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PrefacioEl uso de los marcadores moleculares puede facilitar y hacer más eficaces el uso y la conservación de la diversidad biológica. Con ellos pueden determinarse relaciones filogenéticas, pueden identificarse redundancias en un banco de germoplasma, y es posible también descubrir genes nuevos. Aunque este módulo titulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje tiene la intención de promover el desarrollo de capacidades y estimular la investigación en recursos fitogenéticos en todo el mundo, está especialmente dirigido a los países cuyo acceso a la bibliografía científica actualizada y a las tecnologías de investigación es limitado.

El uso de los marcadores moleculares es costoso y por tanto los recursos financieros deben usarse de la manera más sensata posible. En consecuencia, tiene una importancia crucial la actitud del investigador hacia el uso de la tecnología: no la adoptará simplemente porque puede hacerlo o porque es la de última moda, sino porque la eligió concienzudamente como la más apropiada para responder las preguntas biológicas que quiere resolver.

Nuestra ilusión es que este módulo en línea le dé a usted, su usuario, el contexto, conocimiento y herramientas para tomar decisiones correctas al usar sus recursos.

PrólogoLos recursos fitogenéticos son un componente clave del desarrollo sostenible de la agricultura y la silvicultura. Su contribución al desarrollo viene dada por las posibilidades de aumentar la producción de alimentos, erradicar la pobreza y proteger el ambiente. La pérdida de los recursos genéticos y, en consecuencia, de la diversidad genética que representan, es una realidad generalizada. Es, por tanto, de vital importancia que desarrollemos estrategias adecuadas y eficaces para conservar estos recursos genéticos. Necesitamos primero ampliar nuestro conocimiento de la diversidad genética, e introducir enfoques nuevos y potentes que conduzcan, con el tiempo, a la identificación de genes útiles en el germoplasma. Asimismo, la efectividad en el uso de los recursos genéticos será un prerrequisito importante de su conservación sostenible.

Las tecnologías de marcadores moleculares son el medio más avanzado y, posiblemente, el más eficaz para entender los fundamentos de la diversidad genética. Son herramientas eficientes y exactas con las cuales se puede identificar y evaluar la variación genética de manera rápida y minuciosa. Cuando se aplican tecnologías moleculares para responder a las preguntas biológicas que sirven de base a la comprensión de la diversidad genética, podemos hacer progresos notables en la velocidad y en la profundidad para lograr una conservación adecuada y, en consecuencia, la disponibilidad de los recursos genéticos para el mejoramiento de los cultivos. Ahora bien, dado que la investigación con marcadores moleculares es costosa y que los recursos financieros son limitados, éstos deben usarse tan razonablemente como sea posible.

Este conjunto de módulos de entrenamiento pretende contribuir al desarrollo de capacidades en el uso de las tecnologías de marcadores moleculares, con el propósito de que los recursos humanos formados y las instituciones capaces de "seguirle el ritmo al progreso científico" sean la clave de la conservación de los recursos genéticos. Las autoras, muy conscientes de esta necesidad de capacitación, han desarrollado este conjunto de módulos, el primero de los cuales, titulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje, se concentra en el desarrollo de las habilidades de manejo de las tecnologías moleculares. Este módulo permitirá que, quienes trabajen en recursos fitogenéticos, tomen decisiones apoyados en información más sólida sobre los métodos que deben emplear para comprender mejor y, por tanto, proteger efizcamente los recursos genéticos que son la base de nuestra misma existencia.

Jan EngelsDirectorGrupo de Ciencia y Tecnología de los Recursos Genéticos IPGRI

Lo que usted debe saber sobre este móduloTenemos la firme convicción de que usted, como estudioso de la diversidad fitogenética, debe conocer sus objetivos, sus limitaciones y los resultados que quiere conseguir. Por consiguiente, hemos querido tratar los siguientes temas:

• Los principios fundamentales de la diversidad genética.• Las cualidades de los marcadores empleados para medir esa diversidad.• Las tecnologías que más se usan, entre ellas las que se basan en el estudio

de las proteínas, en el análisis del ADN y en la reacción en cadena de la polimerasa.

Los procedimientos experimentales más importantes se explican con gráficos ilustrativos y fotografías, y se dan ejemplos reales de la aplicación de las tecnologías a casos concretos del estudio de la diversidad genética o del manejo del germoplasma. Con estos ejemplos esperamos contribuir a que el módulo se use como un elemento educativo, es decir, como una herramienta de autoayuda o como componente de un programa de estudios universitario.

Comparamos también las diversas técnicas, es decir, evaluamos sus ventajas y sus inconvenientes, así como el costo relativo de cada procedimiento; de este modo ayudamos al investigador principiante a entender los componentes clave para que elija los procedimientos que más se adapten a su investigación.

Puesto que el módulo fue diseñado como una ayuda en la capacitación o como herramienta de referencia, trae también listas de referencias clave, de referencias sobre aplicaciones adicionales a las presentadas, y del equipo necesario.

Este módulo está dirigido a científicos que tengan no sólo una formación mínima en genética y en biología molecular de las plantas, sino también un conocimiento práctico de los recursos fitogenéticos y de los asuntos relacionados con su conservación y manejo. Esperamos que sea de especial utilidad para aquellos que trabajan en países en desarrollo, donde los materiales impresos o no están disponibles, o son costosos o están desactualizados. Deseamos también que sea útil para los profesores de ciencias que quieran acceder a una síntesis global de las tecnologías actuales del ADN y de la aplicación que pueden tener en la conservación y en el uso de la diversidad biológica.

Para que los usuarios puedan seleccionar sólo aquellas secciones de su interés, el módulo está dividido en submódulos complementarios e independientes. Exceptuamos la Introducción, que tiene relevancia para todas las secciones y que siempre debe considerarse. Por tanto, el módulo en su conjunto puede usarse como referencia, como un instrumento de renovación o de actualización para el científico que necesita tomar nuevas decisiones en su investigación, o como una guía para desarrollar talleres técnicos de corta duración.

La actualización y la información de retorno tienen una importancia crítica en campos que evolucionan rápidamente, como la genética molecular (y sus tecnologías asociadas) y los recursos fitogenéticos. Confiamos, por ello, que podremos actualizar este módulo a intervalos relativamente frecuentes.

Para dar una respuesta eficaz a nuestros colaboradores y atender las necesidades de otros usuarios, agradeceríamos mucho su opinión sobre la organización, el contenido y la utilidad del módulo. Puede escribirnos a: [email protected]; [email protected] a las siguientes direcciones de correo postal:

Institute for Genomic Diversity130 Biotechnology BuildingCornell UniversityIthaca, NY 14583

International Plant GeneticResources InstituteVia dei Tre Denari 472/a00057 Maccarese (Fiumicino)Roma, Italia

Nuestro mayor deseo es que el módulo sea usado de muchas maneras y que, junto con un módulo acompañante sobre el análisis de datos moleculares para estudios de diversidad genética (que aparecerá a principios del 2004) sean para muchos lectores, especialmente los de los países en desarrollo cuyo acceso a la tecnología de vanguardia es limitado, una oportunidad de hacer investigación avanzada en el campo de la diversidad fitogenética. De este modo, esos módulos harán un aporte al conocimiento global de estos recursos tan valiosos.

M. Carmen de Vicente Theresa FultonIPGRI IGD, Cornell University

Objetivos del móduloEn relación con los usuarios del módulo, nuestras metas son las siguientes:

• Que comprendan tanto los conceptos científicos básicos en que se apoyan los marcadores moleculares y las tecnologías de secuenciación del ADN, como su uso en el área de los recursos fitogenéticos

• Que desarrollen la habilidad de comparar y contrastar las ventajas y limitaciones de cada tecnología, y que esa información les permita tomar las decisiones más acertadas respecto a situaciones específicas de sus trabajos de investigación

• Que tengan a mano una lista actualizada de recursos bibliográficos sobre cada tecnología

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Introducción 1

Tecnologías de marcadores moleculares paraestudios de diversidad genética de plantas:

Módulo de aprendizaje

Introducción


Contenido

f Diversidad genéticaf Recursos fitogenéticosf Medición de la variación genéticaf Marcadores genéticos:

• Descripción• Tipos• Propiedades deseables

f Comparación de las técnicas principales:• Tecnologías• Costos


f La diversidad genética se refiere a la variación en:

• la secuencia del ADN,• la cantidad de ADN por célula, o• el número y la estructura de los cromosomas

f La diversidad genética es el resultado de la selección, la mutación, la migración, la deriva genética o la recombinación (solas o en conjunto). Estos fenómenos ocasionan cambios en las frecuencias génicas y genotípicas, lo que conduce a la evolución de las poblaciones

Diversidad genética

La diversidad genética se refiere a la variación de los genes de las especies, o sea, a la variación hereditaria dentro y entre poblaciones de organismos. En realidad, todas las variaciones provienen de la secuencia de los cuatro pares de bases que componen la molécula de ADN y que constituyen el código genético. Es posible encontrar otros tipos de diversidad genética en otros niveles de organización del núcleo celular, por ejemplo, en la cantidad de ADN por célula, en el número de cromosomas y en la estructura del ADN.

La generación de nueva variación genética se produce continuamente en los individuos a causa de las mutaciones cromosómicas y génicas, las cuales se propagan, en los organismos de reproducción sexual, mediante la recombinación. La variación genética recibe también el influjo de la selección. Las consecuencias de estos fenómenos son los cambios en las frecuencias genotípicas y alélicas, que son los responsables de la evolución de las poblaciones. El fitomejoramiento y otros procesos de selección artificial pueden originar cambios similares en la variación genética.


Recursos fitogenéticos

f Entre los recursos fitogenéticos se incluye la variación genética actual, con utilidad potencial para el futuro de la humanidad

f Los recursos fitogenéticos comprenden:• Parientes silvestres de las especies cultivadas• Especies silvestres• Variedades tradicionales o razas locales • Cultivares comerciales, híbridos o líneas de

mejoramiento

f Debemos conservar los recursos fitogenéticospara su uso eventual

Los recursos fitogenéticos comprenden la variación genética presente y potencialmente útil para el futuro de la humanidad. Estos recursos incluyen las variedades tradicionales y las razas locales; los cultivares comerciales, los híbridos y otros materiales desarrollados mediante el fitomejoramiento; los parientes silvestres de las especies cultivadas; otros materiales que podrían usarse en el futuro para la agricultura o en beneficio del ambiente. En consecuencia, los recursos fitogenéticos deben conservarse, siendo el motivo fundamental su posible utilización como fuente de variación genética potencialmente útil.


Medición de la variación genética

f La conservación y el uso eficaz de los recursos fitogenéticos requieren de una evaluación minuciosa de la variación genética que contienen

f La variación genética puede medirse en dos niveles:

• En el fenotipo: es la combinación de los caracteres individuales que resultan de un genotipo y de su interacción con el ambiente

• En el genotipo: es la constitución genética particular de un organismo

Para poder conservar y usar la variación genética, primero hay que evaluarla, es decir, es preciso determinar su extensión y distribución. La variación puede evaluarse a nivel tanto fenotípico como genotípico. La evaluación de la variación fenotípica se concentra en los rasgos morfológicos, o sea, en aquellas características que definen la forma y la apariencia de un conjunto de individuos. Algunos de estos caracteres pueden considerarse ‘genéticos’ si su presencia en individuos emparentados es hereditaria y no depende del ambiente. Esto quiere decir que esos caracteres están asociados con una secuencia específica de ADN.

La evaluación de la variación genotípica se hace al nivel de la molécula de ADN, que es la responsable de la transmisión de la información genética. La molécula de ADN estácompuesta por nucleótidos organizados en una configuración de doble hélice, cuyo nivel de complejidad aumenta hasta constituir los cromosomas.


Marcadores genéticos: Descripción

f Los marcadores genéticos identifican en un individuo las características del fenotipo, del genotipo o de ambos

f El seguimiento de la herencia de los marcadores puede realizarse de generación en generación

Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación ya sea en una proteína o en una secuencia de ADN. Una diferencia, bien sea fenotípica o genotípica, puede actuar como marcador genético si identifica en un individuo características del genotipo, del fenotipo, o de ambos y si, además, puede hacerse seguimiento a su herencia a través de varias generaciones.

Es posible que un carácter genético no tenga efectos observables en el comportamiento de un individuo. A veces, sin embargo, este carácter puede estar ligado a otros caracteres (o correlacionado con ellos) que son más difíciles de medir y afectan, ciertamente, el comportamiento del individuo. En tales casos, estos caracteres genéticos no observables pueden usarse como marcadores genéticos de caracteres que están ligados a ellos, porque indican indirectamente la presencia de una característica de interés (o en estudio). Puede haber una correlación entre los dos tipos de caracteres, y ésta se conoce mediante un análisis de herencia, es decir el estudio de la distribución de la característica tanto en los progenitores como en su descendencia.


Marcadores genéticos: Tipos

f Marcadores morfológicos

f Marcadores proteicos (o bioquímicos)

f Marcadores de ADN (o moleculares)


Marcadores morfológicos

f Ventajas:• Fácilmente disponibles• Su evaluación requiere, generalmente, de equipo

sencillo• Constituyen la medida más directa del fenotipo

f Desventajas:• Requieren un conocimiento práctico del cultivo o

de la especie vegetal (o de ambos)• Están sujetos a influencias ambientales• Su número es limitado

Tradicionalmente, la diversidad que existe dentro y entre las poblaciones se ha determinado mediante la evaluación de sus diferencias morfológicas. Estas medidas tienen la ventaja de que son fácilmente realizables, no requieren de un equipo sofisticado y son la apreciación más directa de un fenotipo; por consiguiente, están al alcance para uso inmediato, lo que es un atributo importante. Sin embargo, las determinaciones morfológicas deben ser tomadas por un experto en la especie, están sujetas a cambios debidos a factores ambientales, pueden variar en las diferentes etapas del desarrollo de las plantas, y su número es limitado.


Marcadores proteicos (o bioquímicos)

f Se basan en las propiedades de migración de las proteínas, las cuales permiten separarlas mediante electroforesis

f Se detectan mediante ensayos histoquímicosespecíficos

f Ventajas:• Requieren de un equipo de laboratorio

relativamente sencillo• Son un valioso complemento de la evaluación

morfológica f Desventajas:

• Están sujetos a influencias ambientales• Su número es limitado

Para superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, se han desarrollado otros tipos de marcadores, tanto a nivel proteico (del fenotipo) como a nivel del ADN (del genotipo). Los marcadores proteicos se conocen también como 'marcadores bioquímicos' aunque se les incluye equivocadamente, y cada vez con más frecuencia, en una clase común bajo la denominación de ‘marcadores moleculares’.

Los marcadores proteicos (proteínas de almacenamiento de la semilla e isoenzimas) se obtienen mediante electroforesis, aprovechando las propiedades migratorias de las proteínas y de los enzimas, y se detectan mediante tinciones histoquímicas específicas de las enzimas que se quieren analizar.

La detección de polimorfismos —o sea, las diferencias detectables para un marcador determinado en un grupo de individuos— en los marcadores proteicos es una técnica que comparte algunas de las ventajas de los marcadores morfológicos. Sin embargo, los marcadores proteicos están también limitados por la influencia del ambiente y de los cambios que ocurren en las diferentes etapas del desarrollo. Aun así, los isoenzimas son un complemento robusto del análisis morfométrico sencillo de la variación.


Marcadores de ADN (o moleculares)

f Son polimorfismos detectados en la secuencia del ADN del núcleo o de los organelos

f Ventajas:• Su número es, potencialmente, ilimitado • No están sujetos a influencias ambientales• Son una medida objetiva de la variación

f Su desventaja principal es que necesitan de un equipo técnicamente más complejo

Los polimorfismos del ADN pueden detectarse en el ADN nuclear y en el ADN de los organelos; este último se encuentra en las mitocondrias y en los cloroplastos. Los marcadores moleculares afectan a la molécula de ADN como tal y se consideran, por ello, medidas objetivas de la variación. No están sujetos a las influencias ambientales, las pruebas con ellos pueden realizarse en cualquier momento del desarrollo de las plantas, y tienen el potencial de hallarse en número ilimitado porque abarcan todo el genoma, lo que representa su mejor atributo.

Hay muchos tipos diferentes de marcadores moleculares y cada uno tiene propiedades diferentes, lo que explicaremos a continuación.


Marcadores genéticos: Propiedades deseables

f Altamente polimórficosf Reproduciblesf Codominantesf Distribuidos de manera uniforme en todo el

genomaf Discriminantesf No sujetos a influencias ambientalesf Neutralesf De bajo costo f Fáciles de medir

Un buen marcador es:

• Polimórfico, o sea, es variable en un grupo de individuos. El grado de polimorfismo detectado depende de la tecnología empleada para medirlo.

• Reproducible en cualquier experimento de laboratorio, ya sea en experimentos hechos en el mismo laboratorio o en diferentes laboratorios que realicen experimentos idénticos.

• Codominante. Según el tipo de aplicación del marcador, la tecnología elegida debe ser capaz de detectar las diferentes formas del marcador, es decir, distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto (herencia codominante). Un individuo heterocigótico muestra simultáneamente la combinación de genotipos de los dos progenitores homocigóticos.

• Distribuido de manera uniforme en todo el genoma. Cuanto mejores sean la distribución y la densidad de cobertura del genoma, mejor será la evaluación del polimorfismo.

• Discriminante, o sea, capaz de detectar diferencias entre individuos estrechamente relacionados.

• No sujeto a influencias ambientales. La inferencia del genotipo de un marcador debe ser independiente del ambiente en que vive el individuo o de su etapa de desarrollo.

• Neutral. El alelo presente en el locus del marcador es independiente de la presión de selección que se ejerce sobre el individuo y no tiene ningún efecto sobre ella. Esta afirmación suele ser una suposición porque, generalmente, no hay datos disponibles que confirmen o nieguen esta propiedad.

• De bajo costo. Su detección en numerosos individuos debe ser fácil, rápida y barata. En la medida de lo posible, el equipo de laboratorio debe ser útil para diversos experimentos.


AltoAltoSíMuy altoSíIlimitadoSNP

MedioMedioSíBajo/MedioSíIlimitadoEST

AltoAltoSí/NoAltoSíIlimitadoSecuenciación

MedioMedioNoAltoNoIlimitadoAFLP

Bajo/MedioBajo/MedioSíAltoNoIlimitadoISSR

BajoMedioSíBajo/MedioSíIlimitadobCAPS

BajoMedioSíBajo/MedioSí/NoIlimitadobSCAR

BajoaBajoaSíMuy altoSíIlimitadoMicrosatélites

BajoBajoNoMuy altoNoIlimitadoAP-PCR

BajoBajoNoMuy altoNoIlimitadoDAF

BajoBajoNoMedioNoIlimitadoRAPD

MedioAltoSíMedioSíIlimitadoRFLP

BajoBajoSíBajoSí< 90Isoenzimas

CostoTecnicidadEspecífico de locus

PolimorfismoCodominanteNúmeroMarcador

a Cuando ya se han identificado los microsatélites y se han diseñado los cebadoresb Dependiendo de otros marcadores que ya estén disponibles

Comparación de las técnicas principales

En este cuadro se comparan las técnicas principales que involucran marcadores bioquímicos y moleculares para identificar la diversidad genética. Los criterios empleados para asignar el nivel dentro de cada columna (sí/no, bajo/medio/alto, etc.) se basan en la experiencia y en los resultados descritos en la literatura científica. No se puede asignar un número o un intervalo a cada marcador y a su tecnología porque los resultados dependen estrechamente de la especie vegetal en cuestión. Sin embargo, el cuadro presenta objetivamente la forma en que se pueden comparar las técnicas entre ellas con respecto a una especie dada y a los elementos contenidos en las columnas.

RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction fragmentlength polymorphism)

RAPD Polimorfismo de ADN amplificado al azar (Random amplified polymorphic DNA)DAF Amplificación de la huella de ADN (DNA amplification fingerprinting)AP-PCR Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (Arbitrarily primed

polymerase chain reaction)SCAR Región amplificada caracterizada por una secuencia (Sequence-characterised

amplified region)CAPS Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (Cleaved amplifiedpolymorphic

sequence)ISSR Secuencia entre repeticiones simples (Inter-simple sequence repeat)AFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amplified fragment length

polymorphism) EST Marcador de secuencia expresada (Expressed sequence tag)SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single nucleotide polymorphism)


Papel de alta densidad vs. polaroid0.20-2.00 (2 geles)Fotografía del gel

(continúa en la siguiente)a � = costo despreciable

Bromuro de etidio

0.20-2.000.20-2.000.20-2.00Método de visualización con bromuro de etidio

1.50Gel (ver electroforesis en geles de acrilamida)

2.56Cebadores marcados con fluorescencia

4.064.06Electroforesis en geles de secuenciación

�aTampón

0.75 (1 gel)Urea

0.75 (1 gel)Acrilamida

1.501.50Electroforesis en geles de acrilamida

13.00 (2 geles)Tampón

10.00 (2 geles)Agarosa

[ ] = opcional, sólo para control de calidad

[23.00]23.00[23.00]23.00Electroforesis en geles de agarosa

1.00-25.00Insumos diversos (alcohol, tampón de lisis, puntas de pipeta, etc.)

96 micropreparaciones vs. 96 preparaciones grandes

2.00-50.00Tampón de extracción

24.00O, tubos de 50 ml (preparaciones grandes)

3.50O, placa de 96-pocillos

2.40Tubos de centrífuga o de microcentrífuga

96 micropreparaciones vs. 96 preparaciones grandes

5.405.405.405.40-101.40Extracción de ADN

ComentariosAFLPRAPDSSRRFLPCosto aprox. para96 muestras

(USD,2002,est.)

MaterialProcedimiento

Costos: Diferencias entre las principales tecnologías


83.76-106.76104.40-106.2085.16-110.2662.75-190.25TOTAL

a = No se necesita PCR en el procedimiento de RFLP. Sin embargo, se pueden amplificar las sondas mediante PCR para ahorrar tiempo con un costo mínimob � = costo despreciable

(MAS vs. mapeo)(para 96 muestras)

0.25Otros reactivos, tubos

2.50Radioisótopo (32P)

0.30Mezcla LS para marcaje

0.30ST ADN (u otro bloqueador)

�bTampón

Sonda de hibridación para 96 muestras3.35Hibridación

2.50 (2 geles)Papel secante

El costo se reduce con cada reutilización del filtro

24 (2 geles)Membrana de nilón

4 (2 geles)Tampones (HCl, NaOH)

30.50Transferencia por “Southern”

~10 unidades/muestra, precios muy variables

0.30-30.00Enzimas

0.30-30.00Digestión con enzimas de restricción

Tampón con MgCl2 para PCR

0.30-0.40Cebadores

24dNTP

1.5 U/reacción. El costo se reducirá considerablemente cuando expire la patente

50Taq polimerasa

74.3074.3074.30PCR

ComentariosAFLPRAPDSSRRFLPaCosto aprox. para

96 muestras(USD,2002,est.)

MaterialProcedimiento

Costos: Diferencias entre las principales tecnologías (continuación)


$1000Unidad de gel vertical

$42/500 gUrea

$30/100 mlAcrilamida

~96 muestras/gelElectroforesis en geles de acrilamida

0.03$40/1500 muestrasCebadores marcados con fluorescencia

Electroforesis en geles de secuenciación

$1500Secador de geles

$400 (2 enchufes)Fuente de energía eléctrica

< $100,000Programa informático para analizar geles

$100,000Equipo de secuenciación

(continúa en la siguiente)

$12/gelPatrones de tamaño

$3Gel

$400 (2 enchufes)Fuente de energía eléctrica

$400Unidad de gel horizontal

0.05$6.50/litroTampón (Tris, EDTA, NaAc)

6 g/gel, ~40 muestras/gel0.11$365/500 gAgarosa

Electroforesis en geles de agarosa

$500Machacador de hojas (opcional)

$8000“Genogrinder” (opcional)

$100Taladro y maza de mortero (opcional)

0.01-0.25Insumos varios (alcohol, tampón de lisis, puntas, etc.)

Varios (EDTA, etc.)

$70/5 kgSorbitol

$270/5 kgTris

Micropreparación vs. preparación grande0.02-0.50($2/litro)Tampón de extracción

0.04$3.50O, placa de 96-pocillos

0.075$25/1000Tubos de centrífuga o de microcentrífuga

Extracción de ADN

ComentariosCosto aprox. por muestra (USD,2002,est.)Costo (USD,2002,est.)MaterialProcedimiento

Costos: Estimación de costos generales

Los costos presentados aquí asumen la existencia de un laboratorio básico equipado con cristalería, contenedores de plástico, calentadores con agitador, medidores de pH, balanza, refrigerador, congelador, agua destilada, pipetas y puntas, y centrífuga.

Estos costos varían de un país a otro y se han calculado basándose en los precios de los Estados Unidos. Debido a que en muchos países estos costos serán más altos, deben tomarse como un indicativo y usarse para comparar las diferentes tecnologías y el equipo alternativo.


Tipos altamente variables$3000-$12,000Equipo de fotografía

Gastos ambientales

$500/mesRecogida de la basura

$15 Unidad de transferencia (esponjas, cubeta)

$124/paquete de 100 láminas grandesPapel secante

6.00/membrana (20x10 cm)$180/rolloMembrana de nilón

$1.00/litro (promedio)Tampones (HCl, NaOH)

0.30$125/50 unidadMezcla de marcaje LS

0.15/ml. 1 ml usado/50 ml tampón de hibridación0.30$306/10 gADN ST (u otro bloqueador)

Tampón

Hibridación

Reactivos varios

$300/estaciónProtección

a � = costo despreciable

2.40$120/100 PlRadioisótopo (32P)

$2500Incubador con agitación

Transferencia por "Southern"

$500-$1000Incubador

~10 unidades/muestra, precios muy variables0.03-3.00$0.003-$0.30/unidadEnzimas

Digestión con enzimas de restricción

Tampón de PCR con MgCl2

0.0025-0.0042$15-$25Cebadores

0.25$250/grupo de 4dNTP

1.5 U/reacción. El costo se reducirá drásticamente cuando expire la patente0.51$170/500 unidadesTaq polimerasa

Tétrada de 96-pocillos (cuatro placas de 96-pocillos)$7000-$23,000Termociclador

PCR

Papel de alta densidad vs. polaroid; ~40 muestras/gel0.0025-0.025$0.10-$1.00Foto del gel

$1000-$2000Transiluminador

Se puede reusar por mucho tiempo�a$100/10 gBromuro de etidio

Método de visualización con bromuro de etidio

ComentariosCosto aprox. por muestra (USD,2002,est.)Costo (USD,2002, est.)MaterialProcedimiento

Costos: Estimación de costos generales (continuación)


En resumen

f La definición de estrategias de conservación y de uso adecuado de los recursos genéticos requiere la evaluación de su variación

f La diversidad fitogenética se puede medir empleando marcadores genéticos de tres tipos: morfológico, bioquímico o molecular

f Un solo marcador no reúne todas las propiedades deseadas

f La elección de la técnica depende de la naturaleza del problema biológico que se maneja


Hasta el momento usted debería saber

f Qué es la variación genética y cómo puede medirse

f Las principales ventajas y desventajas de los diferentes tipos de marcadores genéticos

f Cuáles son las propiedades deseables de los marcadores genéticos

Referencias básicasAyad, W.G., T. Hodgkin, A. Jaradat y V. Ramanatha Rao. 1997.

Molecular genetic techniques for plant genetic resources. Reporte de un taller del IPGRI, octubre 9-11 de 1995, Roma. IPGRI, Roma.

Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization forplant genetic resources conservation. p. 85-93 en Genome Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX.

Karp, A., K.J. Edwards, M. Bruford, S. Funk, B. Vosman, M. Morgante, O. Seberg, A. Kremer, P. Boursot, P. Arctander, D. Tautz y G.M. Hewitt. 1997. Molecular technologies for biodiversity evaluation: opportunities and challenges. Nature Biotechnol. 15:625-628.

Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad y T. Hodgkin. 1997.Molecular tools in plant genetics resources conservation: a guide to the technologies. Boletín técnico No. 2. IPGRI, Roma.


A continuación

f Tecnologías basadas en las proteínas• Isoenzimas

f Tecnologías basadas en el ADN

f Tecnologías complementarias

f Consideraciones finalesf Glosario

Tecnologías basadas en las proteínasNociones básicas sobre las proteínas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Proteínas 1

Tecnologías basadas en las proteínasNociones básicas sobre las proteínas




Contenido

f Nociones básicas sobre las proteínasf Estructura de las proteínas:

• Primaria• Secundaria• Terciaria• Cuaternaria

f Funciones de las proteínasf Enzimas:

• Descripción• Aloenzimas e isoenzimas


f La secuencia de bases del ADN instruye a la célula sobre el modo de hacer las distintas proteínas que necesita para funcionar como parte del organismo en que esa célula existe

f Las proteínas pueden tener distintas funciones: unas son estructurales y otras funcionales

f Las proteínas son moléculas complejas hechas por el ensamblaje de bloques simples (los aminoácidos) en una cadena (la cadena polipeptídica)

Nociones básicas sobre las proteínas

La información que llevan las bases del ADN se traduce en proteínas. La molécula del ADN se copia en un tipo distinto de ácido nucleico –el ARN o ácido ribonucleico. El ARN se mueve en el ribosoma, un organelo que tiene a su cargo la elaboración de las proteínas. Cada grupo de tres bases del ARN determina el aminoácido que se añade a la molécula proteica en progreso. La cadena de ARN pasa a través del ribosoma hasta que se complete la molécula de proteína.

Este proceso se ha llamado el 'dogma central', puesto que es la base de la vida biológica. Los aminoácidos son compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico amino (-NH2) y un grupo ácido carboxilo (-COOH). En las proteínas se encuentran comúnmente 20 aminoácidos distintos, con funciones y propiedades variables según la naturaleza del grupo –R. Por ejemplo, en la alanina el grupo R es (-CH3), mientras que en la cisteína es (-CH2-SH).


La estructura primaria de una proteína es el orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica

Estructura primaria de las proteínas

Adaptado de Griffiths y col. 1996

AA = Aminoácido

NH2

AA AA AA

H2O

NH2 AA COOH AA NH2COOH AA

R R

COOH

+ 2 H2O

H2O

En las proteínas, los aminoácidos se unen en cadena mediante enlaces peptídicos (de tipo amido) que forman el pilar de la molécula. Un enlace peptídico se crea entre un grupo básico amino (-NH2) de un aminoácido y un grupo ácido carboxilo (-COOH) de otro. La fórmula general de un aminoácido es H2N –CHR –COOH. El grupo R puede ser muy diverso: desde un átomo a una molécula compleja. El término ‘polipéptido’ indica, simplemente, a una cadena larga de aminoácidos.

Una vez que la cadena de proteínas se ha terminado, debe plegarse adecuadamente para poder funcionar. La estructura y el plegamiento de cada proteína son específicos. Todavía no se comprende plenamente el modo en que la secuencia de los aminoácidos causa el plegamiento de la proteína. Una proteína puede conformarse con uno o varios polipéptidos independientes; y puede estar hecha también de láminas (es decir, cadenas de aminoácidos que se juntan ordenadamente) que contienen estructuras en espiral. Claramente, las propiedades de los polipéptidos y de las proteínas dependen de la composición de sus aminoácidos.


Estructura secundaria de las proteínas

La estructura secundaria es el resultado de los enlaces de hidrógeno locales creados a lo largo de la base polipeptídica


La estructura secundaria es el resultado de los enlaces de hidrógeno locales que se crean a lo largo de la cadena polipeptídica. Estos enlaces dan solidez y flexibilidad a la proteína. Las estructuras secundarias más comunes son:

• Hélice alfa, causada por enlaces de hidrógeno dentro de la cadena polipeptídica; por ejemplo, proteínas musculares.

• Lámina plegada beta, causada por enlaces de hidrógeno entre cadenas polipeptídicas adyacentes; por ejemplo, la fibra de la seda.


Estructura terciaria de las proteínas

La estructura terciaria resulta de las interacciones entre los grupos R de un polipéptido, es decir, de los enlaces covalentes y no covalentes


La estructura terciaria resulta de las interacciones entre los grupos R de un polipéptido, tales como los enlaces no covalentes (enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas) y los enlaces covalentes débiles (enlaces de tipo disulfuroentre residuos de cisteína).


Estructura cuartenaria de las proteínas

La estructura cuaternaria resulta de las interacciones entre dos o más cadenas polipeptídicas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.


A veces un solo polipéptido es suficiente para que una proteína actúe, y entonces decimos que la proteína actúa como un monómero. Sin embargo, es necesario a menudo que interactúen dos polipéptidos para que la proteína ejerza su función particular. Si éste es el caso, hablamos de un dímero; si interactúan más de dos polipéptidos, decimos que son trímeros, tetrámeros, etc.

La estructura cuaternaria resulta de interacciones entre dos o más cadenas polipeptídicas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Estas cadenas se mantienen juntas mediante enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos y, menos comúnmente, interfases hidrofóbicas y enlaces de tipo disulfuro entre cadenas.


f La estructura tridimensional de las proteínas es un resultado directo de las interacciones que ocurren en su medio interno

f La diversidad en las funciones de las proteínas es el resultado de la complejidad de su estructura

Funciones de las proteínas

La estructura tridimensional de las proteínas es el resultado directo de las interacciones que ocurren en su medio interno. En consecuencia, el conocimiento de la estructura de las proteínas nos da mucha información sobre el modo en que realizan sus tareas en la célula.

Por ejemplo, en ambientes acuosos, los grupos R hidrofóbicos se colocan hacia el interior de las proteínas. Los cambios de temperatura o de pH pueden afectar los enlaces no covalentes causando roturas de la estructura tridimensional y pérdida de actividad en la proteína. Este proceso se llama 'desnaturalización'. Las proteínas desnaturalizadas pueden unirse para volverse insolubles en un proceso llamado coagulación.

Entre las diversas funciones de las proteínas, facilitadas por la complejidad de la estructura de éstas, están las siguientes; se incluyen ejemplos:

• Estructura (colágeno, fibras musculares)• Almacenamiento (gliadinas del trigo, hordeínas de la cebada)• Enzimas (hidrolasas, transferasas, isomerasas, polimerasas, ligasas)• Transporte (transferencia de oxígeno mediante la hemoglobina)• Mensajería (insulina y ciertas hormonas)• Anticuerpos (proteínas que se adhieren a partículas foráneas específicas)• Regulación (proteínas involucradas en la regulación de la síntesis del ADN)


f Los enzimas son un tipo particular de proteínas que actúan como catalizadores

f Cada enzima es altamente específica respecto al tipo de reacción química que cataliza y a las sustancias (llamadas sustratos) sobre los que actúa

Enzimas: Descripción


Las múltiples formas que toman los enzimas permiten agruparlos en dos clases principales según el modo en que estén codificados:

• Aloenzimas: enzimas codificados por alelosdiferentes en un solo locus

• Isoenzimas: enzimas codificados por alelos diferentes en más de un locus

Generalmente, el término isoenzimas se aplica a ambas clases.

Enzimas: Aloenzimas e isoenzimas

A veces, cambios en los aminoácidos resultan en cambios de la estructura primaria del enzima. Estos cambios generan polimorfismos.


f Las proteínas son los productos primarios de los genes

f Las proteínas pueden tener diversas estructuras, que están estrechamente relacionadas con las tareas que realizan en la célula

f Los enzimas son un tipo particular de proteína, es decir, los que actúan como catalizadores

f Los enzimas pueden tener formas múltiples y se clasifican como aloenzimas o isoenzimas

En resumen


f La naturaleza de una proteína

f Los mecanismos que intervienen para dar a las proteínas diferentes estructuras

f La naturaleza de un enzima

f La diferencia entre aloenzimas e isoenzimas


Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. The nature of the gene. p. 345-358 en: An Introduction to Genetic Analysis (6a. ed.). W.H. Freeman., NY.

Referencia básica


A continuación

f Tecnologías basadas en el ADN


f Consideraciones finales

f Glosario

Tecnologías basadas en las proteínasIsoenzimas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Isoenzimas 1

Tecnologías basadas en las proteínasIsoenzimas




f Detección de isoenzimas• Metodología• Electroforesis

f Equipof Tecnología de los isoenzimas en imágenesf Interpretación de las combinaciones de bandasf Ventajas y desventajasf Ejemplos de aplicaciones

• Lysimachia sp.• Fríjol Lima• Cebolla

Contenido


f Tratamiento del material vegetal

f Electroforesis en geles de almidón o de acrilamida

f Tinción histoquímica

f Análisis de los patrones de bandas

Detección de los isoenzimas: Metodología

Los extractos crudos se someten a electroforesis en geles de almidón o de acrilamida y se tratan con tinciones específicas del enzima. El resultado es un patrón de bandas relativamente sencillo.

La variación observada en los patrones de bandas entre los individuos analizados puede interpretarse genéticamente, tal como se haría con cualquier otro marcador fenotípico.


f En este proceso se aplica una corriente eléctrica que favorece la separación de moléculas por su carga y por su tamaño

f La corriente hace que las moléculas se muevan a través de los poros del gel

f La sustancia que constituye el gel se escoge de modo que sus poros sean de un tamaño apropiado para poder separar moléculas de tamaños y formas específicos

Detección de isoenzimas: Electroforesis (1)

La electroforesis es una técnica cromatográfica que permite separar mezclas de compuestos iónicos. Se ha adoptado como una herramienta común para el análisis bioquímico.


-

+Gel

Corriente eléctrica

Cargando las muestras

Detección de isoenzimas: Electroforesis (2)

Las proteínas son el producto primario de los genes. Cuando cambia la secuencia de nucleótidos del ADN, también cambian los patrones de bandas de las proteínas. La electroforesis de los enzimas puede revelar directamente el polimorfismo genético puesto que exhibe las formas múltiples de un enzima específico.


f Equipo:• Refrigerador y

congelador• Fuente de energía

eléctrica• Hornillo o microondas• Guantes gruesos de

algodón

• Medidor de pH• Balanzas• Moldes para solidificar

el gel• Matraces volumétricos

y de succión

Equipo

f Recursos:• Agua destilada o desionizada (o ambas)• Reactivos


La tecnología de isoenzimas en imágenes

Las siguientes fotografías ilustran las etapas de laboratorio necesarias para detectar isoenzimas


Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

El técnico de laboratorio está pipeteando la solución tampón de extracción sobre una sección de hoja. Cada muestra se coloca en una bandejita plástica, de las que suelen usarse para pesar productos químicos. Se pueden usar otros utensilios como placas de vidrio, siempre y cuando estén muy limpios y no permitan la absorción del tejido macerado.



Una vez el tampón de extracción se ha colocado sobre la muestra, ésta se machaca con una varilla de metacrilato para lograr la rotura completa del tejido y su homogeneizacióncon la solución tampón. Esta operación debe hacerse lo más rápidamente posible paraevitar un aumento de temperatura. Mientras se machacan todas las muestras, lasbandejitas plásticas se van colocando sobre una capa de hielo.



Se corta un pequeño trozo rectangular de papel poroso y se mete en la bandejita encontacto con la solución, hasta que el papel absorba la muestra.


Se vierte la solución caliente de almidón en el molde para el gel. A medida que el gel se enfríe, adquirirá una consistencia gelatinosa. En ese momento ya estará listo para recibir las muestras. El gel puede almacenarse en un refrigerador hasta el momento de su uso.



Un gel de almidón, preparado con antelación, se ha cortado con un bisturí, aproximadamente a un tercio desde el extremo del molde. Luego se colocan verticalmente, con ayuda de unas pinzas, los trozos de papel contra uno de los lados del corte hecho en el gel.


Un aparato generador de energía eléctrica debe controlar el voltaje y la intensidad de la corriente que requiere la electroforesis. Hay muchos modelos comercialmente disponibles, que son equivalentes tanto en sus propiedades como en su capacidad. En el aparato de nuestra foto pueden enchufarse simultáneamente dos unidades de electroforesis. El generador de energía puede incluir un cronómetro para detener el proceso de electroforesis en un momento dado.


El gel se coloca en una unidad de electroforesis y ésta dentro de una cámara frigorífica o de un refrigerador. La unidad tiene un recipiente de solución reguladora en dos lados opuestos (cátodo y ánodo) y el contacto entre la solución reguladora y el gel se logra con un trozo de esponjilla delgada o de gasa. Sobre la unidad se coloca una envoltura de plástico para evitar que la superficie del gel se seque durante el proceso y para garantizar una buena transferencia entre los recipientes de solución reguladora. El recorrido de las muestras puede seguirse observando un colorante azul que actúa como control o marcador.



Cuando el proceso de electroforesis termina (se observa entonces, generalmente, una sombra parduzca en el extremo opuesto a aquél en que se colocaron las muestras en el gel), el gel se corta en tajadas. En la parte frontal de la foto vemos un gel listo para ser cortado, el cual debe transferirse a un soporte de metacrilato (centro de la foto). Al fondo puede verse el recipiente en que se colocarán las tajadas para teñirlas.



El gel está ahora sobre el soporte y unas guías delgadas (en la foto, de color negro) se colocan en cada lado para definir el espesor de las tajadas. En la esquina superior derecha del gel se hace un corte en diagonal que sirve de guía para determinar el orden de las muestras una vez que las tajadas se hayan teñido.



Se coloca una placa de vidrio sobre el gel para ejercer presión mientras se hace el corte, lo que garantiza que las tajadas sean semejantes. El gel se corta empleando una sierra de marquetería equipada con una cuerda de guitarra.



Los enzimas diferentes requieren, para ser visualizados, de distintas soluciones de tinción. En la foto, una solución de tinción amarillenta se vierte en un recipiente de metacrilato antes de transferir una tajada del gel.



Una tajada de gel se está transfiriendo al recipiente que contiene la solución de tinción deseada. Dada la fragilidad de las tajadas, se debe tener cuidado al transferirlas al recipiente. Si una tajada se rompe, es frecuente que los pedazos rotos puedan reorganizarse y que los enzimas puedan aún visualizarse en el gel.


Después de cierto período de incubación, una tajada de gel teñida se ve como en la fotografía, la cual muestra la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) de la hoja de esparceta (Onobrychis viciaefolia), un cultivo forrajero.


f La estructura cuaternaria de los enzimas (si es monomérico, dimérico, etc.)

f La condición homocigota o heterocigota de la planta en cada locus

f El número exacto de loci (isoenzimas)f El número de alelos por locusf El tipo de herencia de los genes

Interpretación de los patrones de bandas

Los principales aspectos relacionados con la interpretación son:

Los aloenzimas están controlados por alelos codominantes, lo que significa que los homocigotos (en que todos los alelos en el locus son similares) pueden distinguirse de los heterocigotos (en que los progenitores del individuo han contribuido con diferentes alelos a este locus).

En el caso de enzimas monoméricos (los que constan de un solo polipéptido), las plantas homocigóticas para un locus dado producirán una banda, mientras que las heterocigóticas producirán dos bandas. En el caso de enzimas diméricos (los que constan de dos polipéptidos), las plantas homocigóticas para ese locus producirán una banda, mientras que las heterocigóticas producirán tres bandas en razón de la asociación aleatoria de los polipéptidos.

Hay también enzimas multiméricos en los que los polipéptidos son producidos por diferentes loci. La formación de heterómeros isoenzimáticos puede complicar considerablemente los patrones de bandas.

Estas relaciones complejas y la importancia de interpretar los patrones de bandas correctamente, hacen deseable a veces, e incluso necesario, un análisis genético en que se haga, a su vez, un análisis de descendencias (F1, F2 y retrocruzamiento) de cruzamientos artificiales entre individuos cuyo patrón de bandas es conocido.


f Aloenzima monomérico:Homocigoto

Ejemplo 1: Formación de homómeros

f Aloenzima monomérico:Heterocigoto

F1

F1

Este ejemplo muestra el comportamiento de los enzimas monoméricos en los cruzamientos. Los progenitores son homocigotos para el mismo alelo en el mismo locus o heterocigotos. En el primer caso, toda la descendencia F1 será homocigótica y, en consecuencia, resultará una sola banda. Si los progenitores son heterocigóticos, resultarán tres posibles fenotipos F1.


Ejemplo 2: Formación de heterómeros

Aloenzima dimérico: un gen con dos alelos

Monómeros Enzima dimérico activo

• Homocigoto

• Heterocigoto

• Homocigoto

En un cruzamiento, los enzimas diméricos pueden comportarse de tres maneras posibles. Si ambos progenitores son homocigotos para diferentes alelos en el mismo locus, toda la descendencia será heterocigota, pero a causa de la asociación aleatoria de los polipéptidos, tres combinaciones son posibles; por consiguiente, tras los procesos de electroforesis y tinción aparecerán tres bandas.


Ejemplo 3: Formación de heterómeros(continuación)Aloenzima dimérico: dos genes con dos alelos

Monómeros Enzimas diméricos activos

Dímerosintragénicos

Dímerosintragénicos

Dímerosintergénicos

Gen 1 Gen 2

En este segundo ejemplo con aloenzimas diméricos, los dos polipéptidos son codificados por loci separados. Los progenitores no comparten ningún alelo. La asociación aleatoria de los polipéptidos puede conducir a la formación de un total de 10 dímeros, porque se forman tanto dímeros intragénicos (entre alelos en el mismo locus) como dímeros intergénicos (entre alelos de diferentes loci).


• Enzimas diméricos activos

• Monómeros

Tetraploide heterocigótico (un locus, cuatro alelos)

Ejemplo 4: Formación de heterómeros(continuación)

En el ejemplo del diagrama, un tetraploide heterocigótico, que tiene cuatro alelos en un locus, forma diez enzimas diméricos activos gracias a la asociación aleatoria entre los cuatro monómeros.


Ventajas y desventajas

f Ventajas• La tecnología es sólida y sumamente reproducible• Los marcadores son codominantes, es decir,

apropiados para calcular una amplia variedad de parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos

f Desventajas• Hay relativamente pocas tinciones disponibles para

la detección de enzimas• El análisis está basado en el fenotipo

El análisis de isoenzimas es, en principio, un método sólido y reproducible. Además, los isoenzimas son marcadores codominantes y, por tanto, apropiados para calcular todos los parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos.

En las plantas se han empleado hasta 90 sistemas isoenzimáticos, y en muchos casos esos loci se han localizado en mapas genéticos.

La mayor limitación del análisis con isoenzimas es que suministra un bajo número de marcadores, puesto que el número de ensayos histoquímicos disponibles para detectarlos es relativamente bajo. Por tanto, a menudo, el porcentaje de cobertura del genoma es inadecuado para hacer un estudio comprehensivo de la diversidad genética.

Otra desventaja del análisis con isoenzimas está en que los marcadores se basan en el fenotipo. Por tal razón, los marcadores pueden estar influenciados por factores ambientales, y las diferencias de expresión causar confusión en la interpretación de los resultados. Puesto que la diferente expresión de los genes ocurre en distintos estados del desarrollo o en diferentes tejidos, es importante usar el mismo tipo de material en todos los experimentos que estén relacionados.


f Flujo de genes o introgresión (o en ambos casos)

f Genética de poblacionesf Estrategias para la conservación ex situ de

germoplasmaf Evolución de especies cultivadasf Evaluación y caracterización del germoplasmaf Erosión genéticaf Estabilidad genética del material conservado

Ejemplos de aplicaciones

Bartsch, D., M. Lehnen, J. Clegg, M. Pohl-Orf, I. Schuphan y N.C. Ellstrand. 1999. Impact of gene flow from cultivated beet on genetic diversity of wild sea beet populations. Mol. Ecol. 8:1733-1741.

Finkeldey, R. y O. Murillo. 1999. Contributions of subpopulations to total gene diversity. Theor. Appl. Genet. 98:664-668.

Ibáñez, O., C. Calero, M. Mayol y A. Rosello. 1999. Isozyme uniformity in a wild extinct insular plant, Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae). Mol. Ecol. 8:813-817.

Ledig, F.T. 2000. Founder effects and the genetic structure of Coulter pine. J. Hered. 91(4):307-315.

Li, Z. y J.N. Rutger. 2000. Geographic distribution and multilocus organization of isozyme variation of rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 101:379-387.

Liu, F., R. Von Bothmer y B. Salomon. 1999. Genetic diversity among East Asian accessions of the barley core collection as revealed by six isozyme loci. Theor. Appl. Genet. 98:1226-1233.

Maquet, A., I. Zoro Bi, M. Delvaux, B. Wathelet y J.P. Baudoin. 1997. Genetic structure of a Lima bean base collection using allozyme markers. Theor. Appl. Genet. 95:980-991.

Ortiz, R. y Z. Huaman. 2001. Allozyme polymorphisms in tetraploid potato gene pools and the effect on human selection. Theor. Appl. Genet. 103:792-796.

Rouamba, A., M. Sandmeier, A. Sarr y A. Ricroch. 2001. Allozyme variation within and among populations of onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl. Genet. 103:855-861.

Shapcott, A. 1998. The patterns of genetic diversity in Carpentaria acuminata (Arecaceae) and rainforest history in northern Australia. Mol. Ecol. 7:833-847.

Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que vienen a continuación.


f Título:Isozyme uniformity in a wild extinct insular plant, Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae). Mol. Ecol. 1999. 8:813-817

f Objetivo:Evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de Lysimachia minoricensis, conservadas y suministradas por 10 jardines botánicos europeos

f Materiales y métodos:Se analizaron, en total, 158 plantas respecto a 13 enzimas (22 loci)

Ejemplo: Lysimachia sp.



f Resultados:No se detectó ninguna variación electroforética en ninguno de los 22 loci enzimáticos analizados

f Discusión sobre la falta de variación: • Las técnicas electroforéticas resuelven sólo una porción

pequeña de la variación genética• ¿La muestra era de tamaño pequeño? La muestra ofrece

un 95.6% de probabilidad de detectar la existencia de cualquier variante alélica cuya frecuencia global fuera, por lo menos, de 1%

• ¿Es inesperada esta ausencia de variación? Los resultados se refieren más a la pregunta de la cantidad de variación genética preservada ex situ que al nivel de variación que había antes de la extinción

Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación)



Conclusiones:El sistema de intercambio entre jardines botánicos no es adecuado para la conservación eficaz del germoplasma si la variación genética dentro de una especie está subrepresentada en las colecciones

Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación)


f Título:Genetic structure of a Lima bean base collection using allozyme markers. Theor. Appl. Genet 1997. 95:980-991

f Objetivo:Evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de fríjol lima (Phaseolus lunatus L.), que contenía varias entradas silvestres y razas locales, ampliamente distribuidas

f Materiales y métodos:Se usaron diez sistemas enzimáticos para analizar 235 entradas de fríjol lima (1-5 semillas cada una) recogidas en América Latina y en el Caribe

Ejemplo: Fríjol lima



Ejemplo: Fríjol lima (continuación)

Resultados y discusión:• Los 10 sistemas enzimáticos analizados detectaron 13 loci

(32 alelos)• Se identificaron alelos específicos en cada acervo genético.

El dendrograma mostró claramente dos conglomerados principales: • Entradas de los Andes con un modelo andino de proteína de

semilla• Entradas mesoamericanas y andinas con un modelo

mesoamericano de proteína de semilla • Tanto las razas locales andinas como mesoamericanas se

agruparon con sus familiares respectivos• Por término medio, el fríjol lima mostró un 76% de

diversidad entre las entradas y un 24% dentro de ellas. Las razones de este resultado son la autofecundación, la presencia de poblaciones pequeñas y el escaso flujo de genes



Conclusiones:• Un programa de conservación de P. lunatus debe

incluir formas silvestres y formas cultivadas de ambos acervos genéticos

• Como la diversidad genética se distribuye principalmente entre las entradas, deberían preservarse más poblaciones o entradas para asegurarse de que se retiene la diversidad alélica y genotípica tanto de los acervos genéticos como de las formas botánicas

Ejemplo: Fríjol lima (continuación)


f Título:Allozyme variation within and among populations of onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl. Genet. 2001. 103:855-861

f Objetivo:Evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de cebolla, usando isoenzimas

f Materiales y métodos:• Se estudiaron 16 poblaciones locales cultivadas,

muestreadas en cinco países de África Occidental• Se analizaron nueve sistemas enzimáticos

Ejemplo: Cebolla



Ejemplo: Cebolla (continuación)

Resultados:• Cuatro sistemas fueron polimórficos (ADH, MDH,

6-PGDH, PGI) y hubo, en total, nueve alelos• La media de alelos encontrados por locus polimórfico

fue de 2.25. Además, 67% de los alelos estaban presentes en todas las poblaciones

• El alelo adh-a2 estaba ausente en las cinco poblaciones de Burkina Faso. El alelo 6-pgdh-a2 estaba presente sólo en dos poblaciones, una del sur de Níger y la otra de Nigeria del norte



f Discusión:• La débil diferenciación geográfica entre

poblaciones puede haber resultado del intercambio comercial entre países del mismo idioma

• En general los heterocigotos fueron pocos, quizás por la autogamia de las poblaciones muestreadas o por la deriva genética resultante de la producción de semilla a partir de cantidades pequeñas de bulbos usados como progenitores

f Conclusiones:Para comprender mejor la variabilidad de esta especie, sería aconsejable que se hicieran estudios similares a nivel del continente africano

Ejemplo: Cebolla (continuación)


En resumen

f La tecnología de los isoenzimas se basa en la extracción de las proteínas, en su separación mediante electroforesis y en su tinción histoquímica

f El equipo requerido es sencillof La interpretación de los patrones de bandas es

típicamente codominante y, debido a su complejidad, puede necesitar un análisis genético

f Los isoenzimas usados como marcadores genéticos son sumamente reproducibles



f Los pasos principales que requiere la tecnología de los isoenzimas

f Los puntos principales que deben considerarse al interpretar los patrones de bandas

f Las ventajas y desventajas de los isoenzimas, como marcadores genéticos, en los estudios de diversidad

Hamrick, J.L. y M.J. Godt. 1989. Allozyme diversity in plant species. p. 43-63 en Plant population genetics, breeding, and genetic resources (A.H.D. Brown, M.T. Cleg, A.L. Kahler y B.S. Weir, eds.). Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U.

Manchenko, G.P. 1994. Handbook of detection of enzymes on electrophoretic gels. CRC Press, Boca Raton, FL, E.U.

Murphy, R.W., J.W. Sites, D.G. Buth y C.H. Haufler. 1996. Proteins: isozyme electrophoresis. p. 51-20 en Molecular Systematics (2a. ed.). (D.M. Hillis, C. Moritz y B.K. Mable, eds.). Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U.

Soltis, D.E. y P. Soltis (eds.). 1989. Isozymes in plant biology. Dioscorides Press, Portland, OR.

Tanksley, S.D. y T.J. Orton (eds.). 1983. Isozymes in plant genetics and breeding. Parte A y Parte B. Elsevier Science, Amsterdam, Holanda.

Referencias básicas


f Tecnologías basadas en el ADN• Polimorfismo de longitud de fragmentos de

restricción (RFLP)• Tecnologías basadas en la PCR



f Glosario

Tecnologías basadas en el ADNFundamentos del ADN

A continuación

enú principal

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 1

Tecnologías basadas en el ADNFundamentos del ADN




Contenido

f La molécula de ADN:• Estructura y características• Replicación• Empaquetamiento en el cromosoma• Organización de las secuencias• ADN citoplasmático

f Tecnología del ADN:• Enzimas de restricción• Electroforesis de ácidos nucleicos• Polimorfismo de ADN

f Procedimientos para el aislamiento del ADN, en imágenes


La molécula del ADN: Estructura y características

El ADN y el ARN son moléculas constituidas por filamentos de nucleótidos

Un nucleótido consta de:• Un azúcar pentosa• Un grupo fosfato• Una base nitrogenada

Los elementos fundamentales del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) son los nucleótidos. Un nucleótido consta de:

• Un azúcar pentosa: en el ADN es la desoxirribosa, y en el ARN es la ribosa• Un grupo fosfato• Una base nitrogenada, que puede ser (en el ADN y en el ARN):

• Bases púricas: adenina (A) o guanina (G) • Bases pirimidínicas: citosina (C) o timina (T); el uracilo (U) reemplaza la

timina en el ARN

La molécula de ADN consta de una cadena constituida por cuatro elementos fundamentales sencillos (A, G, C y T) que se reúnen para formar una doble hélice. Una hélice consta de dos hebras, cada una con su soporte de azúcar-fosfato, unidas por enlaces débiles de hidrógeno entre las bases adenina-timina (dos enlaces de hidrógeno) y citosina-guanina (tres enlaces de hidrógeno).

La conformación de las bases A y T y la de las bases C y G son ‘complementarias’ y esta es la razón por la que el ADN puede copiarse a sí mismo. Dos cadenas de soportes y de bases, que corren en direcciones opuestas (antiparalelas) forman la estructura de la doble hélice. El orden o ´secuencia’ de estas bases a lo largo de la cadena forma el código genético que lleva las instrucciones genéticas precisas para que el organismo funcione.


La molécula del ADN: Replicación


3’

5’

3’3’

5’

3’

5’

5’

En ciertas circunstancias (es decir, durante la replicación del ADN celular), las dos cadenas de la molécula de ADN se separan. La ARN polimerasa sintetiza un tramo corto de ARN complementario a una de las hebras de ADN en un sitio específico, conocido como el sitio de inicio de la replicación.

Esta sección corta de ARN actúa como un patrón para que comience la réplica del ADN. Nuevas bases de ADN se acercan al extremo 3’ y se adhieren a su pareja complementaria en la hebra del ADN patrón. Las nuevas bases se unen luego para hacer una cadena de ADN que es 'hija' del patrón anterior. Como los nucleótidos siempre se agregan al extremo 3’, la síntesis de ADN ocurre en la dirección que va de 5’ a 3’. Este proceso se presenta en cada una de las cadenas de la molécula de ADN original.


La molécula del ADN: Empaquetamiento en el cromosoma

Å = angstrom, una unidad de longitud que equivale a 1/109 m

{

{

110 Å

20 Å

14000 Å

3000 Å

300 Å

Una molécula de ADN es mucho más larga que un cromosoma, de manera que se necesita un mecanismo para plegar densamente y empaquetar la fibra de ADN.

La mezcla del material del cual se forman los cromosomas se llama cromatina, y es la suma de la molécula de ADN más algunas proteínas. En los organismos eucariotas, el ADN se condensa con proteínas histonas, con otras no histonas y con un poco de ARN. Las histonas se organizan en nucleosomas y dan al ADN enroscado una apariencia de cuenta de collar. El enroscado adicional de los nucleosomas produce una conformación de solenoide, y todavía hace falta otro nivel de empaquetamiento para llegar a la estructura cromosómica.

Los cromosomas están constituidos por regiones eucromáticas, levemente empacadas y que contienen la mayoría de los genes activos, y por regiones heterocromáticas, densamente empacadas y que aparentemente desactivan los genes a su alrededor. Con frecuencia se encuentra heterocromatina alrededor de los centrómeros.

[La definición de Angstrom está modificada a partir del Merriam-Webster en línea (http:/www.m-w.com)]


La molécula del ADN: Organización de las secuencias

Adaptado de Flavell y Moore (1996)

ADN de copia única

ADN de copia múltiple

Centrómero

Telómeros

El ADN eucariótico puede agruparse en diferentes tipos o clases:

• De copia única, genes que codifican proteínas

• ADN presente en copias múltiples: • Secuencias con función conocida

CodificantesNo codificantes

• Secuencias con función desconocidaRepeticiones (dispersas o en tándem)Transposones

• ADN espaciadorSe pueden encontrar numerosas repeticiones en el ADN espaciador.Constan de la misma secuencia presente en muchas localizaciones,especialmente en los centrómeros y telómeros. Las repeticiones varían en tamaño, en número y en distribución en todo el genoma, lo que las hace sumamente apropiadas para su consideración como marcadores moleculares.

Referencia

Flavell, R.B. y G. Moore. 1996. Plant genome constituents and their organization. En: Plant Genome Isolation: Principles and Practice (Foster, G.D. y D. Twell, eds.). John Wiley & Sons, Chichester, NY.


La molécula del ADN: ADN citoplasmático

f ADN citoplasmático• ADN de los cloroplastos (ADNcp)• ADN de las mitocondrias (ADNmt)

f Características:• Herencia materna• Tasas dispares de evolución (orden de los genes

vs. secuencia de los nucleótidos)• Acumulación lenta de mutaciones

Se encuentran cantidades pequeñas de ADN en el citoplasma, fuera del núcleo: en los cloroplastos (ADNcp) y en las mitocondrias (DNAmt). Tanto los cloroplastos como las mitocondrias tienen su propio cromosoma, del cual hay varias copias. Sus genes codifican para la traducción y la transcripción de los componentes de los organelos, y tienen funciones altamente especializadas en la expresión del fenotipo del organismo a que pertenecen.

El ADN citoplásmico se hereda comúnmente, aunque no siempre, a través del progenitor materno, un modelo conocido como herencia materna.

Las secuencias del ADNcp y del ADNmt tienen sus peculiaridades. El ADNmt de las plantas parece evolucionar rápidamente en lo que se refiere al orden de los genes, y lentamente en la secuencia nucleotídica. La razón de que las mutaciones se acumulen lentamente no se conoce con certeza, pero podría ser un efecto de la presencia ya sea de un mecanismo sumamente eficaz de reparación de daños del ADN o de un sistema de replicación del ADN relativamente libre de errores. En cambio, la tasa de evolución del ADNcp parece, en general, lenta, tanto en función de la secuencia nucleotídicaprimaria como del reordenamiento de genes.


Tecnología del ADN

La tecnología del ADN incluye los conceptos de:

f Enzimas de restricción

f Electroforesis de ácidos nucleicos

f Polimorfismo del ADN


Enzimas de restricción

TAGC

f Cada enzima de restricción corta el ADN en fragmentos definidos, gracias a la acción que ejerce en secuencias específicas que son su objetivo

f Dan lugar a extremos pegajosos o romos

f Los enzimas de restricción son de varios tipos:

• Tipo I y III, que cortan el ADN de hebra o cadena doble por fuera de la secuencia de reconocimiento

• Tipo II, que identifican secuencias de 4, 5 ó 6 pb y cortan por dentro de dicha secuencia

Las bacterias producen enzimas de restricción como un mecanismo de defensa contra los bacteriófagos. Estos enzimas pertenecen a una clase que parte (o corta) el ADN en posiciones internas específicas y únicas en toda su longitud. Por ello, también se los llama endonucleasas. Estas enzimas actúan como tijeras y así cortan el ADN de los fagos y los desactivan.

De los tres tipos de enzimas de restricción, los tipos I y III cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia de reconocimiento. En cambio, los enzimas de tipo II identifican secuencias específicas de 4, 5 ó 6 pares de bases y cortan por dentro de estas secuencias. Debido a sus características, estos tres tipos de enzimas se han tornado esenciales para la tecnología del ADN recombinante.

Los enzimas pueden cortar una secuencia dada de ADN, dejando extremos escalonados (o pegajosos) que permiten la creación de puentes de hidrógeno con una secuencia complementaria (finales contusos). Cuando dos fragmentos de ADN se cortan con el mismo enzima, se producirán fragmentos que tendrán extremos pegajosos complementarios, y a ellos se podrán adherir, por tanto, fragmentos alternativos.

Los enzimas de restricción están disponibles comercialmente y suelen venir con la solución tampón apropiada y con las instrucciones acerca de las condiciones y las temperaturas de reacción.


Electroforesis de ácidos nucleicos


Un método para separar fragmentos de ADN y permitir su visualización o su identificación (o ambos)

-

++ -

Fuente de energía eléctrica

Gel

Unidad de electroforesis

Después de la digestión a que es sometida por un enzima de restricción, la molécula de ADN se convierte en una colección de fragmentos de restricción. Estos fragmentos pueden separarse según su tamaño al hacerlos migrar en un gel de agarosa o de acrilamida.

Para lograr esa separación, la mezcla de fragmentos de ADN y del sobrante de enzima se coloca en pocillos formados cerca de un borde del gel. El gel se somete luego a un campo eléctrico que hace migrar los fragmentos de ADN según su tamaño, de modo que los fragmentos grandes migran más lentamente que los fragmentos cortos. Las moléculas de ADN, que están cargadas negativamente a pH neutro, migran hacia el ánodo. Los geles de agarosa (de 0.8% a 2.0%) son muy útiles para separar fragmentos de ADN cuyo tamaño esté comprendido en el intervalo de 300 a 10.000 pb. Los geles de acrilamida (de 3.5% a 20%) son muy útiles para fragmentos cuyo tamaño oscile entre 20 y 1000 pb.

La visualización de los fragmentos de ADN, después de la electroforesis, se logra mediante la tinción con bromuro de etidio; las moléculas de esta sustancia se colocan entre las bases del ADN y producen una fluorescencia de color anaranjado bajo la luz ultravioleta.

La distancia de migración es proporcional al logaritmo del número de bases. Por consiguiente, el tamaño real de los fragmentos obtenidos puede calcularse partiendo dela movilidad de los fragmentos de ADN de tamaño conocido.


Polimorfismo del ADN

f Diversos sucesos pueden causar variantes, más o menos complejas, en la secuencia de nucleótidos del ADN. Tales variantes se describen, generalmente, como polimorfismos

f El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo —lo que se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan con un procedimiento apropiado— y quizás del fenotipo

f Varios sucesos pueden producir polimorfismos: • Mutaciones puntuales• Inserciones o deleciones• Rearreglos


Mutaciones puntuales

Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base de la secuencia del ADN es reemplazada por otra. La longitud de la secuencia del ADN no cambia

Reemplazo

Las mutaciones puntuales pueden ocurrir en una base solamente, o en unas pocas bases del mismo sitio. En el diagrama de la diapositiva, cuatro bases de la secuencia cromosómica original (parte superior) son reemplazadas por cuatro bases alternativas. Dado que el número original de bases no cambia, la longitud total de la secuencia no se altera.


Inserciones o deleciones

Inserción

Deleción

Las inserciones o las eliminaciones son el resultado de la adición o la desaparición de variasbases en la secuencia del ADN. La longitud de la molécula cambia

La parte superior del diagrama ilustra una deleción: se pierden algunas bases y el fragmento de ADN resultante se vuelve más corto.

La mitad inferior del diagrama ilustra una inserción: se introducen algunas bases en una sección de la secuencia del ADN. La secuencia original se torna, por tanto, más larga según el número de bases que se hayan insertado.


Rearreglos

Los reordenamientos cromosómicos ocurren como resultado de la recombinación genética o de la inserción de elementos transponibles. La longitud de la molécula puede cambiar o quedar igual

También pueden darse cambios en la secuencia del ADN debidos a los reordenamientos; por ejemplo, cuando un segmento se da la vuelta. En estos casos, aunque quizás no cambie la longitud de la secuencia del ADN, su composición puede cambiar suficientemente para que se observe en este caso un polimorfismo.


Procedimiento de aislamiento del ADN en imágenes

Las siguientes fotografías ilustran los diversos pasos del procedimiento para aislar ADN


El técnico de laboratorio está recolectando unas pocas hojas, muy jóvenes, de tomate para hacer una extracción pequeña de ADN. Para una extracción grande, se recolectarían muchas más hojas y más grandes (cerca de 10 g) de plantas más viejas.


El tejido de la hoja (para las extracciones pequeñas de ADN) y la solución tampón se convierten en una mezcla homogénea en un tubo de centrífuga de 1.5 ml, empleando un taladro equipado con un vástago de plástico. Para aumentar la eficiencia, se pueden usar dos taladros simultáneamente, que pueden ser controlados con pedales como los usadosen las máquinas de coser.


Para extracciones grandes de ADN, el tejido de la hoja se homogeneiza con una solución tampón de extracción en batidoras estándar de cocina. Aunque no sean necesarios por razones de seguridad, sí conviene usar guantes y un delantal de laboratorio para proteger la ropa y la piel, ya que puede haber salpicaduras durante el procedimiento.


La mezcla del tejido foliar y solución tampón se vierte de la batidora, a través de una gasa, en botellas de centrífuga colocadas sobre un lecho de hielo. Se exprime la gasa para obtener tanto líquido como sea posible reteniendo en el filtro los pedazos grandes de tejido foliar, que luego se descartan junto con el filtro.


Después de centrifugar y resuspender la bolita (pellet) de ADN (que es todavía verde y contiene algo de material foliar), la mezcla se transfiere a un tubo nuevo al que se le agrega cloroformo. Este paso debe realizarse en una campana extractora con ventilación, y deben usarse guantes de seguridad y una bata de laboratorio.


Los tubos se invierten primero para mezclar suavemente el cloroformo y luego se centrifugan para separar el ADN.


La capa más clara, que contiene el ADN, está ahora en la parte superior y puede ser transferida a un tubo limpio. La capa inferior contiene tejido foliar no deseado, paredes celulares y otros residuos, y se descarta.


Se agrega alcohol para precipitar el ADN, el cual, mediante una inversión suave, se congrega generalmente como una sustancia filamentosa. Este ADN puede ser retirado con un gancho o centrifugado. Luego se lava y se resuspende.


En resumen

f Los elementos fundamentales del ADN son los nucleótidos, que se unen haciendo una doble hélice con la que se forma la cadena del ADN

f La molécula del ADN se pliega cada vez más a medida que la secuencia de los nucleótidos le da forma al cromosoma

f El ADN se organiza en diferentes clases: de copia única, de copia múltiple y espaciador

f Las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propia molécula de ADN

f Varios sucesos causan polimorfismos en la molécula de ADN: las mutaciones puntuales, las inserciones, las deleciones y los rearreglos



f Los componentes de un nucleótido

f De qué modo los nucleótidos forman la doble hélice del ADN

f Las diferentes clases de ADN

f Las características principales del ADN citoplasmático

f Lo que es un enzima de restricción

f La forma en que se producen los polimorfismos en la cadena de ADN

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman, Nueva York.

Lewin, B. 1994. Genes V. Oxford University Press.

Schleif, R. 1993. Genetics and molecular biology (2a. ed.). Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD, E.U.

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f Tecnologías basadas en el ADN• Tecnologías basadas en la PCR



f Glosario

Tecnologías basadas en el ADNPolimorfismo de longitud de fragmentos de

restricción (RFLP)

A continuación

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 RFLP 1

Tecnologías basadas en el ADNPolimorfismo de longitud de fragmentos de

restricción




Contenido

f Tecnología RFLP• Aislamiento del ADN• Digestión de restricción y electroforesis• Transferencia del ADN por el método Southern• Hibridación del ADN• Equipo

f Tecnología RFLP en imágenesf Interpretación de las bandas RFLPf Ventajas y desventajas de los RFLPf Ejemplos de aplicaciones

• Maíz• Trigo• Pino escocés


Tecnología RFLP

f Aislamiento del ADNf Digestión y electroforesisf Transferencia del ADN por el método Southernf Hibridación del ADN

• Procedimiento• Sonda de ADN• Fuentes de sondas

f Equipo

La detección del RFLP se basa en la posibilidadde comparar patrones de bandas generados mediante la digestión con enzimas de restriccióndel ADN patrón. Las etapas de laboratorio son:

El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fue una de las primeras técnicas que se usó ampliamente para detectar variaciones a nivel de la secuencia del ADN. Esta tecnología se basa en el principio de que es posible comparar patrones de bandas generados a partir de moléculas de ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestión con enzimas de restricción. Las diversas mutaciones que afectan a las moléculas de ADN de muchas maneras producen fragmentos de longitud variable. Estas diferencias de longitud de los fragmentos pueden observarse una vez realizadas la electroforesis, la hibridación y la visualización.


Aislamiento del ADN

f Se extrae ADN total de las células de la planta

f Alternativamente, puede usarse el ADN cloroplástico y el mitocondrial

f El ADN debe estar limpio y debe tener elevado peso molecular

f Complicaciones:• Rotura durante el aislamiento• ADN degradado por las nucleasas• Polisacáridos aislados junto con el ADN• Aislamiento de metabolitos secundarios

El aislamiento del ADN es el primer paso en las tecnologías moleculares. El ADN seencuentra tanto en los cromosomas nucleares como en los organelos (mitocondrias ycloroplastos). Para extraer el ADN del sitio en que se halla, son necesarios varios pasosde laboratorio para romper la pared celular y la membrana nuclear, y separar apropiadamente el ADN de otros componentes celulares. Mientras se hace esto, hayque asegurarse cuidadosamente de que el proceso no dañe la molécula de ADN y deque ésta se recupere en forma de una hebra larga.


Digestión de restricción y electroforesis

+ -

-

+Es necesaria la hibridación para detectar fragmentos específicos

El ADN extraído es digerido con enzimas de restricción específicos, cuidadosamente elegidos. Cada enzima de restricción, en condiciones apropiadas, reconocerá el ADN y lo cortará de manera predecible, dando lugar a un conjunto reproducible de fragmentos de ADN (‘fragmentos de restricción') de diferentes longitudes.

Los millones de fragmentos de restricción así obtenidos son separados comúnmente mediante electroforesis en geles de agarosa. Dado que los fragmentos se verían como un rastro continuo si el gel se tiñera con bromuro de etidio, la sola tinción no puede detectar los polimorfismos. Por consiguiente, debe recurrirse a la hibridación para detectar fragmentos específicos.


Transferencia del ADN por el métodoSouthern

Peso

Membrana

Gel

La transferencia del ADN se realiza por el método Southern, nombre tomado de E.M. Southern (1975), quién inventó la técnica. En este método, primero se desnaturaliza el gel en una solución básica y se pone en una bandeja. Se coloca sobre el gel una membrana porosa de nylon o de nitrocelulosa y al conjunto se le superpone un peso. Todos los fragmentos de restricción de ADN que estaban en el gel se transfieren, como cadenas simples a la membrana por acción capilar. Todos los fragmentos conservan en la membrana el mismo patrón que tenían en el gel.

Referencia

Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.


Hibridación del ADN: El procedimiento


ADN adherido a la membrana

Película expuestaa rayos XSe descarta el

sobrante de sonda

Hibridadocon la sonda

Sonda hibridada

La membrana con el ADN patrón se incuba con la sonda de ADN. Las condiciones de incubación son tales que si las cadenas de ADN de la membrana son complementarias a las de la sonda, se dará la hibridación y se formarán duplos marcados. En condiciones muy rigurosas, no ocurrirá la hibridación con un ADN que no sea homólogo o no emparentado. De este modo, la sonda reconoce las secuencias complementarias e “idealmente” homólogas entre los miles o millones de fragmentos no detectados quemigran a través del gel.

Los fragmentos deseados se pueden detectar después de que haya una exposición simultánea de la membrana hibridada y una película fotográfica.


Hibridación del ADN: La sonda

-

+

ADN total o ADNc

ADN digerido

Selección de fragmentos de ADN según su tamaño

Fragmento del ADN patrón

El fragmento de ADN se inserta en el vector

Los clones recombinantes se seleccionan y siguen creciendo

Vector extraído de bacterias y abierto

El vector recombinante se introduce en las bacterias y se clona

Los clones se dejan crecer en una placa

Para detectar el subconjunto de fragmentos de ADN que interesan, de entre todos los fragmentos generados por la digestión con restricción, se necesita una sonda. La sonda de ADN generalmente proviene de una genoteca de ADN (ADN genómico o complementario), que es una colección de vectores (por ejemplo plásmidos) que contiene una representación de una molécula de ADN original cortada en pedazos. Los vectores se pueden transformar en bacterias y pueden multiplicar muchas veces el pedazo de ADN que contienen.

La sonda de ADN también se convierte en una molécula de cadena simple, se marca convenientemente usando cualquier método estándar (por ejemplo un radioisótopo o digoxigenina), y se hibrida con el ADN patrón que está adherido a la membrana.


Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (1)

f ADN nuclear:• Genotecas genómicas• ADNc

f ADN citoplasmático

f La especificidad de muchas sondas de copia única requiere que se construyan genotecas cuando se estudian nuevas especies. Sin embargo, a menudo pueden usarse sondas de géneros emparentados

Entre las fuentes de sondas de ADN están las siguientes:

• Genotecas genómicas: en ellas el ADN total de la planta se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos individuales se clonan en un vector que puede ser un plásmido de una bacteria o un virus. Se seleccionan sondas apropiadas de esta genoteca ‘anónima’ para el análisis de RFLP.

• Genotecas de ADNc (ADN complementario): el RNAm se aísla y se transcribe en ADN, usando el enzima transcriptasa reversa. El ADNc obtenido se clona en vectores y se usa como genoteca para sondas en el análisis de RFLP.

• ADN citoplasmático: genotecas de ADN mitocondrial y cloroplástico.

Como resultado de la especificidad mostrada por muchas sondas de copia única, amenudo deben construirse genotecas genómicas o de ADNc para estudios sobre especies nuevas. Este trabajo puede requerir mucho tiempo. Sin embargo, elconocimiento actual acerca de secuencias y genes comunes permite usar con frecuencia sondas de géneros emparentados.


Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (2)

Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite:• Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem• Altamente variables entre individuos del género

humano• Polimorfismos en el número de unidades repetidas

(también llamados VNTR)

En las plantas, para detectar secuenciasminisatélite se han usado sondas provenientes de una repetición interna del gen de la proteína III del bacteriófago M13

Las secuencias repetitivas de tipo minisatélite tienen también su aplicación específica en el análisis de RFLP. Son repeticiones de secuencias de un ‘motivo’ básico. Miden de 10 a 60 pb, se encuentran en tándem (es decir, en unión de cabeza con cola) y se dan en muchos loci del genoma.

El trabajo con marcadores minisatélite de plantas fue el resultado de estudios pioneros sobre el genoma humano hechos por Jeffreys y col. (1985a, b), en los que se demostró que los marcadores minisatélite eran sumamente variables en los seres humanos. Dado que lospolimorfismos están relacionados con el número de unidades repetidas, las secuencias también se han llamado número variable de repeticiones en tándem (VNTR; Nakamura et al. 1987). Una sonda seleccionada adecuadamente puede detectar fragmentos de restricción que representan un gran número de loci. En la película, los patrones de fragmentos de restricción que contienen minisatélites (la denominada ‘huella identificadora’ del ADN) permiten discriminar claramente entre diferentes individuos.

Referencias

Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions inhuman DNA. Nature 314:67-73.

Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of humanDNA. Nature 316:76-79.

Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E.Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin y R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622.

Rogstad, S.H., J.C. Patton, II y B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNAminisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9176-9178.

Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov y S.A. Limborska. 1988. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392.


Equipo

f Equipo:• Refrigerador y congelador• Campana extractora de

flujo laminar• Centrífuga• Fuente de energía

eléctrica• Hornillo o microondas

• Medidor de pH• Balanza estándar• Unidades de

electroforesis• Cuarto oscuro• Transiluminador

ultravioleta



Tecnología RFLP en imágenes

Las siguientes diapositivas ilustran los pasos delprocedimiento para detectar RFLP


Después de que la agarosa se haya vertido en el molde del gel, se insertan de inmediato los peines para formar los pocillos y se dejan allí hasta que endurezca el gel. Luego se retiran los peines y el gel se coloca en una cubeta de electroforesis.


Las muestras del ADN digerido, a las que se añadió colorante de azul de bromofenol, se descargan en los pocillos con una pipeta.


Después de la electroforesis, el gel se trata con NaCl para romper los enlaces de la doble hélice del ADN y convertirlo en cadenas simples. Esto permite lograr luego la hibridación con una sonda de ADN de cadena simple.


Primero se prepara la bandeja para hacer la transferencia saturando las esponjas con NaOH. Se requieren gafas de seguridad y guantes y se recomienda el uso de una bata de laboratorio. Deben seguirse los reglamentos de seguridad de la institución donde se trabaja.


Se coloca papel absorbente encima de las esponjas para impedir el contacto directo con el gel.


Se quitan las burbujas entre el papel absorbente y las esponjas haciendo rodar una pipeta o una varilla de vidrio por encima del papel. Esta operación asegura una transferencia completa de la solución a través del gel.


Los espacios libres entre las esponjas y la bandeja se cubren con tiras plásticas para prevenir la evaporación, porque ésta reduciría la eficiencia de la transferencia.


El gel de agarosa tratado se coloca encima del papel absorbente.


Se hacen salir las burbujas que haya entre el gel y el papel oprimiendo contra éste una varilla de vidrio mientras se la hace rodar.


La membrana se corta según el tamaño apropiado.


Se coloca la membrana encima del gel, y luego se cubre con una hoja de papel absorbente.


Se coloca un bloque de papel poroso (p.e., toallitas de papel o papel periódico) encima del papel absorbente que protege la membrana.


Sobre todo este conjunto se coloca un peso (en la foto, una botella de agua que descansa en una lámina de vidrio) para promover una buena transferencia. Después de unas horas, la transferencia se ha completado; se quita entonces el papel secante y la membrana se almacena hasta el momento de la hibridación con la sonda.


Empieza el proceso de la hibridación. Un ADN denominado bloqueador (porque minimiza la hibridación de fondo que se realiza con la membrana) se hierve para desnaturalizarlo a cadenas simples.


La membrana se coloca en un recipiente plástico junto con la solución de hibridación apropiada y el ADN bloqueador y preincubado.


Se añade la sonda marcada al recipiente que contiene la solución de hibridación y la membrana, y se incuba el conjunto toda la noche en un horno. Al día siguiente se saca la membrana del recipiente de hibridación y se lava con la solución restringente apropiada.

(Nota: Las medidas de seguridad varían según las instituciones; por favor, revise las de la institución en que usted trabaja)


Se seca la membrana con papel absorbente y se mete en una carpeta como las que contienen películas de rayos X.


Pasando a un cuarto oscuro, se inserta también en la carpeta una película de rayos X.


La carpeta se envuelve, o se sella con cinta adhesiva, y se almacena en un congelador hasta que la película haya estado expuesta suficiente tiempo, generalmente de 1 a4 días.


La foto muestra un autorradiograma de RFLP.


RFLP en imágenes: Resumen

Electroforesis Hibridación

A

B

A B

Digestión

Transferencia

Mutación = un nuevo sitio de restricción

SondaSitio de restricción


Interpretación de las bandas RFLP (1)

Una mutación crea un nuevo sitio de restricción dentro de la región de interés. Por consiguiente, se detectan dos bandas más pequeñas en la película

B

A BA

Nuevo sitio de restricción

Sonda

Sitio de restricción

El resultado ideal de la tecnología de RFLP es una serie de bandas en un gel, que pueden calificarse ahora ya sea por su presencia o por su ausencia, o como marcadores codominantes. Las diferencias entre genotipos se visualizan generalmente como un patrón variado de fragmentos de restricción de ADN.

En ésta y en las siguientes diapositivas se presentan los diferentes casos de mutación que son responsables de los polimorfismos detectados mediante el análisis de RFLP.

En el diagrama anterior, una mutación crea un sitio de restricción nuevo en el segmento A, precisamente en el sitio de reconocimiento de la sonda. En consecuencia, la sonda hibridará simultáneamente con los dos segmentos creados por el enzima. En el segmento B no ha habido mutación, y sólo un segmento hibridará con la sonda. Durante la electroforesis, los dos segmentos de A migrarán más lejos en el gel que el segmento hibridado en B y el polimorfismo como tal se observará en el gel del modo indicado en el cuadrado a la derecha de la imagen.



Una mutación crea un nuevo sitio de restricción entre sitios de restricción contiguos, creando un fragmento de restricción más corto

B

A BA

Nuevo sitio de restricción

Sonda


En este caso una mutación crea un nuevo sitio de restricción en el segmento A. Sin embargo, el nuevo sitio aparece a un lado del lugar de reconocimiento de la sonda. En consecuencia, sólo un fragmento hibridará en el segmento A y sólo uno en el segmento B. El polimorfismo se mostrará como un fragmento hibridado en A que es más corto que el hibridado en B. El fragmento más corto, a su vez, migrará más lejos en el gel (ver el cuadrado, a la derecha).



Una inserción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más largo

B

A BA

Inserción ocurrida

Sonda


Si tiene lugar un caso de inserción entre dos sitios de restricción (segmento A), el fragmento hibridado será más largo. Como resultado, se observará un polimorfismo entre los individuos A y B, en el sentido de que el fragmento hibridado en A será más largo que el hibridado en B y su distancia de migración más corta (ver cuadrado, a la derecha).



Una deleción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más corto

B

A BA

Deleción ocurrida

Sonda


Si ocurre una deleción entre sitios de restricción adyacentes, la sonda hibridará con un segmento más corto. Esta acción se observará en el gel como un polimorfismo con un fragmento que migró más lejos para el individuo A (ver cuadrado, a la derecha).



Uno de los sitios de restricción adyacentes cambia o se pierde a causa de una mutación o una deleción. En consecuencia, el fragmento de restricción se altera

B

A BA

Sonda

Sitio de restricciónSitio perdido

Si queda sólo un sitio de restricción, no se genera ningún fragmento de restricción, y no habrá hibridación. Si el cambio generó un sitio nuevo, el nuevo fragmento hibridará y mostrará un patrón de bandas diferente que el de un individuo en que no se produjo un cambio.


f Metodología sumamente sólida y muy transferible entre laboratorios

f Se heredan en forma codominante y, como tales, pueden estimar heterocigosidad

f No se requiere información acerca de la secuencia del ADNf Muy recomendables para el análisis filogenético de especies

emparentadas porque se basan en la homología de las secuencias

f Adecuado para construir mapas de ligamiento genéticof Marcadores específicos del locus que permiten hacer estudios

de sinteniaf Poder discriminatorio: tanto a nivel de especie o de población

(sondas de copia única) como a nivel de individuo (sondas de copia múltiple)

f Simplicidad: si se dispone de sondas adecuadas, la técnica puede aplicarse fácilmente a cualquier planta

Ventajas de los RFLP


f Requieren cantidades grandes de ADN f No permiten la automatización f Bajos niveles de polimorfismo en algunas especiesf Pocos loci detectados por ensayof Necesitan disponer de una genoteca de sondas

apropiadas f Lentos, especialmente con sondas de copia únicaf Costososf Requieren la distribución de sondas a los laboratorios

colaboradores f Tienen exigencias técnicas moderadasf Pueden necesitar diferentes combinaciones de

sonda/enzima

Desventajas de los RFLP


f Diversidad genéticaf Relaciones genéticasf Historia de la domesticaciónf Origen y evolución de las especiesf Deriva genética y selecciónf Cartografía de genomas y de tipo comparativo f Localización de genes f Descubrimiento de genes valiosos de especies

silvestresf Construcción de genotecas exóticas


Ahn, S. y S.D. Tanksley. 1993. Comparative linkage maps of the rice and maize genomes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 90(17):7980-7984.

Autrique, E., R.P. Singh, S.D. Tanksley y M.E. Sorrells. 1995. Molecular markers for four leaf rust resistance genes introgressed into wheat from wild relatives. Genome 38(1):75-83.

de Vicente, M.C. y S.D. Tanksley. 1993. QTL analysis of transgressive segregation in an interspecific tomato cross. Genetics 134(2):585-596.

de Vicente, M.C., M.J. Truco, J. Truco, J. Egea, L. Burgos y P. Arús. 1998. RFLP variability in apricot (Prunus armeniaca L.). Plant Breed. 117:153-158.

Dubreuil, P. y A. Charcosset. 1999. Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 99:473-480.

Enjalbert, J., I. Goldringer, S. Paillard y P. Brabant. 1999. Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Expl Bot. 50(332):283-290.

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Tanksley, S.D., M.W. Ganal, J.P. Prince, M.C. de Vicente, M.W. Bonierbale, P. Broun, T.M. Fulton, J.J. Giovannoni, S. Grandillo, G.B. Martin, R. Messeguer, J.C. Miller, L. Miller, A.H. Paterson, O. Pineda, M.S. Röder, R.A. Wing, W. Wu y N.D. Young. 1992. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132:1141-1160.

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Zamir, D. 2001. Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Genetics 2:983-989.

En las siguientes diapositivas se tratarán en detalle las referencias impresas en color púrpura.


Ejemplo: Maíz

f Título:Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:473-480

f Objetivo:Estudiar las relaciones genéticas entre líneas puras de grupos heteróticos conocidos y razas locales de granimportancia histórica en el desarrollo del material élite

f Materiales y métodos:Se analizaron 62 líneas puras de grupos heteróticosconocidos y 10 poblaciones de maíz (cerca de 30 individuos por población) respecto a 28 loci de RFLP (29 combinaciones diferentes de sonda/enzima)



Ejemplo: Maíz (continuación)

Resultados:La comparación de alelos específicos de cada tipo de germoplasma mostró un déficit de alelos dentro de las líneas, que representaba cerca del 22% de la riqueza alélica total de las poblaciones:

• Las asociaciones entre líneas puras y poblaciones resultaron compatibles con los datos genealógicos de las líneas puras y aportaron nueva información sobre la base genética de los grupos heteróticos

• Las líneas puras europeas mostraron ser tan cercanas a la población estudiada del nordeste de Estados Unidos como a las típicas poblacioneseuropeas



Ejemplo: Maíz (continuación)

f Discusión:Las poblaciones representan reservorios importantes de diversidad, y no es probable que el germoplasma selectocontenga todos los alelos útilesPregunta: ¿Cómo puede el grupo heterótico europeo estar más cerca de las poblaciones del nordeste de Estados Unidos de tipo 'Compton's Early' que de las demás poblaciones de los Estados Unidos?

f Conclusiones:Los resultados indican que debería estudiarse un conjunto más grande de poblaciones empleandomarcadores moleculares, con el fin de diseñarestrategias apropiadas para que se usen con la máximaefectividad estos recursos genéticos en los programasde fitomejoramiento


Ejemplo: Trigo

f Título:Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Expl. Bot. 1999. 50(332):283-290

f Objetivo:Comparar las frecuencias alélicas de poblaciones de trigo que han estado sometidas a selección natural

f Materiales y métodos:Se estudiaron respecto a 30 loci dos poblacionesoriginales y seis subpoblaciones derivadas, que se cultivaron durante 10 años en lugares contrastantes



Ejemplo: Trigo (continuación)

f Resultados y discusión:La diferenciación entre subpoblaciones basada en la diversidad de RFLP fue muy significativa:• Se encontró que la variación de frecuencias alélicas era

mucho mayor que la esperada considerando la deriva genética solamente. La selección influyó mucho en la evolución de las poblaciones

• Algunos loci mostraron mayor diferenciación que otros. Esto puede haber indicado que estaban genéticamente ligados a otros loci polimórficos relacionados con la adaptación

f Conclusiones:Las variaciones de frecuencias alélicas observadas respecto a los marcadores RFLP no pueden explicarse por la evolución bajo deriva genética solamente, sino también por efectos directos o indirectos de la selección


Ejemplo: Pino escocés

f Título:The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestrisL.) in Western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 1999. 8:83-88

f Objetivo:Investigar la estructura geográfica de las variantes del ADN mitocondrial en poblaciones de pino escocés del oeste de Europa

f Materiales y métodos:Se estudiaron 20 poblaciones de P. sylvestris de Escocia y 18 de Europa continental (21 individuos por población, en promedio), empleando el análisis RFLP de ADN total



Ejemplo: Pino escocés (continuación)

f Resultados:Se detectaron tres patrones principales de RFLP parael ADNmt (mitotipos a, b y d):• En España se encontraron los tres mitotipos. La diversidad

génica fue alta y se distribuyó predominantemente entre las poblaciones más que dentro de ellas. El mitotipo d sólo estuvo presente en la población más sureña (Sierra Nevada, España)

• Las poblaciones italianas estaban fijadas para el mitotipo b. Las poblaciones del norte de Francia, de Alemania, de Polonia, de Rusia y del sur de Suecia estaban fijadas para el mitotipo a. Las poblaciones del norte de Fennoscandia(Noruega, Suecia y Finlandia) estaban fijadas para el mitotipo b

• En Escocia, el mitotipo a se hallaba, en su mayoría, fijado. El mitotipo b estaba presente en algunas poblaciones polimórficas



Ejemplo: Pino escocés (continuación)

f Discusión:• La detección de diferentes mitotipos fue una prueba

inequívoca de las diferencias genéticas existentes en el genoma de las mitocondrias. La diversidad de mitotipos en las poblaciones españolas indica que o bien descienden de los que sobrevivieron en refugios durante la última glaciación o representan reliquias del Terciario que han sobrevivido como poblaciones aisladas

• En Europa, después de la era glacial, P. sylvestris inició, aparentemente, su progresión en tres direccionesevolutivas, por lo menos, cada una de origen diferente: España, Norte de centro Europa y Norte de Fennoscandia

f Conclusiones: Estudios de marcadores de ADNmt heredados por vía maternapueden arrojar luz sobre la historia de las especies y ayudar a definir zonas geográficas en las que hay germoplasma quedebería conservarse


f La tecnología RFLP detecta cambios en longitud en las moléculas de ADN después de ser sometidas a digestión con enzimas de restricción

f Las bandas del RFLP se detectan cuando el ADN de interés hibrida con una sonda de ADN

f Los patrones de bandas RFLP reflejan diferentes casos de mutación en el sitio de hibridación de la sonda o en la región contigua a ella

f RFLP es una tecnología sumamente sólida, pero es lenta y técnicamente exigente

En resumen


f Los pasos principales que comprende la detección de los RFLP

f Las distintas fuentes de sondas

f El efecto de los diferentes casos de mutación en la detección de los patrones de bandas RFLP

f Las ventajas y desventajas de la tecnologíaRFLP para el análisis de la diversidad genética


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A continuación


• PCR con cebadores arbitrarios• Polimorfismo de longitud de fragmentos

amplificados (AFLP)• Sitios de secuencia etiquetada (STS)• Últimas estrategias

f Tecnologías complementariasf Consideraciones finalesf Glosario

Tecnologías basadas en el ADNTecnologías basadas en la PCR

Fundamentos de la PCR

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 PCR 1

Tecnologías basadas en la PCRFundamentos de la PCR

Tecnologías basadas en el ADN




Contenido

f La reacción en cadena de la polimerasa

f Procedimientos de la PCR:• Etapas• Ciclo 1• Ciclo 2• Ciclo 3• Condiciones de los ciclos• Condiciones para la mezcla de la reacción• Componentes• Equipo

f Tecnología de la PCR en imágenes


La reacción en cadena de la polimerasa

La PCR es un método rápido, de bajo costo y sencillo para copiar fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas de ADN original

• Comprende la preparación de la muestra del ADN y de una mezcla maestra de cebadores, y luego la detección de los productos de reacción

• La detección no requiere necesariamente el uso de radioisótopos o de productos químicos tóxicos

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Erlich, 1989) es una técnica potente que se ha convertido rápidamente en una de las más ampliamente usadas en la biología molecular porque es rápida, de bajo costo y sencilla. La técnica amplifica fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas del ADN patrón, aun cuando ese ADN sea de calidad relativamente baja.

Referencia

Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications. Stockton Press, NY, E.U.


f Desnaturalización: La reacción se calienta a altas temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los cebadores

f Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias complementarias

f Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena complementaria. El enzima lee la secuencia de la cadena opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite una y otra vez

Procedimientos de la PCR: Etapas

El ADN polimerasa, conocido como ‘Taq polymerasa’, se denominó así por la bacteria Thermus aquaticus que fue aislada originalmente de aguas termales. El enzima puede resistir las altas temperaturas necesarias para la separación de las cadenas del ADN, permaneciendo en el tubo de la reacción.

El ciclo de calentamiento y enfriamiento se repite una y otra vez, lo que estimula a los cebadores a unirse a las secuencias originales y a las secuencias recién sintetizadas. El enzima volverá a alargar las secuencias del cebador. Este ciclo de temperaturas produce copias y luego copias de copias, y así sucesivamente, lo que lleva a un aumento exponencial del número de copias de determinadas secuencias. Dado que la cantidad de ADN colocado en el tubo al comienzo es muy pequeña, casi todo el ADN presente al final de los ciclos de reacción pertenece a secuencias copiadas.

Los productos de la reacción se separan mediante electroforesis. Según la cantidad producida y el tamaño del fragmento amplificado, los productos de reacción se pueden visualizar directamente tiñendo con bromuro de etidio o con tinción de plata, o mediante radioisótopos y autorradiografía.


Procedimientos de la PCR: Ciclo 1


{

{

Desnaturalización

Hibridación

Extensión

3’

5’

3’

Cebador 1Cebador 25’

3’5’

3’5’

5’

3’

5’

3’

5’3’

5’3’

Sitio de reconocimientodel cebador

Sitio de reconocimientodel cebador

ADN patrón de doble cadena

Las etapas de la PCR se llevan a cabo, una tras otra, en episodios cíclicos. El ciclo 1 es como sigue:

• Durante la desnaturalización (cerca de 1 min a 95°C), las cadenas del ADN se separan para formar cadenas sencillas.

• Durante la hibridación (cerca de 1 min a temperaturas que oscilan entre 45°C y 60°C), un cebador se une a una cadena de ADN y otro se une a la cadena complementaria. Los sitios de hibridación de los cebadores se han elegido para que fomenten la síntesis del ADN en la región de interés durante la extensión.

• Durante la extensión (cerca de 1 min a 72°C), la síntesis del ADN se lleva a cabo en la región de interés y con distancias variables en la región flanqueante, produciendo fragmentos de longitudes variables.




3’5’

3’

ADN original

5’

5’3’5’3’

Desnaturalización

Hibridación

Extensión

ADN recientemente sintetizado

ADN patrónen el 2o ciclo

3’5’

5’3’

3’5’3’5’

3’5’3’5’

3’5’3’5’

3’

5’

3’

5’

5’3’5’3’

5’3’5’3’

5’

3’

5’

3’

Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad dos tipos de patrón: (1) las cadenas del ADN original; y (2) las cadenas del ADN recién sintetizadas, que constan de la región de interés y de fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el extremo 3’. Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de interés.




Desnaturalización

Hibridación

Extensión

ADN patrónen el 3er ciclo

Y así sucesivamente

En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir, sin regiones flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía presente y lo estará hasta el final de la reacción. Sin embargo, después de unos pocos ciclos, el fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente como el patrón predominante.

Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces. La normalización de las condiciones de funcionamiento del termociclador es esencial para poder reproducir los resultados.


f Desnaturalización completa del patrón de ADN

f Temperatura óptima para la hibridación

f Temperatura óptima para la extensión

f Número de ciclos de la PCR

f Etapa final de extensión

Procedimientos de la PCR: Condiciones de los ciclos

En la etapa inicial de desnaturalización, es esencial que se desnaturalice completamente el patrón de ADN. La desnaturalización incompleta del ADN dará como resultado el uso ineficiente del patrón en el primer ciclo de amplificación y, en consecuencia, en un escaso rendimiento del producto de la PCR.

La temperatura de hibridación se calcula en 5°C por debajo de la temperatura de fusión del duplo cebador-patrón de ADN. Si se obtienen productos de la PCR no específicos, además del producto esperado, la temperatura de hibridación se puede optimizar aumentándola por incrementos de 1 a 2°C.

La etapa de extensión se realiza, generalmente, a 72°C y una extensión de 1 min es suficiente para sintetizar fragmentos de PCR de hasta 2 kb (kb = kilobase = 1000 pb). Cuando se amplifican fragmentos de ADN más grandes, el tiempo generalmente se extiende a razón de 1 min por cada 1000 pb.

El número de ciclos de la PCR dependerá, básicamente, del rendimiento esperado del producto de la PCR.

Después del último ciclo, las muestras suelen incubarse a 72°C durante 5 min para completar los extremos que sobresalen de los productos de la PCR recién sintetizados.


f Separando las zonas de extracción del ADN y de la PCR

f Empleando equipo de laboratorio dedicado a un solo uso

f Esterilizando en autoclave y haciendo alícuotas

f Añadiendo una reacción testigo

Hay que evitar la contaminación del ADN con las siguientes medidas:

Procedimientos de la PCR: Condiciones de la mezcla de reacción

Algunos consejos útiles:

• La extracción del ADN y la preparación y el procesamiento de la mezcla de reacción de la PCR deben hacerse en zonas separadas.

• Se recomienda emplear recipientes dedicados a un solo uso, pipetas de desplazamiento positivo y puntas de pipeta diferentes para cada muestra de ADN y para cada preparación de mezcla.

• Todas las soluciones, excepto la de los dNTP, de los cebadores y de la Taqpolimerasa, deben esterilizarse en autoclave. Cuando sea posible, las soluciones deben repartirse en cantidades pequeñas y almacenarse en zonas designadas para la PCR.

• Una buena práctica, para confirmar la ausencia de contaminación, es añadir una reacción testigo sin el ADN patrón.


Procedimientos de la PCR: Componentes

Componentes:• Agua desionizada estéril• Solución tampón de PCR

10X • Mezcla de dNTP• Cebador• Taq polimerasa• MgCl2• ADN patrón

Consideraciones:• ADN patrón• Cebadores• Concentración de

MgCl2• Taq polimerasa• dNTP

Actualmente hay muchas máquinas de PCR disponibles en formatos de 48, 96 ó 384 pocillos. Esta opción, combinada con el uso de pipetas multicanal, puede aumentar enormemente el número de reacciones que se pueden hacer simultáneamente. Para preparar varias reacciones a la vez, se debe hacer una mezcla maestra que contenga lo siguiente: agua, solución tampón, dNTP, cebadores, MgCl2 y Taq polimerasa, en un solo tubo. Luego se repartirán alícuotas en los tubos individuales.

Consideraciones:

ADN patrón. Casi todos los métodos estándar de extracción de ADN son apropiados. La cantidad adecuada está entre 0.1 y 1 µg de ADN genómico, para una mezcla total de reacción de 100 µl. Cantidades más grandes de ADN patrón elevan, generalmente, el rendimiento de productos de la PCR no específicos.

Cebadores. (1) Los cebadores de la PCR deben tener entre 10 y 24 nucleótidos de longitud. (2) El contenido de GC debe estar entre 40% y 60%. (3) El cebador no debe ser auto-complementario o complementario de otro cebador en la mezcla de reacción, para evitar así la formación de dímeros de cebadores u horquillas. (4) Las temperaturas de fusión de los pares de cebadores no deben diferir en más de 5°C, de modo que tanto el contenido de GC como la longitud se deben elegir adecuadamente. (5) Las temperaturas de fusión y de hibridación de un cebador se calculan así: si la longitud del cebador es menor que 25 nucleótidos, el valor de la temperatura de fusión se calcula con la fórmula: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). (6) La temperatura de hibridación debe ser, aproximadamente, 5°C inferior que la temperatura de fusión.

Concentración de MgCl2. Puesto que los iones Mg++ forman complejos con los dNTP, con los cebadores y los patrones de ADN, hay que establecer la concentración óptima de MgCl2 para cada experimento. Si los iones Mg++ son demasiado escasos, se obtiene un bajo rendimiento del producto de la PCR y si son demasiado abundantes, aumentará el rendimiento de productos no específicos. El intervalo recomendado de concentración de MgCl2 es de 1 a 3 mM, en las condiciones de reacción estándar especificadas.

Taq polimerasa. Si las concentraciones de Taq polimerasa son mayores que las requeridas pueden sintetizarse productos no específicos.

dNTP. La concentración de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en la mezcla de reacción es, generalmente, de 200 µM. Se debe comprobar que estas concentraciones sean iguales, porque una inexactitud aumentará el grado de incorporación errónea.


f Micropipetas

f Termociclador

f Unidades de electroforesis

f Fuente de energía eléctrica

f Equipo fotográfico

Procedimientos de la PCR: Equipo


Tecnología de la PCR en imágenes

Las siguientes fotografías muestran la forma en que se lleva a cabo la tecnología de la PCR


La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo. No se requiere ropa de seguridad, pero ésta puede beneficiar la reacción a menos que se practiquen buenas técnicas de manejo estéril.


Los tubos de reacción se colocan en el termociclador.


Se cierra el termociclador, se bloquea y se programa.


Hay diferentes tipos de termocicladores: el de color negro es una tétrada, y en él se pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96 pocillos.


Según el tamaño de las bandas que generó la PCR y de la discriminación que se requiera, la visualización de las bandas puede lograrse mediante un gel de agarosacorriente y horizontal, o con un gel de secuenciación vertical de acrilamida (ver la próxima diapositiva). En esta diapositiva, los productos migran en un gel de agarosa.


El gel de acrilamida puede procesarse en una unidad independiente o en un secuenciador automático.

La preparación del gel de secuenciación, aunque es un poco compleja, es similar para ambos casos. En esta diapositiva se limpia el vidrio y se seca antes de preparar el gelque se usará en un secuenciador automático.


Las placas de vidrio se insertan en el marco, que se colocará en el secuenciador.


Las placas de vidrio se sujetan firmemente en su sitio, y se alista toda la unidad para verter en ella el gel.


El gel de acrilamida líquido se vierte en el molde. Puesto que la acrilamida es un carcinógeno, debe usarse ropa de protección.


Las pinzas sujetan los bordes inferiores de las placas de vidrio para impedir que haya fugas de gel.


Se inserta un peine en el extremo superior del gel para formar los pocillos en los que se depositarán las muestras.


Una vez que el gel se solidifica, la unidad se coloca en el aparato secuenciador.


Las muestras son tomadas con una multi-pipeta…


...y se cargan en los pocillos del gel.


Esta diapositiva es una toma de cerca de la fotografía anterior. Observe que los pocillos son de tamaño muy pequeño lo mismo que las puntas de pipeta, lo que permite cargar muchas muestras en cada gel.


Se coloca una placa de calentamiento contra el gel para garantizar una temperatura de funcionamiento constante.


Se vierte la solución tampón en el reservorio superior del gel…


…y en el reservorio inferior.


Se le da un vistazo final, luego se cierra la puerta y empieza el programa.


En resumen

f La PCR es una técnica sencilla para obtener múltiples copias de fragmentos específicos de ADN

f La PCR comprende tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión

f Para que el éxito sea seguro, hay que tener cuidado tanto en preparar bien la mezcla de reacción como en establecer las condiciones óptimas de los ciclos



f El fundamento en que se basa la PCR

f Los elementos que pueden afectar, paso por paso, el desempeño de la PCR, y los efectos que tendrían en sus resultados

Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications. Stockton Press, NY, E.U.

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• Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP)

• Sitios de secuencia etiquetada (STS)• Últimas estrategias



PCR con cebadores arbitrarios

A continuación

enú principal

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 1

Tecnologías basadas en la PCRPCR con cebadores arbitrarios

(RAPD, DAF, AP-PCR)





Contenido

f PCR con cebadores arbitrariosf Tecnología RAPD, paso a paso:

• Aislamiento del ADN• Reacción en cadena de la polimerasa• Detección del producto de RAPD• Diagrama de resumen

f Equipof Interpretación de los patrones de bandas RAPDf Ventajas y desventajas de los RAPDf Ejemplos de aplicaciones

• Festuca pratensis• Pimiento• Rosa

f Diferencias: DAF y las tecnologías de la AP-PCR


PCR con cebadores arbitrarios

MAAP (caracterización con ‘amplicones’ múltiples arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres tecnologías principales que corresponden a esta categoría:

• Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD)• Amplificación de la huella de ADN (DAF)• Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar

(AP-PCR)

Tres técnicas principales se inscriben dentro de la categoría de marcadores basados en la PCR usando cebadores arbitrarios: RAPD, DAF y AP-PCR. MAAP es la sigla propuesta por Caetano-Anollés et al. (1992), aunque no suele usarse, para incluir estas técnicas estrechamente relacionadas. En este submódulo se prestará atención especial a los RAPD y al final se hará una comparación entre los RAPD y las técnicas DAF y AP-PCR.

Referencia

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting:MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10 (9):937.


Tecnología RAPD, paso a paso

f Características principales:• Emplea un cebador aleatorio corto (generalmente,

de 10 bases)• Amplifica trozos anónimos de ADN

f Etapas de laboratorio:• Aislamiento del ADN• PCR con un cebador• Separación de los fragmentos de ADN mediante

electroforesis • Visualización de los fragmentos de ADN con

bromuro de etidio

La técnica para detectar polimorfismo en el ADN amplificado al azar (RAPD) es un método basado en la PCR, en el que se emplea un cebador corto (generalmente, de 10 bases) para amplificar porciones anónimas de ADN. Con esta técnica no se busca ningún fragmento de ADN específico, ya que el cebador se adherirá al ADN patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida. En consecuencia, no se conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. Los fragmentos de ADN asígenerados se separan y se detectan mediante electroforesis.


Aislamiento del ADN

Se puede usar ADN total, cloroplástico o mitocondrial

• Cantidades diminutas de ADN son suficientes• El ADN debe estar limpio y su peso molecular debe

ser elevado

Si no es posible obtener un ADN de calidad mínima, será difícil garantizar la reproducibilidad de los resultados


f Componentes de la PCR

f Los cebadores (10 bases de longitud) se consiguen de diferentes proveedores comerciales

f Es habitual la adición de MgCl2f Los ciclos de hibridación (acoplamiento de los

cebadores al ADN patrón) se realizan a temperaturas bajas (cerca de 40°C)

Reacción en cadena de la polimerasa

Los componentes que necesita la PCR se tratan en el submódulo “Nociones básicas de la PCR”. Aquí sólo se usa un cebador corto (generalmente de 10 pb de longitud). Los cebadores con estas características están comercialmente disponibles de marcas diferentes. A menudo se agrega una concentración de MgCl2 para promover la amplificación de más bandas durante la reacción. Sin embargo, se debe tener cuidado de determinar la concentración apropiada para cada caso, lo que evitará la aparición de productos no específicos.

Entre las condiciones de la PCR está, generalmente, un ciclo de hibridación a baja temperatura (aproximadamente 40°C) que estimulará la hibridación entre el cebador y el ADN y dará lugar a una cantidad suficiente de productos. Además, se debe impedir la aparición de productos no específicos, y esto puede hacerse determinando la temperatura apropiada en que no aparecerán bandas ‘fantasma’.


Electroforesis de geles de agarosa o de acrilamiday visualización con bromuro de etidio

Detección de productos RAPD

Los RAPD pueden detectarse al migrar los productos de la PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida. En ambos casos, el gel se tiñe con bromuro de etidio.

La diferencia entre hacer migrar los productos del RAPD en acrilamida o en agarosa estásolamente en el grado de resolución de las bandas. En la mayoría de los casos, la electroforesis en geles de agarosa proporciona suficiente resolución.


Diagrama de resumen


F

BE

GelECADBF

Molécula de ADN

Cebador

Banda amplificada

C

D

G

A


Equipo


congelador• Campana extractora

de flujo laminar• Centrífuga• Termociclador• Fuente de energía

eléctrica

• Hornillo o microondas• Medidor de pH• Balanza• Unidades de

electroforesis• Transiluminador de luz

ultravioleta



Interpretación de patrones de bandas RAPD (1)

f Ensamblaje frustrado en el sitio del cebador

f Aparición de un nuevo sitio de reconocimiento del cebador

f Longitud de la región amplificada entre los sitios de reconocimiento del cebador

El polimorfismo del ADN en un grupo de individuos puede deberse a:


f Reproducibilidad: es necesario obtener los mismos resultados en experimentos repetidos

f Espesor (de la banda)f Tamañof Observación de la segregación esperada en

una población segregante

A causa de la naturaleza de los marcadores RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la ausencia de una banda. Los criterios para seleccionar bandas que califican son:

Interpretación de patrones de bandas RAPD (2)


Interpretación de patrones de bandas RAPD:Ejemplo de un gel RAPD de mala calidad

Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de mala calidad. Las bandas son borrosas. Las de la parte superior tienen una sombra que comienza en el pocillo donde se cargó el producto de la PCR y muchas se observan con dificultad. El fondo difuso complica la observación: ¿en qué casos hay una banda o hay dos lado a lado? Algunas bandas son claras, sin duda, y podrían tenerse en cuenta, pero otras muchas son dudosas y su interpretación sería sumamente arriesgada. Esas dificultades hacen dudar de la confianza que merecen los datos obtenidos.


Interpretación de patrones de bandas RAPD:Ejemplo de un gel RAPD de buena calidad

Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de buena calidad. Tanto la presencia como la ausencia de la mayoría de las bandas son datos claros y el fondo es transparente. El investigador no tendría dudas al seleccionar las bandas y tomar datos de este gel. En consecuencia, la interpretación de los resultados sería muy fiable.


f Número alto de fragmentos

f Técnica sencilla

f Los cebadores arbitrarios se adquieren fácilmente, y no requieren de información inicial de tipo genético o genómico

f Se requieren cantidades diminutas del ADN patrón

f Los costos unitarios por ensayo son bajos

Ventajas de los RAPDs

Algunos comentarios:

• Normalmente se amplifican muchos fragmentos diferentes (que corresponden a múltiples loci dispersos por todo el genoma) empleando un solo cebador. Por consiguiente, la técnica es rápida para detectar polimorfismos. Aunque la mayoría de los cebadores comerciales dan lugar a varios fragmentos, algunos cebadores pueden fallar en la amplificación de fragmentos de algunos materiales.

• La técnica es sencilla. El análisis de RAPD no requiere la pericia especial con que se maneja la hibridación del ADN a membranas u otras actividades más especializadas.


f De herencia dominante

f Falta de conocimiento previo de la identidad de los productos de la amplificación

f Problemas de reproducibilidad

f Problemas por co-migración

Desventajas de los RAPDs

Los marcadores de RAPD son dominantes. La amplificación ocurre en un locus o no ocurre, lo que exige considerar las bandas partiendo de su presencia o de ausencia. Esto significa que los homocigotos y los heterocigotos no pueden distinguirse. Además, la ausencia de una banda debida a la falta de una secuencia determinada no puede distinguirse de la ausencia debida a la falta de amplificación por otras razones (por ejemplo, porque el ADN era de calidad deficiente), lo que contribuye a la ambigüedad en la interpretación de los resultados.

No se sabe nada acerca de la identidad de los productos de amplificación a menos que los estudios estén apoyados en análisis de herencia.

Los problemas de reproducibilidad provienen de que la tecnología de RAPD es sensible a los cambios en la calidad del ADN, en los componentes de la PCR y en las condiciones de la PCR, todo lo cual ocasiona cambios en los fragmentos amplificados. Se pueden obtener resultados reproducibles si se tiene cuidado de estandarizar las condiciones de los experimentos (Munthali y col., 1992; Lowe y col., 1996).

Los problemas de co-migración motivan preguntas como ésta: “¿Corresponden las bandas de igual tamaño al mismo fragmento de ADN?”

• La presencia de una banda de idéntico peso molecular en diferentes individuos no es, por sí misma, una prueba de que los individuos comparten el mismo fragmento de ADN (fragmento `homólogo`).

• Una banda detectada en un gel como banda sola puede en realidad comprender diferentes productos de amplificación. Esto ocurre porque el tipo de electroforesis usado, aunque es capaz de separar el ADN cuantitativamente (es decir, según el tamaño), no puede separar los fragmentos de igual tamaño cualitativamente (es decir, según la secuencia de las bases).

Referencias

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f Diversidad genéticaf Caracterización de germoplasmaf Estructura genética de poblacionesf Domesticaciónf Detección de variación somaclonalf Identificación de cultivaresf Pureza híbridaf Cartografía genética


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Nebauer, S.G., L. del Castillo-Agudo y J. Segura. 1999. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.). Theor. Appl. Genet. 98:985-994.

Rodríguez, J.M., T. Berke, L. Engle y J. Nienhuis. 1999. Variation among and within Capsicumspecies revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 99:147-156.

Rom, M., M. Bar, A. Rom, M. Pilowsky y D. Gidoni. 1995. Purity control of F1-hybrid tomato cultivars by RAPD markers. Plant Breed. 114(2):188-190.

Las referencias en color púrpura se explican detalladamente en las siguientes diapositivas.


f Título:Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. in permanent grasslands. Mol. Ecol. 1998. 7:1557-1567

f Objetivo:Evaluar la variabilidad genética de Festuca pratensis y determinar si la frecuencia de fertilización y de defoliación afectan la variabilidad genética dentro de las poblaciones naturales

f Materiales y métodos:• Se estudiaron 6 poblaciones naturales y 3 cultivares de

Festuca pratensis mediante 69 marcadores RAPD (13 cebadores) y 7 caracteres agronómicos

• Se tomaron muestras de las poblaciones naturales de dos experimentos de largo plazo no relacionados entre sí, en los que se habían aplicado tratamientos durante períodos que iban de 11 a 38 años

Ejemplo: Festuca pratensis



Resultados: • El análisis factorial de los caracteres agronómicos no

permitió separar los cultivares de las otras poblaciones

• El análisis de agrupamiento con los datos de RAPD señaló una clara distinción entre cultivares y poblaciones naturales

• La variabilidad genética dentro de cultivares fue inferior que dentro de poblaciones naturales

• El análisis de la varianza molecular (AMOVA) mostróun efecto significativo del manejo sobre la variación genética

Ejemplo: Festuca pratensis (continuación)



Ejemplo: Festuca pratensis (continuación)

f Discusión:Existe variación genética significativa dentro de los cultivares y de las poblaciones naturales de Festuca pratensis. Sin embargo, la fertilización y alta frecuencia de corte pueden reducirla

f Conclusiones:Las poblaciones de Festuca pratensis no fertilizadas y raramente cortadas deben conservarse como un acervo genético. Se necesitan estudios adicionales sobre otras especies para aprender más acerca de la forma en que los sistemas de manejo afectan la diversidad de las comunidades vegetales y la arquitectura genética de la especie


f Título:Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:147-156

f Objetivo:Caracterizar el germoplasma de especies de Capsicum

f Materiales y métodos:Se caracterizaron 134 entradas de seis especies de Capsicum, conservadas en el banco de germoplasmadel Asian Vegetable Research and DevelopmentCenter (AVRDC), empleando 110 marcadores RAPD (25 cebadores)

Ejemplo: Pimiento



Resultados y discusión: • Se documentó la existencia de 10 pares de entradas que

podían estar duplicadas • Se identificaron RAPD de diagnóstico que se emplearon

para mejorar la identificación taxonómica. También podrían usarse para verificar la hibridación natural y artificial

• Tres entradas de Capsicum que estaban mal clasificadas según sus caracteres morfológicos, fueron re-identificadas con los RAPD de diagnóstico

• Se asignaron tres entradas, no clasificadas antes, a una especie partiendo de los RAPD de diagnóstico

• Las entradas de Capsicum annuum del banco no fueron diferentes de las líneas del programa de fitomejoramientorespecto a la variación o diversidad indicada por los marcadores RAPD

Ejemplo: Pimiento (continuación)



Conclusiones:El programa de mejoramiento de pimiento del AVRDC trabaja, al parecer, con una diversidad que es representativa de su colección en el banco de germoplasma. Los marcadores moleculares pueden ser útiles para racionalizar el manejo de una colección ex situ (por ejemplo, identifican duplicados o errores taxonómicos)

Ejemplo: Pimiento (continuación)


f Título:The domestication process of the Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:398-404

f Objetivo:Evaluar la variabilidad genética existente entre variedades cultivadas de rosa e investigar la historia de su fitomejoramiento

f Materiales y métodos:Se seleccionaron, de 13 grupos horticulturales, 100 variedades antiguas de rosa cultivada por el modo en que definieron las etapas sucesivas de su domesticación. Se estudiaron mediante AP-PCR con cinco cebadores largos (de 20 bp)

Ejemplo: Rosa



Resultados y discusión: • Se produjeron 58 fragmentos polimórficos de ADN, de

los cuales 55 fueron informativos y discriminatorios, y permitieron diferenciar casi todos los 100 cultivares

• Un dendrograma mostró las relaciones existentes entre las rosas de fundación chinas y europeas, los grupos híbridos de la primera y segunda generaciones, y los híbridos más modernos producidos durante la domesticación

• El análisis de componentes principales demostró la existencia de un gradiente continuo en la proporción entre alelos europeos y alelos chinos, y una considerable reducción de la variabilidad genética en el curso de la domesticación

Ejemplo: Rosa (continuación)



Conclusiones:El efecto de la selección de un rango limitado de caracteres morfológicos resultó en laretención de un bajo número de alelos durante la domesticación de la rosa. La rosa tiene mucha más variación genética de la que se ha usado hasta ahora. Debe estudiarse la posibilidad de seleccionar diversas variantes con nuevos y valiosos caracteres estéticos para desarrollar más variedades

Ejemplo: Rosa (continuación)


Diferencias entre las tecnologías DAF y RAPD

Respecto a la DAF:

f Las concentraciones de cebador son más altas

f Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8 nucleótidos)

f Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD)

f Obtención de combinaciones de bandas sumamente complejas

Referencias

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307.

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.


Diferencias entre las tecnologías AP-PCR y RAPD

Respecto a AP-PCR:

f La amplificación se realiza en tres partes, cada una con sus propios requisitos y concentración de elementos constitutivos

f Se emplean concentraciones altas del cebador en los primeros ciclos de la PCR

f Se eligen arbitrariamente cebadores de longitud variable y diseñados, a veces, para otros fines (por ejemplo, el cebador universal de análisis de secuencias M13)

Referencia

Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.


En resumen

f La tecnología RAPD se basa en una PCR sencilla con un solo cebador arbitrario y corto

f La técnica RAPD produce fácilmente un número notable de bandas, pero sus marcadores son dominantes y son frecuentes los problemas de reproducibilidad

f DAF y AP-PCR son tecnologías alternas respecto a los RAPD, pero más complejas



f Las características principales del procedimiento de RAPD

f Las causas de los polimorfismos de la molécula de ADN que pueden detectarse con RAPD

f Los criterios para la selección de bandas RAPD para análisis de diversidad genética

f Las ventajas y las desventajas de la tecnología RAPD

f Las diferencias principales de la DAF y de la AP-PCR con respecto a la tecnología de RAPD

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307.

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.

Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting: MAAPingout a RAPD redefinition? Bio/Technology 10(9):937.

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman, NY, E.U.

Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54.

Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury. 1992. The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276.

Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.

Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski y V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18(22):6531-6535.

Referencias bá sicas



• Sitios de secuencia etiquetada (STS)• Últimas estrategias



Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP)

A continuación

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 AFLP 1

Tecnologías basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP)





Contenido

f La tecnología AFLP, paso a paso:• Cuatro etapas• Digestión del ADN y ligación • Reacciones de la PCR y su detección• Resumen de la tecnología

f Equipof Interpretación de las bandas AFLPf Ventajas y desventajas de los AFLPf Ejemplos de aplicaciones

• Limonium sp.• Stylosanthes spp.• Mostaza india


La tecnología AFLP*, paso a paso

Características principales:

f Es una combinación de las tecnologías de RFLP y de PCR

f Está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la PCR

f Es un método muy sensible para caracterizar el ADN cualquiera que sea su origen y su complejidad

f Se puede aplicar con ADN genómico total o con ADNc (‘perfiles de transcripción’)

* La técnica de AFLP fue propuesta por KeyGene (Holanda), una empresa privada de biotecnología que adquirió los derechos de propiedad de esa tecnología. Para más información, vea la página web de KeyGene: http:/www.keygene.com

ReferenciaZabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for

DNA fingerprinting. Publicación Europea de Patente 92402629 (Publicación No. EP0534858A1).


f El ADN es digerido con dos enzimas de restricción diferentes

f Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los extremos de los fragmentos de ADN

f Se amplifican subconjuntos específicos de los productos de digestión del ADN empleando combinaciones de cebadores selectivos

f Se detecta el polimorfismo empleando radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción de plata

Cuatro etapas


f Uno de los enzimas de restricción hace cortes frecuentes (su sitio de reconocimiento es de cuatro bases, por ejemplo MseI)

f El segundo enzima de restricción hace cortes infrecuentes (su sitio de reconocimiento es de seis bases, por ejemplo EcoRI)

f Se ligan a los fragmentos de ADN generados adaptadores sintéticos de doble cadena, que son específicos de cada sitio de restricción

Digestión del ADN y ligación

El ADN objeto de estudio se digiere con dos enzimas de restricción diferentes, uno de los cuales hace cortes frecuentes (el enzima de restricción de cuatro bases) y el otro hace cortes poco frecuentes (el enzima de restricción de seis bases). Se pueden usar diversas combinaciones de enzima/cebador. MseI y EcoRI son más apropiados en los genomas ricos en pares adenina-timina (AT), dado que generan menos fragmentos en los genomas ricos en pares guanina-citosina (GC).

Hecho esto, se ligan unos adaptadores sintéticos, específicos de cada sitio de restricción, al ADN digerido. Tanto la etapa de restricción como la etapa de ligación se pueden realizar en una sola reacción.


f Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. Se añade un nucleótido a los cebadores para seleccionar sólo un subconjunto de fragmentos

f Los productos de la amplificación preselectiva se someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos. Generalmente, en la segunda amplificación selectiva se agregan dos nucleótidos más a los cebadores

f La separación de los fragmentos de la reacción se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo desnaturalizante (geles de secuenciación) o electroforesis capilar

Reacciones de la PCR y su detección

Digamos que un nucleótido A se añade a los cebadores preselectivos. En consecuencia, sólo se amplificará el subconjunto de fragmentos de la mezcla en los que la secuencia del sitio de restricción vaya seguida directamente por una A. Los cebadores de amplificación tienen generalmente de 17 a 21 nucleótidos de longitud y se acoplan perfectamente a sus secuencias complementarias.

Luego se lleva a cabo una segunda amplificación, empleando cebadores similares a los de la primera reacción pero con dos bases adicionales (por ejemplo CA). Así, sólo un subconjunto de la primera reacción de amplificación experimentará amplificación durante la segunda ronda de PCR, es decir, aquellos fragmentos en los que la secuencia CA vaya a continuación en la secuencia del sitio de restricción.

El subconjunto de fragmentos obtenidos se analiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes para generar una huella identificadora. Las bandas de ADN pueden detectarse empleando diversos procedimientos.

Si se usan cebadores fluorescentes, éstos tienen la ventaja de que se pueden cargar en conjuntos de tres en el mismo carril del gel, cada uno marcado con diferente color, de modo que se maximiza el número de datos recogidos por gel (Zhao et al,. 2000). Una segunda ventaja de estos cebadores, al igual que la detección con nitrato de plata, es la de evitar el uso de radioisótopos.

ReferenciaZhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa y J.W.

Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semiautomatedfluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.


Resumen de la tecnología*

ADN genómico

Perfil de AFLP

Digestión con 2 enzimas de restricción

Empalme de los adaptadores

Preamplificación:Cebadores = adaptadores + 1 base

Amplificación selectiva:Cebadores = adaptadores + 1 base + 2 bases

* Adaptado del sitio web de KeyGene: http:/www.keygene.com


Equipo




eléctrica

• Hornillo o microondas• Medidor de pH• Balanza estándar• Unidades de

electroforesis vertical• Transiluminador para luz

ultravioleta• Secuenciador automático



Interpretación de las bandas de AFLP

f Se pueden usar diferentes enzimas de restricción. Distintas combinaciones de nucleótidos preselectivos y selectivos aumentarán la probabilidad de encontrar polimorfismos útiles

f A mayor número de bases selectivas, menor detección de polimorfismo

f Las bandas se registran, generalmente, como presentes o ausentes

f En función del espesor de la banda, se pueden detectar bandas heterocigóticas y homocigóticas, aunque no siempre los resultados son confiables

La técnica AFLP detecta polimorfismos generados por cambios (de presencia o tamaño) en los sitios de restricción o en los adyacentes a éstos

La base molecular de los polimorfismos de AFLP generalmente se origina en los nucleótidos. Se detectan cambios de un solo nucleótido cuando: (1) se afectan los propios sitios de restricción; y (2) se afectan los nucleótidos adyacentes a los sitios de restricción, lo que hará que los cebadores hibriden erróneamente en el extremo 3’impidiendo la amplificación.

La mayoría de los marcadores de AFLP son de tipo mono-alélico, lo que significa que sólo se podrá registrar un alelo porque su alelo complementario no se detecta. Aunque es poco frecuente, se pueden identificar marcadores bi-alélicos como resultado de pequeñas inserciones o deleciones en los fragmentos de restricción.


Un gel de AFLP procesado con cebadores fluorescentes

Esta imagen muestra un gel de AFLP obtenido en un secuenciador automático. Antes de cargar el gel, las muestras se marcaron con uno de tres colorantes fluorescentes (amarillo, azul o verde). El rojo marca una muestra testigo que se incluyó con las demás como comprobante del comportamiento de la electroforesis. La evaluación directa de la presencia o ausencia de bandas específicas es casi imposible debido al elevado número de bandas que normalmente se generan en el procedimiento de AFLP, y porque los colorantes fluorescentes no pueden distinguirse a simple vista. Las bandas pueden identificarse con un rayo láser, y los datos se recopilan con ayuda de programas informáticos especializados.


AFLP detectados con tinción de plata

Esta imagen muestra un gel de AFLP proveniente de la electroforesis en una unidad vertical y teñido con nitrato de plata. La imagen presenta ciertas regiones del gel con alta concentración de bandas, mientras que otras están relativamente vacías. La recopilación de los datos de geles teñidos con nitrato de plata puede hacerse mediante apreciación visual, o con ayuda de programas informáticos después de haber adquirido la figura del gel de forma electrónica mediante un escáner.


f Los AFLP permiten una exploración rápida de los polimorfismos del genoma entero

f Puesto que se genera un gran número de bandas, cada marcador da una huella identificadora de ADN sumamente informativa

f Son también altamente reproduciblesf No se necesita información previa de las secuencias

ni hay que generar sondas de hibridación f Es una técnica muy útil para crear mapas genéticos

en forma rápidaf Permiten la generación de “perfiles de trascripción”

Ventajas de los AFLP

La tecnología de AFLP puede aplicarse a cualquier muestra de ADN, incluyendo el humano, el animal, el vegetal y el microbiano, lo que le da el potencial de convertirse en un sistema universal para la caracterización de ADN.

Debido a la naturaleza de los cebadores de AFLP, los marcadores obtenidos son sumamente confiables y sólidos, y no son afectados por las pequeñas variaciones del proceso de amplificación.

Una “huella identificadora” característica de AFLP contiene entre 50 y 100 fragmentos amplificados, muchos de los cuales pueden servir como marcadores genéticos.

La generación de perfiles de trascripción de AFLP con ADNc es una herramienta eficaz para identificar los ARNm expresados diferencialmente. Esta herramienta tiene ventajas que pueden ser útiles para descubrir genes en el germoplasma.


f Los AFLP generan cantidades enormes de información, por lo que pueden requerir un análisis automatizado y, por consiguiente, tecnología de computación adecuada

f Son de tipo dominante

f En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan, con frecuencia, en los centrómeros y telómeros

f Requieren bastante técnica en el laboratorio y, especialmente, en el análisis de los datos

Desventajas de los AFLP

Un inconveniente adicional de la tecnología de AFLP es, quizás, que no puede garantizar la homología entre bandas de peso molecular (MW) similar, lo que dificulta los estudios del tipo del análisis filogenético. Ahora bien, mientras bandas no homólogas de peso similar también se encuentran utilizando otros marcadores como los RAPD, pueden ser menos comunes en la tecnología de AFLP porque la resolución de los geles es muy alta y, en consecuencia, la probabilidad de que las bandas no homólogas sean, por coincidencia, del mismo peso molecular es más baja.


f Evaluación de diversidad genética

f Análisis de distancia genética

f Huella identificadora de ADN

f Análisis de colecciones de germoplasma

f Construcción de mapas genéticos

f Seguimiento de marcadores de diagnóstico


Badr, A., K. Müller, R. Schäfer-Pregl, H. El Rabey, S. Effgen, H.H. Ibrahim, C. Pozzi, W. Rohde y F. Salamini. 2000. On the origin and domestication history of barley (Hordeum vulgare). Mol. Biol. Evol. 17(4):499-510.

Barret, B.A. y K.K. Kidwell. 1998. AFLP-based genetic diversity assessment among wheat cultivars from the Pacific Northwest. Crop Sci. 38:1261-1271.

Beebe, S., J. Rengifo, E. Gaitán, M.C. Duque y J. Tohme. 2001. Diversity and origin of Andean landraces of common bean. Crop Sci. 41:854-862.

Gilbert, K.G., S. Garton, M.A. Karam, G.M. Arnold, A. Karp, K.J. Edwards, D.T. Cooke y J.H.A. Barker. 2002. A high degree of genetic diversity is revealed in Isatis spp. (dyer's wood) by amplified fragment length polymorphism (AFLP). Theor. Appl. Genet. 104:1150-1156.

Miyashita, N.T., A. Kawabe y H. Innan. 1999. DNA variation in the wild plant Arabidopsis thalianarevealed by amplified fragment length polymorphism analysis. Genetics 152:1273-1731.

Palacios, C. y F. González-Candelas. 1999. AFLP analysis of the critically endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 90(4):485-489.

Rouf-Mian, M.A., A.A. Hopkins y J.C. Zwonitzer. 2002. Determination of genetic diversity in Tall Fescue with AFLP markers. Crop Sci. 42:944-950.

Sawkins, M.C., B.L. Maass, B.C. Pengelly, H.J. Newbury, B.V. Ford-Lloyd, N. Maxted y R. Smith. 2001. Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol. Ecol. 10:1947-1958.

Srivastava, A., V. Gupta, D. Pental y A.K. Pradhan. 2001. AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 102:193-199.

Vuylsteke, M., R. Mank, B. Brugmans, P. Stam y M. Kuiper. 2000. Further characterization of AFLP (R) data as a tool in genetic diversity assessment among maize (Zea mays L.) inbred lines. Mol. Breed. 6(3):265-276.

Las referencias en color púrpura se explican más detenidamente en las diapositivas que vienen a continuación.


Ejemplo: Limonium sp.

f Título:AFLP analysis of the critically endangered Limoniumcavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 1999. 90(4):485-489

f Objetivo:Comparar la efectividad de los AFLP para analizar la diversidad genética de L. cavanillesii y su eficiencia respecto a un estudio anterior de RAPD

f Materiales y métodos:Se extrajo el ADN de 29 individuos silvestres. Estos individuos eran los mismos que se emplearon en un estudio anterior* de RAPD. Se seleccionaron tres combinaciones de cebadores


*Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare andendangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.


Ejemplo: Limonium sp. (continuación)

f Resultados: Se generaron, en total, 231 fragmentos: en promedio, 223 por individuo y 77 por combinación de cebadores. Sólo 6% de los marcadores fueron polimórficos y distinguieron 11 perfiles AFLP diferentes, mientras que en un estudio anterior*con RAPD no se obtuvo ningún marcador polimórfico

f Discusión:Los AFLP demostraron ser un tipo de marcador apropiado para recopilar información crítica para la identificación de poblaciones naturales en riesgo y para la planificación de estrategias de recuperación de L. cavanillesii. Los bajos niveles de variabilidad genética encontrada en L. cavanillesiipodrían explicarse como efecto de su sistema reproductivoapomíctico o como un caso de cuello de botella reciente y severo

*Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare andendangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.


Ejemplo: Stylosanthes spp.

f Título:Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol. Ecol. 2001. 10:1947-1958

f Objetivo:Evaluar la variación genética en dos especies del género tropical Stylosanthes Sw.

f Materiales y métodos:Se escogieron 111 entradas: 59 de S. viscosa y 52 de S. humilis, las cuales representan la distribución geográfica de ambas especies. Se usaron cinco combinaciones de cebadores para S. humilis y cuatro para S. viscosa



Resultados: • S. humilis: de un total de 417 bandas, 316 eran

polimórficas (75%). La semejanza entre las entradas fue, en promedio, de 0.71, y la distancia genética promedio fue de 0.17 (coeficiente de Jaccard)

• S. viscosa: de un total de 373 bandas, 312 eran polimórficas (83%). El valor de la semejanza entre entradas fue, en promedio, de 0.67, y la distancia genética promedio fue de 0.20

• El análisis de conglomerados y de PCA agruparon las entradas de ambas especies según su origen geográfico, con algunas excepciones. Una explicación de esto sería la incidencia de sucesos de dispersión de largo alcance o la introducción de genotipos de una zona a otra por el hombre

Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación)



Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación)

f Discusión:Estos resultados demuestran la utilidad de la tecnología AFLP, no sólo para detectar la diversidad genética dentro de las especies de Stylosanthes, sino también para identificar individuos mal clasificados

f Conclusiones:Este estudio revela la capacidad de los AFLP para detectar patrones geográficos en la variación genética, información que es necesaria para desarrollar estrategias óptimas de conservación


Ejemplo: Mostaza india

f Título:AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomicallyimportant natural and some newly synthesized lines of Brassicajuncea. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:193-199

f Objetivo:• Estudiar la variación genética existente entre entradas de

B. juncea• Identificar las combinaciones de cebadores AFLP que son

informativas para la identificación varietal• Buscar marcadores polimórficos para un posible etiquetado de

los caracteres agronómicos que se suponen presentes en el germoplasma estudiado

f Materiales y métodos:El estudio empleó 30 entradas de B. juncea, que representaban 21 poblaciones naturales y 9 variedades sintéticas y líneas de mejoramiento. La amplificación selectiva se llevó a cabo con 21 combinaciones de cebadores EcoRI/MseI



Resultados:• Se registraron 1251 fragmentos en los 30 genotipos.

Por término medio, 37 bandas por combinación de cebadores fueron polimórficas

• Ni un solo par de cebadores pudo distinguir los 30 genotipos sobre la base de la presencia o la ausencia de bandas específicas de la variedad

• Cuatro pares de cebadores fueron los más informativos y tuvieron un poder discriminatorio del 100%

• El análisis de conglomerados basado en estos cuatro cebadores concordó con resultados de estudios anteriores basados en caracteres morfológicos* y en datos de RAPD**

Ejemplo: Mostaza india (continuación)


*Pradhan, A.K., Y.S. Sodhi, A. Mukhopadhyay y D. Pental. 1993. Heterosis breeding in Indian mustard (Brassica juncea (L.) Czern. & Cross): analysis of component characters contributing to heterosis for yield. Euphytica 69:219-229.

**Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.


f Discusión y conclusiones: En un estudio anterior* con 32 cebadores RAPD se obtuvo un promedio de 12 loci polimórficos por cebador. Por tanto, la técnica AFLP proporcionó un mayor grado de resolución para discriminar el germoplasma estrechamente relacionado. El análisis con AFLP tiene potencial para complementar tanto los datos convencionales como otros de distintos tipos de marcadores moleculares

Ejemplo: Mostaza india (continuación)

*Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.


f La tecnología AFLP se basa en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción después de la digestión del ADN

f Esta tecnología detecta polimorfismos causados por cambios en los sitios de restricción o en sus regiones adyacentes

f Esta tecnología produce un gran número de bandas por experimento; no obstante, las bandas son dominantes y el procedimiento tiene requisitos técnicos considerables

En resumen



f Las diferentes etapas que comprende la generación de los AFLP

f Las principales consideraciones que requiere la interpretación de las bandas de AFLP

f Las ventajas y las desventajas de los AFLP respecto al análisis de la diversidad genética

Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93. En: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company and Academic Press, Austin, TX, E.U.

KeyGene, N.V. 2001. Empowering genomics. http://www.keygene.com(30 junio 2002).

Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper y M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414.

Zabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. Publicación de Patente Europea 92402629 (Publicación No. EP0534858A1).

Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa y J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli0157:H7 by semiautomated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.




• Últimas estrategias

f Tecnologías complementariasf Consideraciones finales

f Glosario


Sitios de secuencia etiquetada

A continuación

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 STS 1

Tecnologías basadas en la PCRSitios de secuencia etiquetada

(Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR)





Contenido

f Sitios de secuencia etiquetada (STS) como marcadores

f Microsatélites (SSR, STMS o SSRP)• Identificación de las regiones de microsatélite• Estructura• Selección de los cebadores• Metodología y visualización• Equipo• Ventajas y desventajas• Aplicaciones de los SSR y ejemplos

f SCARf CAPSf ISSR


Sitios de secuencia etiquetada (STS) como marcadores

f A diferencia de las técnicas basadas en cebadores arbitrarios, los STS dependen de un cierto conocimiento de las secuencias

f Los marcadores basados en STS son codominantes

f Tienden a ser más reproducibles porque se usan secuencias cebadoras más largas

f Requieren, básicamente, los mismos protocolos de laboratorio y el mismo equipo que la PCR estándar

A diferencia de la PCR con cebadores arbitrarios, el diseño de los cebadores para detectar sitios de secuencia etiquetada (STS) está basado en cierto conocimiento de las secuencias. Estos cebadores son únicos y específicos de las secuencias, y detectan variación en el ADN genómico alélico. Los STS tienen una ventaja especial sobre los RAPD por ser codominantes, o sea, pueden distinguir entre los homocigotos y los heterocigotos. Tienden también a ser más reproducibles, porque las secuencias de los cebadores son más largas.

Tienen, sin embargo, una desventaja: requieren de algún conocimiento preexistente de la secuencia del ADN de la región, aunque sólo sea parcial. Su inconveniente principal es la inversión en esfuerzo y costo que se necesita para diseñar los cebadores específicos de cada locus.

Del mismo modo que con los RAPD, el uso de la PCR genera datos rápidamente y requiere poco ADN. Todos los métodos de STS usan los mismos protocolos básicos que usan los RAPD (extracción de ADN y PCR) y requieren el mismo equipo.


f Los microsatélites son secuencias cortas (1-10 pb) que se repiten en serie

f Para poder usarlos como marcadores, debe identificarse, en primer lugar, su ubicación en el genoma de interés

f Los polimorfismos en la región repetida se pueden detectar mediante una PCR con cebadores diseñados a partir de la región del ADN adyacente a la repetición

Microsatélites (SSR, STMS o SSRP)

Los microsatélites también se llaman repeticiones de secuencia simple (SSR) y, ocasionalmente, sitios de microsatélite de secuencia etiquetada (STMS) o polimorfismo de repeticiones de secuencia simple (SSRP). Son con mucho el tipo de STS que más se usa.

Los SSR son repeticiones cortas en serie cuya longitud está entre 1 y 10 pb; los más típicos miden de 2 a 3 pb. Son altamente variables y están distribuidos por igual en todo el genoma. Este tipo de ADN repetitivo es común en organismos eucariotas, y el número de unidades repetidas varía ampliamente entre los organismos, hallándose en algunos hasta 50 copias de la unidad repetida. Para identificar estos polimorfismos, se construyen cebadores de PCR para la región del ADN que flanquea el microsatélite. Las regiones adyacentes a los microsatélites tienden a conservarse dentro de las especies, aunque a veces se conservan también en niveles taxonómicos mayores.

ReferenciaHajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping:

Markers for genetic analysis. En: Biotechniques: Molecular laboratory methods series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.


Identificación de regiones microsatélite

Secuencias disponibles en las bases de datos

Identificar las secuencias que contienen microsatélites

Diseñar cebadores específicos

Detectar el polimorfismo

Usar microsatélites conocidos para aislar clones candidatos de una genoteca

Diseñar cebadores específicos


No hay secuencias disponibles en las bases de datos

Usar secuencias de microsatélite como sonda frente al ADN digerido


Secuenciar los clones positivos

Tal como ocurre en las zonas del genoma con alta concentración de repeticiones, los SSR tienden a agruparse en los centrómeros y en los telómeros. Sin embargo, este problema se puede resolver identificando SSR a partir de genotecas de EST, que son ricas en genes y cuya distribución es más uniforme.


Estructura

Regiones adyacentes únicas

= región repetida (p.e., GA)

f El número de repeticiones es altamente variable entre individuos


Selección de los cebadores

f Diseñar cebadores ( ) complementarios de las regiones adyacentes


Metodología y visualización

f Metodología:• Extracción del ADN• PCR con cebadores específicos de las regiones

adyacentes al microsatélite• Separación de fragmentos

f Visualización:• Mediante electroforesis en geles de agarosa, usando

tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta, o• En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata,

o empleando radioisótopos, o• Con secuenciadores automáticos, empleando

cebadores pre-marcados con fluorescenciaf Análisis de datos

La variación en tamaño de los productos de la PCR se debe a la diferencias en el número de las unidades repetidas en el microsatélite. Los polimorfismos de SSR se pueden visualizar mediante electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. Los alelos del microsatélite se detectan usando diversos métodos: tinción con bromuro de etidio, nitrato de plata, radioisótopos o fluorescencia.

Si se usan cebadores marcados con fluorescencia, y los productos son suficientemente diferentes en tamaño y no se sobreponen, se puede cargar un carril con varios productos de reacción de forma simultánea, lo que aumenta enormemente la eficiencia de estos marcadores, (Dean et al., 1999, trae un buen ejemplo).

ReferenciaDean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic

redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci. 39:1215-1221.


Tinción con bromuro de etidio

Como se mencionó anteriormente, una manera de visualizar los microsatélites es empleando electroforesis en geles de agarosa. Este método es apropiado cuando losalelos son suficientemente largos, o sea, de más de 200-300 pares de bases, y las diferencias entre alelos también son significativas (es decir, más de 10-20 pb).

Esta foto muestra un microsatélite que se hizo migrar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Los carriles segundo y tercero (el primero, muy débil, lleva un marcador de tamaño) corresponden a los progenitores, uno de los cuales tiene solo una banda y el otro dos. El heterocigoto, por lo tanto, tiene tres. En el segundo progenitor, una de las bandas es mucho más tenue. Como las dos bandas co-segregan, no son el resultado de dos loci que estén en diferentes lugares, pero puede deberse a que las dos copias del microsatélite están separadas por una inserción o una deleción, o bien están ubicadas una cerca de la otra.


Tinción con nitrato de plata

Los microsatélites pueden analizarse también después de hacer migrar los productos de la PCR en un gel de acrilamida teñido con nitrato de plata. En esta imagen, las muestras pertenecen a una especie diploide y, por consiguiente, tienen un máximo de dos alelos. Cada banda (cada alelo) parece ser más de una banda. Este fenómeno ocurre con frecuencia en la amplificación de los microsatélites. Puesto que puede causar confusión, se debe poner especial cuidado en la interpretación de los resultados.


Equipo




eléctrica• Hornillo o microondas

• Medidor de pH• Balanza estándar• Unidades de

electroforesis para geles horizontales y verticales

• Transiluminador para luz ultravioleta

• Secuenciador automático




f Ventajas:• Requieren muy poco ADN y éste no

necesariamente de alta calidad• Sumamente polimórficos• Uniformemente distribuidos en todo el genoma• Interpretación sencilla de los resultados• Automatizados fácilmente, y permiten la carga

simultánea de productos en el mismo carril• Buena resolución analítica y alta reproducibilidad

f Desventajas:• Procedimiento de descubrimiento complejo • Costo elevado

Los loci identificados son generalmente multi-alélicos y co-dominantes. Las bandas pueden registrarse o de manera codominante, o como bandas presentes o ausentes.

Dado que el ADN adyacente al microsatélite tiene mayor probabilidad de ser conservado, los cebadores derivados de microsatélites se pueden usar a menudo con muchas variedades e incluso con otras especies. La detección de estos marcadores se automatiza fácilmente, son muy polimórficos y tienen buena resolución analítica. Todo esto los convierte en una alternativa preferida como marcadores (Matsuoka y col., 2002).

ReferenciaMatsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002.

Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450.


f Genotipificación de individuos

f Evaluación de germoplasma

f Diversidad genética

f Cartografía de genomas

f Estudios filogenéticos

f Estudios evolutivos

Ejemplos de aplicaciones de los SSR

Cipriani, G., M.T. Marrazzo, R. Marconi, A. Cimato y R. Testolin. 2002. Microsatellitemarkers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl. Genet. 104:223-228.

Dean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci. 39:1215-1221.

Matsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002.Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450.

Smith, J.S.C., S. Kresovich, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell, R.E. Dean, W.L. Woodman, M. Lee y K. Porter. 2000. Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed with simple sequence repeats. Crop Sci. 40:226-232.

Westman, A.L. y S. Kresovich. 1999. Simple sequence repeats (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations. Euphytica 109:85-92.

Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que siguen.


Aplicaciones: Ejemplo en sorgo

f Título:Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed with simple sequence repeats. Crop Sci. 2000. 40:226-232

f Objetivo:Evaluar los niveles de redundancia genética en las entradas de sorgo mantenidas por el Sistema Nacional de Germoplasma Vegetal (NPGS) de los Estados Unidos

f Materiales y métodos:Se analizaron 96 individuos (5 plantas de cada una de las 19 introducciones de la línea "Orange" y una variedad pura selecta) empleando 15 marcadores SSR



Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación)

Resultados y discusión:f La mayoría de las accesiones fueron genéticamente

distintas, pero se encontraron dos grupos redundantes (que incluían, en total, 5 entradas)

f Los valores promedio de heterocigosidad fueron muy bajos (lo que se espera de un cultivo autógamo). Una entrada contenía una mezcla de genotipos, lo que indicaba algún tipo de contaminación

f El análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó que un 90% de la variación genética total se debía a las diferencias entre entradas, mientras que un 10% era el resultado de las diferencias genéticas entre plantas individuales dentro de las entradas



Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación)

Conclusiones:f Los 15 marcadores SSR dieron una notable

resolución genéticaf El número de entradas de ‘Orange’ conservadas

podría reducirse a casi la mitad sin causar una pérdida sustancial en la variación genética general y reduciendo mucho, por tanto, los costos de mantenimiento

f La combinación de reacciones resultó en un ahorro de 1152 carriles, o sea, en un 80% de reactivos y de tiempo


Aplicaciones: Ejemplo en olivo

f Título:Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaeaL.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl. Genet. 104:223-228

f Objetivo:Evaluar la eficiencia de los marcadores SSR para identificar polimorfismos entre cultivares de olivo

f Materiales y métodos:Se usaron 36 SSR para analizar 12 cultivares de olivo (4 bien conocidos y 8 antiguos)



Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación)

f Resultados y discusión:Todos los marcadores SSR, excepto dos, mostraron polimorfismo (entre 2 y 5 alelos). Todos los cultivares se separaron fácilmente entre sí• Cinco pares de cebadores amplificaron dos loci

diferentes• Se descartaron seis pares de cebadores porque

produjeron patrones ilegibles• Se confirmó que dos variedades, que parecían

idénticas, lo eran en realidad porque mostraron patrones de bandas iguales en todo los loci. Otro par de variedades, que también se creían idénticas, mostraron que no lo eran



Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación)

Conclusiones:Los SSR podrían fácilmente diferenciar todas las variedades y, por tanto, son una buenaherramienta para encontrar patrones exclusivos de ADN. Se identificó también la variabilidad genética dentro de los cultivares de olivo, empleando un número muy bajo de marcadores. En estudios anteriores con AFLP se requirieron muchos más marcadores


Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra

f Título:Simple sequence repeats (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations. Euphytica. 1999. 109:85-92

f Objetivo:Determinar el grado y la distribución de la variación genética en B. nigra (la mostaza negra)

f Materiales y métodos:Se usaron cinco marcadores SSR para analizar 32 entradas de B. nigra (accesiones del banco de germoplasma y poblaciones arvenses) provenientes de cuatro regiones: África del Norte/Europa, India, Etiopía y América del Norte



Resultados y discusión:f Las entradas etíopes formaron el grupo más

sobresalientef Más de la mitad de la variación se detectó entre plantas,

dentro de entradasf Las entradas europeas y norteamericanas contenían la

mayor cantidad de variación y, generalmente, se agrupaban juntas

f En las poblaciones arvenses de América del Norte se detectaron variantes únicas, pero la variación entre poblaciones no se correlacionó con la distancia geográfica

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra (continuación)



Conclusiones:Aunque se creía que había poca variación genética dentro de B. nigra, los marcadoresSSR demostraron que los patrones de variación de la especie eran compatibles con su historia agrícola

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra (continuación)


Región amplificada caracterizada por una secuencia (SCAR)

f Los SCAR aprovechan una banda que ha sido generada en un experimento de RAPD

f Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a partir de los extremos de marcadores RAPD clonados

f Esta técnica transforma una banda —propensaa dificultades de interpretación o de reproducibilidad— en un marcador muy confiable

ReferenciaParan, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked

to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.


Pasos para la obtención de polimorfismos de SCAR

f Se identifica, en un gel de RAPD, una banda que despierta un interés potencial

f La banda se corta y se retira del gelf El fragmento de ADN se clona en un vector y se

obtiene su secuenciaf Se diseñan cebadores específicos (16 a

24 pb de longitud) para ese fragmento de ADN f La reamplificación del ADN patrón con los

nuevos cebadores presentará un patrón de PCR nuevo y más sencillo


Diagrama del procedimiento para obtener los SCAR

Banda polimórfica

Gel de RAPD

Clonar la banda polimórfica en un vector

Secuenciar el fragmento y diseñar nuevos cebadores para amplificar únicamente la banda de interés

Después de la amplificación con los nuevos cebadores, el resultado es un patrón de bandas más fácil de interpretar

Banda polimórfica

1 32

1 32



f Ventajas:• Patrones más sencillos que los RAPD• Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos

específicos• Herencia mendeliana. A veces convertibles a

marcadores codominantes

f Desventajas:• Requieren un conocimiento mínimo de las

secuencias• Requieren esfuerzo y gastos para diseñar

cebadores específicos de cada locus

Dado que los cebadores empleados son más largos que los que se usan en los RAPD, los SCAR se caracterizan por ser más reproducible que los RAPD, de los cuales se derivan. Los SCAR son generalmente co-dominantes, excepto si uno o ambos cebadores se superponen en el sitio de variación de la secuencia.


f Este método se basa en el diseño de cebadores específicos, en la amplificación de fragmentos de ADN, y en la generación de fragmentos más pequeños, posiblemente variables, mediante un enzima de restricción

f El objetivo de esta técnica es convertir una banda amplificada, que no muestra variación, en una banda polimórfica

Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (CAPS)

ReferenciaKonieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations

using codominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.

Los marcadores de secuencia de restricción amplificada y polimórfica (CAPS) son como los SCAR, pero con una paso adicional (una digestión de restricción) para favorecer la identificación de polimorfismos que quizás no hubieran podido identificarse entre el total de productos de la PCR. Tanto los SCAR como los CAPS se basan en la presencia de cambios en los nucleótidos o de inserciones o deleciones, los cuales causan diferencias entre las secuencias experimentales. Un inconveniente de ambas tecnologías es que detectan polimorfismo sólo en un intervalo pequeño del genoma, o sea, en la zona entre los cebadores que se caracteriza por ser menor que 5 kb.


f Se reconoce la importancia de una banda, de un fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro tipo de marcador

f O bien la banda se detecta a través de la PCR (y se corta del gel y el fragmento se clona y es secuenciado) o la secuencia del fragmento está ya disponible

f Se diseñan cebadores específicos partiendo de la secuencia del fragmento

f Los cebadores recién diseñados se usan para amplificar el ADN patrón

f El producto de la PCR se somete a digestión con varios enzimas de restricción

f Se identifica el polimorfismo empleando alguno de los enzimas

Pasos que requiere la generación de CAPS

Una vez identificado un polimorfismo con un enzima de restricción específico, los cebadores pueden rediseñarse sobre la base de los fragmentos recién generados, para optimizar la detección y la visualización del polimorfismo.

En cuanto sea posible, los cebadores deben elegirse de modo que exista la probabilidad de que los productos de la PCR incluyan intrones. Así aumentarán las oportunidades de obtener polimorfismos.


Generación de CAPS

De: Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. Plant J. 4(2):403-410.

PCR + digestión con el enzima R + electroforesis

A/A B/B A/BR R R RR R RR

*

*

En este ejemplo, se generaron CAPS para dos ecotipos de Arabidopsis.

En la parte superior del diagrama se muestran los tres genotipos posibles para el experimento: los dos ecotipos homocigóticos (A/A y B/B) y el ecotipo heterocigótico (A/B).

Si se llevara a cabo una PCR estándar de los ADN originales con los cebadores dibujados (flechas azules), no se obtendría ningún polimorfismo entre los tres genotipos.

Se encontró un enzima de restricción que digería los fragmentos A dos veces y el fragmento B tres veces. En consecuencia, el heterocigoto A/B debe producir una copia del fragmento digerido dos veces y otra del fragmento digerido tres veces.

Se realizó entonces una PCR y los productos se digirieron con el enzima de restricción específico ya mencionado. La visualización en gel de agarosa mostró tres fragmentos para el genotipo A/A, cuatro fragmentos para el genotipo B/B y siete fragmentos para el heterocigoto A/B. El diagrama muestra sólo 5 fragmentos para A/B, porque dos de los siete fragmentos (señalados por asteriscos) migran a distancias similares a las de otros fragmentos.



f Ventajas:• Ensayo sólido, porque se usan cebadores

específicos largos • Marcadores co-dominantes• Favorecido por marcadores que pueden estar ya

localizados en un mapa genético• Identifican polimorfismos en marcadores que

anteriormente no eran informativosf Desventajas:

• Requieren, al menos, un mínimo nivel de conocimiento de las secuencias

• El diseño de cebadores específicos para cada locus requiere trabajo adicional y más gastos


f Son las regiones situadas entre microsatélites

f La técnica se basa en la amplificación, mediante la PCR, de las secuencias ubicadas entre microsatélites

f Gracias a la conocida abundancia de secuencias repetitivas esparcidas por todo el genoma, identifica múltiples loci

Secuencia entre repeticiones simples (ISSR)

ReferenciaZietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple

sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.


Identificación de polimorfismos ISSR

f Se emplea sólo un cebador f Se emplean dos cebadores de características

similares f Se combinan un cebador de secuencia de

microsatélite anclado y un cebador aleatorio (como los usados para RAPD)

Se ejecuta una PCR típica en la cual los cebadores han sido diseñados partiendo de una secuencia repetitiva de microsatélite y se han extendido, en una o varias bases, en la secuencia adyacente a modo de puntos de anclaje. Puede haber varias opciones:


Diseño de cebadores para polimorfismos ISSR

De: Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genomics 20:176–183

NNNN(CA)n(CA)nNN

Repetición CA

NN(CA)n(CA)nNN

Repetición CA

Producto de la PCR cebador anclado en 3’

Producto de la PCR cebador anclado en 5’

CACACACACACACACA

TGTGTGTGTGTGTGTG

TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

CACACACACACACACACACACACACACANNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNN

ADN genómico

El diagrama anterior presenta tres puntos diferentes:

• La secuencia del ADN original, en la cual se identifican dos secuencias repetidas diferentes (CA), orientadas en sentido inverso. Entre las dos secciones repetidas hay, además, un espacio bastante corto.

• Si los cebadores se diseñaran solamente del interior de la región repetida, se amplificaría la sección entre las repeticiones pero podría no estar garantizada la especificidad del locus. En la segunda hilera (ver diagrama), aparece un producto de la PCR como resultado de la amplificación de un cebador anclado en 3’ (CA)nNN en cada extremo de la región entre las repeticiones. CA es la secuencia que se alargó en NN, dos nucleótidos que entran dentro de la región situada entre las repeticiones.

• Alternativamente, las anclas pueden elegirse de la región 5’. El producto de la PCR de la tercera hilera resulta de emplear cebadores basados en la repetición CA pero prolongados en el extremo 5’ por NNN y NN, respectivamente.



f Ventajas:• No requieren información previa sobre secuencias• Se puede encontrar variación dentro de regiones

únicas del genoma en varios loci simultáneamente• Tienden a identificar niveles significativos de variación• Específicos de secuencias de microsatélites• Muy útiles para realizar perfiles de ADN,

especialmente de especies estrechamente relacionadas

f Desventajas:• Marcadores dominantes• Puede ser necesaria la electroforesis en gel de

poliacrilamida y la detección con tinción de plata o con radioisótopos


f El uso de los STS como marcadores se apoya en algún conocimiento sobre secuencias. Son co-dominantes y altamente reproducibles

f Los SSR son el tipo de STS más ampliamente usado. Otros son SCAR, CAPS e ISSR

f Los SSR son repeticiones cortas en serie, sumamente variables y distribuidas uniformemente en el genoma. Estas características hacen de los SSR los marcadores preferidos para el análisis de diversidad genética

f Los polimorfismos de los SSR son causados por las diferencias en el número de unidades repetidas

En resumen


f Las características de los STS como marcadores

f Los diferentes tipos de marcadores STS y sus rasgos contrastantes

f Los pasos necesarios para identificar microsatélites, diseñar los cebadores y detectar los polimorfismos

f Las propiedades de los microsatélites respecto a los análisis de diversidad genética


Ajay, J., C. Apparanda y P.L. Bhalla. 1999. Evaluation of genetic diversity and genome fingerprinting of Pandorea(Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. Genome 42:714-719.

Blair, M.W., O. Panaud y S.R. McCouch. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 98:780-792.

Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93 en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.

Buso, G.S.C., P.H.N. Rangel y M.E. Ferreira. 2001. Analysis of random and specific sequences of nuclear and cytoplasmatic DNA in diploid and tetraploid American wild rice species (Oryza sp.). Genome 44:476-494.

Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic analysis. Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.

Joshi, S.P., V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar y D.S. Brar. 2000. Genetic diversity and phylogeneticrelationship as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor. Appl. Genet. 100:1311- 1320.

Kantety, R.V., X.P. Zeng, J.L. Bennetzen y B.E. Zehr. 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Mol. Breed. 1:365-373.

Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.

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Morgante, M. y A.M. Olivieri. 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J. 3(1):175-182.

Paran, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985- 993.

Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.



A continuación



f Glosario


Últimas estrategias

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Últimas estrategias 1

Tecnologías basadas en la PCRÚltimas estrategias

(Secuenciación de ADN, EST, matrices, DArT, SNP)





Contenido

f Secuenciación de ADN

f Marcador de secuencia expresada (EST)

f Tecnología de matrices

f Tecnología de matrices de diversidad (DArT)

f Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)


f La secuenciación del ADN es la medida fundamental de la diversidad porque detecta polimorfismos dentro de los elementos básicos del ADN

f La información puede obtenerse automáticamente

Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN es la medida de la diversidad verdaderamente fundamental, porque todos los marcadores se derivan de polimorfismos en los elementos básicos del ADN, o sea, en la secuencia nucleotídica de un segmento específico de ADN. La tecnología de la secuenciación ha mejorado enormemente en los últimos años, y ahora los productos de la PCR (una región de ADN amplificada en cantidad suficiente) pueden provenir de cualquier posición genómica de interés y secuenciarse directamente. La recopilación de los datos puede automatizarse.

Referencias básicasMaxam, A.M. y W. Gilbert. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:560-564.

Sanger, F. 1988. Sequences, sequences and sequences. Annu. Rev. Biochem. 57:1-28.

Sanger, F., S. Nicklen y A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5468.


Secuenciación del ADN: Métodos

Hay dos métodos principales:

f Maxam-Gilbert

f Sanger (secuenciación dideoxy o terminación de cadena)

Los dos métodos difieren ligeramente; el método de Sanger (descrito en la diapositiva 6) es más fácil de automatizar y, por tanto, es mucho más empleado.


f El ADN se divide en fragmentos, que luego se sub-clonan

f Cada pedazo corto se usa como una plantilla para generar un conjunto de fragmentos que difieren entre sí, en longitud, en una sola base

f Los fragmentos se separan mediante electroforesisf Se identifica la base que queda al final de cada

fragmento. Se recrea la secuencia original de las bases (A, T, C y G) de cada pedazo corto generado en el primer paso

f Las secuencias cortas se ensamblan en una secuencia larga

Secuenciación del ADN: Procedimientos


Un diagrama del método Sanger


ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

MarcajePolimerasa + dNTP

3’5’C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A

C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A

C T T T

A G G A C A C T T T

C A C T T T

G C A A A G G A C A C T T T

G T A T C G A C A A A G G A C A T T T

+

+

+

+CATAGCTGT

T

TTCC

GTGAAA

Pueden usarse colorantes fluorescentes de diversos colores, lo que permite la separación de los cuatro fragmentos en un solo carril del gel y aumenta mucho la eficiencia. Los secuenciadores automáticos pueden analizar los electroferogramas resultantes y producir un cromatograma de cuatro colores en que aparecen los picos que representan cada una de las cuatro bases de ADN.


Secuenciación del ADN: Ventajas y desventajas

f Ventajas:• Resultados altamente reproducibles• El contenido de información es máximo

f Desventajas:• Costos todavía elevados• Presenta exigencias técnicas

Los resultados son, desde luego, sumamente reproducibles e informativos. Los costos son elevados, sin embargo, y se necesita un nivel alto de pericia técnica, dos factores que alejan esta tecnología de las posibilidades de muchos investigadores. El uso de la PCR para abordar regiones específicas del ADN y la disponibilidad de máquinas de secuenciación automatizadas han reducido las dificultades técnicas, aunque el proceso es todavía costoso, en particular en su etapa de establecimiento.


f Estudios evolutivos

f Cálculos de la variación genética

f Genómica comparativa

f Elaboración de ensayos de tipo PCR (diseño de cebadores para convertir cualquier marcador en otro marcador basado en la PCR)


Aunque la tecnología de los marcadores está basada, en general, en la variación de la secuencia del ADN, el investigador no necesita, por fortuna, conocer toda la secuencia del ADN para poder usar los marcadores moleculares. Desde luego, el análisis de la secuencia del ADN tiene muchas aplicaciones útiles, pero tiene un gran inconveniente, en particular para la medición de la diversidad: el hecho de que genes diferentes evolucionan en grado diferente. Por consiguiente, la extrapolación de información obtenida de genes específicos al nivel de la especie debe hacerse con cuidado (Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93, en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.)


f Las etiquetas de secuencia expresada son pedazos pequeños de secuencia del ADN que tienen, generalmente, de 200 a 500 nucleótidos de largo

f Se generan al secuenciar bien sea uno o ambos extremos de un gen expresado proveniente de una genoteca de ADNc

f Esta estrategia es una forma sumamente eficaz de encontrar genes nuevos

Marcador de secuencia expresada (EST)

El número de secuencias de EST de plantas disponibles para el público ha aumentado extraordinariamente en los últimos años llegando a más de 1,000,000 en el momento de escribir este documento (Informe de Progreso de la Iniciativa Nacional del Genoma Vegetal, diciembre 2001). Una lista de bases de datos de los EST de muchas plantas se puede encontrar en la dirección electrónica http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm

Referencia básicaNational Center for Biotechnology Information (NCBI). 2001. ESTs: gene discovery made easier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html


Diseño de cebadores de EST

http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm

ARNm

ARN

Transcriptasa inversa

Degradación del ARN por ribonucleasasSíntesis de la segunda cadena del ADN

ADNc

ADN de doble cadena

CebadorCebador

3’ EST5’ EST

A C U G

A C U G

T G A C

A C T GT G A C


Los EST: Ventajas y desventajas

f Ventajas:• Muy buenos como marcadores genéticos• Codominantes• Las secuencias se pueden generar rápidamente• Fuente eficiente de secuencias para obtener

cebadores para SSR

f Desventajas:• El aislamiento del ARNm puede ser complicado• Los intrones, que pueden contener información

importante, no son parte del ADNc


Los EST: Ejemplos de aplicaciones

Las aplicaciones de los EST se basan en el hecho de que se originan a partir de segmentos de secuencias génicas:f Comparación de la diversidad génica en

diferentes organismosf Estudios de evolución génicaf Búsqueda de supuestos ortólogos en bases de

datos f Sondas para estudios de expresión génica f Detección de SNP*

* Ver la sección que empieza en la diapositiva 25.


f Las matrices son ordenamientos de pequeños fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de vidrio o membranas de nylon

f Esta tecnología permite hacer el seguimiento simultáneo del genoma entero

f El principio fundamental de las matrices es el apareamiento de las bases �o la hibridación� de sondas cortas con secuencias complementarias de ADN

f Las matrices se construyen con ADNc (matrices de ADNc), con secuencias genómicas o con oligonucleótidos sintetizados in silico (“arreglos de ADN”)

Tecnología de matrices o “arreglos”

Mediante la tecnología de matrices (también llamada 'tecnología de chip'), los genomas pueden analizarse a escala del genoma entero. Esta tecnología se basa en la hibridación entre sondas cortas de oligonucleótidos y secuencias complementarias de ADN. Decenas de miles de muestras se pueden inmovilizar en una lámina pequeña de vidrio (que es lo más corriente) o en una membrana de nylon donde pueden hibridarse con diferentes sondas o trozos de ADN de interés (la terminología es equívoca y permite que al ADN inmovilizado en el “arreglo” se le llame también sonda o ADN de interés). Se puede hibridar más de una sonda a la vez, por ejemplo, para comparar diferencias en la expresión, marcando las sondas con tintes fluorescentes de diverso color.

Hay programas informáticos especiales que captan datos automáticamente. Las matrices pueden aplicarse al diagnóstico, al estudio de la expresión de genes y al desarrollo o análisis de mapas genéticos, entre otros objetivos. Sin embargo, la tecnología es todavía relativamente costosa, en particular en su etapa inicial, y la cantidad de datos generados puede ser imponente.

Referencias básicasAlscher, R. 2001. Grid it: resources for microarray research. http://www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit/

Brown, V.O. y D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genet. 21(supp): 33-37.

Richmond, T. y S. Somerville. 2000. Chasing the dream: plant EST microarrays. Current Opinion Plant Biol. 3(2):108-116.


Una matriz hibridada

http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html

La imagen es cortesía de Mark D’Ascenzo, Boyce Thompson Institute for Plant Research, Center for Gene Expression Profiling, Cornell University.


Matrices: Ventajas y desventajas

f Ventajas:• Tecnología de alto rendimiento• Exploración del genoma entero• Permite el descubrimiento de la relación genotipo-

fenotipof Desventajas:

• Debe estar disponible la información sobre la secuencia de los genes

• Costosa• Tiene requisitos técnicos considerables• La cantidad y el tipo de los datos producidos

requiere de un alto nivel de pericia en computación y de un equipo avanzado


Matrices: Ejemplos de aplicaciones

f Identificación de secuencias (génicas o de mutación génica)

f Determinación del nivel de expresión de los genes

• Ensayo de la abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico

• Análisis de la expresión de gran número de genes (matrices de ADNc)

• Identificación de gran número de marcadores específicos de ADN (por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o SNP) mediante hibridación molecular (matrices de oligonucleótidos sintéticos)


Tecnología de matrices de diversidad (DArT)

Comprende dos pasos:

f Generación de la matriz

f Genotipificación de la muestra

Las matrices de diversidad, también llamadas DArT, fueron concebidas por CAMBIA (ver Glosario). Esta tecnología implica un nuevo uso de las matrices que no requiere un conocimiento previo de las secuencias; por tanto, puede convertirse en una herramienta muy útil para los investigadores.

Las siguientes diapositivas de DArT se han tomado, con autorización previa de CAMBIA, del sitio web de dicho Centro: http://www.cambia.org.au/

Referencias básicasCAMBIA. 2000. Enabling innovation. http://www.cambia.org/

Jaccoud, D., K. Peng, D. Feinstein y A. Kilian. 2001. Diversity arrays: a solid-state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29 (4):E25.


f Se clonan los fragmentos generados por restricción, que representan la diversidad de un acervo genético. Al resultado se le llama una 'representación' (de 0.1% a 10% del genoma, comúnmente)

f Se identifican los clones polimórficos de la genoteca obteniendo primero la matriz de fragmentos tomados de un conjunto aleatorio de clones e hibridando luego la matriz con diferentes muestras

f Los fragmentos de los clones polimórficos se inmovilizan en una matriz

DArT: Preparación de la matriz (1)


DArT: Preparación de la matriz (2)Gx Gy Gn ADN de interés

Mezcla de genomas

Clonar fragmentosde la representación Genoteca

Seleccionar clones individuales y amplificar por PCR

Productos de la PCR purificados y ordenados

Utilizar método de reducción de complejidad, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción, ligamiento de adaptadores, amplificación por PCR


f Marcar la representación (ADN) de la muestra con fluorescencia e hibridarla con la matriz

f Examinar la matriz y medir, para cada fragmento de la matriz, la cantidad de señal de hibridación

f Empleando marcas múltiples, contrastar la representación de una muestra con la representación obtenida de otra o con una sonda testigo

DArT: Obtención del genotipo de una muestra (1)


DArT: Obtención del genotipo de una muestra (2)

Cortar, ligar adaptadores y amplificar vía PCR

Gx GySeleccionar 2 genomas para el análisis

Utilizar el mismo método de reducción de la complejidad que usópara hacer el panel de diversidad

Marcar cada subgrupo genómico: color rojo…

Marcar cada subgrupo genómico: color verde…

Hibridar con la matriz


Una matriz DArT hibridada


DArT: Ventajas y desventajas

f Ventajas:• No requiere información sobre las secuencias• Alto rendimiento • Adquisición rápida de datos y análisis rápido • Detecta cambios de una sola base así como inserciones o

deleciones• Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el enzima

usado para generar los fragmentos• Genera clones listos para secuenciar • Requiere muestras pequeñas de ADN • Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de

mejoramiento• Puede automatizarse totalmente

f Desventajas:• Los marcadores son dominantes• Tiene requisitos técnicos considerables


f Caracterización rápida del germoplasma

f Construcción de mapas genéticos

f Mejoramiento asistido por marcadores

DArT: Ejemplos de aplicaciones


f Sustituciones de una sola base entre secuencias homólogas

f Los SNP se dan con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de polimorfismo

f Pueden identificarse mediante matrices y el equipo DHPLC

Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Un tipo muy reciente de marcador, que está disponible gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación, son los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP). Estos polimorfismos son sustituciones de una sola base entre secuencias. Los SNP ocurren con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de marcador y están o muy cerca del gen que interesa o incluso dentro de él.

Los SNP pueden ser identificados o empleando una matriz o con una máquina de DHPLC.

ReferenciaPatil, N., A.J. Berno, D.A. Hinds, W.A. Barret, J.M. Doshi, C.R. Hacker, y otros. 2001. Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human chromosome 21. Science 294:1719-1723.


Equipo DHPLC

DHPLC se refiere a la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, y se usa para visualizar los SNP.


Interpretación de los SNP (1)

http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm

Este dibujo esquemático del polimorfismo de un solo nucleótido muestra dos fragmentos de ADN (uno en la parte superior y otro en la inferior) que comparten la misma secuencia en 30 pares de bases y difieren sólo en un par: la posición 28 de los fragmentos. En esa posición, un A-T (parte superior) ha cambiado a un C-G (parte inferior).


Interpretación de los SNP (2)

De: Patil y col., 2001. Science 294:1719-1723

SNP #1

SNP #2

La altura del bloque representa un tramo de ADN en un cromosoma. Cada columna de cuadritos representa la misma sección de ADN en un individuo diferente por genotipo. Cada hilera de cuadritos amarillos o azules representa un solo SNP. Los cuadritos azules de cada hilera representan el alelo principal de ese SNP, y los cuadritos amarillos representan el alelo secundario. La ausencia de un cuadrito en cualquier posición de una hilera indica que faltan datos.

En este bloque, se pueden identificar 26 SNP comunes. Pueden organizarse en siete patrones diferentes de haplotipos (número de genotipos: 5, 4, 4, 3, 2, 1 y 1). Entre los cuatro patrones más comunes están 16 de los 20 cromosomas muestreados. Los círculos azules y amarillos indican los patrones alélicos de dos SNP (encerrados por líneas rectas), que distinguen sin ambigüedad los cuatro haplotipos comunes del bloque.


f Continuamente se desarrollan estrategias para mejorar la detección de polimorfismos

f La obtención de secuencias de ADN permite detectar la variación incluso a nivel de los nucleótidos

f Los EST son herramientas poderosas para detectar la diversidad dentro de regiones codificantes

f Las matrices y las DArT hacen posible el análisis simultáneo de muchos loci

f Los SNP son sustituciones de una sola base entre secuencias, y representan la variante más frecuente del ADN

En resumen


f Los diferentes tipos de variación del ADN que pueden detectarse por secuenciación, los EST y los SNP

f El principio fundamental de las matrices y de las DArT

f Las ventajas y las desventajas de las más modernas tecnologías con que se analiza la diversidad genética


Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a edn.). W.H. Freeman y Co., NY.

Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic analysis. Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.

USDA-ARS. 1999. The Cregan lab. http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm

Wang, D.G., J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky, y otros. 1998. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 280(5366):1077-1082.



A continuación


f Glosario

Tecnologías complementarias

AgradecimientosLa producción del módulo títulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje es el resultado de un esfuerzo de colaboración entre el Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos(IPGRI) y el Instituto para la Diversidad Genómica (IGD) de la Universidad de Cornell. Las autoras agradecen especialmente la contribución recibida de las siguientes personas o instituciones:

La Oficina Regional del IPGRI para Asia, el Pacífico y Oceanía, que desde su Proyecto de Árboles Frutales Tropicales apoyado, a su vez, por el Banco Asiático de Desarrollo (ADB), financió en parte la preparación del material de este módulo.

Félix Alberto Guzmán (Oficina Regional de IPGRI-Américas), por su ayuda en la recopilación de la información para los submódulos, especialmente por elegir buenos ejemplos de la aplicación de las tecnologías a estudios reales de diversidad genética, y también por sus sugerencias para hacer que los módulos fueran claros y comprensibles.

Brian V. Ford-Lloyd (Universidad de Birmingham, Reino Unido), quien escribió el módulo de capacitación producido inicialmente por el IPGRI en 1996 (Measuringgenetic variation using molecular markers), que sirvió de base en la preparación del módulo actual, extendido y actualizado. En realidad, conservamos el texto anterior en aquellos sitios en que resultó ser el más apropiado.

Pere Arús (Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, IRTA, España), por ayudar a hacer las diapositivas en que se interpretan los isoenzimas, y por prestarnos la serie de imágenes sobre los procedimientos de laboratorio empleados para detectar isoenzimas. Estas imágenes fueron incluidas en el submódulo correspondiente.

Andrzej Kilian (Centre for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture, CAMBIA, Australia), por permitirnos usar las ilustraciones esquemáticas de la tecnología DArT que aparecen en la página web de CAMBIA.

Steve Tanksley (Cornell University, NY), quien nos prestó diapositivas de su colección didáctica sobre microsatélites para incluirlas en este módulo; también Rebecca Nelson, de Cornell University, por compartir información acerca de la simplificación de los protocolos de AFLP.

Humberto Gómez Paniagua (Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, Colombia, y International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, ICRISAT-Colombia), quien facilitó imágenes de perfiles de RAPD para usarlas como ejemplos de resultados buenos o malos obtenidos con esta tecnología, y nos dio muchas ideas sobre la forma de mejorar la presentación didáctica de este módulo.

Helmer Ayala (Universidad de San Carlos, Guatemala), por la imagen que sirvió de ejemplo de detección de AFLP con tinción de plata; Xiaoming Pang (Universidad de Guizhou, China), por facilitar una imagen de un microsatélite detectado con tinción de plata; y Kamel Chabane (International Center for Agricultural Research in Dry Areas, ICARDA, Siria) y Martin Fregene (CIAT, Colombia), quienes proporcionaron imágenes de diferentes marcadores moleculares, para fondo de las diapositivas de varios submódulos.

El personal de la Unidad de Recursos Genéticos del CIAT (Colombia), por permitirnos tomar fotos de los procedimientos de detección de isoenzimas en su laboratorio.

Heiber Cárdenas (Profesor del Departamento de Biología, Universidad del Valle, Cali, Colombia), quien ensayó el módulo de capacitación con cinco de sus estudiantes (Iván Andrés González, Olga Lucía Agudelo H., Martha Nora Moyano, Fernando Rondón G. y Diego Mauricio Villamarín M.) e hizo comentarios valiosos para el mejoramiento del módulo.

Luigi Guarino, Ramanatha Rao, Issiaka Zoungrana, Margarita Baena, Toby Hodgkin, Jan Engels, Paul Neate y Elisabeth Goldberg (de diferentes oficinas del IPGRI), por sus comentarios y sugerencias sobre la forma de mejorar este producto y hacerlo más útil a nuestros socios.

José Ignacio Cubero Salmerón (Universidad de Córdoba, España), por su ayuda para lograr una traducción adecuada de los nombres de las tecnologías de marcadores del inglés al español.

W. H. Freeman y los Editores de Company/Worth (Nueva York), quienes dieron autorización para reproducir las versiones modificadas de las figuras 4-3, 11-12, 12-3(a), 12-6, 12-7(c), 12-7(d), 14-20, 14-24, 14-29 y 17-10(a) del libro que publicaron en 1996 bajo el título Introducción al Análisis Genético (escrito por Griffiths et al.).

Francisco Motta, por su ayuda en la edición de estilo del manuscrito en español.

Elizabeth L. McAdam, por su ayuda en la revisión del manuscrito en inglés y por sus útiles sugerencias para mejorar el formato de este producto.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Tecnologías complementarias 1

Tecnologías complementarias




Contenido

f Introducciónf Electroforesis en geles de gradiente

desnaturalizante (DGGE)f Electroforesis en geles de gradiente de

temperatura (TGGE)f Polimorfismo de conformación de cadena única

(SSCP)f Análisis de heteroduplexf Cromatografía líquida desnaturalizante de alto

rendimiento (DHPLC)


f Hay varias tecnologías que sirven para señalar la presencia de diferencias en las secuencias

f Ayudan a reducir la posibilidad de que sea necesario secuenciar algo (¿hay algún polimorfismo que merezca secuenciarse?)

f No indican, sin embargo, en qué consisten las diferencias que hay en las secuencias

Introducción

Cuando se buscan diferencias en la secuencia del ADN, es necesario que podamos separar segmentos específicos de ADN de una mezcla (p.e. del genoma entero).

La electroforesis separa las moléculas sometidas a un campo eléctrico basándose en su carga, su tamaño y su forma. Si una molécula de ADN se corta en secciones pequeñas y se coloca en un pocillo en el extremo (cátodo) de un gel de agarosa, los fragmentos de ADN se moverán a través del gel hacia el ánodo. La velocidad del movimiento dependerá de los tamaños individuales, de manera que aparecerán bandas en el gel en diferentes posiciones. Las bandas pueden visualizarse luego con tinción de bromuro de etidio, un compuesto que le da fluorescencia al ADN bajo la luz ultravioleta.

El mismo resultado se logra con la electroforesis en gel de acrilamida, siendo la única diferencia el grado de resolución. La acrilamida permite discriminar diferencias más pequeñas en el tamaño de los fragmentos que la agarosa.

La electroforesis es un procedimiento de diagnóstico que permite identificar moléculas de diferentes tamaños. Cuando se emplea como tal, la electroforesis es un medio para mostrar polimorfismos y, en consecuencia, la variación genética que hay entre genotipos.

La electroforesis, no obstante, puede ser también útil como un primer paso hacia la identificación y el aislamiento de moléculas específicas de ADN que, aunque del mismo tamaño, difieren en la composición de sus secuencias.


f Hace posible la detección de polimorfismos o de mutaciones muy pequeñas del ADN

f También se puede aplicar a fragmentos de ADN grandes, que midan cientos de pares de bases

f No requiere un conocimiento previo de la existencia de algún polimorfismo

f Se basa en las propiedades de renaturalizaciónde las cadenas de ADN

f La desnaturalización del ADN tiene lugar durante la electroforesis

Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) (1)

Referencia básicaMyers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.


f Fragmentos pequeños de ADN se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida bajo condiciones de desnaturalización progresiva (con concentraciones de formamida/urea)

f El ADN se ‘deshace’ y se convierte en ADN de cadena simple

f Las moléculas del ADN cambian de forma y se detienen

f Se identifican entonces las diferencias en la secuencia del ADN


Primero, los fragmentos de ADN migran como moléculas de cadena doble. Más adelante, y a causa de la composición cambiante del gel, las moléculas se desnaturalizan, y se convierten en cadenas simples formando una estructura ramificada. Esta estructura, así modificada, reduce la capacidad de las moléculas para moverse a través del gel.

El punto en que el ADN se ‘deshace’ depende de la secuencia de los nucleótidos en la región afectada. Por consiguiente, la ubicación final de las moléculas en el gel depende de la secuencia nucleotídica de los fragmentos.


La DGGE puede ser un proceso de dos etapas:

f Las muestras se hacen migrar para separar los fragmentos según su tamaño

f Los fragmentos se separan en las condiciones de la DGGE según el proceso de ‘punto de fusión’


Cuando las muestras se mezclan, las bandas dobles indican diferencias de secuencia entre las bandas del mismo tamaño

Se calcula que, con este procedimiento, se pueden detectar al menos 95% de las diferencias en la composición de las secuencias.

La DGGE sirve también para distinguir los genotipos homocigotos de los heterocigotosrespecto a un fragmento determinado de ADN. Para aprovechar esta capacidad, después del último ciclo de la PCR debe hacerse un ciclo de desnaturalización y otro de 'renaturalización'. A medida que los alelos se reasocian, se forman homoduplex y heteroduplex. En un gel de DGGE, las combinaciones homoduplex que migran rápidamente indicarán genotipos homocigóticos. Los genotipos heterocigóticos presentarán combinaciones tanto de homoduplex como de heteroduplex. Los heteroduplex se forman a causa del emparejamiento erróneo y de la desnaturalización rápida en el gel, los cuales detienen el curso migratorio de estas moléculas.


f Es similar a la DGGE

f Las condiciones de desnaturalización progresiva se logran con un gradiente de temperatura, no por cambios en la concentración de los reactivos

f Puede emplearse también para analizar ARN de cadena simple y proteínas

Electroforesis en geles de gradiente de temperatura (TGGE)

Referencia básicaMyers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.


Polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) (1)

f La técnica de SSCP se basa en el comportamiento electroforético de una molécula de ADN de cadena simple a través de un gel de acrilamida no desnaturalizante

• Una molécula de cadena simple tiene la propiedad de formar estructuras secundarias gracias a apareamientos internos de sus bases

• Estas estructuras secundarias dependen de la secuencia y dan lugar a formas particulares en cada molécula de cadena simple

f Las diferencias de estructura secundaria hacen que las cadenas de ADN migren de modo diferente en el gel

La técnica de SSCP puede distinguir entre dos secuencias de ADN muy similares, sólo basada en la forma específica de sus estructuras de cadena simple. Por consiguiente, pueden discriminarse, en principio, hasta dos alelos del mismo gen.

Referencia básicaHayashi, K. 1992. A method for the detection of mutations. Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79.


SSCP (2)

f La secuencia objeto de estudio se somete a la PCRf Enseguida, el producto de la PCR se desnaturaliza

a 94°C y se enfría rápidamente en hielo. Las moléculas de cadena simple no se emparejan pero forman estructuras secundarias estables

f Los fragmentos reasociados se someten luego a electroforesis:

• En el caso de un homocigoto, se observarán dos bandas, cada una de las cuales corresponde a una estructura secundaria ligeramente diferente

• En el caso de un heterocigoto, podrán observarse cuatro bandas, por lo menos

SSCP es una técnica sencilla, sin embargo tiene dos desventajas principales, por lo menos:

• El comportamiento electroforético de las moléculas de cadena simple es impredecible, porque depende mucho de la temperatura y de las condiciones en que ocurre la migración.

• Si se trata de fragmentos largos de ADN (> 200 pb), el método se vuelve insensible a algunas mutaciones. En principio, el SSCP funciona mejor, al parecer, para analizar inserciones o deleciones pequeñas.


Análisis de heteroduplex

f Dos productos amplificados mediante la PCR se mezclan en cantidades iguales, se desnaturalizan a 95°C y se dejan enfriar

f Durante el enfriamiento, las cadenas de ADN se reasocian para formar ADN heteroduplex

f Cualquier acoplamiento erróneo en el heteroduplex dará lugar a una estructura tridimensional diferente, cuya movilidad se reducirá proporcionalmente al grado de divergencia de las secuencias

Referencia básicaDelwart, E.L., E.G. Shpaer, J. Louwagie, F. McCutchan, M. Grez, H. Rübsamen Waigmanny J.I. Mullins. 1993. Genetic relationships determined by a heteroduplex mobility assay: analysis of HIV env genes. Science 262:1257-1261.


f Este método puede detectar diferencias de secuencia en un solo par de bases, así como inserciones y deleciones

f Funciona con los productos directos de la PCR y no requiere la secuenciación previa del ADN

f Está basado en la elución diferencial del ADN homoduplex y el heteroduplex cuando migran a través de una columna cromatográfica

Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC): Metodología

La DHPLC es un método de cromatografía líquida de alto rendimiento, en el cual se separan fragmentos de ADN según su tamaño o según la presencia de heteroduplex (cadenas de ADN reasociadas) durante su tránsito por un gradiente de una columna.

En el ADN amplificado de cadena doble, los nucleótidos que se asocian erróneamente a causa de mutaciones y polimorfismos se hacen evidentes después de la formación de heteroduplex. La presencia de estos polimorfismos crea una mezcla de heteroduplex y homoduplex durante la reasociación del ADN salvaje y del mutante. Si esta mezcla de fragmentos se hace migrar, mediante HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes, los heteroduplex fluyen de la columna antes que los homoduplex debido a su temperatura de fusión más baja.

Este análisis puede hacerse para detectar variaciones de secuencia entre individuos o para determinar heterocigosidad.

Referencia básicaOefner, P.J. y P.A. Underhill. 1998. DNA mutation detection using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). En: Current Protocols in Human Genetics, Suplemento 19, [7.10.1]-[7.10.12]. Wiley & Sons, NY, E.U.


DHPLC: Aplicaciones

f Descubrimiento de nuevas mutaciones y polimorfismos en cualquier fragmento de ADN o en cualquier secuencia específica de un gen

f Evaluación de clones para identificar fragmentos candidatos para secuenciación

f Evaluación de la fidelidad de fragmentos amplificados

f Diagnóstico de la presencia de mutaciones conocidas


En resumen

f Varias tecnologías sirven para identificar la presencia de diferencias en las secuencias

f Aunque no pueden identificar la variante, pueden ciertamente ayudar a reducir el intervalo de posibles estrategias que se emplearían para detectarla



Los principios básicos de:f La electroforesis en geles de gradiente

desnaturalizante (DGGE)f La electroforesis en geles de gradiente de

temperatura (TGGE)f El polimorfismo de conformación de cadena

única (SSCP)f El análisis de heteroduplexf La cromatografía líquida desnaturalizante de alto

rendimiento (DHPLC)


A continuación

f Glosario

Consideraciones finales

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Consideraciones finales 1

Consideraciones finales




Contenido

f Al elegir una técnica...

f Aplicaciones prácticas


Al elegir una técnica...

Haga primero la pregunta biológica:

f ¿Cuál es el problema?

f ¿Cuántos loci o alelos (o ambos) se requieren?

f ¿A qué nivel se busca discriminar?

f ¿Es importante la modalidad de herencia del marcador?


¿Cuál es el problema que se presenta? Esta es la pregunta más importante. El primer paso es conocer exactamente la pregunta biológica a la que se quiere responder con la investigación. Este conocimiento es esencial para elegir la técnica correcta. Por ejemplo, para obtener información sobre historia de poblaciones o sobre relaciones filogenéticas, deben usarse datos de secuencias o de sitios de restricción.

Número de loci o de alelos (o de ambos) que se requiera¿Será suficiente la información derivada de unos pocos loci o se requerirá un examen más amplio del genoma? Los isoenzimas son limitados. Los AFLP detectan un alto número de loci. Cuando se requiere alta variabilidad, las mejores técnicas son las que se basan en loci específicos (por ejemplo, SSR).

Nivel de discriminaciónHay que definir el nivel taxonómico al cual queremos medir la variación genética: ¿Dentro de poblaciones, entre especies o entre géneros? ¿Es el método escogido el apropiado para detectar el nivel deseado de variación?

Modalidad de herencia¿Deberían identificarse tanto los homocigotos como los heterocigotos? ¿Se necesitan marcadores codominantes (RFLP de copia única, aloenzimas, microsatélites amplificados por PCR) o bastarán marcadores dominantes (RAPD, AFLP)? Si es suficiente la información que indique presencia o ausencia, se puede emplear cualquier tecnología de marcador molecular; pero si se necesita información acerca de los heterocigotos (por ejemplo, estructura poblacional y estructura de la diversidad, noción del tipo de herencia) deberían usarse solamente marcadores codominantes como los isoenzimas o los microsatélites.


Al elegir una técnica... (continuación)

Recursos:

f ¿Es importante disponer de ADN de buena calidad?

f ¿Se dispone de la experiencia adecuada?

f ¿Se cuenta con un laboratorio bien equipado?

f Costos:• Equipo• Reactivos

f Rapidez


Disponibilidad del ADNEl análisis de RFLP requiere cantidades grandes de ADN. La mayoría de los métodos basados en la PCR requieren sólo cantidades mínimas de ADN obtenido por métodos sencillos. En muchos casos, la PCR se lleva a cabo sólo para amplificar la cantidad original del ADN objeto de estudio.

Experiencia requeridaLas tecnologías que contemplan la hibridación o la secuenciación manual tienen más requisitos técnicos que las otras. Los RAPD o los SSR (estando ya disponibles los cebadores) son los que presentan menos exigencias.

Disponibilidad de instalaciones y de equipo de laboratorio Una vez aclaradas las preguntas biológicas, los criterios técnicos y de organización adquieren importancia a la hora de seleccionar una tecnología. Consideremos, por ejemplo, los siguientes: (1) tener acceso a un laboratorio que tenga el equipo adecuado; (2) tener presupuesto para adquirir equipo adicional y reactivos cuando sean necesarios; (3) poseer buenos conocimientos de habilidades básicas de laboratorio; y (4) tener nociones básicas sobre diseño experimental y su ejecución.

CostosHablando de costos, los isoenzimas son los más baratos; RAPD, RFLP e incluso AFLP son de costo intermedio; la secuenciación es aún más costosa que los anteriores. Deben considerarse los costos de todos los tipos de experimentos, porque la falta de reproducibilidad de algunos marcadores puede ocasionar, al final, costos mayores. Respecto a las habilidades necesarias, una visita prolongada a otro laboratorio en que se empleen las técnicas requeridas aporta, a menudo, información excelente para establecer una investigación. Los contactos personales que puedan ayudar en los primeros pasos de la investigación, son de un valor inestimable. Rapidez¿Con qué rapidez se necesitan los datos y qué tiempo nos rendirá el equipo disponible? Los métodos basados en la PCR dan, sin duda, resultados rápidos cuando se dispone ya de los cebadores. Los métodos basados en la hibridación son más lentos. La secuenciación convencional del ADN es lenta, mientras que la secuenciación automatizada es más rápida.


Otros asuntos relacionados:

f Reproducibilidad

f Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas en la PCR

f Últimas estrategias

Al elegir una técnica... (continuación)

Reproducibilidad¿Es necesario emplear métodos sólidos? Preguntemos, por ejemplo: ¿se intercambiarán los marcadores? ¿Participa más de un laboratorio en la investigación? En tales casos, los isoenzimas, los RFLP, los SSR y la secuenciación son sólidos, pero los RAPD no lo son. Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas en la PCRLas técnicas de marcadores moleculares basadas en la PCR abren numerosas posibilidades y podrían considerarse entre las primeras a la hora de decidir, en razón de su sencillez. Las técnicas basadas en hibridación suponen un trabajo más intenso, tienen mayores exigencias técnicas y requieren un equipo diferente.

• RAPD es una técnica excelente que ayuda a familiarizarse con la PCR. Permite el examen rápido de los polimorfismos en la mayoría de las especies de interés y se dispone fácilmente de cebadores.

• Otros marcadores basados en la PCR, como los SSR, se pueden aplicar con relativa facilidad, cuando los cebadores están disponibles. Cada vez más, éste es el caso en muchas especies. Están mejorando también las estrategias para buscar cebadores apropiados, y hay enfoques de búsqueda de microsatélites que se apoyan en bases de datos de secuencias, de manera que se puede eludir la dificultad de tener que elaborar y examinar genotecas en el laboratorio.

• Los AFLP se han convertido en una opción muy popular; sin embargo, los requisitos de una PCR doble y la electroforesis en geles verticales los hacen más costosos y elevan sus requisitos técnicos.

Últimas estrategiasLos costos de los experimentos de secuenciación han disminuido significativamente. Muchos EST están ya disponibles para varias especies. Las matrices, basadas ya sea en la caracterización anónima del genoma o en la expresión génica, se están convirtiendo en técnicas comunes. La tecnología de matrices plantea todavía muchas exigencias, tanto técnicas como relativas al equipo. Antes de decidirse por ella, es importante familiarizarse con las técnicas, sus requisitos y los resultados que entrega. Una mejor opción sería considerar la contratación del servicio de análisis de muestras y concentrarse en la interpretación de los resultados y en la toma de decisiones. Los SNP se usan habitualmente en los estudios realizados con seres humanos. Son todavía demasiado costosos para aplicarlos a los estudios corrientes de diversidad genética de plantas. Se orientan, no obstante, al último nivel de variación de la secuencia del ADN, es decir, a los nucleótidos, y tienen muchas probabilidades de ser la mejor opción como marcador molecular en el futuro, cuando hayan disminuido los costos de su descubrimiento y de su aplicación.


Aplicaciones prácticas: Estudios de diversidad genética

f Parentesco genético y diversidad: genética de poblaciones

f Estudio del polimorfismo en razas locales y en cultivares

f Identificación de cultivares y taxonomía

f Estudios filogenéticos

f Estudios de domesticación y evolución

f Flujo de genes e introgresión

f Cartografía comparativa de genomas

Algunos de los submódulos anteriores describen experimentos reales, en los cuales se aplicaron las técnicas moleculares para responder a preguntas sobre diversidad genética. En ellos se dieron también listas de referencias sobre la tecnología correspondiente.


Aplicaciones prácticas: Manejo de germoplasma

f Caracterización taxonómica de germoplasmaf Mantenimiento de las colecciones:

• Identificación de ausencias • Identificación de duplicados• Constitución de colecciones nucleares• Evaluación de la estabilidad del material conservado• Medición de la erosión genética

f Desarrollo de estrategias de conservación

Los marcadores moleculares pueden usarse en el manejo de los bancos de germoplasma para:

• Identificar con exactitud el germoplasma

• Seleccionar el germoplasma que necesitan usar los mejoradores y otros investigadores. Ejecutar el mantenimiento rutinario del banco, que se simplificarágracias a la identificación de duplicados, a la evaluación de la estabilidad por medio de diferentes rondas de regeneración o multiplicación, y a la medición de la erosión genética

• Identificar las ausencias que tiene la colección para planear futuras actividades de conservación y de recolección. Definir colecciones nucleares, con el complemento de otros datos, asegurando al máximo la riqueza alélica de la colección

Asimismo, la información molecular puede usarse para definir estrategias de conservación, tanto ex situ (por ejemplo estrategias de recolección) como in situ.


f Localización de genes en mapas genéticos y su identificación

f Selección asistida por marcadores para el fitomejoramiento

f Detección de variación somaclonal

f Evaluación de germoplasma para descubrir genes útiles

f Análisis de parentesco

f Identificación de híbridos

Aplicaciones prácticas: Uso del germoplasma

Las tecnologías moleculares ayudan a promover el uso del germoplasma al suministrar datos exactos acerca de los atributos genotípicos de las plantas, incluyendo las cultivadas. La caracterización del germoplasma ofrece información sobre la composición genómica del individuo y, como tal, permite que los mejoradores seleccionen material promisorio basados en el genotipo tanto como en el fenotipo. La construcción de mapas de ligamiento moleculares ha abierto la posibilidad de ubicar caracteres agronómicos importantes en los genomas de los cultivos y, en consecuencia, de seleccionar germoplasma partiendo de la presencia de un gen específico de interés. La introgresiónde genes a partir del germoplasma ‘donante’ puede seguirse en las generaciones posteriores, mediante la denominada selección asistida por marcadores, facilitando y acelerando los ensayos tradicionales de selección.

Las tecnologías de marcadores moleculares se emplean también para detectar la variación somaclonal —potencialmente útil para el fitomejoramiento— la cual se presenta a veces después de la regeneración que sigue al cultivo de tejidos. Estas tecnologías pueden ayudar también en las actividades corrientes de mantenimiento de un programa de fitomejoramiento, tales como seguirle el rastro a la descendencia a través del análisis de parentesco, identificar los individuos fuera de tipo en los lotes de semilla, y confirmar o rechazar la pureza híbrida.

Se espera que las herramientas más modernas de la genética molecular aceleren los procedimientos de fitomejoramiento mediante actividades como facilitar el descubrimiento rápido de genes útiles en las colecciones de germoplasma o correlacionar el genotipo con el fenotipo de los individuos.


En resumen

f Los criterios más importantes que se aplican en la elección de una técnica molecular para un estudio de diversidad genética son:

• La pregunta biológica que motiva el estudio • Los recursos de que se dispone frente a los que se

requierenf Las aplicaciones de las tecnologías moleculares

abarcan todos los aspectos del análisis de la diversidad genética, del manejo del germoplasma y del uso del germoplasma



f Los criterios que le ayudarán a acertar en el proceso de selección de las tecnologías moleculares y en su aplicación a los recursos fitogenéticos de interés


A continuación

Glosario

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas:


Glosario

Accesión: Muestra de un cultivo recolectada en una localidad y en un tiempo específicos; puede ser de cualquier tamaño. Se llama también entrada (por la acción de 'entrar' en una colección o tener 'acceso' a ella)

Acervo genético: La suma total de los genes, con todas sus variantes, propios de una especie determinada en un momento dado.

ADN: Acido desoxirribonucleico, una cadena doble de nucleótidos unidos entre sí (en los que el componente azúcar es la desoxirribosa), que es la molécula fundamental en la trasmisión de los genes.

ADNc o ADN complementario: ADN trascrito de una molécula de ARN por un enzima llamada transcriptasa inversa.

ADNcp: ADN de los cloroplastos.

ADN homoduplex: Molécula de ADN de doble cadena en la que ambas cadenas tienen el mismo origen.

ADN microsatélite: Tipo de ADN repetitivo que consiste en repeticiones muy cortas, tales como dinucleótidos, trinucleótidos o tetranucleótidos. Ver también ADN repetitivo.

ADN minisatélite: Tipo de secuencia de ADN repetitivo que consiste en repeticionescortas que tienen un núcleo común único. Ver también ADN repetitivo.

ADNmt: ADN de las mitocondrias.

ADN polimerasa: Cualquier enzima que sea capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de un ADN patrón.

ADN repetitivo: Tramo de ADN que consta de repeticiones múltiples de un motivo. Ver también ADN microsatélite, ADN minisatélite y ADN satélite.

ADN satélite: Repetición de alta frecuencia (desde 1000 hasta más de 100,000 copias) de un motivo básico o unidad de repetición (comúnmente de 100 a 300 pares de bases) que se presenta en unos cuantos loci del genoma. Ver también ADN repetitivo.

AFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados. Es un método muy sensible para detectar polimorfismos del ADN. Primero se somete el ADN a digestión con dos enzimas de restricción; luego se selecciona un subconjunto de los fragmentos de ADN que resultan de la digestión para que sean amplificados en la PCR y, finalmente, visualizados.

Alelo: Una de las formas alternas de un gen que puede existir en un locus.

Alelo dominante: Alelo que expresa su efecto fenotípico aun cuando esté en heterocigosis con un alelo recesivo (ver este término). Es decir, si A es dominante sobre a, entonces AA y Aa tienen el mismo fenotipo.

Alelo recesivo: Alelo cuyo efecto fenotípico no se expresa en condición heterocigótica porque es ocultado por el alelo dominante.

Aloenzima: Isoenzima cuya síntesis es controlada por los alelos codominantes de un gen.

Aminoácidos: Compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico amino (–NH2) y un grupo ácido carboxilo (–COOH). También se llaman ácidos aminos.

Análisis de heteroduplex: Es el estudio de la movilidad del ADN heteroduplexsometido a electroforesis en geles de poliacrilamida. La reducción en la movilidad del ADN heteroduplex, comparada con la del ADN homoduplex, es proporcional al grado de divergencia de las secuencias. Ver también DGGE, SSCP y TGGE.

Apomixis: Es la producción de un embrión sin meiosis. Las plantas superiores apomícticas producen semillas asexuadas, que provienen de tejido materno solamente.

AP-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar. Una técnica para amplificar tramos anónimos de ADN mediante la PCR. Está relacionada con el RAPD.

Árbol genealógico: Diagrama simplificado del linaje de una familia que muestra las relaciones entre los miembros de la familia y cómo se han heredado un carácter dado o enfermedades.

ARN: Ácido orgánico constituido por unidades de nucleótidos de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U) que se repiten, cuyos componentes de ribosa están unidos con enlaces de tipo fosfo-diester.

Autogamia: Es la transferencia del polen desde la antera de una flor al estigma de la misma flor o, a veces, al de una flor genéticamente idéntica (o sea, de la misma planta o del mismo clon). Es también la habilidad que tienen muchas especies vegetales de lograr con éxito la fertilización natural de ellas mismas. Se llama también autopolinización.

Autorradiografía: Es una técnica en que las moléculas marcadas radiactivamente se visualizan en una película de rayos X.

Bacteriófago: Virus que infecta bacterias. Sus formas genéticamente alteradas se usan como vectores para clonar el ADN.

Banco de germoplasma: Instalación que se construye para la conservación ex situde individuos (semillas), tejidos o células reproductivas de plantas o animales.

Base: Unidad química que caracteriza a un nucleótido. En el ADN, las bases son: adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). Las bases del ARN son adenina, guanina, uracilo (U) y citosina.

Bases nitrogenadas: Moléculas que son componentes importantes de los ácidos nucleicos; están constituidas por una estructura de anillo que contiene nitrógeno. Los puentes de hidrógeno que unen las bases sirven de enlace a las dos cadenas de ADN para formar la doble hélice.

CAPS: Secuencia de restricción amplificada y polimórfica, conocida también como PCR-RFLP; es una técnica que detecta polimorfismos en un locus específico. Un locus se somete a la amplificación por PCR y los polimorfismos resultantes se detectan por las diferencias en tamaño de los fragmentos de restricción entre individuos.

Carácter: O rasgo, atributo de los individuos de una especie para el cual pueden definirse varias diferencias hereditarias.

Cebador: Fragmento corto de ADN o de ARN hibridado con un ADN de cadena simple, y al cual pueden agregarse más nucleótidos mediante la polimerasa de ADN.

Cebador arbitrario: Cebador constituido por un oligonucleótido corto, que se usa en ciertos métodos de PCR para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN patrón.

Centrómero: La región constreñida de un cromosoma, a la cual se adhieren las fibras del huso durante la división celular.

Clonación: En biología molecular: es el proceso en que, mediante procedimientos de manipulación del ADN, se producen copias múltiples de un único gen o de un segmento de ADN.

Codominancia: Es la situación en que un individuo heterocigótico exhibe el fenotipo de ambos alelos de un gen específico.

Conservación ex situ: (1) Método de conservación que implica la remoción de los recursos de germoplasma (semilla, polen, esperma, organismos individuales) de su hábitat original o de su ambiente natural. (2) Es la acción de mantener vivos los componentes de la diversidad biológica fuera de su hábitat original o de su ambiente natural. Ver Conservación in situ

Conservación in situ: Es un método de conservación que pretende preservar la integridad genética de los recursos genéticos manteniéndolos dentro de los ecosistemas de evolución dinámica del hábitat original o del ambiente natural. VerConservación ex situ.

Cromatina: Complejo de ADN y proteínas de la célula en la interfase.

Cromosoma: Organización lineal continua de genes y de otro ADN, además de proteínas y del ARN asociado.

Cuello de botella: Breve reducción del tamaño de una población que ocasiona, generalmente, deriva genética aleatoria.

DAF: Amplificación de la huella de ADN. Técnica que amplifica tramos anónimos de ADN, aplicando la PCR. Está relacionada con el RAPD.

DArT: Tecnología de matrices de diversidad.

Deleción: Es una clase especial de mutación en que se pierde parte del ADN de un cromosoma.

Dendrograma: Todo diagrama ramificado que muestre, mediante líneas en forma de U, una jerarquía de categorías u objetos basada en el grado de semejanza o en el número de caracteres compartidos. La longitud de cada rama en U representa, a veces, la distancia que separa los dos objetos conectados.

Deriva genética: Es un cambio de frecuencia alélica entre una generación y la siguiente de una población, debida al muestreo de un número finito de genes, inevitable en todas las poblaciones de tamaño finito. Cuanto más pequeña es la población, mayor es la deriva genética, y el resultado será que algunos alelos se pierdan y que la diversidad genética se reduzca.

Desnaturalización: Es la separación de las dos cadenas de la doble hélice del ADN, o la ruptura severa de una molécula compleja sin que se destruyan los enlaces principales de sus cadenas.

DGGE: Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante. Método para separar fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones cada vez más desnaturalizantes (generalmente, por concentración creciente de formamida o de urea). Ver también Análisis de heteroduplex, SSCP y TGGE.

DHPLC: Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento. Este método permite detectar la variación en la secuencia de un sólo par de bases.

Doble hélice: Estructura propuesta por Watson y Crick (los primeros en hacerlo) para el ADN, que consta de dos hélices afines unidas por enlaces de hidrógeno que se establecen entre las bases apareadas.

Ecotipo: Población o raza de un organismo adaptada a un hábitat específico.

Electroforesis: Técnica que separa, los componentes de una mezcla de moléculas (proteínas, ADN, ARN) según su tamaño, como resultado de un campo eléctrico en un gel que sirve de soporte.

Elemento transponible: Elemento genético que tiene capacidad para moverse de un sitio a otro en un cromosoma. Algunos se asemejan a los retrovirus y es posible que se hayan originado en ellos.

Enzima: Proteína que funciona como catalizador de reacciones bioquímicas.

Enzima de restricción: Endonucleasa que reconoce como objetivo una secuencia específica y corta la cadena de ADN en ese punto.

EST: Marcador de secuencia expresada. Es una sección pequeña de la parte activa de un gen, y está hecha de ADNc. Puede usarse como un marcador, para buscar el resto del gen o para ubicarlo en un segmento más grande de ADN.

Eucariota: Célula u organismo que posee un núcleo rodeado por una membrana, y otros componentes subcelulares diferenciados.

Fenotipo: (1) Forma en que se manifiesta un carácter (o grupo de caracteres) en un individuo determinado; (2) la apariencia externa perceptible de un genotipo específico.

F 1, F 2, F 3, …: Notación abreviada que se usa para indicar las diferentes generaciones que ocurren en un experimento de mejoramiento. F1 es la primera generación filial, o sea, la descendencia del cruzamiento paterno; F2 es la segunda generación filial, o sea, la descendencia de la autofecundación o del cruzamiento de los individuos de la F1; y así sucesivamente.

Flujo génico: Intercambio de genes entre poblaciones diferentes aunque, por loregular, con alguna relación.

Fragmento de restricción: Fragmento de ADN que ha sido cortado por un enzima de restricción.

Frecuencia alélica: Es una medida de la presencia continua o asidua de un alelo en una población, o de la proporción que representa de todos los alelos de un gen.

Gen: Unidad básica, tanto física como funcional, de la herencia, que transmite información de una generación a la siguiente. Es un segmento de ADN que incluye una sección transcrita y un elemento regulador que permite su transcripción.

Gen estructural: Cualquier gen que codifique para una proteína.

Genoma: Todo el complemento de material genético en un organismo.

Genoteca: Colección de clones de ADN obtenidos de un donante de ADN.

Genotipo: Composición específica de alelos de toda la célula o, más comúnmente, de determinado gen o de un conjunto de genes.

Germoplasma: La variabilidad genética total disponible de una población de organismos representados por células germinales, semillas, etc.

Haplotipo: Constitución alélica específica de cierto número de loci en un bloque de ligamiento definido.

Herencia: Proceso en que se transmiten los rasgos genéticos de los progenitores a sus progenies.

Herencia citoplasmática: Herencia de los genes encontrados en los organelos del citoplasma (los cloroplastos o las mitocondrias).

Heteroduplex: Molécula de ADN de doble cadena o híbrido de ADN y ARN, en que cada cadena tiene un origen diferente.

Híbrido: Puede ser: (1) un individuo heterocigótico, o (2) un individuo descendiente de un cruzamiento entre progenitores de diferente genotipo.

Hibridación: En biología molecular, es la unión de secuencias complementarias de ADN y/o de ARN para formar una estructura de doble cadena.

Homólogo: Correspondiente o similar en estructura, posición u origen.

Huella identificadora de ADN: Patrón único de fragmentos de ADN que puede revelarse mediante la hibridación Southern o la PCR.

Inserción: Anormalidad cromosómica en la que se inserta una secuencia de ADN en un gen, lo que distorsiona la estructura y la función normales de ese gen.

Isoenzima: Formas múltiples de un enzima cuya síntesis es controlada por más de un gen.

ISSR: Secuencia entre repeticiones simples. Los cebadores de la ISSR quedan anclados en sus extremos 3’ para dirigir la amplificación de los segmentos genómicosentre los ISSR.

Ligación: Proceso en que se unen de nuevo dos o más fragmentos de ADN.

Ligamiento genético: Proximidad de dos o más genes en un cromosoma, de modo que los genes tienden a heredarse juntos.

Ligasa: Tipo de enzima que puede unir de nuevo un enlace fosfo-diester roto de un ácido nucleico.

Locus (pl. loci): Sitio específico de un cromosoma donde está localizado un gen o un trozo definido de ADN.

MAAP: Caracterización con amplicones múltiples arbitrarios. Término colectivo para las técnicas de tipo PCR en las que se emplean cebadores arbitrarios.

Mapa de genes: Es la determinación de la posición relativa de los genes en un cromosoma o en un plásmido, y de la distancia que los separa.

Marcador: Ubicación física identificable en un cromosoma cuya herencia puede rastrearse (por ejemplo, un gen, un sitio de corte de un enzima de restricción o marcador de RFLP).

Marcador genético: Un alelo, una banda en un gel o un carácter que sirve experimentalmente como sonda para identificar a un individuo o a alguna de sus características.

Matriz: Manchas pequeñas de ADN que se fijan en portaobjetos de vidrio o en membranas de nilón. Esta tecnología se basa en la hibridación de sondas cortas de oligonucleótidos con secuencias complementarias de ADN.

Mutación: Alteración estructural permanente del ADN. En la mayoría de los casos, los cambios ocurridos en el ADN o no tienen ningún efecto o causan algún daño; ocasionalmente, una mutación puede mejorar la probabilidad de supervivencia de un organismo y pasar el cambio favorable a sus descendientes.

Mutación puntual: Cambio en un solo par de bases de ADN.

Nucleasa: Enzima que corta los enlaces de tipo fosfodiéster que enlazan los nucleótidos adyacentes del ADN y del ARN. Una exonucleasa avanza cortando enlaces desde el extremo de la molécula de sustrato; una endonucleasa corta en sitios internos de la molécula del sustrato.

Nucleótido: Molécula compuesta por una base nitrogenada, un azúcar y un grupo de tipo fosfato. Los nucleótidos son los componentes elementales de los ácidos nucleicos.

Oligonucleótido: Segmento corto de ADN sintetizado artificialmente.

Par de bases: Las dos bases de nucleótidos que están situadas en diferente cadena de una molécula de ácido nucleico y que se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno. Las bases pueden emparejarse de dos maneras: adenina con timina (en el ADN) o con uracilo (en el ARN), y guanina con citosina (en ADN y ARN). Vertambién Secuencia complementaria.

Par de genes heterocigótico: Par de genes que tiene dos alelos diferentes en los dos cromosomas de un individuo diploide; por ejemplo, Aa o A1A2.

Par de genes homocigótico: Par de genes en que hay alelos idénticos en ambas copias del cromosoma; por ejemplo, AA o aa.

Patrón: Molécula que sirve como modelo para sintetizar otra molécula; por ejemplo, una molécula de ADN de cadena simple puede usarse como plantilla para sintetizar la cadena de nucleótidos complementaria.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Método para amplificar una secuencia de ADN en grandes cantidades mediante una polimerasa estable al calor y con cebadores apropiados, los cuales dirigen la amplificación de la región del ADN que interesa.

PCR-RFLP: Nombre alternativo para la técnica conocida como ‘Secuencia de restricción amplificada y polimórfica’ o CAPS (Ver este término).

Péptido: Conjunto de dos o más aminoácidos unidos por un enlace péptidico.

Plásmido: Molécula cromosómica de ADN extra que es capaz de replicarse en forma autónoma.

Polimerasa: Término genérico para los enzimas que llevan a cabo la síntesis de un ácido nucleico, usando un patrón de ácido nucleico pre-existente y los nucleótidos apropiados (es decir, ribonucleótidos para el ARN y desoxiribonucleótidos para el ADN).

Polímero: Molécula compuesta por subunidades repetidas.

Polimorfismo: Aparición de diferentes formas asociadas con diversos alelos de un gen o con homólogos de un cromosoma.

Polipéptido: Una proteína, que es una cadena de aminoácidos unidos.

Proteína: Polímero de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, que puede incluir dos o más cadenas polipeptídicas.

RAPD: Polimorfismo de ADN amplificado al azar. Técnica que amplifica tramos anónimos de ADN empleando la PCR con cebadores arbitrarios.

Raza local: Cultivar vegetal o línea animal que ha evolucionado junto con los agricultores tradicionales y ha sido mejorado(a) genéticamente por ellos, sin la intervención de las prácticas modernas de mejoramiento.

Reacción múltiple (en inglés: multiplexing): Es la realización simultánea de varias reacciones diferentes en un mismo tubo de reacción, o la electroforesis simultánea de varios productos de reacción obtenidos separadamente, con el fin de aumentar la eficiencia del proceso.

Recombinación: También llamada sobrecruzamiento. Es la producción de una molécula de ADN con segmentos derivados de más de una molécula del ADN de los progenitores. En los organismos eucariotas, este proceso se realiza mediante el intercambio recíproco de ADN entre cromátidas no hermanas de un par homólogo de cromosomas durante la profase de la primera división meiótica. La recombinación permite a los cromosomas la reorganización de su material genético, y de este modo incrementa el potencial de la diversidad genética.

Recursos genéticos: Genes que se encuentran en plantas y animales y que tienen un valor real o potencial para los seres humanos.

Regiones flanqueantes: Secuencias de ADN que se extienden a uno y otro lado de un gen o de un locus.

Repetición en tándem: Copias múltiples de una misma secuencia de bases en un cromosoma.

RFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. La variación entre los individuos se detecta por las diferencias en los tamaños de los fragmentos de ADN después de la digestión con un enzima de restricción.

SCAR: Región amplificada caracterizada por una secuencia Es un locus identificado a partir de un solo fragmento de RAPD que ha sido secuenciado. Se pueden diseñar cebadores específicos para el locus y usarse para la amplificación específica del fragmento mediante PCR.

Secuenciar: Determinar el orden de los nucleótidos en una molécula de ADN o de ARN, o el orden de los aminoácidos en una proteína.

Secuencia complementaria: Secuencia de una cadena simple de ADN o de ARN, a la cual se puede unir una determinada secuencia de nucleótidos para formar una estructura de doble cadena de uno u otro ácido. Por ejemplo, TAGGAT es la secuencia complementaria de ATCCTA, donde A = adenina, C = citosina, G = guanina y T = timina. Ver también Par de bases.

Secuencia de ADN: Orden de las bases de los nucleótidos en la molécula de ADN.

Secuencia de bases: El orden de las bases de nucleótidos en el ADN o el ARN.

Segregación: Genéticamente, se refiere a la producción de los dos fenotipos separados correspondientes a los dos alelos de un gen.

Sintenia: Se dice que ocurre donde todos los loci se localizan en el mismo cromosoma. Los loci quizás no parezcan ligados por las pruebas genéticas convencionales de ligamiento pero todavía pueden ser sinténicos.

Sitio de restricción: Secuencia determinada de ADN, la cual es reconocida por un enzima de restricción específica de ADN.

SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido. Polimorfismos que resultan de la sustitución de una sola base entre secuencias homólogas.

Sonda: Trozo finito de ácido nucleico empleado para identificar segmentos específicos de ADN que lleven su secuencia complementaria.

SSCP: Polimorfismo de conformación de cadena única. Método para distinguir mutaciones en fragmentos de ADN de tamaño similar según la movilidad del ADN de cadena simple bajo electroforesis de geles de poliacrilamida. Ver también DGGE, análisis heteroduplex y TGGE.

SSR: Repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite.

SSRP: Polimorfismo de repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite.

STMS: Sitios de microsatélite de secuencia etiquetada. Los cebadores son construidos de las regiones que flanquean el ADN microsatélite y pueden usarse en reacciones de PCR para amplificar la región repetida.

STS: Sitios de secuencia etiquetada. Término general dado a un marcador que se define por la ubicación exacta de su cebador y por el orden de las bases.

Telómeros: Extremos distales de cada brazo cromosómico, involucrados en la replicación y en la estabilidad de las moléculas lineales de ADN.

Temperatura de fusión (Tm): Punto medio del intervalo de temperaturas al cual el ADN se desnaturaliza.

TGGE: Electroforesis en geles de gradiente de temperatura. Método para separar fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones desnaturalizantesgradualmente más calientes. Ver también DGGE, Análisis de heteroduplex y SSCP.

Tipo silvestre: Tipo o forma de un organismo o gen que se da con más frecuencia en la naturaleza. Se refiere muchas veces a la forma en que los organismos o los genes se encuentran en la naturaleza, antes de que los investigadores indujeran mutaciones.

Transcripción: Es la síntesis del ARN complementario, usando un patrón de ADN.

Transcriptasa inversa: Enzima que, cuando dispone de un cebador de ADN, cataliza la síntesis de una cadena de ADN complementaria a partir de un patrón de ARN.

Transferencia Southern: Procedimiento en que los fragmentos de ADN, separados mediante electroforesis, son transferidos a una membrana para detectar secuencias de bases específicas mediante sondas complementarias marcadas radiactivamente. Se conoce también como hibridación Southern.

Variación somaclonal: La variación hallada en células vegetativas que se dividen mitóticamente en un cultivo de tejidos.

Vector: Agente (por ejemplo, un plásmido o un virus) que se emplea para transportar un segmento de ADN clonado.

VNTR: Número variable de repeticiones en tándem. Tipo de polimorfismo caracterizado por un número muy variable de copias de secuencias idénticas o estrechamente relacionadas.

Formulario para sugerencias

El tema de este módulo experimenta cambios continuos, lo que hace aconsejable su actualización periódica. Por esta razón, presentamos el módulo en formato electrónico. Para ayudarnos con nuestra tarea de actualización, agradeceríamos recibir comentarios y solicitudes de los usuarios para mejorar aún más el módulo. También nos ayudarán mucho sus opiniones sobre la utilidad de esta herramienta.

Hacemos enseguida unas cuantas preguntas orientadoras para que usted las responda. Puede enviar sus respuestas directamente pulsando el botón ‘Enviar’ al final de esta página, o puede enviarlas por telefax [No: (57-2) 445 0096], por correo postal a su contacto en el IPGRI, o por correo electrónico a alguna de estas direcciones: [email protected] o [email protected]

Preguntas:

1. Descríbanos la forma en que usa esta herramienta…

2. ¿Usted piensa que el módulo…:

a. …proporciona una síntesis global de los conceptos científicos básicosrelativos a las tecnologías de los marcadores moleculares y secuenciación del ADN, y de su uso en el campo de los recursosfitogenéticos?

SíNo¿Por qué?

b. …suministra información sobre la forma de comparar las ventajas y las desventajas de cada tecnología y de contrastarlas entre sí, y permite así tomar decisiones adecuadas respecto a una situación específica de investigación?

SíNo¿Por qué?

c. …proporciona una lista de los recursos bibliográficos actuales para cada una de las tecnologías tratadas?

SíNo¿Por qué?

3. Díganos lo que le gustó y lo que usted cambiaría sobre los siguientes

aspectos del módulo:

a. El contenido

b. La diversidad de tecnologías ofrecidas

c. Los criterios empleados para seleccionar las técnicas

d. La estructura que tienen los submódulos

e. Los dibujos, los diagramas, las imágenes

f. Otros aspectos

4. De los siguientes temas, ¿cuál agregaría usted al módulo para hacerlo más

útil en relación con su situación particular?

a. Referencias básicas

b. Ejemplos de aplicaciones

c. Información adicional sobre conceptos básicos

d. Más tecnologías:

i. Antiguas

ii. Recientes

5. ¿Qué otros temas querría usted ver en este módulo?

5. ¿Fue difícil descargar de Internet el módulo o alguna de sus partes? ¿Por qué?

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M. Carmen de Vicente, IPGRI César López, Univ. La MolinaCorreo electrónico: [email protected] Correo electrónico: [email protected]

Theresa Fulton, IGD, Cornell UniversityCorreo electrónico: [email protected]

IPGRI - El Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) es un organismo internacional autónomo de carácter científico cuya misión es promover la conservación y el uso de los recursos fitogenéticos para beneficio actual y futuro de la humanidad. Es uno de los 16 Centros de Future Harvest que opera bajo los auspicios del Grupo Consultivo sobre Investigación Agrícola Internacional (GCIAI), una asociación de miembros públicos y privados que apoyan las actividades para promover los últimos descubrimientos de la ciencia para reducir el hambre y la pobreza, mejorar la salud y la nutrición y proteger el medio ambiente. El Instituto tiene su sede en Maccarese, cerca de Roma, Italia, y oficinas en más de 20 países del mundo. El IPGRI opera mediante tres programas: (1) el Programa de Recursos Fitogenéticos, (2) el Programa de Apoyo a las actividades en Recursos Fitogenéticos de los Centros del GCIAI y (3) la Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano (INIBAP).

IGD - El Instituto para la Diversidad Genómica (Institute for Genomic Diversity, IGD) se encuentra en la ciudad de Ithaca, Nueva York, Estados Unidos. La misión del IGD es desarrollar, transferir y proveer tecnologías y recursos educacionales, para resolver los problemas que afectan la conservación de la biodiversidad y la seguridad alimentariaglobal. Específicamente, nuestros objetivos son: utilizar estrategias de genómicacomparativa y evolutiva para resolver problemas aplicados; desarrollar y transferir tecnologías capacitadoras en genómica y bioinformática; proveer apoyo a los esfuerzos nacionales e internacionales en conservación, agricultura y mejoramiento de cultivos; y educar y entrenar en todos los niveles (incluyendo pero no limitados a los estudiantes de pregrado y posgrado, científicos visitantes, profesores y personal en general).

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Salvo lo declarado expresamente de otro modo, el IPGRI y Cornell Universityposeen los derechos de autor y todos los demás derechos relacionados con este trabajo. Los individuos pueden copiar e imprimir libremente los materiales para fines educativos o no comerciales, sin necesidad de obtener permiso previo de los propietarios de los derechos de autor. Sin embargo, es un requisito citar la fuente de los materiales.

Citade Vicente, M.C. y Fulton, T. (eds.). 2003. Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje. Illus. Nelly Giraldo. Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI), Roma, Italia.

M. Carmen de Vicente, Ph.D., es Genetista Molecular de Plantas, en la Oficina Regional del IPGRI-Américas, en Cali, Colombia. Theresa Fulton, Ph.D., es Directora de Extensión en el Instituto para la Diversidad Genómica de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY.

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