UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA

DE CIENCIAS Y TECNOLOGIA

Laboratorio de Parasitología.

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

PARASITOLOGIA

Nutrición y Dietética

Primer Semestre 2011

PROFESORES ENCARGADOS DE PRÁCTICO: Julia Opazo, Nelson Caro

Objetivos del Práctico de Parasitología

Al término del trabajo práctico, el alumno deberá ser capaz de:

1.- Conocer los métodos de diagnóstico parasitarios, sus fundamentos y su

interpretación.

2.-Identificar los principales grupos y especies de parásitos de importancia médica en Chile.

3.- Conocer las propiedades morfológicas de los parásitos más importantes.

4.- Identificar las diferentes etapas de los ciclos de vida de los parásitos y su relevancia en la epidemiología de las enfermedades que ocasionan.

Normas Generales del trabajo en Laboratorio

1.- El alumno llevará obligatoriamente un delantal blanco, fundamentalmente

para proteger su ropa de material infeccioso y reactivos corrosivos o de tinción.

El NO uso del delantal significará que NO podrá ingresar al laboratorio práctico. 2.- Está absolutamente prohibido ingresar o consumir cualquier tipo de

alimentos, beber o fumar. 3.- Apagar celulares y todo tipo de artefacto electrónico.

4.- Para evitar contaminación y el peligro de quemaduras es indispensable la

utilización del cabello recogido durante el desarrollo del trabajo práctico. 5.- Para evitar contaminación y el peligro de quemaduras no se debe portar

elementos como gorros, bufandas o pañuelos ni ningún tipo de ropa que incomode durante el desarrollo del trabajo práctico.

6.- En caso de ruptura de material contaminado con bacterias u hongos, debe

comunicarse inmediatamente con el Profesor encargado para proceder a la desinfección de la zona.

7.- No se podrá ingresar al Laboratorio de Práctico con mochilas, bolsos o ropa

de abrigo por lo que deben ser guardados en las gavetas dispuestas para ello. Deben traer su propio candado.

8.- Cada grupo de trabajo será responsable por los microscopios disponibles y

del material entregado. El material debe ser devuelto íntegramente y los microscopios deben quedar limpios, ordenados y desenchufados.

9.- La duración de los trabajos prácticos son de 80 minutos, incluyendo el

control, por lo que el Profesor encargado está capacitado para retirar el material de trabajo, si es necesario, una vez cumplido el plazo.

10.- No se permiten atrasos e inasistencias. Esta última deberá ser justificada

por medio de un certificado médico.

11.- Antes de iniciar cada trabajo práctico se realizará un Test de Entrada en relación a la actividad a realizar (trabajo práctico o seminario). Tendrá una duración de 10 minutos El alumno que llegue tarde a este control tendrá nota 1.0.

12.- Se trabajará en grupos de 2 personas y cada uno deberá tener un

cuaderno en el cual deben dibujar en detalle y anotar lo observado. Los seminarios expuestos también serán evaluados con nota.

OBJETIVOS DEL PRÁCTICO 1 1.- Adquirir conocimientos sobre bioseguridad

2.- Identificar material empleado en la práctica parasitológica.

3.-Adquirir conocimiento en la manipulación de materiales y muestras.

PRACTICO1: Reglas generales de bioseguridad y diagnóstico parasitológico. En el laboratorio, al igual que en la cocina de cualquier casa, nos

enfrentamos a algunos peligros que debemos considerar para disminuir los

riesgos de accidentes. Podríamos clasificar a estos riesgos en Riesgos

Biológicos (virus, bacterias, parásitos u hongos) y en No Biológicos. Estos

últimos incluyen los riesgos químicos (por ejemplo, uso de cloro y solventes

inflamables o cáusticos), físicos (por ejemplo cortaduras), eléctricos (por

ejemplo descargas eléctricas por enchufes o cables en mal estado) y el fuego

(por ejemplo quemaduras).

El estudio de los microorganismos que pueden ser patógenos para el

hombre, los animales u otras formas de vida, trae consigo ciertos riesgos que

varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados.

El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos

en lo que respecta a la manipulación de muestras con parásitos. Esto incluye

manejo del concepto de esterilidad, autocuidado, métodos de análisis micro y

macroscópico de parásitos.

I.- SEGURIDAD BIOLÓGICA.

Las Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel

aceptable el riesgo relacionado con la manipulación de material peligroso, y su

rigurosidad varía con la peligrosidad de los agentes.

La seguridad biológica se fundamenta entonces en tres elementos:

• Técnicas de Laboratorio. Se refieren a todas aquellas prácticas y técnicas

microbiológicas que se realizan dentro y fuera del laboratorio. Un buen

seguimiento de las mismas ayuda a contener los riesgos biológicos. Como

práctica de mayor importancia se encuentra el desarrollo o adopción por parte

de cada laboratorio de un Manual de Seguridad Biológica en el que se

identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los

procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como así también las

responsabilidades.

• Equipo de seguridad (Barreras Primarias). Corresponden a los dispositivos o

aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de seguridad

biológica), como las prendas de protección personal (guantes, mascarillas,

delantal, calzado, etc.).

• Diseño y Construcción de la Instalación (Barreras Secundarias). La

magnitud de las barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso

que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de

las zonas donde tiene acceso el público, la disponibilidad de sistemas de

descontaminación (autoclaves), filtrado del aire de salida al exterior, flujo de

aire direccional, etc.

Para disminuir los riesgos es importante mantener buenos hábitos de

trabajo, respetar las normas de seguridad y conocer los peligros potenciales

dentro del laboratorio.

EL FACTOR HUMANO EN LA PREVENCIÓN DE ACCIDENTES.

Debe tenerse especial atención en aquellos factores humanos que

intervienen en la prevención de accidentes. Por ejemplo, estados de ansiedad,

irritabilidad y apresuramiento; reflexionar sobre las actitudes de negación ante

situaciones de riesgo.

ELEMENTOS DE RIESGO.

HÁBITOS DE HIGIENE

Manos: En algunos aspectos, son como las patas de las moscas, tocan la

suciedad, las fuentes de infección y sin que tengamos una noción clara de sus

movimientos, las llevamos a la boca o a los ojos que son, a su vez, la puerta de

entrada de muchas infecciones. Un paso importante en la protección de

nuestra salud es aceptar e incorporar en nuestras prácticas la “Regla de los 4

NO” (o primera regla de oro de la bioseguridad), en ella se destaca que en el

laboratorio se debe: No fumar; No comer; No beber; No maquillarse.

Como una práctica diaria y en forma repetida, deben lavarse las manos con

jabón (preferentemente líquido), cuantas veces sea necesario. Dado que las

manos son susceptibles de recibir pinchazos, heridas y abrasiones, para

realizar algunas tareas conviene utilizar guantes, dado que la posibilidad de

que lo anterior ocurra se encuentra muy disminuida. Dos prácticas son

necesarias cuando utilizamos guantes, el lavado con jabón y el sacárselos

cuando se vayan a realizar otras tareas diferentes a las que estamos

realizando, como por ejemplo, levantar el teléfono, luego de trabajar.

Cabello: Es conveniente usarlo corto o recogido durante el trabajo.

Uso de ropa protectora: el uso de delantal impide daños mayores, por

ejemplo salpicaduras con material infeccioso o contaminado. Esta ropa debe

ser higienizada periódicamente y permanecer siempre dentro del área del

laboratorio.

Protección de ojos: Cuando se trabaja con sustancias corrosivas, es

conveniente usar anteojos protectores o máscaras para disminuir el riesgo de

lesionar la córnea con salpicaduras o por exposición a vapores químicos. Es

importante trabajar bajo campana, al manipular solventes, como así también

tener a mano soluciones y dispositivos especiales para el enjuague de los ojos.

Otras protecciones: En las operaciones comunes del laboratorio se generan

aerosoles y dado que la mayoría de las bacterias y virus tienen como puerta de

entrada al organismo la vía aérea, hay que evitar la producción de éstos y es

necesario usar máscaras de protección. Debe evitarse el pipeteo directo con la

boca, por ello es conveniente usar aquellos dispositivos apropiados como lo

son las pipetas automáticas, las propipetas (peras de goma), dispensadores,

etc. Tener en el laboratorio desinfectante para piel y mesones. Colocar el

material contaminado en recipientes con tapa, para esterilizarlos antes del

lavado. Esterilizar o incinerar el material contaminado antes de su eliminación.

Tratar de realizar las operaciones dentro de una cabina de seguridad biológica.

Otra regla importante, considerada la segunda regla de oro de la bioseguridad

es “Considerar que toda muestra es potencialmente peligrosa y tratarla

como tal”.

CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPOS DE

RIESGO

Según la peligrosidad de los microorganismos infectantes, existe una

clasificación por grupos de riesgo:

•Agente Biológico del Grupo I. Es aquél que resulta poco probable que cause

una enfermedad en el hombre y en la comunidad.

•Agente Biológico del Grupo II. Es aquél que puede causar una enfermedad

en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco

probable que se propague a la comunidad y existiendo generalmente profilaxis

o tratamiento eficaz.

•Agente Biológico del Grupo III. Aquél que puede causar una enfermedad

grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, pudiendo

causar la muerte con riesgo de que se propague a la comunidad y existiendo

frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

•Agente Biológico del Grupo IV. Aquél que causando una enfermedad grave

en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas

posibilidades de que se propague a la comunidad y sin que exista

generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.

CLASIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS SEGÚN SU NIVEL DE

SEGURIDAD BIOLÓGICA:

Nivel 1. Microorganismos no patógenos para el hombre. Es el nivel de

seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo I, es decir, los que

no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida

y estable a los antimicrobianos. Es el habitualmente utilizado en los laboratorios

de prácticas de universidades o centros docentes.

Nivel 2. Microorganismos y procedimientos de riesgo moderado. En él se

trabaja con agentes del grupo II, como así también con algunos que,

perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar

patología infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser

manipulados por personal especializado y son los que con más frecuencia se

estudian en laboratorio de microbiología clínica: Salmonella typhi,

Mycobacterium tuberculosis, Virus de la Hepatitis B, etc.

Nivel 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos de riesgo

moderado En este nivel se trabaja con agentes biológicos del grupo III,

microorganismos que causan patología grave, de difícil y largo tratamiento, que

pueden dejar secuelas y ocasionalmente producir la muerte, en cuya

manipulación se aplican procedimientos de trabajo, que implican alto riesgo de

infección

Nivel 4: Microorganismos exóticos y/o altamente peligrosos y procedimientos

de alto riesgo. Este nivel se requiere cuando se procesa con certeza y se

sospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no,

que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco

fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta

contagiosidad. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales

de experimentación infectados con microorganismos del grupo IV. Debe

trabajarse en laboratorios especiales de máxima seguridad (contención

máxima), en los que es necesario ducharse y cambiarse de ropa tanto a la

entrada como a la salida del mismo y en donde existen barreras de aire con el

exterior. El manejo del material limpio y contaminado se realiza por canales

altamente controlados.

Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir

básicamente cuatro elementos:

• un huésped susceptible,

• un agente infeccioso,

• una concentración suficiente de éste y

• una ruta de transmisión apropiada.

De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de

transmisión. Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la

aérea y la inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la

oral, la percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son

posibles.

II.- DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

La Parasitología es la rama de la biología que estudia los fenómenos de

dependencia o interrelaciones que se establecen entre dos seres vivos.

En la naturaleza las asociaciones biológicas pueden establecerse entre

individuos de una misma especie o de especies distintas. El ciclo de cada

parásito expresa la complejidad del fenómeno biológico. Las variables agente,

huésped y ambiente (tríada ecológica), son fundamentales para orientar el

diagnóstico parasitario. Se debe tomar en consideración el estado parasitario

buscado (huevo, quiste, larva, etc.), tanto en el huésped como en el ambiente,

para seleccionar el tipo y características de la muestra (orina, deposición,

ambiente, etc.)

El objetivo de las técnicas diagnósticas es pesquisar e identificar al

parásito (en cualquiera de sus estados) lo que se realiza con técnicas directas,

o a través de técnicas indirectas que evalúan la respuesta inmune del huésped.

El hallazgo de una forma parasitaria en cualquiera de sus estados es

considerado un diagnóstico patognomónico (signos y síntomas que aseguran la

presencia de la enfermedad), en cambio, la evidencia de la respuesta inmune

positiva hacia un agente parasitario sólo hace posible un diagnóstico

presuntivo.

Existe una variedad de técnicas que se utilizan según el agente

parasitario que se desea buscar, por lo que se deben conocer las ventajas y

desventajas de cada una para solicitarlas e interpretarlas en forma adecuada.

IDENTIFICACIÓN

La identificación se lleva a cabo en función de la morfología y a través de

pruebas complementarias como el hemograma (anemia, leucocitosis,

eosinofilia) y la radiología (detección de hidatidosis).

Técnicas directas

Se basan en el diagnóstico morfológico de los distintos estados de los

parásitos. Tiene como objetivo pesquisar e identificar distintas formas de

protozoos (trofozoitos, quistes, ooquistes) y helmintos (proglótidas y huevos).

Su sensibilidad depende de las características de las técnicas, de la carga

infectante, de la biología de los parásitos, del transporte y preparación de la

muestra, de la implementación de equipos adecuados y de la disponibilidad de

tiempo y experiencia de los observadores.

Detección directa de endoparásitos en heces.

En el caso de la investigación de Trofozoítos deberá hacerse un procesamiento

rápido que no deberá superar los 30 minutos después de la recogida de la

muestra. En caso de huevos y larvas no es tan importante el rápido

procesamiento. Se utilizará un conservante y/o fijador que se añadirá en

proporción 3:1, es decir, 3 partes de conservante por 1 de muestra. Los

conservantes más comúnmente utilizados son: Tormalina (formol al 5-10%);

PVA (Alcohol Polivinílico) y MIF (Mertiolate Iodo y Fenol), Fijador PAF (fenol-

alcohol-cloroformo). Estas sustancias sirven para preservar, sin que se

modifiquen las estructuras internas, sobre todo cuando las muestras no pueden

ser procesadas inmediatamente.

A la muestra se le realiza un EXAMEN MACROSCÓPICO en el cual permite

observar las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o

fraccionados y la consistencia de la muestra (formes o semiformes; blandas;

o líquidas, presencia de sangre y/o moco, etc.).

También se le realiza un EXAMEN MICROSCÓPICO en el cual se busca la

presencia de formas evolutivas móviles de parásitos te tamaño microscópico

(trofozoítos, quistes y huevos). El procesamiento de la muestra consiste en los

siguientes pasos:

Realizar la suspensión de las heces

Depositar una gota en un portaobjeto

Añadir un colorante, generalmente lugol, que tiñe las estructuras de un

color amarillo-marrón.

Colocar un cubreobjeto

Observar al microscopio con el objetivo de bajo aumento.

Se pueden llevar a cabo TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN en el caso de

que el microorganismo sea escaso en la muestra.

Existen dos tipos de técnicas de concentración:

Concentración por Flotación:

Se basa en la flotación de quistes, ooquistes y huevos de parásitos en una

solución que posee mayor densidad que ellos. Esta técnica es útil para la

concentración de quistes y ooquistes de protozoos y huevos de helmintos.

Concentración por Sedimentación:

Se basa en la gravidez que presentan todas las formas parasitarias para

sedimentar espontáneamente en un medio menos denso y adecuado como la

solución fisiológica. En este método es posible la detección de quistes,

trofozoítos, huevos y larvas de helmintos.

Otras de las pruebas que se pueden llevar a cabo son las TINCIONES

PERMANENTES como son la tinción Tricrómica, la tinción Hierro-Hematoxilina,

método de Ziehl-Neelsen, etc.

Por último se encuentran las TÉCNICAS ESPECIALES, algunas son las

siguientes:

Prueba de Graham: Se utiliza especialmente para la pesquisa de huevos de

helmintos en los márgenes de la zona perianal. Se utiliza para el diagnóstico de

Oxiuros generalmente aquellos que pertenecen al género Enterobius

vermicularis.

Se usa una cinta de adhesiva transparente, que se extenderá

posteriormente en u portaobjeto. Se pasa por la zona perianal a primera hora

de la mañana y sin aseo previo. Colocamos la cinta sobre un portaobjeto y

examinamos en busca de huevos al microscopio.

Técnica para la búsqueda de proglótides de cestodos (segmentos del cuerpo

de gusanos): Se utiliza para diferenciar entre las especies de Tenia solium y

Tenia saginata.

Prueba de cápsulas duodenales o enterotest: Esta prueba se utiliza para la

investigación de Giardia y Strongyloides. Consiste en hacer pasar un hilo de

nylon con un peso por el intestino y posteriormente, cuando el hilo es

eliminado, se raspa para la examinación.

Cuantificación de huevos: se utiliza para la investigación de helmintos Se basa

en la Técnica de Kato o método de concentración por tamizado. Consiste en la

aclaración de las heces con el uso de glicerina, que permite preparar una capa

transparente y observar las formas parasitarias. Se expresa en número de

huevos por gramos de heces.

Detección directa en otras muestras distintas a heces.

Sangre: para el estudio del Paludismo, Filarias y Tripanosomas. Se pueden

utilizar las siguientes técnicas:

Examen de sangre al fresco: Una gota de sangre recién extraída se

observa entre lámina y laminilla, directamente al microscopio.

Frotis de sangre: Se extiende una gota de sangre recién extraída, sobre un

portaobjeto, se tiñe con May Grunwald Giemsa o Wright.

Gota gruesa: Se colocan tres gotas de sangre en un portaobjeto, se mezcla

con movimientos concéntricos con un alfiler o con el extremo de un portaobjeto,

se extrae la fibrina. Se seca a temperatura ambiente y luego se tiñe.

Microstrout o microhematócrito: Se toma una muestra de sangre en tubo

de microhematócrito y se centrifuga a 100 rpm por tres minutos. Se fractura el

capilar en el límite de la capa leucocitaria. Se deposita sobre un portaobjeto la

capa de leucocitos y plasma y se observa al microscopio.

Xenodiagnóstico: Esta técnica sólo se utiliza para enfermedad de Chagas.

Se emplean ninfas de Triatoma spp. libres de infección, las que se alimentan

con sangre del paciente. Los resultados se obtienen a los 30, 60 y 90 días.

Esta técnica sólo es utilizada en algunos centros de investigación y puede ser

reemplazada por PCR para T cruzi.

Esputo: Se puede realizar un examen en fresco o tinciones permanentes.

Podemos encontrar: Fases larvarias de Áscaris, Strongyloides, huevos de

algunos gusanos, amebas (excepcionalmente), Criptosporidium

Exudados vaginales: se realiza un examen en fresco y se investiga la

presencia de Tricomonas vaginalis.

Técnicas indirectas

Los métodos indirectos tienen real importancia cuando se los elige como

alternativa a los procedimientos invasivos en cuadros complicados

extraintestinales.

Dentro de estas técnicas encontramos:

Test ELISA, se ve la reacción antígeno anticuerpo

PCR, reacción en cadena de la polimerasa. PCR Trypanosoma cruzi:

Se basa en la pesquisa de fracciones del parásito a partir de secuencias

conocidas de su ADN. La técnica se basa en la ampliación de un

segmento del ADN del parásito, para luego caracterizarlo e identificarlo.

Detección de presencia de inmunoglobulinas específicas antiparasitarias

en el suero del paciente.

ARTROPODOS

Los principales artrópodos de interés médico se muestran en la siguiente tabla.

ARTROPODOS DE INTERES MEDICO

Clase Orden Ejemplos

Insectos Dípteros Moscas

Mosquitos

Blattaria Cucarachas

Hemíptero Triatomídeos

Siponaptera Pulgas

Anoplura Piojos

Arácnidos Scorpionida Arañas

Escorpiones

Acarina Acaros

Garrapatas

Crustáceos Copépodo Cyclops

Técnicas directas

Tienen como objeto identificar el género y la especie y están basadas en la

observación con lupa o microscopio del artrópodo en algunos de sus estados.

Las muestras pueden ser trasladadas en seco o en agua al laboratorio y

pueden ser tomadas del huésped (ectoparásitos permanentes) o del ambiente

(ectoparásitos temporales).

Entre los artrópodos que más afectan al hombre se encuentran los ácaros

de la piel (Sarcoptes scabiei y Demodex folliculorum). La técnica de toma de

muestra, denominada Acaro test, es la ideal para obtener el parásito. Otro

artrópodo de alta prevalencia es el arácnido Loxoceles laeta (Araña del rincón),

cuyo diagnóstico específico se realiza al examinar su morfología y

específicamente la distribución de sus ojos (tres pares distribuidos en forma de

triángulo).

El diagnóstico por el laboratorio de las parasitosis generalmente se confirma

por el hallazgo directo del parásito, o por la detección de la respuesta inmune

que provoca siendo importante por lo tanto el empleo de las mejores técnicas y

de personal debidamente capacitado, cuidadoso y que disponga de los medios

y el tiempo necesario para realizarlos.

REFERENCIAS.

Atias Antonio. (2008). Parasitología Médica. Editorial Mediterráneo, Brooks, G.F., Butel, J.S. Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz,

Melnick y Adelberg. Editorial El Manual Moderno, México D.F. Murray, P.R., Rosenthal, K.S. y Pfaller, M.A. (2008). Microbiología Médica.

Segunda Edición. Editorial Mosby, Madrid.

Saredi Nélida. (2002). Manual Práctico de Parasitología Médica. Laboratorios

Andrómaco, Buenos Aires.