PRÁCTICA Nº 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

I. OBJETIVOS

- Aprender a preparar medios de cultivo más comunes.- Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.

II. FUNDAMENTO

Está basada en preparar sustancias nutritivas que sirven como medios de cultivo para promover el crecimiento de los microorganismos; donde la mayoría de estos medios de cultivo contienen distintas sustancias orgánicas e inorgánicas que proveen elementos necesarios para el desarrollo del microorganismo.

III. MARCO TEÓRICO

III.1. MEDIOS DE CULTIVO:

Es el material alimenticio donde crecen los microorganismos. Para que las bacterias crezcan adecuadamente este medio de cultivo debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxigeno adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad; debe estar excento de todo microorganismo contaminante. (Guía práctica).

Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporado a un coloide en estado de gel) en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento y multiplicación de los microorganismos en el laboratorio; con el objetivo de aislar las diferentes especies bacterianas u hongos, para luego proceder a su identificación y llevar a cabo unos estudios complementarios (Mendo, 2003).

Un medio de cultivo adecuado es aquel que contenga los elementos nutricios esenciales en concentraciones adecuadas, la cantidad necesaria de sal y el adecuado volumen de agua, se encuentra excento de sustancias inhibidoras del organismo que se va a cultivar, tenga la consistencia deseada, la reacción (pH) conveniente para el metabolismo del cultivo, y ser estéril (Mendo, 2003).

Cultivo: es el crecimiento de los microorganismos.

El Extracto de levadura se obtiene por extracción acuosa de levadura de cerveza autolizada. Merced a su elevado contenido en vitamina B, ofrece antecede excelentes condiciones de crecimiento para una serie de microorganismos.

Bajo la denominación de peptonas se comprenden las sustancias de origen proteico que a partir del estado coloidal de las proteínas nativas, se han transformado, por escisión de estas últimas, en fragmentos fácilmente hidrosolubles y ya no coagulables… las peptonas constituyen mezclas de péptidos que, que según la proteína de origen y la enzima utilizada, presentan las sustancias basales más importantes de los medios de cultivo.

III.2. INGREDIENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

La base de muchos medios de cultivo es la infusión de extractos de carne y peptona a la que se añadirán otros nutrientes; cualquiera que sea el grupo de microorganismos que se quiera cultivar, el medio de cultivo de incluir:

- Agar- Peptonas- Extractos- Sistemas amortiguadores- Sales inorgánicas- Vitaminas- Indicadores de pH.

III.3. TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO:

1. POR SU COMPOSICIÓN QUÍMICA:

a. Medios de cultivos empíricos- Caldo nutritivo- Agar nutritivo

b. Medios de cultivos sintéticos (medios deshidratados)- Agar citrato de simmons- Caldo malonato- Medios para la determinación de vitaminas

2. POR SU CONSISTENCIAa. Medios líquidosb. Medios sólidosc. Medios semi-sólidos

3. POR SU USO:a. Medios básicos

- El agar tripticasa de soya (TSA)

b. Medios enriquecidosc. Medios selectivosd. Medios diferencialese. Medios especiales

IV. PARTE EXPERIMENTAL

IV.1. MATERIALES Y REACTIVOS- Espátula - Papel Kraft- Balones- Probetas de 100mL, 250mL y 500mL- Matraces de250mL- Extracto de carne - Peptona - Lactosa

IV.2. EQUIPOS- Autoclave - Balanza mecánica

IV.3. PROCEDIMIENTO

IV.3.1. Ingredientes para la preparación del caldo lactosado

Extracto de levadura 3g Peptona 5g Lactosa 5g Agua 1000mL

IV.3.2. Pasos para la preparación del caldo lactosado

o Preparar en 2 balones de 1L, en cada una 500mL de caldoo Pesar los ingredientes para cada balón (previamente estandarizado los pesos

para ambos balones).o Disolver en cada balón añadiendo cierta cantidad de agua destilada, disolver

completamente si se pegó por las paredes del balón hasta completar lo 50mL previamente medidos con la probeta.

o Distribuir el caldo en 5 matraces (4 con 180mL y 1 con 90mL).o Taponar los matraces con algodón no absorbente.o Cubrir la boca del matraz con papel Kraft previamente taponado con algodón.o Esterilizar en autoclave a 121 ⁰C de 10min-15min.o Dejar descender la temperatura, para luego acondicionarlo estéril para su

posterior uso.

Conservar

Enfriar

Autoclavar

Cubrir con papel Kraft

Taponar

Distribuir

Diluir

Pesar los ingredientes

Medir vol. De H2O

500mL 500mL

- Extracto de levadura- Peptona- Lactosa

Ingredientes+

H2Od

500mL 180mL180mL 180mL 90mL

4 ⁰C

IV.4. RESULTADOSo Luego del tiempo de autoclavado el color del caldo salió menos intenso varió

de un naranja oscuro a un naranja claro.o El extracto de levadura no tenía una consistencia fina sino que habían captado

humedad y se encontraba en forma de grumos grandes.

V. CONCLUSIONES

- Aprendí a preparar un medio de cultivo que es el caldo lactosado- Se esterilizó los medios de cultivo a una temperatura de 121 ⁰C en un tiempo de

10min-15min.- Luego del tiempo de esterilizado se dejó descender la temperatura del autoclave

abriendo poco a poco la llave de este para que la presión del vapor y de la atmosfera se equilibren.

- Se sacaron del autoclave a los medios de cultivos ya esterilizados y se dejó al medio ambiente durante 2 días (sábado y domingo) y el lunes se colocó a refrigerarlo a una temperatura de 4 ⁰C.

VI. DISCUSIONES

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: El extracto de levadura es un polvo fino, amarillo-parduzco, de olor característico. Es soluble en agua, dando una solución clara, pardo-amarillenta… el extracto de levadura se añade a los medios de cultivo a concentraciones, casi siempre de unos 3 gramos por litro.

En nuestro laboratorio el extracto de levadura estaba vencido y no se encontró en forma de polvo fino sino que este había captado humedad y se encontraba formando grumos pegajosos; pero si se agregó los 3g por litro.

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: Modo de actuar: la fermentación de la lactosa se comprueba por la formación de gas obtenida. El gas liberado se recoge en forma de burbujas en tubitos de DURHAM.

En nuestra práctica al disolver el extracto de levadura este tuvo la propiedad de formar pequeñas burbujas la cual no intervinieron en nada a la hora de distribuir en los matraces.

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: Preparación, su distribución en tubos, se colocan tubitos de DURHAM en los mismos. Se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121 ⁰C, siendo necesario que se alcance la temperatura de esterilización antes de transcurrir 30min. Inmediatamente después de la esterilización se enfrían los tubos con la mayor rapidez posible.

En nuestra practica llegó a la temperatura de 121 ⁰C en el tiempo de aproximadamente a los 45 min, en nuestro caso en la distribución del medio de cultivo se hizo en matraces en la cual no se colocó tubitos de DURHAM.

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: Para la preparación de medios de cultivo debe emplearse agua recién destilada o desmineralizada, de reacción neutra, y, dentro de lo posible, pobre en gérmenes, lo cual ha de controlarse siempre. A una cantidad de agua aproximadamente igual a la mitad de la necesaria, se añade la cantidad prescrita de medio de cultivo disecado se hace una suspensión homogénea agitando detenidamente y se añade a una continuación la cantidad restante de agua. Al mismo tiempo, deben arrastrarse e incorporarse las partes de material que pudieran haber quedado adheridas a las paredes del recipiente.

En la disolución de los ingredientes para el medio de cultivo de realizo en 2 balones de 1L en cada una se preparó 500mL de caldo esto para poder homogenizar correctamente los ingredientes, en cada una me mezcló con una cierta cantidad de agua destilada para luego al final diluir con un mayor éxito, para que no quede ningún ingrediente que no se haya disuelto.

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: Para la mayoría de los medios de cultivo lo más conveniente es su almacenamiento a baja temperatura. Otros, como los medios de cultivo que contienen tioglicolato, se conservan a temperatura ambiente. Siempre deben ser conservados, además, protegidos contra la luz.

En nuestra práctica luego de esterilizar los medios de cultivo se dejaron al medio ambiente durante 2 días y al tercer día recién pasó a refrigerarse a una temperatura de 4 ⁰C.

Según E. Merck “manual de microbiología”. Nos dice: <<Caldo>>, medio de cultivo fluido, libre de agar, que contiene productos cárnicos y o proteicos (peptonas, extractos).

En nuestra práctica preparamos el caldo lactosado que contenía extracto de levadura, peptona y lactosa.

Según Mendo, M. (2003). “Medios de cultivo en microbiología”. Nos dice: De igual manera el pH o la reacción del medio de cultivo es extremadamente importante para el crecimiento de microorganismos.

En nuestra práctica no se midió el pH del caldo lactosado, ya que no se contaba con los materiales necesarios para poder hacer las correcciones previas de pH antes de autoclavar.

VII. BIBLIOGRAFÍA

E. Merck “manual de microbiología”. Alemania

Mendo, M. (2003). “Medios de cultivo en microbiología”. EDICIONES laborales SRL. (Perú).