: La Flavescencia Dorada en los viñedos del Alt Emporda. Bol. San. Veg. Plagas vol. 23 (3) 403-416.

PRES ..­

CIA DE F o LASMES N LLEDO rsTRALI5)

I

S D'AFEB SIMPTO

Torres,E.*, Garcia,F.*, del Uano,J.M.*, Castillo,B.*, Pinart,M.*, Martin,M.P**.

• Sesvei laboratori SanitatAgraria. DARP. Via Circulació Nord, Tram , 08004 Barcelona. ssausv@lander.es •• Real JardIn Botínico (CSIC). Pza. de Murillo, 2. 28014 Madrid. maripaz@ma-rjb.csic.es eSle

INTRODUCCIÓ El lIedoner (Celtis australis L.) és un arbre ornamental amb gran potencial com a arbre urna. Actualment té una presencia important en ciutats i també es traba de man.era més esporadica en zones rurals com a arbre de marge.

Des de fa una decada s'estan observant un conjunt de símptomes que afecten taol a arbres joves com a adults de lIedoners, tant de zones urbanes com rurals:

~ afebl.iment progressiu que pot evolucionar fins la mort

:> entrenusos més curts, brots amb tulles petites i més ramificaci6 donant I'aspecte d'escombra de bruixa

:> tulles amb mosaics grocs molt definits iJo tulles amb esgroguei"ment Olés difús

L'aplicació de técniques moleculars, degut a la seva elevada especiflCitat i sensibil"itat, ha possibilitat la detecci6 de frtop lasmes en moltes p!antes.

S'ha estudiat la presencia de fitoplasmes en lledoners amb símptomes clars de mosaic i afebüment de zones rura.ls del Delta de l'Ebre.

MATERIAL METODES

S'han recollit en dues dates diferents, la

mosaJC o ClOroSIS), peauncles mida petita (12 mostres).

I rulles ae pc:Illll U" I eAUaC'le a un gram oe mos"tra amb tampó PGB (Phytoplasma grinding buffer)

Tlu>pli:l$lneS \fU" IU'Ultv-.::n ~1 ni ~uuu...\.o\, IU.., IUI"". r'CO. Ig .... u.n::aa

amplificació, s'ha utilitzat la parella d'iniciadors 8xtems P1/P7 (P1: Deng & Hiruki, 1991; P7: Smart et al., 1995) i, per la segona, els intems U5lU3

Com controls positius s'han uülitzat (Lorenz et al., 1996).

extractes de DNA de frtoplasmes del grup de "Stolbur (St) (Ey).

y del grup deIs Elm YellOws Kit EZNA@ plant (Omega biotek) (Martin & Torres, 1998). 3 Digesti6

Enzims de restricdó Alu I i Kpn 1.

RESULTATS

DlGESTl6

EXRACCIO DE DN

NESTED-PCR Alu I

--~ Kpnl _ ~ .<- ~t~";.-' ..--~~.-...... .

• • I1_ ....4 ••CONCLUSIONS

mostres setembre novembre 1 brots tulles petites + + 2 fruits + + 3IDeduncles truit + +

nervis f. Clorosi +/­ +/­

:> S'ha pogut confirmar la presencia de fitoplasmes en tots els IIedoners que presentaven els simptomes descrits.

:>Tota la temporada de tardor és adient per reaJitzar el diagnóstic de la malaltia.

:> És important triar la mostra de zones vegetativament actives i joves, ja que els resultats negatius en fulles clorótiques adultes indiquen que, molt probablement, el fitoplasma es troba en un concentraci6 insuficient per a ser detectat.

:> L'estudi del polimorfisme de la longitud deis fragments de restricci6 (RFLP), encara que incomplet, dona un resultat compatible amb un fitoplasma del grup deis "Aster Yellows" (16Srl).