(

Prctica VII

Cultivo por Lote Alimentado de Saccharomyces cerevisiae

Tecnolgico de Monterrey

Campus Estado de Mxico

Mario Alfonso Arenas Garca A01162581 Ariadna Berenice Trejo Raya A01163207

Mara Elena Mendoza Acosta A01163564 Natalia Martnez Balderas A01163759

Mara Alejandra Garca Alcaraz A01167481

Dr. Csar Garca Daz

2014

Laboratorio de

Bioprocesos

2

ndice General 1. Resultados..... 3

1.1 Crecimiento de la Biomasa..... 3

1.2 Conteo Celular...... 4

1.3 Efecto de la Concentracin de Sustrato.... 5

1.3.1 Azucares Totales. 5

1.4 Actividad de la Invertasa.. 7

2. Discusin.... 9

3. Conclusin 11

4. Fuentes de Informacin.. 11

ndice de Figuras Figura 2.1 - Logaritmo natural de biomasa contra tiempo para S. cerevisiae.. 9

Figura 2.2 - Comportamientos de compuestos en fermentacin fed-batch para etanol

con S. cerevisiae.. 10

ndice de Grficas Grfica 1.1 - Comportamiento Ln [O.D] con el tiempo..... 3

Grfica 1.2 - Fase exponencial de crecimiento..... 4

Grfica 1.3 - Concentracin celular con respecto al tiempo 5

Grfica 1.4 - Concentracin de azucares totales con el tiempo. 6

Grfica 1.5 - Velocidad consumo de sustrato (azucares totales)... 7

Grfica 1.6 - Actividad enzimtica de la Invertasa......................... 8

Grfica 1.7 - Velocidad de actividad enzimtica de la Invertasa............................. 8

ndice de Tablas Tabla 1.1 - Toma de muestras y O.D de S. cerevisiae.... 3

Tabla 1.2 - Conteo celular por muestra.. 5

Tabla 1.3 - Datos de concentracin de azucares totales con respecto al tiempo... 6

Tabla 1.4 - Concentracin de azucares invertidos por muestra) 7

3

1. Resultados Saccharomyces cerevisiae fue empleada en un proceso tipo lote alimentando; creciendo

por un periodo de 19 horas bajo condiciones ptimas con la finalidad de obtener el perfil

de crecimiento y caracterizacin de los parmetros cinticos.

1.1 Crecimiento de la Biomasa La densidad ptica (O.D, por sus siglas en ingls) se registr aproximadamente cada 2

horas (con la notable excepcin de la primera toma). En total se realizaron 10 tomas de

muestra, las cuales pueden observarse en la Tabla 1.1.

Tabla 1.1 Toma de muestras y O.D de S. cerevisiae

Tiempo (Horas) O.D (Absorbancia)

0 0

3 -2.79688

5 0

7 -2.20727

9 -2.13707

11 -2.51331

13 -2.19823

15 -1.50058

17 -0.56563

19 0.270027

A partir de los datos de la tabla 1.1 se realiz la grfica 1.1; el cual grfica Ln O.D

contra el tiempo. La tasa de crecimiento es el cambio en el no. de clulas por minuto,

estimado como el cambio de O.D por minuto (en ste caso); para poder calcularlo en

base a la grfca, se requiere obtener el cambio instantneo es dado por (Ec. 1):

=

Donde N es la cantidad de clulas en el tiempo t y es la constante de la tasa de

crecimiento (unidades dadas en h-1).

Grfica 1.1. Comportamiento de Ln [O.D] en relacin al tiempo (h).

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

LN [

O.D

]

Tiempo [h]

LN[O.D] vs Tiempo

4

Cuando que se integra la ecuacin anterior a partir de t = 0 a t = T, la relacin es la

siguiente (Ec. 2):

ln [

0 ] = ( 0)

En base a ello, la pendiente de la grfica de Ln [N] en funcin de t sea . Para poder

calcular este valor, se emplea nicamente la parte lineal de la grfica 1.1, la cual es

correspondiente a la fase exponencial del crecimiento del microorganismo (ver grfica

1.2).

En la grfica 1.2, se realiz una regresin lineal; de la cual su expresin es (Ec. 3):

= 0.36 6.701 De esto, tiene un valor de 0.36 h-1, el cual en minutos equivale a 21.6 min-1. Por otro lado, para la obtencin del tiempo de duplicacin (tD), se debe emplear la siguiente frmula (Ec. 4):

= 2

Con ello, se obtiene que tD equivale a 1.92 h, el cual en minutos equivale a 115.2 min.

1.2 Conteo celular

Para poder realizar el anlisis del nmero de clulas, se procedi al uso de la cmara

de Neubauer. A partir de esto, se obtuvieron los datos de la Tabla 1.2; con los cuales se

realiz la Grafica 1.3 donde se observa el cambio del nmero de clulas a travs del

tiempo.

Grfica 1.2 Regresin lineal del crecimiento en la fase exponencial.

y = 0.36x - 6.701R = 0.9736

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

LN [

O.D

]

Tiempo [h]

Fase Exponencial de Crecimiento - Ln [O.D] vs Tiempo

5

Tabla 1.2 Conteo celular por muestra.

Tiempo Nmero de clulas por

litro (# clulasl-1)

0 442500000

3 312500000

5 342500000

7 275000000

9 317500000

11 320000000

13 245000000

15 397500000

17 352500000

19 402500000

1.3 Efecto de la Concentracin de Sustrato

1.3.1 Azucares Totales

El anlisis de la concentracin de sustrato (glucosa como azucares totales) se realiz

mediante el uso de una curva fenol-cido sulfrico, previamente generado en la prctica

V.

Para ello, se requiri determinar las concentraciones de glucosa en cada una de las

muestras, cuyos datos son vistos en la tabla 1.3.

Grfica 1.3 Relacin de concentracin de clulas por

litro a travs del tiempo

0

50000000

100000000

150000000

200000000

250000000

300000000

350000000

400000000

450000000

500000000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

N

mer

o d

e ce

lula

s p

or

litro

Tiempo [h]

Nmero de Celulas por Litro vs. Tiempo

6

Tabla 1.3 Datos de concentracin de glucosa con respecto al tiempo.

Tiempo [h] Concentracin de azcares [g/ml]

Concentracin real de azcares [g/ml]

0 70.81538462 70.815

3 79.89230769 79.892

5 164.4307692 164.431

7 180.2 180.2

11 464.4307692 11610.775

13 480.5846154 12021.45

15 507.5076923 12687.7

17 239.8153846 2398.15

19 303.2 3032

En base a los datos de la tabla 1.3, se realiza la grfica 1.4; la cual denota el cambio

de concentracin de sustrato con relacin al tiempo.

De esto, la pendiente de la grfica 1.4 es la velocidad de consumo de sustrato.

Similar a la determinacin de velocidad de crecimiento, solo se usa la fase parte lineal

de la grfica, la cual corresponde a la fase exponencial de crecimiento. (Ver grfica 1.5)

Grfica 1.4 Relacin de concentracin de glucosa

total al paso del tiempo.

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 5 10 15 20

Co

nce

ntr

aci

n d

e d

e az

uca

res

tota

les

[g/

ml]

Tiempo [h]

Concentracin de Azcares Totales [g/ml]

7

De la previa grfica, la regresin lineal da la siguiente expresin (Ec. 5):

= 5144.8 + 89859

La velocidad de consumo de sustrato de azcar total, equivale a 51144.8 gml-1h1. Sin embargo, debido a la dificultad y problemtica visto al analizar los datos, solo se reduce el anlisis de la concentracin de azucares totales a dos puntos.

1.4 Actividad de la Invertasa

Para analizar la concentracin de azucares invertidos, se realiz una cuantificacin por

medio de la tcnica del cido 3-5 dinotrosaliclico. En base a esta tcnica, se realiz

una regresin lineal para poder determinar su actividad enzimtica a travs del tiempo,

a partir de las muestras tomadas. Dichos datos estn en la tabla 1.4.

Tabla 1.4 Concentracin de azucares invertidos a travs del tiempo

Tiempo [h] Concentracion [m]

0 3.296636086

3 4.499490316

5 10.12640163

7 9.902140673

9 11.55351682

11 8.576962283

13 10.94189602

15 12.57288481

17 14.89704383

19 16.20183486

Grfica 1.5 Velocidad de consumo de sustrato.

y = -5144.8x + 89859R = 1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5

Co

nce

ntr

acio

n d

e az

uca

res

[g/

ml]

Tiempo [h]

Velocidad de Consumo de Sustrato Azucares Totales

8

De la previa tabla, se genera la grfica 1.6; el cual muestra la concentracin de azucares invertidos con respecto al tiempo.

Para el anlisis de la velocidad de consumo de azucares invertidos, solo se emplea

la parte correspondiente a la fase lineal de la grfica 1.6. De esto, solo sera de las

muestras a las 9 horas y 11 horas.

De la grfica 1.7, se obtiene la siguiente correlacin (Ec. 6):

= 0.9489 + 19.54

La actividad enzimtica de la invertasa es de 0.9489 Mh-1, equivalente a 56.934 Mmin-1.

Grfica 1.6 Relacin de la actividad enzimtica a travs del tiempo.

00,000

00,002

00,004

00,006

00,008

00,010

00,012

00,014

00,016

00,018

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Co

nce

ntr

ci

n d

e az

uca

res

inve

rtid

os

[M

]

Tiempo [h]

Actividad Enzimatica [Azucares Invertidos]

y = -0.9489x + 19.54R = 1

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14Co

nce

ntr

aio

n d

e az

uca

res

inve

rtid

os

[

M]

Tiempo [h]

Velocidad de Consumo de Azucares Invertidos

Grfica 1.7 Actividad enzimtica, velocidad de

consumo de azucares invertidos.

9

2. Discusin

En un estudio realizado por Valentinotti, Srinivasan y colaboradores (2002); reportan

que bajo condiciones optimizadas S. cerevisiae en un proceso fed-batch tiene una

velocidad de crecimiento de 0.27 h-1, equivalente a 16.2 min-1. Este valor es muy

semejante al del reportado en la seccin de resultados.

Sin embargo, hay una diferencia notable con respecto al comportamiento de la

grfica; ya que Valentinotti reporta la siguiente figura:

La figura 2.1 denota la diferencia del comportamiento de crecimiento en relacin a

la grfica 1.1; la cual tiene un comportamiento errneo entre las muestras a 0 horas y a

las 9 horas. Es posible que este error sea a partir de una medicin inapropiada o por la

presencia de contaminantes en las muestras.

De manera anloga, la figura 2.1 puede ser empleada para poder explicar el

comportamiento de la cantidad de clulas disponibles en el sistema; ya que la tendencia

general es que se mantenga relativamente estable sin que presente un aumento; lo cual

no debera de ocurrir y en todo caso debera de aumentar.

Ambas discrepancias previamente mencionadas son debido a la contaminacin de

las primeras 5 muestras, el cual perjudica significativamente el anlisis del

comportamiento de S. cerevisiae. La contaminacin se debe a que tenan otro

microorganismo creciendo (no se identific, solo se observ al realizar el conteo celular);

el cual posiblemente afectaba la cantidad de nutrientes disponibles y/o alguna otra

relacin que ocurre entre ellos.

Por otro lado, en un estudio realizado por Laopaiboo, Thanonkeo y

colaboradores (2007); se entonctro que S. cerevisiae tenia un consumo de glucosa de

8.75 gl-1h-1; equivalente a 8750 gml-1h-1; un valor que es un ms elevado que el

reportado en la seccin de resultados. Es importante destacar, a su vez, que es erroneo

Figura 2.1 Logaritmo natural del total de biomasa contra tiempo; de la cual se

observa una regresin lineal indicando la velocidad de crecimiento de la

levadura. (Valentinotti et al, 2002)

10

el incremento de concentracin de glucosa en el sistema. Su comportamiento se

asemejaria ms al de la siguiente figura:

La figura 2.2 no muestra un incremento en la cantidad de azucar presente en el

sistema (ver grfica 1.4); al contrario, disminuye al paso el tiempo, denotando que es

empleado por el microorganismo ya sea para poder crecer o genera un metabolito

secundario de inters.

Por otro lado, se reporta un valor de actividad especfica para la invertasa

extracelular de 4800 molmin-1mg. (BRENDA, 2014) Aunque este valor permite

identificar fcilmente la enzima con la cual se esta tratando, no se correlaciona

enteramente con el reportado en la prctica y no se puede asegurar del todo si se trate

de la misma.

Asimismo, es importante destacar que no debio haber aumentado la concentracin

de azucares invertidos; en dado caso, se debio haber mantenido estable o se debi

haber observado una disminucin en la concentracion de azucares invertidos; y por

ende el uso de solamente dos puntos al momento de determinar la velocidad de reaccin

de la enzima.

Las causas por este error pueden ser debido a dos motivos principales:

Se estaba alimentando con mayor sustrato al sistema; por encima de la

capacidad de procesarlo

Se realiz un error al momento de tomar las mediciones de las muestras

Figura 2.2 Comportamientos de compuestos en la fermentacin fed-batch para

etanol. Azucares reductores ( ), solidos solubles totales ( ), etanol ( ),

cantidad de clulas ( ) y pH ( ). (Laopaiboon et al, 2007)

11

3. Conclusin Mario Alfonso Arenas Garca

Considerando nuevamente fallas al momento de realizar las muestras, notablemente

por la contaminacin de los primeros cinco valores por microorganismos (bacterias) y la

posibilidad de que se tuvo un error al realizar DNS; los resultados presentan una mejor

tendencia de crecimiento y aparentemente los parmetros de crecimiento y consumo

para S. cerevisiae son los apropiados (en contraste con los reportados por la literatura).

Por otro lado, aunque probablemente se trate de la enzima invertasa por la levadura

que se estaba manejando (y las condiciones a las que se encontraba); no se puede

verificar del todo debido a que se reporta generalmente la actividad especfica de la

enzima; el cual no es compatible con la actividad enzimtica que se reporta.

4. Fuentes de Informacin

BRENDA. (2014). EC 3.2.1.26 - beta-fructofuranosidase. Functional Parameters -

Specific Activity - Saccharomyces cerevisiae Extracellular. Obtenido el 1 de abril de

2014 de: http://www.brenda-

enzymes.info/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26&Suchword=&organism%5B%5D=Sa

ccharomyces+cerevisiae&show_tm=0

Laopaiboon, L.; Thanonkeo, P.; Jaisil, P. y Laopaiboon, P. (2007). Ethanol production

from sweet sorghum juice in batch and fed-batch fermenttions by Saccharomyces

cerevisiae. World Journal of Microbiology and Biotechnology - Springer. Obtenido el 1

de abril de 2014 de: http://link.springer.com/article/10.1007/s11274-007-9383-x

Valentinotti, S.; Srinivasan, B.; Holmberg, U.; Bonvin, D.; Cannizzaro, C.; Rhiel, M. y

Von Stockar, U. (2002). Optimal operation of fed-batch fermentations via adaptative

control of overflow metabolite. Control Engineeering Practice - Elsevier. Obtenido el

31 de marzo de 2014 de: http://www.sciencedirect.com.sci-

hub.org/science/article/pii/S0967066102001727